BRPI0818764B1 - Process of production of a polipeptídeo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO".

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a uma célula que será utilizada na produção de heteroproteínas e a um processo de produção que utiliza a célula. Em mais detalhes, a presente invenção refere-se a uma célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato e a um processo para a produção de um polipeptídeo utilizando a célula.

TÉCNICA ANTERIOR

Quando proteínas úteis como agentes farmacêuticos são produzidas com a técnica de DNA recombinante, o uso de células de animais possibilita a modificação pós-transcrição e o dobramento que as células procarióticas não podem realizar. Portanto, as células de animais são frequentemente utilizadas como células hospedeiras para a produção de proteínas recombinantes.

Recentemente, um grande número de agentes biofarmacêuticos, tais como anticorpos e proteínas fisiologicamente ativas, foi desenvolvido. As técnicas que permitem a produção eficiente de proteínas recombinantes por células de animais levam à redução de custo de agentes biofarmacêuticos e asseguram seu fornecimento estável aos pacientes.

Sob estas circunstâncias, é desejado um método de produção de proteínas com maior eficiência de produção.

Um trocador aniônico é um transportador que medeia o antiporte de ânions intracelulares e extracelulares através de uma membrana plasmática (proteína de transporte em membranas). Uma família SLC4 é uma família de transportadores HC03' e três membros que pertencem à família SLC4, a saber, AE1, AE2 e AE3, possuem uma função de trocar Cl' para fora de uma membrana plasmática por HCO3' para dentro de uma membrana plasmática.

Em um rim, AE1 é encontrado em células intercaladas com α em dutos de coleta na membrana basolateral (Documento sem ser Patente 1).

Era sabido que mutações noAE1 humano causam acidose tubular renal distai (Documentos sem ser Patentes 2 e 3).

Ainda, em um rim, três isoformas de AE2, a saber, AE2a, AE2b e AE2c, foram descobertas. AE2 é considerado como regulador da homeosta-se de pH intracelular para transdução de sinal das células (Documento sem ser Patente 4). Entretanto, foi descoberto que um camundongo nocauteado em relação a AE2 que morre durante o período de desmame não sofre de anormalidades fenotípicas renais (Documento sem ser Patente 5).

Um SLC26 é uma família de trocadores aniônicos relativamente nova é foi sugerido que um grande número de seus membros (por exemplo, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A6 e SLC26A9) são trocadores de bicarbonato (Documentos sem ser Patentes 6 até 11).

Por outro lado, era absolutamente desconhecido que através da expressão forte de um trocador aniônico que possui uma função transportadora de bicarbonato, a captação de ânions por uma célula cultivada e a excreção de ânions para fora da célula, que é mediada pelo trocador aniônico, podem ser promovidas artificialmente, o que contribui para o aumento na produção de uma proteína recombinante desejada na célula cultivada. [Documento sem ser Patente 1] van Adelsberg JS. e outros, J Biol Chem 1993; 268:11283-11289 [Documento sem ser Patente 2] Shayakui C. e outros, Curr Opin Nephrol Hypertens 2000; 9:541-546 [Documento sem ser Patente 3] Alper SL. e outros, Annu Rev Physiol 2002; 64:899-923 [Documento sem ser Patente 4] Komlosi P. e outros, Am J Physiol Renal Physiol 2005; 288:F380-F386 [Documento sem ser Patente 5] Gawenis LR. e outros, J Biol Chem 2004; 279:30531-30539 [Documento sem ser Patente 6] Melvin e outros, J Biol Chem 1999; 274:22855-22861 [Documento sem ser Patente 7] Ko e outros, EMBO J. 2002; 21:5662-5672 [Documento sem ser Patente 8] Soleimani e outros, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2001; 280:F356-F364 [Documento sem ser Patente 9] Wang e outros, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2002; 282:G573- G579 [Documento sem ser Patente 10] Petrovic e outros, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2004; 286:F161-F169 [Documento sem ser Patente 11] Xu e outros, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005; 289:C493-C505 DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMA PARA SOLUÇÃO PELA INVENÇÃO É um objetivo da presente invenção fornecer um método que é capaz de produzir um polipeptídeo eficientemente.

MEIOS PARA RESOLVER O PROBLEMA

Como um resultado de pesquisas extensivas e intensivas em direção à solução do problema acima, os presentes inventores descobriram que é possível aumentar o rendimento de um polipeptídeo desejado através da utilização de uma célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato. Assim, a presente invenção foi conseguida. Além disso, o polipeptídeo desejado podería ser produzir em uma quantidade ainda maior a-través da utilização de células capazes de co-expressar um transportador de bicarbonato e descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico (posteriormente aqui referida algumas vezes aqui como "CSAD") ou alanina aminotransferase (posteriormente aqui referida algumas vezes aqui como "ALT"). A presente invenção pode ser resumida como a seguir. (1) Um método de produção de um polipeptídeo, que compreende o cultivo de uma célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato e possui um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e permite assim que a célula produza do dito polipeptídeo. (2) O método de (1) acima, em que a célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato é uma célula para dentro da qual um DNA que codifica o transportador de bicarbonato foi transferido. (3) O método de produção de (1) ou (2) acima, em que a célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato expressa ainda descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico ou alanina aminotransferase fortemente. (4) O método de produção de qualquer um de (1)-(3) acima, em que o transportador de bicarbonato é um trocador aniônico SLC4 ou um trocador aniônico SLC26. (5) O método de produção de qualquer um de (1)-(3) acima, em que o transportador de bicarbonato é um trocador aniônico SLC4. (6) O método de produção de (5) acima, em que o trocador aniônico SLC4 é AE1. (7) O método de qualquer um de (1)-(6) acima, em que a célula é células de ovário de hamster chinês. (8) O método de qualquer um de (1)-(7) acima, em que o poli-peptídeo desejado é um anticorpo. (9) O método de qualquer um de (4)-(6) acima, em que o DNA que codifica o trocador aniônico SLC4 é qualquer um dos seguintes (a) até (e): (a) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2; (b) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2 através de substituição, de deleção, de adição e/ou de inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos e possui ainda atividade do trocador aniônico SLC4; (c) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui 50% ou mais de homologia de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2 e que possui ainda atividade do trocador aniônico SLC4; (d) um DNA que possui a sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1; (e) um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui a sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes e codifica ainda um polipeptídeo que possui atividade do trocador aniônico SLC4. (10) Um método de preparação de um agente farmacêutico que contém um polipeptídeo preparado através do método de qualquer um de (1)-(9) acima. (11) uma célula que possui um DNA transferido que codifica um transportador de bicarbonato e um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado. (12) A célula de acordo com (11) acima, que possui ainda um DNA transferido que codifica descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico ou alanina aminotransferase. (13) uma célula que possui um DNA transferido que codifica um transportador de bicarbonato e um DNA transferido que codifica descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico ou alanina aminotransferase.

EFEITO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, se torna possível produzir um polipeptídeo desejado em alto rendimento.

O presente relatório descritivo abrange o conteúdo divulgado no relatório descritivo e/ou nas figuras do Pedido de Patente Japonês N2 2007-276182 com base no que o presente pedido de patente reivindica prioridade. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 mostra uma topologia de membrana AE1 produzida com base em um domínio transmembrana e na direção prevista partindo de uma sequência de aminoácidos de AE1 derivado de células hepáticas humanas que é obtida através do programa TMpred com referência à figura 1 em Exo Physiol 91.1 pp.153-161, 2006, Seth L. Alper. A figura 2 mostra um plasmídeo para seleção com Higromicina, em que ο AE1 humano (911 aminoácidos) foi expresso. A figura 3 mostra um plasmídeo para seleção com Puromicina, em que ο AE1 humano (911 aminoácidos) foi expresso. A figura 4 é uma representação gráfica da quantidade de produção de anticorpo anti-glipican-3 no dia 12 de cultura em batelada alimentada em um frasco de agitação de 50 mL. A quantidade de um anticorpo anti-glipican-3 produzido por células transformadas com pHyg-AE1 (n=4) era significativamente maior que a produzida por células transformadas com pHyg (n=4) (P < 0,05). A figura 5 é uma representação gráfica da quantidade de produção de anticorpo anti-glipican-3 no dia 10 de cultura em batelada alimentada em um frasco de agitação de 50 mL. A quantidade de um anticorpo anti-glipican-3 produzido por uma cepa de células co-expressando AE1/CSAD (n=9) que foi obtida através da introdução de pPur-CSAD em uma cepa pHyg-AE1-42 ou uma célula transformada com pHyg-AE1 capaz de produzir anticorpo em alto rendimento, era significativamente maior que a produzida por células co-expressando AE1/pPur (n=8) que que foram obtidas através da introdução de pPur em uma cepa pHyg-AE1-42 (P < 0,05). A figura 6 é uma representação gráfica de taxas de sobrevivência no dia 10 de cultura em batelada alimentada em um frasco de agitação de 50 mL. A taxa de sobrevivência de uma cepa de células co-expressando AE1/CSAD (n=9) que foi obtida através da introdução de pPur-CSAD em uma cepa pHyg-AE1-42 ou uma célula transformada com pHyg-AE1 capaz de produzir anticorpo em alto rendimento, era significativamente maior que a de células co-expressando AE1/pPur (n=8) que foram obtidas através da introdução de pPur em uma cepa pHyg-AE1-42 (P < 0,01).

As taxas de sobrevivência no dia 7 da cultura também eram caracterizadas por P < 0,01 (dados não mostrados). A figura 7 é uma representação gráfica da quantidade de produção de anticorpo anti-glipican-3 no dia de 8 culturas em batelada alimentada em um frasco de agitação de 50 mL. A quantidade de um anticorpo anti-glipican-3 produzido por uma cepa de células co-expressando AE1/ALT (n=10) que foi obtida através da introdução de pPur-ALT1 em uma cepa pHyg-AE1-42 ou uma célula transformada com pHyg-AE1 capaz de produzir anticorpo em alto rendimento, era maior que a produzida por uma cepa ΑΕΙ/CSAD (n=9) e ainda, a quantidade do anticorpo anti-glipican-3 produzido por uma cepa de células co-expressando AE1/ALT era significativamente maior que a produzida por células co-expressando AE1/pPur (n=8) que foram obtidas através da introdução de pPur em uma cepa pHyg-AE1-42 (P < 0,01). A figura 8 é um gráfico que mostra a quantidade de um anticorpo produzido por AA53 ou uma cepa co-expressando AE1/ALT1, durante a cultura em batelada alimentada em uma jarra de 1 L. A quantidade de produção do anticorpo anti-glipican-3 no dia 7 da cultura era de 1,9 g/L. A figura 9 mostra a sequência de nucleotídeos de um gene CSAD de hamster derivado de células CHO recém clonado e a sequência de aminoácidos deduzida partindo da mesma.

Afigura 10 mostra um plasmídeo para seleção com Puromicina que foi utilizado para expressar CSAD de hamster (493 aminoácidos).

Afigura 11 mostra um plasmídeo para seleção com Puromicina que foi utilizado para expressar ALT1 humano (496 aminoácidos). A figura 12 é um gráfico que mostra a quantidade de um anticorpo produzido por uma célula AE1-S08 produtora de anticorpo anti IL-6R derivada de um hospedeiro expressando fortemente AE1 durante a cultura em batelada alimentada em uma jarra de 1 L. A quantidade de produção de anticorpo anti-IL-6R no dia 14 da cultura era de 3,0 g/L. A figura 13 mostra a sequência de nucleotídeos de um gene transportador de taurina de hamster derivado de células CHO recém clonado e a sequência de aminoácidos deduzida partindo da mesma. A figura 14 é uma topologia de membrana do transportador de taurina que foi criada com base nas regiões transmembranas e orientações previstas pelo programa TMpred partindo da sequência de aminoácidos de um TauT de hamster derivado de células CHO recém clonado com referência à figura 5 de Shinichi Uchida e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA Vol. 89, pp. 8230-8234, Setembro de 1992. A Marca © indica os resíduos de aminoácidos específicos ao TauT de hamster. Um grande número de resíduos de aminoácidos diferentes daqueles no TauT humano estão presentes na 2-volta (EX: região de membrana extracelular), a 12â região transmembrana (TM) e o C-terminal (IC: região intracelular).

Afigura 15 mostra um plasmídeo para seleção com Higromicina, que foi utilizado para expressar TauT de hamster (622 aminoácidos). MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO

Posteriormente aqui, as modalidades da presente invenção serão descritas em maiores detalhes. A presente invenção fornece um método de produção de um po-lipeptídeo, que compreende o cultivo de uma célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato e possui um DNA transferido que codifica um polipeptídeo desejado e permite assim que célula produza o polipeptí-deo.

No método da presente invenção, a célula pode ser uma célula natural capaz de produzir o polipeptídeo desejado ou uma célula transformada para dentro da qual um DNA que codifica o polipeptídeo desejado foi transferido. Preferencialmente, é utilizada uma célula transformada para dentro da qual um DNA que codifica o polipeptídeo desejado foi transferido.

No método da presente invenção, o polipeptídeo desejado não é particularmente limitado. O polipeptídeo pode ser qualquer polipeptídeo tal como um anticorpo (por exemplo, anticorpo do receptor anti-IL-6, anticorpo anti-glipican-3, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-GPIIb/llla, anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-CD25, anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-Her2/neu, anticorpo anti-RSV, anticorpo anti-CD33, anticorpo anti-CD52, anticorpo anti-lgE, anticorpo anti-CD11a, anticorpo anti-VEGF, anticorpo anti-VLA4 e similares) ou uma proteína fisiologicamente ativa (por exemplo, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator esti-mulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), eritropoietina, interferon, interleucina tal como IL-1 ou IL-6, t-PA, uroquinase, albumina do soro, fator de coagulação sanguínea, PTH e similares). Um anticorpo é particularmente preferido e pode ser qualquer anticorpo tal como um anticorpo natural, um anticorpo de baixo tamanho molecular (por exemplo, Fab, scFv, sc(Fv)2), um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado etc.

Através da utilização de células que expressam fortemente um transportador de bicarbonato, a quantidade de um polipeptídeo produzido pelas células pode ser maior.

Um transportador de bicarbonato é uma proteína de membrana que possui uma função de antiporte, através da qual os ânions de bicarbonato (HCO3') ou os ânions de carbonato (C032’) são excretados enquanto que os ânions de cloreto e os ânions de sulfato são coletados. Um transportador de bicarbonato pode ser exemplificado por um trocador aniônico SLC4 e um trocador aniônico SLC26.

Um trocador aniônico SLC4 é uma proteína de membrana que regula a homeostase de pH intracelular e 0 volume da célula. Atualmente, 10 tipos (SLC4A1 (AE1), SLC4A2 (AE2), SLC4A3 (AE3), SLC4A4 (NBCel), SLC4A5 (NBCe2), SLC4A7 (NBCnl), SLC4A8 (kNBC3), SLC4A9 (NBCn2), SLC4A10 (NBCn3) e SLC4A11 (NaBC1)) de famílias de SLC4 são conhecidos e existe pelo menos um tipo de isoforma. Estes trocadores aniônicos SLC4 possuem funções diferentes; por exemplo, SLC4A1 (AE1), SLC4A2 (AE2), ALC4A3 (AE3) e ALC4A9 (NBCn2 ou AE4) são não dependentes de Na+, trocadores eletricamente neutros para Cl' e HCO3', ALC4A4 (NBCel) e ALC4A5 (NBCe2) são eletrogênicos, ALC4A7 (NBCnl) é um co-trans-portador eletricamente neutro para Na+ e HCO3', ALC4A8 (kNBC3) e ALC4A10 (NBCn3) são trocadores eletricamente neutros dependentes de Na+ para Cl' e HC03' e ALC4A11 (NaBC1) é um co-transportador eletrogêni-co para Na+ e borato. Os trocadores aniônicos SLC4 acima possuem uma ação específica ao sítio. Por exemplo, em um caso de AE1, AE1 presente em células epiteliais polares contribui para a secreção e para a reabsorção transepitelial de ácidos e bases enquanto que ο AE1 presente em eritrócitos de truta promove o transporte de osmolitos. O trocador aniônico SLC4 pode ser exemplificado por SLC4A1 (AE1), SLC4A2 (AE2), SLC4A3 (AE3), S-LC4A4 (NBCel), SLC4A5 (NBCe2), SLC4A7 (NBCnl), SLC4A8 (kNBC3), SLC4A9 (NBCn2), SLC4A10 (NBCn3) e SLC4A11 (NaBC1), dentre os quais AE1 é preferível.

Um trocador aniônico SLC26 é uma proteína de membrana multifuncional que atua em quase todos os sistemas de órgãos. Para o trocador aniônico SLC26, existe um que medeia o antiporte de ânions de sulfato, â-nions de iodeto, ânions de formato, ânions de oxalato, ânions de cloreto, â-nions de hidroxila, ânions de bicarbonato e similares e um canal de íons cloreto ou um motor molecular dependente de ânions. O trocador aniônico S-LC26 é considerado como estando envolvido na homeostase de vários â-nions e 10 tipos (SLC26A1, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A5, S-LC26A6, SLC26A7, SLC26A8, SLC26A9 e SLC26A11) de famílias de troca-dores iônicos foram conhecidas. Por exemplo, SLC26A3, SLC26A4, S-LC26A6 e SLC26A9, que são transportadores para ânions de hidroxila e â-nions de bicarbonato regulam o pH dentro bem como fora de uma membrana de uma maneira similar à de um trocador aniônico SLC4. SLC26A1, S-LC26A2, SLC26A4, SLC26A6, SLC26A9 e SLC26A11 são expressos em um rim. SLC26A1 transporta ânions de sulfato e ânions de oxalato enquanto SLC26A6 medeia o antiporte de vários ânions com a finalidade de captar cloreto de sódio. SLC26A1, SLC26A4 e SLC26A6 e SLC26A5 se tornaram fatores causadores da nefrolitiase, hipertensão e perda de cabelos, respectivamente. SLC26A7 está envolvido na homeostase de ácido-base e no controle da pressão sanguínea de uma maneira similar a SLC26A4. O trocador aniônico SLC26 pode ser exemplificado por SLC26A1, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A4, SLC26A5, SLC26A6, SLC26A7, SLC26A8, SLC26A9 e S-LC26A11.

Uma célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato não é particularmente limitada contanto que a célula tenha um nível de expressão maior de um transportador de bicarbonato comparado com o de uma célula natural correspondente. A célula natural não é particularmente limitada. Uma célula que é utilizada como um hospedeiro na produção de uma proteína recombinante (por exemplo, células CHO) pode ser utilizada.

Um transportador de bicarbonato que será fortemente expresso em uma célula pode ser derivado de qualquer organismo e nenhuma limitação particular é imposta sobre isto. Especificamente, o transportador de bi- carbonato pode ser derivado de organismos incluindo um ser humano, roedores tais como um camundongo, um rato e um hamster, mamíferos tai como um chimpanzé, uma vaca, um cavalo, um cão e um lobo, aves tal como um frango, peixes tais como um peixe-zebra e uma enguia e insetos tal como Drosófila; o transportador de bicarbonato é preferencialmente derivado de um ser humano, roedores ou da mesma espécie que a célula hospedeira. Por exemplo, em um caso em que a célula na qual um transportador de bicarbonato deve ser fortemente expresso é uma célula de ovário de hamster chinês (célula CHO), o transportador de bicarbonato é preferencialmente derivado de um ser humano ou um hamster. A célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato pode ser qualquer célula, por exemplo, célula eucariótica tal como células de animais, plantas e leveduras, célula procariótica tal como E. coli e B. subtilis etc. Preferencialmente, células de animais tais como células CHO e COS são utilizadas, as células CHO são particularmente preferidas. Com a finalidade de preparar um polipeptídeo desejado, as células adequadas para a transferência de um gene que codifica o polipeptídeo desejado tais como células CHO-dhfr- são preferidas.

Como uma célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato, pode ser fornecida uma célula na qual um gene de transportador de bicarbonato (por exemplo, gene do trocador aniônico SLC4, gene do trocador aniônico SLC26 etc.) foi artificialmente transferido. Uma célula na qual um gene de transportador de bicarbonato foi artificialmente transferido pode ser preparada através de métodos conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, tal célula pode ser preparada através da incorporação de um transportador de bicarbonato dentro de um vetor e da transformação do vetor para dentro de uma célula. Além disso, o conceito de "células nas quais um gene de transportador de bicarbonato foi artificialmente transferido" a-brange aqui células nas quais um gene endógeno de transportador de bicarbonato foi ativado através da tecnologia de ativação gênica (ver, por exemplo, a Publicação Internacional WO94/12650) de forma que o transportador de bicarbonato seja fortemente expresso.

Como um trocador aniônico SLC4 gene que será transferido para dentro de uma célula, qualquer um dos DNAs (a) até (e) a seguir que codificam um trocador aniônico SLC4 pode ser utilizado. (a) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2; (b) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2 através de substituição, de deleção, de adição e/ou de inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos e possui ainda atividade do trocador aniônico SLC4; (c) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui 50% ou mais de homologia de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2 e que possui ainda atividade do trocador aniônico SLC4; (d) um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1; (e) um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes e codifica ainda um polipeptídeo que possui atividade do trocador aniônico SLC4. O conceito de uma atividade de trocador aniônico SLC4 abrange uma atividade de captar Cl' e SO42' presentes no meio e excretar HCO3' e borato intracelulares com a finalidade de manter a homeostase de pH intracelular e o volume da célula. A atividade do trocador aniônico SLC4 pode ser medida como a seguir.

As células nas quais o SLC4 é funcionalmente expresso são tratadas com BCECF-AM que é um corante sensível ao pH. Então, a intensidade de fluorescência é comparada entre as células que sofreram perfusão com um meio que contém Cl' e Na* e células que sofreram perfusão com um meio isento de Cl' e Na+, através do que as alterações no pH intracelular (pHi) podem ser medidas (Dahl NK. e outros, J Biol Chem 2003; 278:44949-44958; Fujinaga J. e outros, J Biol Chem 1999; 274:6626-6633).

Na presente invenção, um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é vantajosamente utilizado como um DNA que codifica um trocador aniônico SLC4. Além disso, um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 na qual um ou um grande número (por exemplo, vários) de aminoácido(s) é/são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos e que possui ainda uma atividade de trocador aniônico SLC4 pode ser utilizado. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é uma sequência de aminoácidos do AE1 humano. À parte da informação de sequência do AE1 humano, a informação correspondente em relação a um camundongo, um rato, um chimpanzé, uma vaca, um cavalo, um cão, um lobo, um frango, um peixe-zebra e similares foi registrada como camundongo; GenBank NM_011403, rato; GeneBank NM_012651, chimpanzé; GenBank XM_001151353, vaca; GeneBank NM_181036, cavalo; GeneBank NM 001081788, cão; GenBank AB242566, lobo; GeneBank NM_001048031, frango; GenBank NM 205522 e peixe-zebra; GenBank NM_198338. Assim, ο AE1 que é descrito acima também pode ser utilizado. Outros trocadores aniônicos SLC4 também podem ser utilizados uma vez que a informação de sequência dos mesmos foi registrada em vários bancos de dados. O polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2 através de substituição, de deleção, de adição e/ou de inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos e possui ainda atividade do trocador aniônico SLC4 é funcionalmente equivalente a um trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano, camundongo, rato, chimpanzé, vaca, cavalo, cão, lobo, frango ou peixe-zebra (posteriormente aqui referido algumas vezes como "trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar"). Tal polipeptídeo abrange, por exemplo, mutantes do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar. No Exemplo descrito abaixo, foi utilizado um mutante no qual quatro de 911 aminoácidos foram substituídos (L88R, E693G, V712Ae H834Y).

Como métodos bem conhecidos pelos peritos na arte para a preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico, podem ser fornecidos os métodos de introdução de mutações nos polipeptídeos. Por exemplo, os peritos na arte poderíam preparar polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar através da introdução de forma apropriada de mutações nos aminoácidos do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar através de mutagênese direcionada ao sítio (Hashimoto-Gotoh, T. e outros (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ e Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. e outros (1984) NucleicAcids Res. 12, 9441-9456; Kramer W e Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sei USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766). As mutações nos aminoácidos também podem ocorrer na natureza.

Os exemplos específicos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar incluem, mas não estão limitados a, um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos (por exemplo, SEQ ID NOS: 2) do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar através da deleção de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos; um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar através da adição de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos; e um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar através da substituição de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos, por outros aminoácidos.

Os resíduos de aminoácidos que serão mutados não são particu- iarmente limitados. Preferencialmente, os resíduos de aminoácidos são mu-tados em outros aminoácidos nos quais a natureza da cadeia lateral do ami-noácido inicial é conservada. Os exemplos específicos da natureza da cadeia lateral do aminoácido incluem aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S e T), aminoácidos com uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I e P), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém grupo hidroxila (S, T e Y), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém átomos de enxofre (C e M), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém ácido carboxílico e amida (D, N, E e Q), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém base (R, K e H) e aminoácidos com uma cadeia lateral que contém grupo aromático (H, F, Y e W) (Entre parênteses estão os códigos de uma letra para os aminoácidos).

Foi relatado que um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos original através de modificação (tal como deleção, adição e/ou substituição de um ou mais aminoácidos) mantém a atividade biológica do polipeptídeo original (Mark, D. F. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M. NucleicAcids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. e outros, Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982) 79, 6409-6413).

Como um exemplo do polipeptídeo no qual um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar, um polipeptídeo de fusão que compreende o trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar pode ser fornecido. Tal polipeptídeo de fusão é composto do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar e outro polipeptídeo fundido ao mesmo. Tal polipeptídeo de fusão pode ser preparado através da ligação de um gene que codifica o trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar em quadro com um gene que codifica o outro polipeptídeo, transferindo o DNA resultante para dentro de um vetor de expressão e expressando o DNA em uma célula hospedeira. As técnicas conhecidas pelos peritos na arte podem ser utilizadas. Não há limitação em relação ao polipeptídeo que será fundido ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar.

Os exemplos de polipeptídeos que serão fundidos ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar incluem, mas não estão limitados a, FLAG (Hopp, T. P. e outros, BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis que compreende seis resíduos de histidina (His), 10xHis, hemaglutini-na de influenza (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento do antígeno de SV40T, Ick tag, fragmento de α-tubulina, B-tag, fragmento da proteína C, glu-tationa-S-transferase (GST), hemaglutinina de influenza (HA), região constante de imunoglobulina, β-galactosidase e proteína de ligação à maltose (MBP).

Um gene disponível comercialmente que codifica tal polipeptídeo é fundido ao gene que codifica o trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar. O gene fundido preparado dessa maneira é expresso para preparar um polipeptídeo fundido.

Um método alternativo conhecido pelos peritos na arte para a preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico é um método que utiliza a técnica de hibridização (Sambrook, J e outros, Molecular Cloning 2- ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Os peritos na arte poderiam isolar de forma rotineira um DNA altamente homólogo à sequência de DNA (por exemplo, SEQ ID NOS: 1) do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar com base em tal sequência de DNA ou uma parte da mesma e isolar polipeptídeos funcionalmente equivalentes ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar de tal DNA.

As condições de hibridização para o isolamento de um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar podem ser apropriadamente selecionadas pelos peritos na arte. Por exemplo, podem ser fornecidas condições de hibridização de baixa estringência. As condições de hibridização de baixa estringência são, por exemplo, 42°C, 2 x SSC e 0,1% SDS, preferencialmente 50°C, 2 x SSC e 0,1% SDS. Mais preferencialmente, podem ser fornecidas as condições de alta estringência. Por exemplo, as condições de alta estringência são 65°C, 2 x SSC e 0,1% SDS. Sob estas condições, à medida que a temperatura de hibridização é diminuída, não somente os DNAs com alta homologia são obtidos, mas também os DNAs com apenas baixa homologia. De modo oposto, é esperado que apenas estes DNAs com alta homologia sejam obtidos à medida que a temperatura de hibridização é elevada. Entretanto, não somente a temperatura, mas também um grande número de fatores (tais como concentrações de sais) afetam a estringência da hibridização. Os peritos na arte poderíam selecionar apropriadamente estes fatores para obter uma estringência similar. O polipeptídeo codificado por um DNA isolado através destas técnicas de hibridização pode ter 70% ou mais homologia e geralmente possui alta homologia com o trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar na sequência de aminoácidos. O termo "alta homologia" refere-se a geralmente 97% ou mais homologia, preferencialmente 98% ou mais homologia, mais preferencialmente 99% ou mais homologia. Para a determinação da homologia de polipeptídeos, o algoritmo descrito em Wilbur, W. J. e Lip-man, D. J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 726-730 pode ser seguido. O polipeptídeo pode variar em relação à sequência de aminoácidos, ao peso molecular, ao ponto isoelético, à presença ou à ausência de cadeias de açúcar, à morfologia etc. dependendo da célula ou do hospedeiro que produz o polipeptídeo ou do método de purificação que será descrito posteriormente. Entretanto, contanto que o polipeptídeo resultante possua funções equivalentes às funções do trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar, um DNA que codifica o polipeptídeo pode ser utilizado na presente invenção. Por exemplo, quando o polipeptídeo da presente invenção é expresso em um procarioto (por exemplo, Escherichia coli), um resíduo de metionina é adicionado ao terminal N da sequência de aminoácidos inicial do polipeptídeo. Quando o polipeptídeo é expresso em um eucarioto (por exemplo, uma célula de mamífero), a sequência sinal N-terminal é removida. Estes polipeptídeos podem ser utilizados na presente invenção.

Na presente invenção, como um DNA que codifica um trocador aniônico SLC4, pode ser utilizado um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1. Alternativamente, pode ser utilizado um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes e codifica ainda um polipeptídeo que possui atividade do trocador aniônico SLC4. A SEQ ID NO. 1 mostra a sequência de nucleotídeos do AE1 humano. À parte da informação de sequência do AE1 humano, a informação correspondente em relação a um camundongo, um rato, um chimpanzé, uma vaca, um cavalo, um cão, um lobo, um frango, um peixe-zebra e similares foi registrada como camundongo; GenBank NM_011403, rato; GeneBank NM_012651, chimpanzé; GenBank XM_001151353, vaca; GeneBank NM_181036, cavalo; GeneBank NM_001081788, cão; GenBank AB242566, lobo; GeneBank NM_001048031, frango; GenBank NM_205522 e peixe-zebra; GenBank NM_198338. Assim, Ο AE1 como descrito acima também pode ser utilizado. Outros trocadores aniônicos SLC4 também podem ser utilizados uma vez que a informação de sequência dos mesmos foi registrada em vários bancos de dados. O DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 pode ser utilizado na produção in vivo ou in vitro de um polipeptídeo desejado como descrito acima. Ainda, o DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 pode ser utilizado na criação de uma célula que expressa fortemente um trocador aniônico SLC4. O DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 pode tomar qualquer forma contanto que seja capaz de codificar um trocador aniônico SLC4. Ou seja, o DNA pode ser, por exemplo, um cDNA sintetizado partindo de mRNA, um DNA genômico ou um DNA sintetizado quimicamente. Deve ser observado que, contanto que o DNA seja capaz de codificar um trocador aniônico SLC4, o DNA pode ter qualquer sequência de nucleotídeos baseada na degeneração dos códigos genéticos. O DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 pode ser preparado através de métodos conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, o DNA pode ser obtido através da preparação de uma biblioteca de cDNA partindo de uma célula que expressa um trocador aniônico SLC4 e da realiza- ção da hibridização utilizando uma parte da sequência de DNA de um troca-dor aniônico SLC4 (por exemplo, SEQ ID NO: 1) como uma sonda. A biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, através do método descrito em Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Alternativamente, pode ser utilizada uma biblioteca de cDNA comercial. É também possível preparar o DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 através da preparação de RNA partindo de uma célula que expressa um trocador aniônico SLC4, da síntese de moléculas de oligo DNA com base na sequência de DNA de um trocador aniônico SLC4 (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e da realização da PCR utilizando as moléculas de oligo DNA como iniciadores para amplificar assim um cDNA que codifica um trocador aniônico SLC4.

Ainda, através da determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA resultante, é possível determinar a região de tradução que codifica um trocador aniônico SLC4 e para obter a sequência de aminoácidos do trocador aniônico SLC4. Ainda, através da verificação de uma biblioteca genô-mica utilizando o cDNA resultante como uma sonda, é possível isolar um DNAgenômico.

Especificamente, podem ser utilizados os procedimentos a seguir. Em primeiro lugar, mRNA é isolado de células, tecidos ou similar que expressam um trocador aniônico SLC4. Para o isolamento do mRNA, o RNA total é preparado através de métodos conhecidos, por exemplo, o método de ultracentrifugação em guanidina (Chirgwin, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), o método de AGPC (Chomczynski, P. e Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) ou similar e então o mRNAé purificado partindo do RNA total utilizando o mRNA Purification Kit (Pharmacia) etc. Alternativamente, o mRNA pode ser preparado diretamente utilizando o QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).

Partindo do mRNA resultante, o cDNA é sintetizado utilizando uma transcriptase reversa. Alternativamente, o cDNA pode ser sintetizado utilizando um kit tal como o AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit (SEIKAGAKU CORPORATION). É também possível sintetizar e amplificar o cDNA de acordo com o método de 5’-RACE (Frohman, Μ. A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) utilizando o 5’-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) e a reação em cadeia da polimerase (PCR) com inicia-dores.

Um fragmento de DNA de interesse é preparado partindo do produto de PCR resultante e ligado ao DNA de um vetor para preparar assim um vetor recombinante. O vetor é introduzido em um hospedeiro (por exemplo, E. coli), o que é seguido pela seleção de colônias resultantes para obter assim um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeos do DNA de interesse pode ser confirmada através de um método conhecido tal como o método de término da cadeia de didesoxinucleotídeo.

Ainda, uma sequência de nucleotídeos de maior eficiência de expressão pode ser planejada para o DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 considerando a frequência do uso de códons no hospedeiro que serão utilizados para expressão (Grantham, R. e outros, Nucleic Acids Research (1981) 9, p. 43-74). Ainda, o DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 pode ser modificado utilizando kits disponíveis comercialmente ou métodos conhecidos. Os exemplos de tais modificações incluem, mas não estão limitados a, digestão com enzimas de restrição, inserção de oligonucleotídeos sintéticos ou fragmentos de DNA apropriados, adição de ligantes e inserção de um códon de iniciação (ATG) e/ou um códon de término (TAA, TGA ou TAG). O DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 inclui ainda um DNA que se hibridiza a um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes e codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente a um trocador aniônico SLC4.

As condições estringentes podem ser apropriadamente selecionadas pelos peritos na arte, incluindo, por exemplo, condições de estringên-cia baixa. As condições de estringência baixa referem-se, por exemplo, a 42° C, 2 x SSC e 0,1% de SDS, preferencialmente 50° C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Mais preferencialmente, as condições de alta estringência podem ser selecionadas. As condições de alta estringência referem-se, por exemplo, a 65° C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Sob estas condições, à medida que a temperatura de hibridização é elevada, os DNAs com uma homologia maior podem ser obtidos. O DNA descrito acima que se hibridiza é preferencialmente um DNA derivado da natureza, por exemplo, cDNA ou DNA cromossomal.

Estes DNAs isolados através de técnicas de hibridização possuem geralmente uma alta identidade de sequência de nucleotídeos com um DNA que codifica o trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar. O DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 inclui ainda um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente ao trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar e possui alta identidade com um DNA que codifica o trocador aniônico SLC4 derivado de ser humano ou similar. O termo "alta identidade" refere-se a geralmente 96% ou mais homologi-a, preferencialmente 98% ou mais homologia, mais preferencialmente 99% ou mais identidade. A identidade de sequências de nucleotídeos pode ser determinada pelo algoritmo BLAST (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993). Com base neste algoritmo, foram desenvolvidos programas tais como BLASTN e BLASTX (Altschul e outros J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Quando as sequências de nucleotídeos são analisadas por BLASTN baseado em BLAST, os parâmetros podem ser ajustados como escore = 100 e comprimento de palavra = 12, por exemplo. Os procedimentos específicos para estes métodos de análise são conhecidos (http://www. ncbi.nlm.nih.gov.).

Um gene de transportador de bicarbonato que será incorporado em uma célula pode ser um gene do trocador aniônico SLC26. A informação de uma sequência de nucleotídeos de um gene do trocador aniônico SLC26 e um aminoácido codificado pelo gene foi registrada como GenBank AF331525 (suposto SLC26A9 humano), GenBank NM_052934 (variante 1 do SLC26A9 humano), GenBank NM_134325 (variante 2 do SLC26A9 humano), GenBank NM_134420(SLC26A6 de camundongo), GenBank NM_177243(SLC26A9 de camundongo), GenBank AY240025 (Slc26d9702 de Drosófila), GenBank AY240023 (Slc26d6928 de Drosófila), GenBank ΑΥ240022 (Slc26d6125 de Drosófila), GenBank AY240021 (Slc26d5002 de Drosófila) e GenBank AB084425 (Slc26A6 de enguia). Assim, o gene do tro-cador aniônico SLC26 como descrito acima pode ser utilizado. O DNA que codifica um trocador aniônico SLC4 pode ser inserido dentro de um vetor.

Quando a célula hospedeira que será utilizada for E. coli, é preferível que o vetor tenha uma origem de replicação ("ori") de forma que o vetor seja enormemente amplificado em E. coli (por exemplo, JM109, DH5a, HB101 e XL1-Blue) e preparado em grande quantidade e também genes para a seleção de E. coli transformada (por exemplo, genes de resistência a fármacos que possibilitam a discriminação de transformantes com alguns fármacos tal como ampicilina, tetraciclina, canamicina ou cloranfenicol). Os exemplos de vetores preferíveis incluem, mas não estão limitados a, vetores M13, vetores pUC, pBR322, pBluescript e pCR-Script. Em adição a estes vetores, pGEM-T, pDIRECT, pT7 etc. podem ser enumerados quando o vetor é utilizado com a finalidade de subclonar um cDNA e cortar o cDNA subclo-nado. Quando o vetor é utilizado para a finalidade de produzir o polipeptídeo da presente invenção, um vetor de expressão é especialmente útil. Quando a expressão em E. coli é pretendida, o vetor de expressão possui preferencialmente as características descritas acima de forma que o vetor é amplificado em E. coli e possui ainda preferencialmente um promotor que permite a expressão eficiente em E. coli tal como JM109, DH5a, HB101 ou XL1-Blue, por exemplo, o promotor lacZ (Ward e outros, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), o promotor araB (Better e outros, Science (1988) 240, 1041-1043) ou o promotor T7. Os exemplos específicos de tal vetor incluem, em adição aos listados acima, pGEX-5X-1 (Pharmacia), QIA-express system (Qiagen), pEGFP ou pET (para seu hospedeiro, é preferido o BL21 que expressa a RNA polimerase do T7). O vetor pode compreender sequências sinais para a secreção de polipeptídeos. Quando o polipeptídeo deve ser produzido no periplasma de E. coli, a sequência sinal pelB (Lei, S. P. e outros, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser utilizada como uma sequência sinal para a secreção de polipeptídeos. A introdução do vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada, por exemplo, através do método de cloreto de cálcio ou de eletropo-ração.

Em casos em que uma célula hospedeira sem ser E. coli é utilizada, os vetores úteis para a produção de um polipeptídeo desejado incluem, mas não estão limitados a, vetores de expressão derivados de mamíferos [por exemplo, pcDNA3 da Invitrogen; pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p. 5322); pEF, pCDM8], vetores de expressão derivados de células de insetos (por exemplo, o sistema de expressão de baculovírus Bac-a-Bac da GIBCO BRL; pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, pMH1, pMH2), vetores de expressão derivados de vírus de animais (por exemplo, pHSV, pMV, pAdexLcw), vetores de expressão derivados de retrovírus (por exemplo, pZIpneo), vetores de expressão derivados de leveduras (por exemplo, Pichia Expression Kit da Invitrogen; pNV11; SP-Q01) e vetores de expressão derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608, pKTH50).

Quando a expressão do polipeptídeo em células de animais (tais como células CHO, células COS, células NIH3T3 etc.) for pretendida, o vetor possui preferencialmente um promotor necessário para a expressão do polipeptídeo em tais células. Os exemplos de tal promotor incluem, mas não estão limitados a, promotor de SV40 (Mulligan e outros, Nature (1979) 277, 108), promotor de MMLV-LTR, promotor de EF1a (Mizushima e outros, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) e promotor de CMV. Mais preferencialmente, o vetor possui ainda genes para a seleção de células transformadas (por exemplo, genes de resistência a fármacos que possibilitam a discriminação com fármacos tal como neomicina ou G418). Os exemplos de vetores que possuem tais propriedades incluem, mas não estão limitados a, pMAM, p-DR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13.

Ainda, quando a expressão estável de um gene de interesse e a amplificação intracelular do número de cópias do gene são pretendidas, pode ser utilizado o método a seguir. Sucintamente, nas células CHO que não possuem uma via de síntese de ácidos nucléicos, é introduzido um vetor que possui o gene DHFR que complementa a ausência (por exemplo, pCHOl), seguido pela amplificação com metotrexato (MTX). Por outro lado, quando a tentativa de expressão de um gene de interesse é pretendida, pode ser utilizado um método em que as células COS que carregam um gene que expressa o antígeno SV40T no cromossomo são transformadas com um vetor que possui a origem de replicação de SV40 (por exemplo, pcD). Como a origem de replicação, uma origem de replicação derivada de poliomavírus, a-denovírus ou papilomavírus bovino (BPV) também pode ser utilizada. Ainda, o vetor de expressão pode conter marcadores que podem ser selecionados para a amplificação do número de cópias do gene em um sistema de células hospedeiras. Os exemplos de tais marcadores que podem ser selecionados incluem, mas não estão limitados ao gene da aminoglicosídeo fosfotransfe-rase (APH), ao gene da timidina quinase (TK), ao gene da xantina-guanina fosforribosil transferase de E. coli (Ecogpt) e ao gene da dihidrofolato redu-tase (dhfr). A célula hospedeira para a qual o DNA que codifica um transportador de bicarbonato (que pode ser incorporado em um vetor) é transferido não é particularmente limitada. Por exemplo, E. coli ou várias células de a-nimais podem ser utilizadas. Se um DNA que codifica um polipeptídeo desejado for transferido para uma célula hospedeira para dentro da qual um DNA que codifica um transportador de bicarbonato é transferido, esta célula hospedeira pode expressar o transportador de bicarbonato fortemente, que leva a uma maior produção do polipeptídeo desejado. Na célula hospedeira para dentro da qual um DNA que codifica um transportador de bicarbonato é transferido, um DNA que codifica CSAD ou ALT (que pode ser incorporado dentro de um vetor) pode ser ainda transferido. Através da transferência de um DNA que codifica um polipeptídeo desejado e um DNA que codifica CSAD ou ALT em uma célula hospedeira para dentro da qual um DNA que codifica um transportador de bicarbonato é transferido, o rendimento do polipeptídeo desejado pode ser aumentado. Para a produção do polipeptídeo, há sistemas de produção in vivo e in vitro.Os exemplos de sistemas de produção in vitro incluem sistemas que utilizam eucariotos e sistemas que utili- zam procariotos.

Quando um polipeptídeo desejado é produzido utilizando uma célula na qual um gene de transportador de bicarbonato foi artificialmente transferido, a ordem da transferência de um gene de transportador de bicarbonato e da transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado não são particularmente limitadas. Um gene que codifica um polipeptídeo desejado pode ser transferido após a transferência de um gene de transportador de bicarbonato. Alternativamente, um gene de transportador de bicarbonato pode ser transferido após a transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado. É também possível transferir um gene de transportador de bicarbonato e um gene que codifica um polipeptídeo desejado simultaneamente.

Um gene de transportador de bicarbonato e um gene que codifica um polipeptídeo desejado podem ser transferidos simultaneamente em um único vetor. Alternativamente, podem ser transferidos separadamente utilizando um grande número de vetores.

Preferencialmente, a célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato expressa ainda descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico (CSAD) ou alanina aminotransferase (ALT) fortemente com a finalidade de preparar um polipeptídeo desejado. Através da transferência de um gene que codifica o polipeptídeo desejado em uma célula e o cultivo da célula resultante em um meio, o polipeptídeo desejado pode ser produzido em uma quantidade maior. A CSAD é originalmente conhecida como uma enzima que converte o ácido alanina-3-sulfínico em hipotaurina. Se a descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico for fortemente expressa em uma célula CHO, a célula sintetiza uma quantidade em excesso de β-alanina.

Uma célula que expressa fortemente CSAD não é particularmente limitada contanto que a célula tenha um maior nível de expressão de CSAD comparado ao de uma célula natural correspondente. A célula natural não é particularmente limitada. Uma célula que é utilizada como um hospedeiro na produção de uma proteína recombinante (por exemplo, células CHO) pode ser utilizada.

Como a CSAD que será fortemente expressa em uma célula, pode ser utilizada a CSAD derivada de qualquer organismo. Especificamente, a CSAD derivada de ser humano, de um roedor (tal como camundongo, rato ou hamster), de um peixe bola (tal como peixe bola tigre) ou de uma seringa do mar (tal como Ciona intestnalis) pode ser utilizada. Preferencialmente, a CSAD derivada de ser humano, um roedor ou da mesma espécie que a célula hospedeira pode ser utilizada. Por exemplo, quando a célula que é permitida expressar fortemente CSAD for células de ovário de hamster chinês (células CHO), a CSAD é preferencialmente derivada de ser humano ou hamster.

Como uma célula que expressa fortemente CSAD, pode ser fornecida uma célula na qual um gene de CSAD foi artificialmente transferido. Uma célula na qual um gene de CSAD foi artificialmente transferido pode ser preparada através de métodos conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, tal célula pode ser preparada através da incorporação de um gene de CSAD dentro de um vetor e da transformação do vetor dentro de uma célula. Além disso, o conceito de "células para as quais um gene de CSAD foi artificialmente transferido" abrange aqui células nas quais um gene de CSAD endógeno foi ativado através da tecnologia de ativação gênica (ver, por e-xemplo, a Publicação Internacional WO94/12650) de forma que a CSAD é fortemente expressa.

Como um gene de CSAD que será transferido para dentro de uma célula, qualquer um dos seguintes DNAs (a1) até (e1) pode ser utilizado. (a1) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 4 ou a sequência de aminoácidos da UniProt Knowledqebase (Swiss-Prot e TrEMBL) CSAD (Q64611) de rato, CSAD_(Q9DBE0) de camundongo ou CSAD_(Q9Y600) humana; (b1) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos que é mos- trada na SEQ ID NO: 4 ou a sequência de aminoácidos da UniProt Knowled-qebase (Swiss-Prot e TrEMBü CSAD (Q64611) de rato, CSAD_(Q9DBE0) de camundongo ou CSAD_(Q9Y600) humana através de substituição, de deleção, de adição e/ou de inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos e possui ainda atividade de CSAD; (c1) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui 70% ou mais de homologia de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 4 ou a sequência de aminoácidos da UniProt Knowledaebase (Swiss-Prot e TrEMBü CSAD (Q64611) de rato, CSAD_(Q9DBE0) de camundongo ou CSAD_(Q9Y600) humana e possuindo ainda atividade de CSAD; (d1) um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 3 ou a sequência de nucleotídeos do GenBank CSAD NM 021750 de rato, CSAD NM 144942 de camundongo ou CSAD NM 015989 humana; (e1) um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 3 ou a sequência de nucleotídeos do GenBank CSAD NM 021750 de rato, CSAD NM 144942 de camundongo ou CSAD NM 015989 humana sob condições estringentes e codifica ainda um polipeptídeo que possui atividade de CSAD. O conceito de uma atividade de CSAD abrange uma atividade de catalisar 3-sulfino-L-alanina=hipotaurina+C02 para descarboxilação. É também uma atividade de descarboxilar o ácido L-cistéico. (Número-EC 4.1.1.29). A atividade de CSAD pode ser medida como a seguir.

Como ensinado por Davis K. e outros, J Biomed Sei 2001;8:359-364, o 14C02 produzido partindo do ácido L-[1-14C]cistéico por uma atividade de descarboxilase de CSAD é quantificado.

Na presente invenção, um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou a sequência de aminoácidos da UniProt Knowledaebase (Swiss-Prot e TrEMBü CSAD (Q64611) de rato, CSAD_(Q9DBE0) de camundongo ou CSAD_(Q9Y600) humana pode ser utilizado como um DNA que codifica CSAD. Além disso, um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de amino-ácidos da SEQ ID NO: 4 ou a sequência de aminoácidos da UniProt Kno-wledaebase (Swiss-Prot e TrEMBÜ CSAD (Q64611) de rato, CSAD_(Q9DBE0) de camundongo ou CSAD_(Q9Y600) humana em que um ou um grande número de aminoácido(s) é/são substituído(s), deletado(s), adicionado(s) e/ou inserido(s) e possuindo ainda atividade de CSAD pode ser utilizado. O polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou a sequência de aminoácidos da UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot e TrEMBÜ CSAD (Q64611) de rato, CSADJQ9DBE0) de camundongo ou CSAD_(Q9Y600) humana em que um ou um grande número de aminoácido(s) é/são substituído(s), deletado(s), adicionado(s) e/ou inseri-do(s) e possuindo ainda atividade de CSAD é funcionalmente equivalente à CSAD derivada de hamster, rato, camundongo ou ser humano (posteriormente aqui referida algumas vezes aqui como "CSAD derivada de hamster ou similar). Tal polipeptídeo abrange, por exemplo, mutantes de CSAD derivada de hamster ou similar.

Como métodos bem conhecidos pelos peritos na arte para a preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico, podem ser fornecidos os métodos de introdução de mutações nos polipeptídeos. Por exemplo, os peritos na arte poderíam preparar polipeptídeos funcionalmente equivalentes à CSAD derivada de hamster ou similar através da introdução de forma apropriada de mutações nos aminoácidos da CSAD derivada de hamster ou similar através de mutagênese direcionada ao sítio (Hashimoto-Gotoh, T. e outros (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ e Smith, M.(1983) Metods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. e outros (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W e Fritz HJ (1987) Metods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sei USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Metods Enzymol. 85, 2763-2766). As mutações nos aminoácidos também podem ocorrer na natureza.

Os exemplos específicos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes à CSAD derivada de hamster ou similar incluem, mas não estão limitados a, um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da CSAD derivada de hamster ou similar (por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou a sequência de aminoácidos da UniProt Knowledaebase (Swiss-Prot e TrEMBL) CSAD (Q64611) de rato, CSAD_(Q9DBE0) de camundongo ou CSAD_(Q9Y600) humana) através da deleção de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos; um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da CSAD derivada de hamster ou similar através da adição de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos; e um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da CSAD derivada de hamster ou similar através da substituição de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos, por outros aminoácidos.

Os resíduos de aminoácidos que serão mutados não são particularmente limitados. Preferencialmente, os resíduos de aminoácidos são mutados em outros aminoácidos nos quais a natureza da cadeia lateral do ami-noácido inicial é conservada. Os exemplos específicos da natureza da cadeia lateral do aminoácido incluem aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S e T), aminoácidos com uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I e P), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém grupo hidroxila (S, T e Y), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém átomos de enxofre (C e M), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém ácido carboxílico e amida (D, N, E e Q), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém base (R, K e H) e aminoácidos com uma cadeia lateral que contém grupo aromático (H, F, Y e W) (Entre parênteses estão os códigos de uma letra para os aminoácidos).

Foi relatado que um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos original através de modificação (tal como deleção, adição e/ou substituição de um ou mais ami-noácidos) mantém a atividade biológica do polipeptídeo original(Mark, D. F. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smi-th, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. e outros, Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982) 79, 6409-6413).

Como um exemplo do polipeptídeo no qual um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à CSAD derivada de hamster ou similar, pode ser fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende CSAD derivada de hamster ou similar. Tal polipeptídeo de fusão é composto de CSAD derivada de hamster ou similar e outro polipeptídeo fundido ao mesmo. Tal polipeptídeo de fusão pode ser preparado através da ligação de um gene que codifica CSAD derivada de hamster ou similar em quadro com um gene que codifica o outro polipeptídeo, transferindo o DNA resultante para dentro de um vetor de expressão e expressando o DNA em uma célula hospedeira. As técnicas conhecidas pelos peritos na arte podem ser utilizadas. Não há limitação sobre o polipeptídeo que será fundido à CSAD derivada de hamster ou similar.

Os exemplos de polipeptídeos que serão fundidos à CSAD derivada de hamster ou similar incluem, mas não estão limitados a, Fl_AG (Hopp, T. R e outros, BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis que compreende seis resíduos de histidina (His), 10xHis, hemaglutinina de influenza (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento do antígeno de SV40T, Ick tag, fragmento de α-tubulina, B-tag, fragmento da proteína C, glutationa-S-transferase (GST), hemaglutinina de influenza (HA), região constante de imunoglobulina, β-galactosidase e proteína de ligação à maltose (MBP).

Um gene disponível comercialmente que codifica tal polipeptídeo é fundido ao gene que codifica CSAD derivada de hamster ou similar. O gene fundido preparado dessa maneira é expresso para preparar um polipeptídeo fundido.

Um método alternativo conhecido pelos peritos na arte para a preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico é um método que utiliza a técnica de hibridização (Sambrook, J e outros, Molecular Cloning 2- ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Os peritos na arte poderíam isolar de forma rotineira um DNA altamente homólogo à sequência de DNA da CSAD derivada de hamster ou similar (por exemplo, a sequência de DNA da SEQ ID NO: 3 ou a sequência de DNA do GenBank CSAD NM 021750 de rato, CSAD NM 144942 de ca-mundongo ou CSAD NM 015989 humana), com base em tal sequência de DNA ou uma parte da mesma e poderíam isolar polipeptídeos funcionalmente equivalentes à CSAD derivada de hamster ou similar de tal DNA.

As condições de hibridização para o isolamento de um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente à CSAD derivada de hamster ou similar podem ser apropriadamente selecionadas pelos peritos na arte. Por exemplo, podem ser fornecidas condições de hibridização de baixa estringência. As condições de hibridização de baixa estringência são, por exemplo, 42°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS, preferencialmente 50°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Mais preferencialmente, podem ser fornecidas as condições de alta estringência. Por exemplo, as condições de alta estringência são 65°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Sob estas condições, à medida que a temperatura de hibridização é diminuída, não somente os DNAs com alta homologia são obtidos, mas também os DNAs com apenas baixa homologia. De modo oposto, é esperado que apenas estes DNAs com alta homologia sejam obtidos à medida que a temperatura de hibridização é elevada. Entretanto, não somente a temperatura, mas também um grande número de fatores (tais como concentrações de sais) afeta a estringência da hibridização. Os peritos na arte poderíam selecionar apropriadamente estes fatores para obter uma estringência similar. O polipeptídeo codificado por um DNA isolado através destas técnicas de hibridização pode ter 70% ou mais homologia e geralmente possui alta homologia com a CSAD derivada de hamster ou similar na sequência de aminoácidos. O termo "alta homologia" refere-se a geralmente 97% ou mais homologia, preferencialmente 98% ou mais homologia, mais prefe- rencialmente 99% ou mais homologia. Para a determinação da homologia de polipeptídeos, o algoritmo descrito em Wilbur, W. J. e Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 726-730 pode ser seguido. O polipeptídeo pode variar em relação à sequência de aminoáci-dos, ao peso molecular, ao ponto isoelético, à presença ou à ausência de cadeias de açúcar, à morfologia etc. dependendo da célula ou do hospedeiro que produz o polipeptídeo ou do método de purificação que será descrito posteriormente. Entretanto, contanto que o polipeptídeo resultante possua funções equivalentes às funções da CSAD derivada de hamster ou similar, um DNA que codifica o polipeptídeo pode ser utilizado na presente invenção. Por exemplo, quando o polipeptídeo é expresso em um procarioto (por e-xemplo, Escheríchia coli), um resíduo de metionina é adicionado ao terminal N da sequência de aminoácidos inicial do polipeptídeo. Quando o polipeptídeo é expresso em um eucarioto (por exemplo, uma célula de mamífero), a sequência sinal N-terminal é removida. Um DNA que codifica tal polipeptídeo pode ser utilizado na presente invenção.

Na presente invenção, um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 ou as sequências de nucleotídeos do Gen-Bank CSAD NM 021750 de rato, CSAD NM_144942 de camundongo ou CSAD NM_015989 humana pode ser utilizado como um DNA que codifica a CSAD. Além disso, um DNA que codifica um polipeptídeo que se hibridiza com um DNA complementar ao DNA que possui uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 ou as sequências de nucleotídeos do GenBank CSAD NM_021750 de rato, CSAD NM_144942 de camundongo ou CSAD NM_015989 humana sob uma condição estringente e possuindo ainda atividade da CSAD pode ser utilizado. O DNA que codifica a CSAD é utilizado para preparar uma célula que expressa fortemente CSAD e posteriormente utilizado na produção in vivo ou in vitro de um polipeptídeo desejado como descrito acima. O DNA que codifica CSAD pode tomar qualquer forma contanto que seja capaz de codificar CSAD. Ou seja, o DNA pode ser, por exemplo, um cDNA sintetizado partindo de mRNA, um DNA genômico ou um DNA sintetizado quimicamen- te. Deve ser observado que, contanto que o DNA seja capaz de codificar CSAD, o DNA pode ter qualquer sequência de nucleotídeos baseada na de-generação dos códigos genéticos. O DNA que codifica CSAD pode ser preparado através de métodos conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, o DNA pode ser obtido através da preparação de uma biblioteca de cDNA partindo de uma célula que expressa CSAD e da realização da hibridização utilizando uma parte da sequência de DNA da CSAD (por exemplo, a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 ou a sequência de nucleotídeos do GenBank CSAD NM 021750 de rato, CSAD NM 144942 de camundongo ou CSAD NM 015989 humana) como uma sonda. A biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, através do método descrito em Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Alternativamente, pode ser utilizada uma biblioteca de cDNA comercial. É também possível preparar o DNA que codifica CSAD através da preparação de RNA partindo de uma célula que expressa CSAD, da síntese de moléculas de oligo DNA com base na sequência de DNA da CSAD (por exemplo, a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3 ou a sequência de nucleotídeos do GenBank CSAD NM 021750 de rato, CSAD NM 144942 de camundongo ou CSAD NM 015989 humana) e da realização da PCR utilizando as moléculas de oligo DNA como iniciadores para amplificar assim um cDNA que codifica CSAD.

Ainda, através da determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA resultante, é possível determinar a região de tradução que codifica o polipeptídeo e obter a sequência de aminoácidos da CSAD. Ainda, através da verificação de uma biblioteca genômica utilizando o cDNA resultante como uma sonda, é possível isolar um DNA genômico.

Especificamente, podem ser utilizados os procedimentos a seguir. Em primeiro lugar, o mRNA é isolado de células, tecidos ou similar expressando CSAD. Para o isolamento do mRNA, o RNA total é preparado a-través de métodos conhecidos, por exemplo, o método de ultracentrifugação em guanidina (Chirgwin, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), o método de AGPC (Chomczynski, P. e Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) ou similar e então o mRNA é purificado partindo do RNA total utilizando o mRNA Purification Kit (Pharmacia) etc. Alternativamente, o mRNA pode ser preparado diretamente utilizando o QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia), Partindo do mRNA resultante, o cDNA é sintetizado utilizando uma transcriptase reversa. Alternativamente, o cDNA pode ser sintetizado utilizando um kit tal como o AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit (SEIKAGAKU CORPORATION). É também possível sintetizar e amplificar o cDNA de acordo com o método de 5-RACE (Frohman, Μ. A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) utilizando o 5’-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) e a reação em cadeia da polimerase (PCR) com inicia-dores.

Um fragmento de DNA de interesse é preparado partindo do produto de PCR resultante e ligado ao DNA de um vetor para preparar assim um vetor recombinante. O vetor é introduzido em um hospedeiro (por exemplo, E. coli), o que é seguido pela seleção de colônias resultantes para obter assim um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeos do DNA de interesse pode ser confirmada através de um método conhecido tal como o método de término da cadeia de didesoxinucleotídeo.

Ainda, uma sequência de nucleotídeos de uma eficiência de expressão maior pode ser planejada para o DNA que codifica CSAD considerando a frequência do uso de códons no hospedeiro que serão utilizados para expressão (Grantham, R. e outros, Nucleic Acids Research (1981) 9, p. 43-74). Ainda, o DNA que codifica CSAD pode ser modificado utilizando kits disponíveis comercialmente ou métodos conhecidos. Os exemplos de tais modificações incluem, mas não estão limitados a, digestão com enzimas de restrição, inserção de oligonucleotídeos sintéticos ou fragmentos de DNA apropriados, adição de ligantes e inserção de um códon de iniciação (ATG) e/ou um códon de término (TAA, TGAou TAG). O DNA que codifica CSAD inclui ainda um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui uma sequência de nucleotí-deos que é mostrada na SEQ ID NO: 3 ou a sequência de nucleotídeos do GenBank CSAD NM 021750 de rato, CSAD NM 144942 de camundongo ou CSAD NM 015989 humana sob condições estringentes e codifica um poli-peptídeo funcionalmente equivalente à CSAD.

As condições estringentes podem ser apropriadamente selecionadas pelos peritos na arte, incluindo, por exemplo, condições de estringên-cia baixa. As condições de estringência baixa referem-se, por exemplo, a 42° C, 2 x SSC e 0,1% de SDS, preferencialmente 50° C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Mais preferencialmente, as condições de alta estringência podem ser selecionadas. As condições de alta estringência referem-se, por exemplo, a 65° C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Sob estas condições, à medida que a temperatura de hibridização é elevada, os DNAs com uma homologia maior podem ser obtidos. O DNA descrito acima que se hibridiza é preferencialmente um DNA derivado da natureza, por exemplo, cDNAou DNA cromossomal.

Estes DNAs isolados através de técnicas de hibridização possuem geralmente uma alta identidade de sequência de nucleotídeos com um DNA que codifica CSAD derivada de hamster ou similar. O DNA que codifica CSAD inclui ainda um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente e-quivalente à CSAD derivada de hamster ou similar e possui alta identidade com um DNA que codifica CSAD derivada de hamster ou similar. O termo "alta identidade" refere-se a geralmente 96% ou mais homologia, preferencialmente 98% ou mais homologia, mais preferencialmente 99% ou mais identidade. A identidade de sequências de nucleotídeos pode ser determinada pelo algoritmo BLAST (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993). Com base neste algoritmo, foram desenvolvidos programas tais como BLASTN e BLASTX (Altschul e outros J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Quando as sequências de nucleotídeos são analisadas por BLASTN baseado em BLAST, os parâmetros podem ser ajustados como escore = 100 e comprimento de palavra = 12, por exemplo. Os procedimentos específicos para estes métodos de análise são conhecidos (http://www.ncbi.nlm.nih. gov.). ALT é fundamentalmente conhecida como uma enzima que produz glutamato através da transferência de um grupo amino da alanina para 2-oxoglutarato. Se a reação de biossíntese de piruvato e glutamato partindo da alanina puder ser promovida através de expressão forte de ALT em células hospedeiras tais como células CHO, os produtos poderíam ser utilizados no metabolismo durante um ciclo de TCA e da produção de glicose por gli-cogênese e assim poderíam melhorar o comportamento de cultura das células, levando a uma produção de alto rendimento do polipeptídeo desejado.

As células que expressam fortemente ALT não são particularmente limitadas contanto que sejam capazes de expressar ALT em níveis maiores que as células naturais. As células naturais incluem, mas não são particularmente limitadas a, células que são utilizadas como hospedeiros na produção de proteínas recombinantes e podem ser exemplificadas por células CHO.

Como uma célula que expressa fortemente ALT, pode ser fornecida uma célula dentro da qual um gene de ALT foi artificialmente transferido. Uma célula dentro da qual um gene de ALT foi artificialmente transferido pode ser preparada através de métodos conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, tal célula pode ser preparada através da incorporação de um gene de ALT dentro de um vetor e da transformação do vetor para dentro de uma célula. Além disso, o conceito de "células dentro das quais um gene de ALT foi artificialmente transferido" abrange aqui células nas quais um gene de ALT endógeno foi ativado através da tecnologia de ativação gênica (ver, por exemplo, a Publicação Internacional WO94/12650) de forma que ALT é fortemente expressa.

Como a ALT que será fortemente expressa em uma célula, a ALT derivada de qualquer organismo pode ser utilizada. Especificamente, as ALTs derivadas de ser humano, camundongo, rato, cão, sapo com garras africano, mosca de frutas, nematóide, arroz japonês, Cyanidioschyzon mero-lae, Saccharomyces cerevisiae, Ashbya gossypii, Candida albicans, Schizo-saccharomyces pombe, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Asper-gillus oryzae, Cryptococcus neoformans, Dictyostelium discoideum, Trypano- soma brucei, Leishmania major, Entamoeba histolytica e Trypanosoma cruzi são conhecidas e podem ser utilizadas. Preferencialmente, a ALT derivada de ser humano, de um roedor ou da mesma espécie que a célula hospedeira pode ser utilizada. Por exemplo, quando a célula que é permitida expressar fortemente ALT for células de ovário de hamster chinês (células CHO), ALT é preferencialmente derivada de ser humano ou hamster. Para a ALT em seres humanos, camundongos e levedura, existem variações (ALT1 e ALT2). A ALT2 possui 80% ou maior homologia com ALT1 no nível de aminoácidos. A ALT 1 foi expressa de forma forçada nos Exemplos e nos Exemplos de Referência descritos posteriormente.

Como um gene de ALT que será fortemente expresso em uma célula, qualquer um dos seguintes DNAs (a2) até (e2) que codificam ALT podem ser utilizados. (a2) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de KEGG/ENZYME: 2.6.12!Homo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Homo sapiens (humana): 84706 KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2/Mus musculus (camundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IRattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ICanis familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6A.2IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Drosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ICaenorhabditis elegans (nematóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Cyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1 2/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): A-GOS AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ICandida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Asperg///us nidulans. AN1923.2, KEGG/ENZYME. 2.6 A.21 Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME. 2.6.1.2lAspergilIus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/ Cryp-tococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/ Dictyos-telium discoideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma bru-cei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Leishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2lEntamoeba histolytica: 233.t00009, KEGG/ENZYME: 2.6.12lEntamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypa-nosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Trypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140; (b2) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.12IHomo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Mus mus-culus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6A.21 Mus musculus (ca-mundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.12IRattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.12 ICanis familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6A ,2/Xenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6A.2fDrosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Caenorhabditis elegans (ne-matóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/EM-ZYME. 2.6.1.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ICandida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IAspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.QA.2IAspergillus fumigatus: AFUA 6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6A.21 Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME. 2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Dictyostelium discoideum: DDB 0232139, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ITrypanosoma brucei: Tb927. 1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Leishmania major LmjF12.0630, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.1.2 lEntamoeba histolytica: 233.Í00009, KEGG/ENZYME. 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ITrypano-soma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2/Trypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Trypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ITrypanosoma cruzi: 510889.140 através de substituição, de deleção, de adição e/ou de inserção de um ou mais (por exemplo, vários) resíduos de aminoácidos e possui ainda atividade de ALT; (c2) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui 70% ou mais de homologia de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2//-/omo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (camundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Rattus norvegi-cus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Can/s familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6.12IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.12IDrosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.12ICaenorhabditis elegans (ne-matóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.12tOryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.12lOryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME. 2.6A.2ICyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6 A .2! Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ENZYME: 2.6.12lAshbya gossypii (Eremothecium gossypii): A-GOS AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Candida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus fumigatus: AFUA 6G07770, KEGG/ENZYME. 2.6.1.2/As-pergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Dictyostelium dis-coideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ILeishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Entamoeba histolytica: 233Λ00009, KEGG/EM-ZYME: 2.61.2 /Entamoeba histolytica: 24Λ00016, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypano-soma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2ITrypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ITrypanosoma cruzi: 510889.140 e que possui ainda atividade de ALT; (d2) um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6A 2/Homo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6A.2IMus mus-culus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (ca-. mundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Rattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Can/s familiarís (cão): 609510, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6A.2/Xenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Drosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Caenorhabditis elegans (nematói-de): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/O/yza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/O/yza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2/Cyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6A .2!Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Candida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ISchizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6A.21Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6A .21 Dictyosteíium discoideum: DDB 0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Leishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Entamoeba histolytica: 233.Í00009, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Enta-moeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2/Trypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140; (e2) um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Homo sapi-ens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2IMus musculus (camundon-go): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6A.2!Mus musculus (camundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6A.2fRattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Can/s familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6A.2IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Dro-sophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Caenorhabditis elegans (nematóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.1,2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Sac-charomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ENZYME: 2.6A.2IAshbya gossypii (Eremothe-cium gossypii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2JCandida albi-cans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6A.2IAspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ICryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Dictyostelium discoideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/ Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Leishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 lEntamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Trypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140 sob condições estringentes e codifica ainda um polipeptídeo que possui atividade de ALT. O conceito de uma atividade de ALT abrange uma atividade en-zimática de catalisar a transferência de um grupo amino entre um aminoáci-do e um α-ceto ácido. A atividade de ALT pode ser medida como a seguir.

Um nível de atividade de ALT é determinado por um reagente para analisador automático para medir a alanina aminotransferase (Runpia liquid S-ALT, número de aprovação 20900AMZ00597000) e o método ensi-mado por Rajamohan F. e outros, Protein Expression and Purification (2006) 48, 81-89.

Na presente invenção, como um gene que codifica ALT, um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.12IMus mus-culus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (ca-mundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Rattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Can/s familiaris (cão): 609510, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.1.2/Xenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Drosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.12ICaenorhabditis elegans (nematói-de): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/EM-ZYME: 2.6.1.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.12ICandida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME. 2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IAspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6.12 ICryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME. 2.6.1.2/Dictyostelium discoideum: DDB 0232139, KEGG/ENZYME: 2.61.2 ITrypanosoma brucei: Tb927. 1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2/Leishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2 6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.Í00009, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Entamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ITrypano-soma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ITrypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2ITrypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140 pode ser utilizado. Alternativamente, um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos descrita a-cima através de substituição, de deleção, de adição e/ou de inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos e possui ainda atividade de ALT pode ser utilizado. O polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapi-ens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.12IHomo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Mus musculus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.12IMus musculus (camundongo): 108682, KEGG/EM-ZYME: 2.6.12IRattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Canis familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6.12IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IDrosophila mela-nogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Cae-norhabditis elegans (nematóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.12lOryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Cyanidi-oschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ISaccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossy-pii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Candida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.1,2/Aspergillus fumigatus: AFUA 6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Cryptococ- cus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.12IDictyostelium discoideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6Λ.2ILeishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 233.t00009, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 24.Í00016, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.QA.2/Trypa-nosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ITrypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140 através de substituição, de deleção, de adição e/ou de inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos e possui ainda atividade de ALT é funcionalmente equivalente à ALT derivada de ser humano, camundongo, rato, cão, sapo com garras africano, mosca de frutas, nematóide, arroz japonês, Cya-nidioschyzon merolae, Saccharomyces cerevisiae, Ashbya gossypii, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Cryptococcus neoformans, Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, Leishmania major, Entamoeba histolytica ou Trypanosoma cruzi (posteriormente aqui referida algumas vezes aqui como "ALT derivada de ser humano ou similar"). Tal polipeptídeo abrange, por e-xemplo, mutantes de ALT derivada de ser humano ou similar. No Exemplo e nos Exemplos de Referência descritos abaixo, foi utilizado um mutante em que quatro de 496 aminoácidos foram substituídos (R53S, Q72R, F286S e M332K).

Como métodos bem conhecidos pelos peritos na arte para a preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico, podem ser fornecidos os métodos de introdução de mutações nos polipeptídeos. Por exemplo, os peritos na arte poderíam preparar polipeptídeos funcionalmente equivalentes à ALT derivada de ser humano ou similar através da introdução de forma apropriada de mutações nos aminoácidos da ALT derivada de ser humano ou similar através de mutagênese direcionada ao sítio (Hashimoto-Gotoh, T. e outros (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ e Smith, M.(1983) Metods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. e outros (1984) NucleicAcids Res. 12, 9441-9456; Kramer W e Fritz HJ (1987) Metods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sei USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Metods Enzymol. 85, 2763-2766). As mutações nos aminoácidos também podem ocorrer na natureza.

Os exemplos específicos de polipeptídeos funcionalmente equivalentes à ALT derivada de ser humano ou similar incluem, mas não estão limitados a, um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos (por exemplo, a sequência de aminoácidos de KEGG/ENZYME: 2.6.12 IHomo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Mus musculus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.12IMus musculus (camundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.12IRattus norvegi-cus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.12ICanis familiarís (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6.12IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.121Drosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Caenorhabditis elegans (ne-matóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.12lOryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.12ICyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): A-GOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Cand/da albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.12lAspergilIus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.12lAspergilIus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6.12ICryptococ-cus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.12IDictyostelium discoideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Leishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 233Λ00009, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Entamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Try-panosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ITrypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140) da ALT derivada de ser humano ou similar através da deleção de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos; um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da ALT derivada de ser humano ou similar através da adição de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos; e um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da ALT derivada de ser humano ou similar através da substituição de um ou mais aminoácidos, preferencialmente 1-30 aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 aminoácidos, por outros aminoácidos.

Os resíduos de aminoácidos que serão mutados não são particularmente limitados. Preferencialmente, os resíduos de aminoácidos são mutados em outros aminoácidos nos quais a natureza da cadeia lateral do ami-noácido inicial é conservada. Os exemplos específicos da natureza da cadeia lateral do aminoácido incluem aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S e T), aminoácidos com uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I e P), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém grupo hidroxila (S, T e Y), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém átomos de enxofre (C e M), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém ácido carboxílico e amida (D, N, E e Q), aminoácidos com uma cadeia lateral que contém base (R, K e H) e aminoácidos com uma cadeia lateral que contém grupo aromático (H, F, Y e W) (Entre parênteses estão os códigos de uma letra para os aminoácidos).

Foi relatado que um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos original através de modificação (tal como deleção, adição e/ou substituição de um ou mais aminoácidos) mantém a atividade biológica do polipeptídeo original(Mark, D. F. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smi-th, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. e outros, Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. e outros, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA (1982) 79, 6409-6413).

Como um exemplo do polipeptídeo no qual um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à ALT derivada de ser humano ou similar, um polipeptídeo de fusão que compreende a ALT derivada de ser humano ou similar pode ser fornecido. Tal polipeptídeo de fusão é composto da ALT derivada de ser humano ou similar e outro polipeptídeo fundido ao mesmo. Tal polipeptídeo de fusão pode ser preparado através da ligação de um gene que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar em quadro com um gene que codifica o outro polipeptídeo, transferindo o DNA resultante para dentro de um vetor de expressão e expressando o DNA em uma célula hospedeira. As técnicas conhecidas pelos peritos na arte podem ser utilizadas. Não há limitação sobre o polipeptídeo que será fundido à ALT derivada de ser humano ou similar.

Os exemplos de polipeptídeos que serão fundidos à ALT derivada de ser humano ou similar incluem, mas não estão limitados a, FLAG (Hopp, T. P. e outros, BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis que compreende seis resíduos de histidina (His), 10xHis, hemaglutinina de influenza (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento do antígeno de SV40T, Ick tag, fragmento de α-tubulina, B-tag, fragmento da proteína C, glutationa-S-transferase (GST), hemaglutinina de influenza (HA), região constante de i-munoglobulina, β-galactosidase e proteína de ligação à maltose (MBP).

Um gene disponível comercialmente que codifica tal polipeptídeo é fundido ao gene que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar. O gene fundido preparado dessa maneira é expresso para preparar um polipeptídeo fundido.

Um método alternativo conhecido pelos peritos na arte para a preparação de polipeptídeos funcionalmente equivalentes a um polipeptídeo específico é um método que utiliza a técnica de hibridização (Sambrook, J e outros, Molecular Cloning 2- ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Os peritos na arte poderíam isolar de forma rotineira um DNA altamente homólogo à sequência de DNA (por exemplo, a sequência de DNA de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Mus mus-culus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (ca-mundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.12IRattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Can/s familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Xenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IDrosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.12ICaenorhabditis elegans (ne-matóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.12lOryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ICyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6 A.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): A- GOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6A.2fCandida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ICrypto-coccus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Dictyoste-lium discoideum: DDB 0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Leishmania major.

LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 233.t00009, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Try-panosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6A .2/Trypanosoma cruzi: 510889.140) da ALT derivada de ser humano ou similar com base em tal sequência de DNA ou uma parte da mesma e isolar polipeptídeos funcionalmente equivalentes à ALT derivada de ser humano ou similar de tal DNA.

As condições de hibridização para o isolamento de um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente à ALT derivada de ser humano ou similar podem ser apropriadamente selecionadas pelos peritos na arte. Por exemplo, podem ser fornecidas condições de hibridização de baixa estringência. As condições de hibridização de baixa estringência são, por exemplo, 42°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS, preferencialmente 50°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Mais preferencialmente, podem ser fornecidas as condições de alta estringência. Por exemplo, as condições de alta estringência são 65°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Sob estas condições, à medida que a temperatura de hibridização é diminuída, não somente os DNAs com alta homologia são obtidos, mas também os DNAs com apenas baixa homologia. De modo oposto, é esperado que apenas estes DNAs com alta homologia sejam obtidos à medida que a temperatura de hibridização é elevada. Entretanto, não somente a temperatura, mas também um grande número de fatores (tais como concentrações de sais) afeta a estringência da hibridização. Os peritos na arte poderíam selecionar apropriadamente estes fatores para obter uma estringência similar. O polipeptídeo codificado por um DNA isolado através destas técnicas de hibridização pode ter 70% ou mais homologia e geralmente possui alta homologia com a ALT derivada de ser humano ou similar na sequência de aminoácidos. O termo "alta homologia" refere-se a geralmente 97% ou mais homologia, preferencialmente 98% ou mais homologia, mais preferencialmente 99% ou mais homologia. Para a determinação da homologia de polipeptídeos, o algoritmo descrito em Wilbur, W. J. e Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 726-730 pode ser seguido. O polipeptídeo pode variar em relação à sequência de aminoácidos, ao peso molecular, ao ponto isoelético, à presença ou à ausência de cadeias de açúcar, à morfologia etc. dependendo da célula ou do hospedeiro que produz o polipeptídeo ou do método de purificação que será descrito posteriormente. Entretanto, contanto que o polipeptídeo resultante possua funções equivalentes às funções da ALT derivada de ser humano ou similar, um DNA que codifica o polipeptídeo pode ser utilizado na presente invenção. Por exemplo, quando o polipeptídeo da presente invenção é expresso em um procarioto (por exemplo, Escherichia coli), um resíduo de metionina é adicionado ao terminal N da sequência de aminoácidos inicial do polipeptí-deo. Quando o polipeptídeo é expresso em um eucarioto (por exemplo, uma célula de mamífero), a sequência sinal N-terminal é removida. Um DNA que codifica tal polipeptídeo pode ser utilizado na presente invenção.

Na presente invenção, como um DNA que codifica ALT, um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IHomo sapi-ens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (camundon-go): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (camundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Rattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Canis familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Droso-phila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2/Caenorhabditis elegans (nematóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2lOryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Cyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Sacc/7a-romyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ENZYME: 2.6A.21 Ashbya gossypii (.Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Can-dida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2IAspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ICryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Dictyostelium discoideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Le/'-shmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolyti-ca: 233.Í00009, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6A .2/Trypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.1,2/Trypa-nosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140 pode ser utilizado. Alternativamente, um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui uma sequência de nucleotí-deos descrita acima sob condições estringentes e codifica ainda um polipep-tídeo que possui atividade de ALT, pode ser utilizada. O DNA que codifica ALT pode ser utilizado na produção in vivo ou in vitro de um polipeptídeo desejado como descrito acima. Ainda, o DNA que codifica ALT pode ser utilizado na criação de uma célula que expressa fortemente ALT. O DNA que codifica ALT pode tomar qualquer forma contanto que seja capaz de codificar ALT. Ou seja, o DNA pode ser, por exemplo, um cDNA sintetizado partindo de mRNA, um DNA genômico ou um DNA sintetizado quimicamente. Deve ser observado que, contanto que o DNA seja capaz de codificar ALT, o DNA pode ter qualquer sequência de nucleo-tídeos baseada na degeneração dos códigos genéticos. O DNA que codifica ALT pode ser preparado através de métodos conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, o DNA pode ser obtido através da preparação de uma biblioteca de cDNA partindo de uma célula que expressa ALT e da realização da hibridização utilizando uma parte da sequência de DNA de ALT (por exemplo, a sequência de DNA de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mtvs mus-culus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (ca-mundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Rattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ICanis familiaris (cão): 609510, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6A.2IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.61.2IDrosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ICaenorhabditis elegans (nematói-de): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6A.2lCyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6A.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.61.2/Candida albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 ISchizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6.12tCryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6A.2IDictyostelium discoideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.12 ITrypanosoma brucei: Tb927. 1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6 A.2/Leishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.12 /Entamoeba histolytica: 233.t00009, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 24.t00016, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Trypa-nosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Trypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypanosoma cruzi: 510889.140) como uma sonda. A biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, através do método descrito em Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Alternativamente, pode ser utilizada uma biblioteca de cDNA comercial. É também possível preparar o DNA que codifica ALT através da preparação de RNA partindo de uma célula que expressa ALT, da síntese de moléculas de oligo DNA com base na sequência de DNA de ALT (por exemplo, a sequência de DNA de KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Homo sapi-ens (humana). 2875, KEGG/ENZYME: 2.6.12IHomo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.12IMus musculus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.12IMus musculus (camundongo): 108682, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.12IRattus norvegicus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Canis familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Xenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Drosophila mela-nogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Cae-norhabditis elegans (nematóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Cyanidi-oschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Ashbya gossypii (Eremothecium gossy-pii): AGOSAGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Cand/da albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus nidulans: AN1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.1.21 Aspergillus oryzae: A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.61.2ICryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.12ÍDictyostelium discoideum: DDB_0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Leishmania major. LmjF12.0630, KEGG/ENZYME: 2.6.12 /Entamoeba histolytica: 233.Í00009, KEGG/ENZYME: 2.6.12 /Entamoeba histolytica: 24.Í00016, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Trypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Trypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 510889.140) e da realização da PCR utilizando as moléculas de oligo DNA como iniciadores para amplificar assim um cDNA que codifica ALT.

Ainda, através da determinação da sequência de nucleotídeos do cDNA resultante, é possível determinar a região de tradução que codifica ALT e obter a sequência de aminoácidos da ALT. Ainda, através da verificação de uma biblioteca genômica utilizando o cDNA resultante como uma sonda, é possível isolar um DNA genômico.

Especificamente, podem ser utilizados os procedimentos a seguir. Em primeiro lugar, o mRNA é isolado de células, tecidos ou similar expressando ALT. Para o isolamento do mRNA, o RNA total é preparado através de métodos conhecidos, por exemplo, o método de ultracentrifugação em guanidina (Chirgwin, J. M. e outros, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), o método de AGPC (Chomczynski, P. e Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) ou similar e então o mRNA é purificado partindo do RNA total utilizando o mRNA Purification Kit (Pharmacia) etc. Alternativamente, o mRNA pode ser preparado diretamente utilizando o QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).

Partindo do mRNA resultante, o cDNA é sintetizado utilizando uma transcriptase reversa. Alternativamente, o cDNA pode ser sintetizado utilizando um kit tal como o AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit (SEIKAGAKU CORPORATION). É também possível sintetizar e amplificar o cDNA de acordo com o método de 5-RACE (Frohman, Μ. A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) utilizando o 5’-Ampli FIN-DER RACE Kit (Clontech) e a reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores.

Um fragmento de DNA de interesse é preparado partindo do produto de PCR resultante e ligado ao DNA de um vetor para preparar assim um vetor recombinante. O vetor é introduzido em um hospedeiro (por exemplo, E. colí), o que é seguido pela seleção de colônias resultantes para obter assim um vetor recombinante desejado. A sequência de nucleotídeos do DNA de interesse pode ser confirmada através de um método conhecido tal como o método de término da cadeia de didesoxinucleotídeo.

Ainda, uma sequência de nucleotídeos de maior eficiência de expressão pode ser planejada para o DNA que codifica ALT considerando a frequência do uso de códons no hospedeiro que serão utilizados para expressão (Grantham, R. e outros, Nucleic Acids Research (1981) 9, p. 43-74). Ainda, o DNA que codifica ALT pode ser modificado utilizando kits disponíveis comercialmente ou métodos conhecidos. Os exemplos de tais modificações incluem, mas não estão limitados a, digestão com enzimas de restrição, inserção de oligonucleotídeos sintéticos ou fragmentos de DNA apropriados, adição de ligantes e inserção de um códon de iniciação (ATG) e/ou um códon de término (TAA, TGA ou TAG). O DNA que codifica ALT inclui ainda um DNA que se hibridiza a um DNA complementar a um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos de KEGG/ENZYME: 2.6.1.2 IHomo sapiens (humana): 2875, KEGG/ENZYME: 2.6A.2/Homo sapiens (humana): 84706, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (camundongo): 76282, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IMus musculus (camundongo): 108682, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IRattus norvegi-cus (rato): 81670, KEGG/ENZYME: 2.6.12iCanis familiaris (cão): 609510, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2IXenopus laevis (sapo com garras africano): 444533, KEGG/ENZYME: 2.6.12IDrosophila melanogaster (mosca de frutas): Dmel_CG1640, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ICaenorhabditis elegans (ne-matóide): C32F10.8, KEGG/ENZYME: 2.6.12/Oryza sativa japonica (arroz japonês): 4342210, KEGG/ENZYME: 2.6.12lOryza sativa japonica (arroz japonês): 4348524, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2ICyanidioschyzon merolae: CMM066C, KEGG/ENZYME: 2.6.1,2ISaccharomyces cerevisiae: YLR089C, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21 Saccharomyces cerevisiae: YDR111C, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.12/Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Cand/cfa albicans: Ca019_346, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ISchizosaccharomyces pombe: SPBC582.08, KEGG/ENZYME: 2.6.1.21Aspergillus nidulans: AN 1923.2, KEGG/ENZYME: 2.6 A.21 Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770, KEGG/ENZYME: 2.6.121.Aspergillus oryzae: . A0090003000164, KEGG/ENZYME: 2.6A.2ICryptococcus neoformans JEC21: CNG01490, KEGG/ENZYME: 2.6.12IDictyostelium discoideum: DDB 0232139, KEGG/ENZYME: 2.6.12 ITrypanosoma brucei: Tb927. 1.3950, KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Le/s/?mar7/a major. LmjF12.0630, KEGG/ ΕΝΖΥΜΕ: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 233.Í00009, KEGG/ENZYME: 2.6.12 lEntamoeba histolytica: 24.Í00016, KEGG/ENZYME: 2.6.12/ Trypa-nosoma cruzi: 506529.420, KEGG/ENZYME: 2.6.1,2ITrypanosoma cruzi: 506529.430, KEGG/ENZYME: 2.6.12ITrypanosoma cruzi: 510889.120 ou KEGG/ENZYME: 2.6A.2ITrypanosoma cruzi: 510889.140 sob condições estringentes e codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente à ALT.

As condições estringentes podem ser apropriadamente selecionadas pelos peritos na arte, incluindo, por exemplo, condições de estringên-cia baixa. As condições de estringência baixa referem-se, por exemplo, a 42°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS, preferencialmente 50°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Mais preferencialmente, as condições de alta estringência podem ser selecionadas. As condições de alta estringência referem-se, por exemplo, a 65°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS. Sob estas condições, à medida que a temperatura de hibridização é elevada, os DNAs com uma homologia maior podem ser obtidos. O DNA descrito acima que se hibridiza é preferencialmente um DNA derivado da natureza, por exemplo, cDNA ou DNA cromossomal.

Estes DNAs isolados através de técnicas de hibridização possuem geralmente uma alta identidade de sequência de nucleotídeos com um DNA que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar. O DNA que codifica ALT inclui ainda um DNA que codifica um polipeptídeo funcionalmente equivalente à ALT derivada de ser humano ou similar e possui alta identidade com um DNA que codifica a ALT derivada de ser humano ou similar. O termo "alta identidade" refere-se a geralmente 96% ou mais homologia, preferencialmente 98% ou mais homologia, mais preferencialmente 99% ou mais identidade. A identidade de sequências de nucleotídeos pode ser determinada pelo algoritmo BLAST (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993). Com base neste algoritmo, foram desenvolvidos programas tais como BLASTN e BLASTX (Altschul e outros J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Quando as sequências de nucleotídeos são analisadas por BLASTN baseado em BLAST, os parâmetros podem ser ajustados como escore = 100 e comprimento de palavra = 12, por exemplo. Os procedimentos específicos para estes métodos de análise são conhecidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.). A produção de um polipeptídeo desejado pode ser realizada a-través da transferência de um gene que codifica o polipeptídeo desejado para dentro de uma célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato e CSAD ou ALT e do cultivo da célula resultante em um meio.

Quando um polipeptídeo desejado é produzido utilizando uma célula na qual um gene de transportador de bicarbonato e um gene de CSAD ou de ALT foram transferidos artificialmente, a ordem da transferência de um gene de transportador de bicarbonato, da de uma CSAD ou de um gene e da transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado não é particularmente limitada. Um gene que codifica um polipeptídeo desejado pode ser transferido após a transferência de um gene de transportador de bicarbonato e um gene de CSAD ou de ALT. Alternativamente, um gene de transportador de bicarbonato e um gene de CSAD ou de ALT podem ser transferidos após a transferência de um gene que codifica um polipeptídeo desejado. É também possível transferir um gene de transportador de bicar-bonato, um gene de CSAD ou de ALT e um gene que codifica um polipeptí-deo desejado simultaneamente.

Um gene de transportador de bicarbonato, um gene de CSAD ou de ALT e um gene que codifica um polipeptídeo desejado podem ser transferidos simultaneamente em um único vetor. Alternativamente, podem ser transferidos separadamente utilizando um grande número de vetores.

Para o cultivo da célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato (e que pode expressar fortemente CSAD ou ALT), podem ser utilizados meios que são usados em cultura de células convencionais (preferencialmente, cultura de células de animais). Estes meios contêm geralmente aminoácidos, vitaminas, fatores lipídicos, fontes de energia, reguladores osmóticos, fontes de ferro e reguladores de pH. O conteúdo destes componentes é geralmente como a seguir: aminoácidos 0,05-1500 mg/L, vitaminas 0,001-10 mg/L, fatores lipídicos 0-200 mg/L, fontes de energia 1-20 g/L, reguladores osmóticos 0,1-10000 mg/L, fontes de ferro 0,1-500 mg/L, reguladores de pH 1-10000 mg/L, elementos metálicos traços 0,00001-200 mg/L, tensoativos 0-5000 mg/L, co-fatores de crescimento 0,05-10000 pg/L e nucleosídeos 0,001-50 mg/L. Entretanto, o conteúdo não está limitada a estas faixas e pode ser selecionado apropriadamente dependendo do tipo da célula que será cultivado, do tipo do polipeptídeo desejado e assim por diante.

Em adição a estes componentes, os elementos metálicos traços, os tensoativos, os co-fatores de crescimento, os nucleosídeos e similares pode ser adicionados.

Os exemplos específicos de tais componentes incluem aminoácidos, tais como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina, preferencialmente, L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cistina, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L- lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina; vitaminas, tais como i-inositol, biotina, ácido fólico, ácido lipóico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido p-aminobenzóico, pantotena-to de cálcio, cloridrato piridoxal, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12 e ácido ascórbico, preferencialmente, biotina, ácido fólico, ácido lipóico, nicotinamida, pantotenato de cálcio, cloridrato piridoxal, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12 e ácido ascórbico; fatores lipí-dicos, tais como cloreto de colina, tartarato de colina, ácido linoléico, ácido oléico e colesterol, preferencialmente, cloreto de colina; fontes de energia, tais como glicose, galactose, manose e frutose, preferencialmente, glicose; reguladores osmóticos, tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio e nitrato de potássio, preferencialmente, cloreto de sódio; fontes de ferro, tais como ferro EDTA, citrato férrico, cloreto ferroso, cloreto férrico, sulfato terroso, sulfato férrico e nitrato férrico, preferencialmente, cloreto férrico, ferro EDTA e citrato férrico; e reguladores de pH, tais como bicarbonato de sódio, cloreto de cálcio, dihidrogêniofosfato de sódio, HEPES e MOPS, preferencialmente, bicarbonato de sódio. Os meios de cultura que contêm qualquer um destes componentes podem ser fornecidos como exemplos.

Além dos componentes acima, podem ser adicionados elementos metálicos traços, tais como sulfato de cobre, sulfato de manganês, sulfato de zinco, sulfato de magnésio, cloreto de níquel, cloreto de estanho, cloreto de magnésio e subsilicato de sódio, preferencialmente, sulfato de cobre, sulfato de zinco e sulfato de magnésio; tensoativos, tais como Tween 80 e Pluronic F68; co-fatores de crescimento, tais como insulina recombinante, IGF-1 recombinante, EGF recombinante, FGF recombinante, PDGF recombinante, TGF-α recombinante, cloridrato de etanolamina, selenito de sódio, ácido retinóico e dicloridrato de putrescina, preferencialmente, selenito de sódio, cloridrato de etanolamina, IGF-1 recombinante e dicloridrato de putrescina; e nucleosídeos, tais como desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxi-guanosina, adenosina, citidina, guanosina e uridina. Podem estar contidos nos exemplos preferíveis de meios acima, antibióticos, tais como estreptomi-cina, penicilina-G potássio e gentamicina e indicadores de pH, tais como Vermelho de Fenol. O pH do meio varia dependendo da célula que será cultivada. Geralmente, o pH 6,8-7,6 é apropriado. Em muitos casos, o pH 7,0-7,4 é apropriado. É também possível utilizar um meio comercial para cultura de células de animais, por exemplo, D-MEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco), Mistura 1:1 de D-MEM/F-12 (Meio de Eagle Modificado por Dul-becco. Mistura de Nutrientes F-12), RPMI1640, CHO-S-SFMII (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL 301 (JRH Biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich) ou similar.

Alternativamente, o meio pode ser um meio isento de soro.

Quando a célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato (e que pode expressar fortemente CSAD ou ALT) for células CHO, as células CHO podem ser cultivadas através de métodos conhecidos pelos peritos na arte. Por exemplo, as células CHO podem ser cultivadas geralmente em uma atmosfera com uma concentração de C02 em uma fase gasosa de 0 até 40%, preferencialmente de 2 até 10%, a 30 até 39°C, preferencialmente aproximadamente 37°C.

Um período de cultura apropriado para a produção de um poli-peptídeo desejado utilizando a célula que expressa fortemente um transportador de bicarbonato (e que pode expressar fortemente CSAD ou ALT) é geralmente de 1 dia até 3 meses, preferencialmente de 1 dia até 2 meses, mais preferencialmente de 1 dia até 1 mês.

Em relação a vários dispositivos de cultura para a cultura de células de animais, um dispositivo de cultura em tanque do tipo fermentador, um dispositivo de cultura do tipo suspensão a ar, um dispositivo de cultura do tipo frasco de cultura, um dispositivo de cultura do tipo frasco rotatório, um dispositivo de cultura do tipo microcarreador, um dispositivo de cultura do tipo leito fluidizado, um dispositivo de cultura do tipo fibra oca, um dispositivo de cultura do tipo garrafa giratória, um dispositivo de cultura do tipo leito em-pacotado ou similar pode ser utilizado. A cultura pode ser realizada através de qualquer método de cultura tal como cultura em batelada, cultura em batelada alimentada ou cultura contínua. Preferencialmente, a cultura em batelada alimentada ou a cultura contínua é utilizada. A cultura em batelada alimentada é mais preferida.

Quando o polipeptídeo produzido de acordo com o método da presente invenção possui uma atividade biológica útil como um agente farmacêutico, é possível produzir um agente farmacêutico através da mistura deste polipeptídeo com carreadores ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis e da formulação em uma preparação.

Os exemplos específicos de carreadores e aditivos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, solventes orgânicos que são farmaceuticamente aceitáveis, colágeno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polímero de carboxivinila, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilato de sódio, alginato de sódio, dextran solúvel em água, carboximetil amido de sódio, pectina, metilcelulose, etil celulose, goma xantana, goma arábica, caseína, ágar-ágar, polietileno glicol, diglicerina, glicerina, propileno glicol, petrolato, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina do soro humano (HSA), ma-nitol, sorbitol, lactose e tensoativos que são aceitáveis como aditivos farmacêuticos.

Os aditivos atuais podem ser selecionados dos aditivos mencionados anteriormente isoladamente ou em combinação de acordo com a forma de dosagem do agente terapêutico da presente invenção, mas não estão limitados aos listados acima. Por exemplo, quando um polipeptídeo é utilizado em uma formulação injetável, o polipeptídeo purificado pode ser dissolvido em um solvente tal como solução salina fisiológica, tampão ou uma solução de glicose e então um inibidor de adsorção tal como Tween 80, Tween 20, gelatina ou albumina do soro humano pode ser adicionado na solução. Alternativamente, um agente seco por congelamento pode ser utilizado para preparar uma forma de dosagem que é dissolvida e reconstituída antes do uso. Os exemplos do excipiente útil para secagem por congelamento incluem alcoóis de açúcar e sacarídeos tais como manitol e glicose.

As doses eficientes do polipeptídeo podem ser selecionadas a- propriadamente dependendo do tipo do polipeptídeo, do tipo da doença que será tratada ou prevenida, da idade do paciente, da gravidade da doença etc. Por exemplo, quando o polipeptídeo é um anticorpo anti-glipican, a dose eficiente de anticorpo anti-glipican é selecionada dentro de uma faixa de 0,001 mg até 1000 mg por kg de peso corporal por administração. Alternativamente, uma dose de 0,01-100000 mg/corpo pode ser selecionada por paciente. Entretanto, a dose eficiente não é limitada a estas faixas. O polipeptídeo pode ser administrado de forma oral ou de forma parenteral, mas a administração parenteral é preferida. Especificamente, a injeção (por exemplo, administração sistêmica ou local através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutâ-nea etc.), a administração transnasal, a administração transpulmonar, a administração transdermal e similares podem ser enumeradas. A presente invenção fornece uma célula que possui um DNA transferido que codifica um transportador de bicarbonato e um DNA transferido que codifica descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico ou alanina amino-transferase, dos quais ambos ou qualquer um pode ser incorporado dentro de um vetor.

Quando eucariotos são utilizados, células de animais, células vegetais, células fúngicas etc. podem ser utilizadas como o hospedeiro. Os exemplos específicos células de animais incluem células de mamíferos, tais como células CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), células COS, células3T3, células de mieloma, células BHK (renais de hamster bebê), células HeLa e células Vero; células de anfíbios, tais como oócitos de Xenopus laevis (Valle e outros, Nature (1981) 291, 358-340); ou células de insetos, tais como células sf9, sf21 e Tn5. Entre as células CHO, a dhfr-CHO que não possui o gene DHFR (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77, 4216-4420) e a CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1968) 60, 1275) são utilizadas com vantagem particular. Quando é pretendida a alta expressão em uma célula de animal, as células CHO são especialmente preferidas. A introdução do DNA que pode ser incorporado dentro de um vetor na célula hospedeira pode ser realizada através de métodos tais como o método de fosfato de cálcio, o método de DEAE dextran, um método utilizando um DOTAP de ribossomo catiônico (Boehringer-Mannheim), eletroporação, lipofecção etc.

As células vegetais para produção de polipeptídeos, uma célula derivada de Nicotiana tabacum é conhecida como um sistema de produção de polipeptídeos e esta pode ser submetida à cultura de calos. As células fúngicas para a produção de polipeptídeos, os exemplos específicos incluem levedura pertencendo ao gênero Saccharomyces, por exemplo, Saccha-romyces cerevisiae e fungos filamentosos pertencendo ao gênero Aspergil-lus, por exemplo, Aspergillus niger.

Quando procariotos são utilizados, são conhecidos os sistemas de produção que utilizam células bacterianas. Os exemplos específicos de tais células bacterianas incluem E. coli (tal como JM109, DH5a, HB101) e Bacillus subtilis. O polipeptídeo codificado por um gene de interesse pode ser obtido através da transformação destas células com o gene de interesse e o cultivo das células transformadas in vitro. A cultura pode ser realizada através de métodos conhecidos. Por exemplo, como um caldo de cultura para células de animais, um meio tal como DMEM, MEM, RPMI1640 ou IMDM pode ser utilizado. Um suplemento de soro tal como soro fetal de bezerro (FCS) pode ser utilizado junto. Alternativamente, pode ser realizada uma cultura isenta de soro. O pH durante a cultura é de preferencialmente aproximadamente 6 até 8. A cultura é geralmente realizada a aproximadamente 30-40°C durante aproximadamente 15-200 horas. Se necessário, são realizadas a substituição do meio, a aeração e a agitação.

Por outro lado, os sistemas de produção in vivo incluem aqueles que utilizam animais ou plantas. Um gene de interesse é transferido para estes animais ou plantas para produzir o polipeptídeo nos corpos de animais ou em corpos de plantas. Então, o polipeptídeo é coletado. O termo "hospedeiro" como utilizado aqui inclui tais animais ou plantas.

Quando animais são utilizados, os sistemas de produção disponíveis incluem aqueles que utilizam mamíferos ou insetos. Caprinos, suínos, ovinos, camundongo e gado podem ser utilizados como mamíferos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Quando mamíferos são utilizados, podem ser utilizados animais transgênicos.

Em primeiro lugar, um gene de interesse é fundido a um gene que codifica um polipeptídeo produzido inerentemente no leite (tal como β-caseína de cabra) para preparar assim um gene de fusão. Um fragmento de DNA que contém este gene de fusão é injetado em um embrião de caprino, que é então implantado no útero de uma fêmea de caprino. O polipeptídeo de interesse pode ser obtido partindo do leite produzido por caprinos transgênicos nascidos da cabra que aceitou o embrião ou da prole dos caprinos transgênicos. Com a finalidade de aumentar o rendimento de leite que contém o polipeptídeo produzido pelos caprinos transgênicos, hormônios podem ser apropriadamente administrados aos caprinos transgênicos (Ebert, K. M. e outros, Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Os exemplos de insetos que podem ser utilizados incluem o bi-cho-da-seda. Neste caso, o bicho-da-seda é infectado com baculovírus carregando um gene transferido que codifica o polipeptídeo de interesse. O polipeptídeo de interesse pode ser obtido do fluido corporal do bicho-da-seda (Susumu, M. e outros, Nature (1985) 315, 592-594).

Além disso, quando plantas são utilizadas, o tabaco pode ser tipicamente utilizado. Quando o tabaco é utilizado, um gene que codifica o polipeptídeo de interesse é inserido em um vetor de expressão de planta (por exemplo, pMON 530), que é então transferido para dentro de uma bactéria tal como Agrobacterium tumefaciens. Uma planta de tabaco (por exemplo, Nicotiana tabacum) é infectada com a bactéria resultante. O polipeptídeo de interesse pode ser obtido partindo de folhas desta planta (Julian, K.-C. Ma e outros, Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). O polipeptídeo obtido dessa maneira pode ser isolado da parte interna da célula hospedeira ou de sua parte externa (por exemplo, meio) e purificado em um polipeptídeo substancialmente puro e homogêneo. O isolamento e a purificação de polipeptídeos podem ser realizados utilizando métodos convencionais de isolamento e purificação para polipeptídeos e não são limitados de forma alguma. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser isolados e purificados através da seleção apropriada e da combinação de várias ferramentas e técnicas, tais como colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, extração por adição de sais, precipitação com solvente, extração com solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, focalização isoelétrica, diálise, recristalização etc.

Os exemplos de cromatografia incluem cromatografia por afinidade, cromatografia por troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia em fase inversa, cromatografia de adsorção etc. (Strategi-es for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas técnicas cromatográficas podem ser realizadas utilizando cromatografia em fase líquida, por exemplo, HPLC, FPLC etc. A presente invenção inclui ainda os polipeptídeos altamente purificados utilizando estes métodos de purificação.

Antes ou depois da purificação, é também possível fornecer modificações adicionais ao polipeptídeo ou remover um peptídeo parcial do mesmo através da reação do polipeptídeo com uma enzima apropriada de modificação do polipeptídeo. Os exemplos de tal enzima incluem, mas não estão limitados a, tripsina, quimiotripsina, lisil endopeptidase, proteína quina-se e giucosidase.

Na presente invenção, o conceito de "células para dentro das quais o DNA foi transferido" abrange não somente as células para dentro das quais o DNA exógeno foi incorporado através da tecnologia de recombina-ção genética; mas também as células nas quais o DNA endógeno foi ativado através da tecnologia de ativação gênica (ver, por exemplo, a Publicação Internacional WO94/12650) de forma que a expressão de uma proteína correspondente ao DNA exógeno ou a transcrição do DNA era iniciada ou aumentada.

EXEMPLOS

Posteriormente aqui, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos a seguir. Deve ser observado que estes Exemplos são fornecidos apenas para ilustrar a presente invenção e não para limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1 Clonagem de um gene de trocador aniônico de célula hepática humana (Trocador aniônico 1, banda 3) Utilizando um cDNA Human Liver QUICK-Clone comercial (Clon-tech Laboratories, Inc.) como um molde, um gene de trocador aniônico (AE1) derivado de um fígado humano foi obtido através de um método de PCR. O gene clonado dessa maneira foi sequenciado para confirmar que este codificava AE1 em vista de sua homologia com um AE1 humano publicado. O gene AE1 obtido dessa maneira tinha mutações em oito sítios na sequência de 2733 bases (t263g, t357c, a645t, a672c, c951t, a2078g, t2195c, c2500t) e codificava 911 aminoácidos incluindo quatro aminoácidos diferentes (L88R, E693G, V712A, H834Y). Entretanto, devido ao fato de que um produto obtido pelo gene foi previsto como sendo um transportador possuindo 13 domínios transmembrana (Fig. 1), o gene foi utilizado para a modulação celular como um gene AE1 derivado de um fígado humano.

Exemplo 2 Aumento na quantidade de produção de anticorpos através da introdução de um gene de trocador aniônico humano Através da adição de uma sequência de Kozak ao gene AE1 humano obtido através da clonagem por PCR no Exemplo 1 (que é posteriormente aqui chamado de AE1), pHyg-AE1 (Fig. 2) e pPur-AE1 (Fig. 3) foram construídos como os plasmídeos de expressão com o promotor de CMV. Os plasmídeos de expressão pHyg-AE1 ou pHyg que não continham o gene AE1 (que foi obtido introduzindo primeiro unidades de expressão de gene de resistência à Higromicina derivadas do pTK5 fornecido pela Clonte-ch Laboratories, Inc. em plasmídeos pSV2-dhfr (ATCC No.37146) e então removendo as unidades de expressão de dhfr dos plasmídeos construídos) foram induzidos em células CHO produtoras de anticorpo anti-glipican-3 como uma cepa parental (ver a Publicação Internacional WO 2006/006693) por eletroporação. Então, as cepas que exibiam alta proliferação em cultura estática na presença de Higromicina (200 r_]g/ml) foram selecionadas. Após a amplificação, foi preparado um RNA total partindo da cepa de pHyg-AE1 e cinco cepas expressando AE1 humano em altos níveis foram selecionadas através de um método de TaqMan. Ainda, foi feita uma comparação em relação à quantidade de produção de anticorpos entre células transformadas com pHyg como um controle(quatro cepas) e quatro cepas decélulas transformadas com AE1 humano que se proliferavam em um nível equivalente ao observado com o controle durante a cultura em agitação. Durante a cultura em batelada alimentada em um frasco de agitação de 50 ml_ sob a condição de 2 x 105 células/mL em um estágio inicial, a quantidade de um anticorpo anti-glipican-3 produzido por células transformadas com pHyg-AE1 (quatro cepas) no dia 12 após o início da cultura em agitação era significativamente maior que a produzida pelas células transformadas com pHyg (quatro cepas) (teste t: P < 0,05, figura 4).

Então, utilizando como uma cepa parental a cepa que expressa AE1 que produzia a maior quantidade de um anticorpo entre as quatro cepas transformadas com pHyg-AE1, pPur-CSAD ou um plasmídeo de expressão de descarboxilase do ácido cisteína sulfúrico (CSAD) que contém um gene de resistência à Puromicina (Fig. 10, ver o Exemplo de Referência 2 descrito posteriormente), pPur-ALT 1 ou um plasmídeo de expressão de alanina ami-notransferase (ALT1) que contém um gene de resistência à Puromicina (Fig. 11, ver o Exemplo de Referência 4 descrito posteriormente) e um plasmídeo de controle pPur (pPUR, vetor de expressão de resistência à Puromicina, fornecido pela Clontech Laboratories, Inc.) foram introduzidos por eletropo-ração. Então, as cepas que exibiam alta proliferação em cultura estática na presença de Puromicina (6 ng/mL) foram selecionadas. Após a amplificação, foi preparado um RNA total partindo das cepas selecionadas dessa maneira. Então, as cepas co-expressando AE1/CSAD (nove cepas), as cepas co-expressando AE1/ALT1 (10 cepas) e as cepas co-expressando AE1/pPur (oito cepas), que expressavam os genes recém introduzidos em altos níveis, foram selecionadas e comparadas em relação à quantidade de produção de anticorpos e à taxa de sobrevivência. Na cultura em batelada alimentada em frascos de agitação de 50 mL sob a condição de 2 χ 105 células/mL em um estágio inicial, as cepas co-expressando AE1/CSAD (nove cepas) exibiam quantidades significativamente maiores de produção de anticorpos anti-glipican-3 (teste t P < 0,05, figura 5) e taxas de sobrevivência significativamente maiores (teste t P < 0,01, figura 6) que a cepa de controle co-expressando AE1/pPur (oito cepas) no dia 10 no estágio tardio da cultura em agitação. Entre os três tipos de cepas de co-expressão, as cepas co-expressando AE1/ALT1 (10 cepas) produziam a maior quantidade de um anticorpo anti-glipican-3, que era significativamente maior que a produzida pelas cepas de controle co-expressando AE1/pPur (oito cepas) no dia 8 da cultura em batelada alimentada com agitação (teste t P < 0,01, figura 7). Subsequentemente, AA53, que produzia a maior quantidade de um anticorpo (1497 mg/L/8 dias) e expressava mRNAde ALT1 no nível mais alto entre as cepas co-expressando AE1/ALT1 (10 cepas) no estudo utilizando a cultura em batelada alimentada com agitação, foi submetida à cultura em batelada alimentada em uma jarra de 1 L (10 χ 105 células/mL em um estágio inicial). Então, foi observado que a quantidade de um anticorpo produzido por AA53 no dia 7 da cultura era de 1,9 g/L/7 dias, revelando que a AA53 era capaz de produzir anticorpo em alto rendimento em cultura de curta duração (Fig. 8). Considerando que TA41, que era uma cepa co-expressando TauT/ALT1 que produzia 5,3 g/L de um anticorpo no dia 21 da cultura (ver o Exemplo de Referência 4 descrito posteriormente), produzia 1,5 g/L de um anticorpo no dia 7 da cultura, a AA53 possui um potencial de produzir uma quantidade maior de um anticorpo em um curto período de tempo que a TA41 e, consequentemente, a AA53 é considerada como sendo adequada para a produção prática.

Os resultados acima mostram que as células capazes de produzir anticorpo em alto rendimento podem ser obtidas através da expressão forte de um trocador aniônico (AE1) artificialmente e através da expressão forte deAE1 e CSAD ou ALT1 simultaneamente.

Ainda, o efeito da expressão forte de AE1 foi mostrado através da construção de uma cepa capaz de produzir um anticorpo anti-IL-6R utilizando uma célula hospedeira que expressa fortemente AE1. Dentro de uma célula hospedeira comum DXB11, o pHyg-AE1 (Fig. 2) foi introduzido por eletroporação. Então, as cepas que exibiam alta proliferação em cultura estática na presença de Higromicina (200 Gg/mL) foram selecionadas. Após a amplificação, as células expressando AE1 humano em altos níveis foram estabelecidas com uma célula hospedeira AE1/DXB11 através de um método de TaqMan. Os plasmídeos de expressão do anticorpo anti IL-6R foram introduzidos nas células hospedeiras AE1/DXB11 e a AE1-S08 foi obtida a-través da clonagem de uma célula isolada. AAE1-S08 obtida dessa maneira era capaz de produzir em altos rendimentos um anticorpo anti-IL-6R e a quantidade de sua produção no dia 14 de cultura em batelada alimentada em uma jarra de 1 L (7 χ 105 células/mL em um estágio inicial) era de 3,0 g/L como mostrado na figura 12. Foi confirmado que a AE1-S08 capaz de produzir anticorpo em alto rendimento e as células hospedeiras, AE1/DXB11, eram ambas estáveis em um teste de estabilidade através do subcultivo e da manutenção da expressão de AE1 em altos níveis.

Os resultados acima sugerem que o efeito da introdução de um gene AE1 atua positivamente tanto antes quanto depois da introdução de um gene de anticorpo. A presente invenção pode ser aplicada em todos os tipos de células capazes de produzir um polipeptídeo (preferencialmente um anticorpo).

Exemplo de Referência 1 Clonagem de Genes da Descarboxila-se do Ácido Cisteína Sulfúrico (CSAD) e da Cisteína Dioxigenase, do tipo I (CD01) de Hamster Derivados de Células CHO O RNA total foi extraído de células produtoras de anticorpo do receptor anti-IL-6 (Uma linhagem de células CHO DXB11 para dentro da qual um gene do anticorpo do receptor anti-IL-6 foi transferido) (Publicação de Patente Não Verificada Japonesa No. Hei 8-99902) e então o cDNA foi sintetizado partindo do mesmo de uma maneira dependente de poli(A). Os genes CSAD e CD01 de hamster foram obtidos por PCR utilizando como um molde o cDNA fragmentado com três enzimas de restrição, Sall, Xhol e EcoRI. Como iniciadores da PCR, foram planejados aqueles que contêm a sequência da extremidade a 5’ e da extremidade a 3’ conservada entre CSADs ou CD01s de rato e camundongo. As sequências de nucleotídeos dos genes clonados foram determinadas. Partindo de sua homologia com outros genes de CSAD ou de CD01 de espécies conhecidas, o gene clonado foi confirmado como codificando CASD de hamster (Fig. 9). A sequência de aminoácidos da CSAD de hamster possui alta homologia com as sequências de aminoácidos conhecidas da CSAD de camundongo (96% de identidade), da CSAD de rato (96% de identidade) e da CSAD humana (91% de identidade); foi previsto que a CSAD de hamster é uma enzima que possui a mesma atividade. A sequência de nucleotídeos da CSAD de hamster é mostrada na SEQ ID NO: 3. A sequência de aminoácidos da CSAD de hamster é mostrada na SEQ ID NO: 4.

Exemplo de Referência 2 Construção de um plasmídeo que expressa CSAD de hamster para seleção com Puromicina Através da adição de uma sequência de Kozak no gene de CSAD de hamster (que é posteriormente aqui chamado de CSAD) obtido através da clonagem por PCR no Exemplo de Referência 1, foi construído um plasmídeo de expressão com o promotor de CMV pPur/CSAD (Fig. 10).

Exemplo de Referência 3 Clonagem do Gene de Alanina Amino-transferase de Células Hepáticas Humanas Utilizando um Human Liver QUICK-Clone cDNA comercial (Clon-tech Laboratories, Inc.) como um molde, o gene da alanina aminotransferase (ALT1) derivado de um fígado humano foi obtido através de um método de PCR. O gene clonado dessa maneira foi sequenciado e confirmado como codificando ALT 1 com base em sua homologia com o ALT 1 humano publicado. O gene ALT 1 obtido dessa maneira tinha mutações em cinco sítios na sequência de 1488 bases (c157a, a215g, c765t, t857c, t995a) e codificava 496 aminoácidos incluindo quatro aminoácidos diferentes (R53S, Q72R, F286S, M332K), mas este foi utilizado como um clone da PCR do ALT1 derivado de fígado humano para a modulação das células.

Exemplo de Referência 4 Aumento no Rendimento de Anticorpos Através da Transferência da Alanina Aminotransferase Humana Através da adição de uma sequência de Kozak ao ALT1 humano obtido através da clonagem no Exemplo de Referência 3 (que é posterior- mente aqui chamado de ALT1), o pPur-ALT1, que era um plasmídeo de expressão com o promotor de CMV, foi construído (Fig. 11). Os plasmídeos de expressão pPur-ALT1 ou pPur que não continham o gene ALT1 foram introduzidos nas células CHO produtoras de anticorpo anti-glipican-3 como cepas parentais (ver a Publicação Internacional WO 2006/006693) por eletropora-ção e foram selecionadas as cepas de células que exibiam alta proliferação em cultura estática na presença de Puromicina (6 Gg/mL) (pPur-ALT 1: sete cepas, pPur: três cepas). Após a expansão, foi preparado um RNA total partindo das cepas de células com pPur-ALT1 e seis cepas expressando ALT1 humano em altos níveis foram selecionadas através de um método de Taq-Man. Ainda, foi feita uma comparação em relação ao rendimento de anticorpos entre células com pPur transferido como um controle(três cepas) e quatro cepas de células com ALT1 humano transferido que se proliferavam em um nível equivalente ao observado com as células com pPur transferido durante a cultura em agitação. Durante a cultura em batelada alimentada em um frasco de agitação de 50 mL com uma densidade de células inicial de 2 χ 105 células/mL, o rendimento do anticorpo anti-glipican-3 de células com pPur-ALT1 transferido (quatro cepas, 1236±149 mg/L) no dia 17 no estágio tardio da cultura em agitação era significativamente maior que aquele de células com pPur transferido (três cepas, 871±119 mg/L) (teste t: p < 0,01). Foi observado que cada uma de A72, uma cepa expressando pPur-ALT1 e de P41, uma cepa expressando pPur, produziam a maior quantidade de um anticorpo no estudo utilizando cultura em batelada alimentada com agitação e foram submetidas à cultura em batelada alimentada em jarras de 1 L (uma densidade de células inicial de 10 χ 105 células/mL). Como um resultado, o rendimento de anticorpos de A72 era de 2,9 g/L no dia 19 da cultura, que era maior que o rendimento de anticorpos de P41 (2,2 g/L). Uma vez que não foi observado um aumento no rendimento de anticorpos de P41 no dia 14 ou dias subsequentes após o início da cultura, a produção em alto rendimento de um anticorpo por A72 foi considerada como sendo atribuída ao efeito que mantinha a taxa de sobrevivência (As taxas de sobrevivência da cepa expressando pPur-ALT1 A72 e da cepa expressando pPur P41 eram de 60% e 23%, respectivamente, no dia 14 da cultura).

Então, o pPur-ALT1 ou o pPur foi co-transferido na T10 que era uma célula com pHyg-TauT transferido utilizada como uma cepa parental (ver o Exemplo de Referência 6 descrito posteriormente). As células co-expressando TauT/ALT1 que exibiam alta proliferação e expressavam ALT1 humano em alto nível (seis cepas) e as células co-expressando TauT/pPur que exibiam alta proliferação (oito cepas) foram selecionadas e submetidas à cultura em batelada alimentada em frascos de agitação de 50 mL (uma densidade de células inicial de 10 χ 105 células/mL). O rendimento do anticorpo anti-glipican-3 (745±87 mg/L) de células co-expressando TauT/ ALT 1, que eram células que expressavam ALT, no dia 4 da cultura em agitação era significativamente maior que aquele de células com TauT/pPur (616±29 mg/L) (teste t: p < 0,01). ATA41, que era uma cepa co-expressando TauT/ALT1 que produzia a maior quantidade de um anticorpo (881 mg/L/4 dias) e expressava o mRNA de ALT1 no nível mais alto no estudo utilizando a cultura em batelada alimentada com agitação, foi submetida à cultura em batelada alimentada em uma jarra de 1 L (uma densidade de células inicial de 10 χ 105 célu-las/mL). Os rendimentos de anticorpos era tão alto quanto 1,3 g/L no dia 7 da cultura, 3,0 g/L no dia 10 da cultura, 3,5 g/L no dia 12 da cultura, 4,6 g/L no dia 17 da cultura e 5,3 g/L no dia 21 da cultura, que eram claramente mais altos que os valores para TP08 (656 mg/L/4 dias), que era uma cepa de controle que produzia a maior quantidade de um anticorpo entre as cepas co-expressando TauT/pPur (2,4 g/L no dia 10 da cultura).

Exemplo de Referência 5 Clonagem do Gene do Transportador de Taurina de Hamster Derivado de Células CHO O RNA total foi extraído das células produtoras de anticorpo do receptor anti-IL-6 (Uma linhagem de células CHO DXB11 para dentro da qual um gene do anticorpo do receptor anti-IL-6 foi transferido) (Publicação de Patente Não Verificada Japonesa No. Hei 8-99902) e então o cDNA foi sintetizado partindo do mesmo de uma maneira dependente de poli(A). O gene do transportador de taurina de hamster (TauT) foi obtido através da PCR utilizando como um molde o cDNA fragmentado com três enzimas de restrição, Sall, Xhol e EcoRI. Como iniciadores da PCR, foram planejados aqueles contendo a sequência da extremidade a 5’ e da extremidade a 3’conservada entre TauTs de rato e de camundongo. A sequência de nucleo-tídeos do gene clonado foi determinada. Partindo de sua homologia com outros genes de TauT de espécies conhecidas, o gene clonado foi confirmado como codificando TauT de hamster (Fig. 13). A sequência de aminoácidos de TauT de hamster possui alta homologia com TauT de camundongo (96% de identidade), TauT de rato (96% de identidade) e TauT humana (93% de identidade); foi previsto que o TauT de hamster é um transportador com 12 regiões transmembranas (Fig. 14).

Exemplo de Referência 6 Aumento na Densidade de Células Viáveis, Inibição da Produção de Lactato e Aumento no Rendimento de Anticorpos, Que São Causados Pela Transferência do Transportador de Taurina de Hamster Foi construído o plasmídeo de expressão com o promotor de CMV pHyg/TauT (Fig. 15) através da adição da sequência de Kozak ao gene TauT de hamster (posteriormente aqui, TauT) obtida através da clonagem no Exemplo de Referência 5. O plasmídeo de controle pHyg sem o gene pHyg/TauT ou TauT foi introduzido através de eletroporação na célula CHO produtora de anticorpo anti-glipican-3 da cepa parental (ver WO 2006/006693). Após a seleção de células com o plasmídeo de expressão transferido na presença de higromicina (400 pg/mL), todas as cepas de células que cresceram estavelmente foram expandidas (pHyg/TauT: 8 cepas; pHyg: 7 cepas). Foi preparado o mRNA de TauT. Subsequentemente, 7 cepas foram confirmadas como expressando TauT mais fortemente que a cepa parental através do método de TaqMan; estas foram selecionadas como células com pHyg/TauT transferido. O nível médio de expressão de mRNA destas células que sofreram transferência (7 cepas) era aproximadamente 40 vezes maior que o do controle (7 cepas). As células das 14 cepas totais foram submetidas à cultura em batelada e à cultura em batelada alimentada em frascos de agitação de 50 mL com uma densidade de células inicial de 2 χ 105 células/mL. No dia 7 de cultura (estágio tardio), as densidades das células viáveis, os rendimentos de lactato e os rendimentos de anticorpo anti-glipican-3 em tais cepas foram comparados. Na cultura em batelada, as substâncias inibidoras do crescimento, tal como o lactato, se acumulavam no caldo de cultura à medida que as células cresciam e seu crescimento era inibido. Entretanto, as densidades de células viáveis (9,28±3,27 χ 105 célu-las/mL) e os rendimentos de lactato (1,54±0,20 g/L) nas células com pHyg/TauT transferido eram superiores aqueles nas células com pHyg transferido (densidades de células viáveis: 5,69±2,09 χ 105 células/mL, rendimentos de lactato: 1,54±0,20 g/L) (teste t; p<0,05). Em relação ao rendimento de anticorpo anti-glipican-3, 4 das 7 cepas de células com pHyg/TauT transferido exibiam rendimentos de anticorpos (rendimento médio de anticorpos: 440,6 mg/L) maiores que o maior rendimento na célula com pHyg transferido (389,6 mg/L). Ainda, uma vez que a superioridade de células com pHyg/TauT transferido no rendimento de anticorpo anti-glipican-3 se tornou mais evidente (teste t; P<0,01) em cultura em batelada alimentada, a cepa com pHyg/TauT transferido T10 (que exibia a maior capacidade de crescimento entre as 4 cepas acima) e a cepa parental foram submetidas à cultura em batelada alimentada em uma jarra de 1 L. Como um resultado, a proporção viável de T10 foi mantida em 80% ou em ainda mais no dia 32 de cultura, com a produção de lactato inibida. Consequentemente, seu rendimento de anticorpo anti-glipican-3 atingiu 2,9 g/L no dia 35 de cultura. Foi confirmado através de análise de citometria de fluxo que a célula com TauT transferido T10 estava expressando moléculas de TauT na membrana de uma célula. Estes resultados sugerem que através da expressão artificial de TauT de hamster, é possível aumentar o potencial de células produtoras de anticorpos e criar cepas capazes de maior produção de anticorpos.

Todas as publicações, as patentes e os pedidos de patentes citados aqui são incorporados aqui como referência em sua totalidade. APLICABILIDADE INDUSTRIAL A presente invenção pode ser aplicada na produção de polipeptí- deos. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS TEXTO LIVRE <SEQ ID NO: 1> A SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica AE1 humano (GenBank M27819) . <SEQ ID NO: 2> A SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos do AE1 humano (UniProtKB/Swiss-Prot P02730) . <SEQ ID NO: 3> A SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica CSAD de hamster. <SEQ ID NO: 4>

A SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácidos da CSAD de hamster. <SEQ ID NO: 5> A SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica ALT1 humano (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (humana): 2875) . <SEQ ID NO: 6> A SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácidos da ALT1 humana (KEGG/ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (humana): 2875) . <SEQ ID NO: 7> A SEQ ID NO: 7 mostra a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica o transportador de taurina de hamster. <SEQ ID NO: 8> A SEQ ID NO: V mostra a sequência de aminoácidos do transportador de taurina de hamster.

REIVINDICAÇÕES

Claims (1)

1. Processo de produção de um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que o DNA que codifica o trocador aniônico SLC4 é qualquer um dos (a) e (b) seguintes: (a) um DNA que codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos que é mostrada na SEQ ID NO: 2; e(b) um DNA que possui uma sequência de nucleotídeos que é mostrada na SEQ ID NO: 1; e em que o polipeptídeo desejado é um anticorpo.