TWI434935B - A cell for producing a different protein, and a method for producing the same - Google Patents

A cell for producing a different protein, and a method for producing the same Download PDF

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TWI434935B
TWI434935B TW97140931A TW97140931A TWI434935B TW I434935 B TWI434935 B TW I434935B TW 97140931 A TW97140931 A TW 97140931A TW 97140931 A TW97140931 A TW 97140931A TW I434935 B TWI434935 B TW I434935B
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Hisahiro Tabuchi
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Tomoya Sugiyama
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Description

製造異種蛋白質用之細胞及使用其之製造方法
本發明係有關製造異種蛋白質用之細胞及使用其之製造方法，更詳細而言係關於使用大量表現碳酸氫根離子輸送蛋白(Bicarbonate transporter)之細胞，以及使用其製造多肽之方法。
使用基因重組技術生產適用於醫藥之蛋白質時，因使用動物細胞，使原核細胞無法進行的複雜的轉譯後修飾及摺疊變為可能，遂使動物細胞廣泛被使用於生產重組蛋白質用之宿主細胞。
近年來，雖有許多抗體及具生理活性之蛋白質等生技藥品不斷輩出，但可使動物細胞有效率地生產重組蛋白質之生產技術，不但與生技藥品之成本低減相連，更是對患者安定供給之保證。
因此，尋求更高生產效率的蛋白質製造方法。
陰離子交換蛋白係交換輸送細胞膜內外之陰離子之轉運蛋白(膜輸送蛋白質)。SLC4家族係HCO3 - 轉運蛋白家族之一，而其所屬之AE1、AE2及AE3該3個成員，具有細胞膜內之HCO3 - 交換細胞膜外之C1- 之功能。
在腎臟可於底側邊細胞膜之集尿管之α間細胞發現AE1(非專利文獻1)。已知人類AE1之變異會引起遠端小管性酸血症(非專利文獻2及3)。
另外可於腎臟中找到AE2的3個異構體AE2a、AE2b及AE2c。AE2被認為係為傳遞細胞訊息而控制細胞內pH值恆定(非專利文獻4)，但剔除AE2基因之小鼠於離乳期死亡時，並未發現腎性的表現型異常(非專利文獻5)。
SLC26為較新的陰離子交換蛋白家族，其多數的成員(例如SLC26A3、SLC26A4、SLC26A6、SLC26A9等)顯示其可能為Bicarbonate輸送蛋白(非專利文獻6～11)。
反之，針對藉由使具有Bicarbonate轉運蛋白功能之陰離子交換蛋白大量表現，以陰離子交換蛋白為介，人為地促進陰離子進入培養細胞內以及排出細胞外，而期望培養細胞可提升所期望的重組蛋白質之生產此點，目前仍屬未知。
非專利文獻1：van Adelsberg JS. et.al.,J Biol Chem 1993；268：11283-11289
非專利文獻2：Shayakui C. et.al.,Curr Opin Nephrol Hypertens 2000；9：541-546
非專利文獻3：Alper SL. et.al.,Annu Rev Physiol 2002；64：899-923
非專利文獻4：Komlosi P. et.al.,Am J Physiol Renal Physiol 2005；288：F380-F386
非專利文獻5：Gawenis LR. et.al.,J Biol Chem 2004；279：30531-30539
非專利文獻6：Melvin et.al.,J Biol Chem 1999；274：22855-22861
非專利文獻7：Ko et.al.,EMBO J. 2002；21：5662-5672
非專利文獻8：Soleimani et.al.,Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2001；280：F356-F364
非專利文獻9：Wang et.al.,Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2002；282：G573-G579
非專利文獻10：Petrovic et.al.,Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2004；286：F161-F169
非專利文獻11：Xu et.al.,Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005；289：C493-C505
本發明係以提供可以良好的效率生產多肽之方法為目的。
[解決課題之手段]
本發明之發明者們，為解決上述課題專心研究後，發現藉由使用大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞，可使所期望之多肽的生產量增加，本發明遂至完成。進而，藉由使用同時表現Bicarbonate輸送蛋白與半胱亞磺酸脫羧酶(以下亦有記做「CSAD」)或丙胺酸轉胺酵素(以下亦有記做「ALT」)的細胞，可使所期望的多肽的產生量更加增加。
本發明之要旨如下所述。
(1)一種多肽之製造方法，其係包含培養可大量表現碳酸氫根離子輸送蛋白，且經導入編碼所期望多肽之DNA之細胞，並使其產生所期望的多肽。
(2)如(1)之製造方法，其中可大量表現碳酸氫根離子輸送蛋白之細胞，係經導入編碼碳酸氫根離子輸送蛋白之DNA之細胞。
(3)如(1)或(2)項之製造方法，其中可大量表現碳酸氫根離子輸送蛋白之細胞，進而可大量表現半胱亞磺酸脫羧酶或丙胺酸轉胺酶。
(4)如(1)～(3)項中任一項之製造方法，其中碳酸氫根離子輸送蛋白，係SLC4陰離子交換蛋白或SLC26陰離子交換蛋白。
(5)如(1)～(3)項中任一項之製造方法，其中碳酸氫根離子輸送蛋白係SLC4陰離子交換蛋白。
(6)如(5)之製造方法，其中SLC4陰離子交換蛋白係AE1。
(7)如(1)～(6)項中任一項之製造方法，其中細胞係中國倉鼠卵巢細胞。
(8)如(1)～(7)項中任一項之製造方法，其中所期望之多肽係抗體。
(9)如(4)～(6)項中任一項之製造方法，其中編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA係下述(a)～(e)之任何一種，
(a)編碼具有序列編號2之胺基酸序列的多肽之DNA
(b)編碼於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA
(c)編碼具有與序列編號2之胺基酸序列50%以上之相似性，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA
(d)具有序列編號1之鹼基序列之DNA
(e)編碼使具有序列編號1之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA。
(10)一種醫藥品之製造方法，其係含有(1)～(9)項中任一項之方法所製造之多肽。
(11)一種細胞，其係導入有編碼碳酸氫根離子輸送蛋白之DNA與編碼所期望的多肽之DNA。
(12)如(11)之細胞，其係進而導入有編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙胺酸轉胺酶之DNA。
(13)一種細胞，其係導入有編碼碳酸氫根離子輸送蛋白之DNA與編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙胺酸轉胺酶之DNA。
[發明的效果]
根據本發明，可大量地生產所期望之多肽。
本說明書係包含為本申請案之優先權基礎之日本專利申請專利2007-276182之說明書以及/或圖面所記載之內容。
[實施發明之最佳形態]
以下針對本發明之實施形態更詳細地加以說明。
本發明係本發明係包含培養大量表現Bicarbonate輸送蛋白且經導入編碼所期望之多肽之DNA之細胞，使其產生所期望之多肽，並提供多肽之製造方法。
本發明之方法中，細胞為可產生所期望之多肽的天然細胞，亦可為導入編碼所期望之多肽的DNA之轉化細胞，但以導入編碼所期望之多肽的DNA之轉化細胞為佳。
本發明之方法中，並未特別限定所期望之多肽，可為抗體(例如抗IL-6受體抗體、抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗GPⅡb/Ⅲa抗體、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體、抗IgE抗體、抗CD11a、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體等)，及生理活性蛋白質(顆粒細胞生長激素(G-CSF)、巨噬細胞生長激素(GM-CSF)、紅血球生成素、干擾素、IL-1及IL-6等介白素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、PTH等)等各種多肽，但以抗體特佳。抗體可為天然抗體、Fab、scFv、sc(Fv)2 等低分子化抗體、嵌合體抗體、人類化抗體等任一種抗體。
藉由使用可大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞，而可使藉由該細胞之多肽生產量增加。
Bicarbonate輸送蛋白係於排出碳酸氫根離子(HCO3 - )或碳酸根離子(CO3 2- )時，同時攝入氯離子及硫酸根離子等，具有交換輸送功能之膜蛋白。Bicarbonate輸送蛋白可舉出例如SLC4陰離子交換蛋白、SLC26陰離子交換蛋白等。
SLC4陰離子交換蛋白係控制細胞內pH值恆定以及細胞容積之膜蛋白。目前已知有10種(SLC4A1(AE1)、SLC4A2(AE2)、SLC4A3(AE3)、SLC4A4(NBCe1)、SLC4A5(NBCe2)、SLC4A7(NBCn1)、SLC4A8(kNBC3)、SLC4A9(NBCn2)、SLC4A10(NBCn3)、SLC4A11(NaBC1))之SLC4家族，且至少存在有1種以上之異構體。且分別具有如為非依賴Na+ 之中性電荷之Cl- 、HCO3 - 之交換蛋白之SLC4A1(AE1)、SLC4A2(AE2)、ALC4A3(AE3)、ALC4A9(NBCn2或AE4)，具發電性之ALC4A4(NBCe1)、ALC4A5(NBCe2)，為中性電荷Na+ 與HCO3 - 之共同輸送體之ALC4A7(NBCn1)，依賴Na+ 之中性電荷之Cl- 、HCO3 - 之交換蛋白之ALC4A8(kNBC3)、ALC4A10(NBCn3)，具發電性之Na+ 與Borate之共同輸送體之ALC4A11(NaBC1)等相異的功能。該等陰離子交換蛋白具有部位特異之作用。例如AE1於具極性之上皮細胞具有經上皮分泌及再吸收鹽酸根離子之作用，在鱒魚的紅血球內可促進osmolyte輸送。SLC4陰離子交換蛋白可舉出例如SLC4A1(AE1)、SLC4A2(AE2)、SLC4A3(AE3)、SLC4A4(NBCe1)、SLC4A5(NBCe2)、SLC4A7(NBCn1)、SLC4A8(kNBC3)、SLC4A9(NBCn2)、SLC4A10(NBCn3)、SLC4A11(NaBC1)等，以AE1為佳。
SLC26陰離子交換蛋白係幾乎於各種臟器系中作用之多功能膜蛋白，除了進行硫酸根離子、溴離子、蟻酸根離子、草酸根離子、氯離子、羥基離子、碳酸氫根離子等之交換輸送外，亦存在有氯離子通道或陰離子依賴性分子馬達。認為其係與各種陰離子之恆定有關，已知有10種(SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A11)之陰離子交換蛋白家族。例如為羥基離子、碳酸氫根離子之轉運蛋白之SLC26A3、SLC26A6、SLC26A9，與SLC4陰離子交換蛋白同樣係控制細胞膜內外之pH值。在腎臟表現者為SLC26A1、SLC26A2、SLC26A4、SLC26A6、SLC26A9、SLC26A11。SLC26A1係擔任硫酸根離子與草酸根離子之輸送，SLC26A6作用則為攝入氯化鈉，進行各種陰離子之交換輸送。SLC26A1為腎石症之原因，SLC26A4、SLC26A6則為高血壓之原因，而SLC26A5則為失聰之病因。SLC26A7係與SLC26A4相同，與鹽酸基恆定及控制血壓有關。SLC26陰離子交換蛋白可舉出如SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A11等。
大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞，若為與天然細胞相比Bicarbonate輸送蛋白的表現量為增加之細胞，則無特別限定。天然細胞並無特別限定，例如可舉出CHO細胞等製造重組蛋白時用為宿主之細胞。
使細胞所大量表現之Bicarbonate輸送蛋白可為來自任何生物之Bicarbonate輸送蛋白，無特別限定。具體可舉出來自人類或小鼠、大鼠、倉鼠等囓齒類，黑猩猩、牛、馬、犬、狼等哺乳類，雞等鳥類，斑馬魚、鰻魚等魚類，果蠅等昆蟲類等來自生物之Bicarbonate輸送蛋白，而以人類、囓齒類或與宿主細胞來源相同種之Bicarbonate輸送蛋白為佳，例如使Bicarbonate輸送蛋白大量表現之細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)時，以來自人類或倉鼠之Bicarbonate輸送蛋白為佳。
大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞可為動物細胞、植物細胞、酵母等真核細胞；大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞之任一種細胞，以CHO細胞、COS細胞等動物細胞為佳，CHO細胞特佳。另外，為製造所期望的多肽，以使用CHO dhfr-細胞等適合導入所期望的基因之細胞為佳。
大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞可舉出例如經人為地導入Bicarbonate輸送蛋白基因(例如SLC4陰離子交換蛋白基因、SLC26陰離子交換蛋白基因等)之細胞。經人為地導入Bicarbonate輸送蛋白基因之細胞可依相關業者周知之方法進行製作，例如可將Bicarbonate輸送蛋白之基因插入載體，再以該載體使細胞成為轉化細胞而進行製作。進而，於本說明書中，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號冊子)，使內源性Bicarbonate輸送蛋白基因被活化，其結果包含大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞，及經人為導入Bicarbonate輸送蛋白基因之細胞。
導入細胞之SLC4陰離子交換蛋白基因，可舉出下列(a)～(e)之任一種編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA。
(a)編碼具有序列編號2之胺基酸序列的多肽之DNA
(b)編碼於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個或複數個(例如為數個)胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA
(c)編碼具有與序列編號2之胺基酸序列50%以上之相似性，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA
(d)具有序列編號1之鹼基序列之DNA
(e)編碼使具有序列編號1之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA。
SLC4陰離子交換蛋白活性係包含為維持細胞內pH之恆定性及細胞容積，攝入培養基中之Cl- 及SO4 2- ，排出於細胞內之HCO3 - 與Borate的活性此一概念。
SLC4陰離子交換蛋白活性可依下述方式進行測定。藉由將使其表現SLC4功能之細胞以BCECF-AM此一pH感受性色素處理後，於灌沖含有或不含有Cl- 及Na+ 之培養基時所得之螢光強度比較，可測定細胞內pH(pHi)之變化(Dahl NK. et.al.,J Biol Chem 2003；278:44949-44958；Fujinaga J. et.al.,J Biol Chem 1999；274:6626-6633)。
本發明中，編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA，以使用編碼具有序列編號2之胺基酸序列之多肽之DNA為佳。其他亦可使用編碼於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個或複數個(例如為數個)胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA。序列編號2之胺基酸序列係人類AE1之胺基酸序列。針對AE1，除人類以外，小鼠、大鼠、黑猩猩、牛、馬、犬、狼、雞、斑馬魚等之序列資訊，係登錄於小鼠GeneBank NM_011403、大鼠GeneBank NM_012651、黑猩猩GenBank XM_001151353、牛GeneBank NM_181036、馬GeneBank NM_001081788、犬GenBank AB242566、狼GeneBank NM_001048031、雞GenBank NM_205522、斑馬魚GenBank NM_198338等，而可加以利用。針對其他SLC4陰離子交換蛋白亦於各種數據資料中登錄有序列之資訊可加以利用。
於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個或複數個(例如為數個)胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽，係與人類、小鼠、大鼠、雞、黑猩猩、牛、馬、犬、狼、雞、斑馬魚之SLC4陰離子交換蛋白(以下有時略記為「人類等之SLC4陰離子交換蛋白」)具相同功能之多肽。該等多肽包含例如人類等之SLC4陰離子交換蛋白之異型體等。於後述之實施例中，即使用編碼公開之人類SLC4陰離子交換蛋白基因(AE1基因)之911個胺基酸中，有4個胺基酸(L88R、E693G、V712A、H834Y)被取代之異型體。
為調製與某種多肽功能相同的多肽，相關業者熟知之方法已知有將突變導入多肽之方法。例如該領域之業者可使用特定部位的誘發突變法(Hashimoto-Gotoh,T. et al.(1995)Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W. et al.(1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82,488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85,2763-2766)等，藉由於人類等之SLC4陰離子交換蛋白之胺基酸導入適當的突變，可調製與人類等之SLC4陰離子交換蛋白功能相同的多肽。自然界亦會產生胺基酸之突變。
與人類等之SLC4陰離子交換蛋白功能相同的多肽，具體而言可舉出人類等之SLC4陰離子交換蛋白之胺基酸序列(例如序列編號2之胺基酸序列)中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之胺基酸為缺失者，人類等之SLC4陰離子交換蛋白之胺基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之胺基酸為附加者，人類等之SLC4陰離子交換蛋白之胺基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之胺基酸為被取代者。
突變的胺基酸殘基並未特別加以限定，但希望是保存胺基酸側鏈性質而變異為其他胺基酸。胺基酸側鏈性質可舉出例如為疏水性胺基酸(A、1、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族側鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)，具含羥基側鏈之胺基酸(S、T、Y)，具含硫磺原子側鏈之胺基酸(C、M)，具含有碳酸及醯胺之胺基酸(D、N、E、Q)，具含鹼基側鏈之胺基酸(R、K、H)，具含芳香族側鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內係表示各胺基酸之縮寫)。
對某些胺基酸序列，具有藉由1個或複數個胺基酸殘基之缺失、附加及/或以其他胺基酸取代修飾後之胺基酸序列之多肽，已知其如何維持生物學上的活性(Mark,D. F.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81,5662-5666、Zoller,M. J. & Smith,M. Nucleic Acids Research(1982)10,6487-6500、Wang,A. et al.,Science 224,1431-1433、Dalbadie-McFarland,G. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79,6409-6413)。
於人類等之SLC4陰離子交換蛋白經附加1個或複數個胺基酸殘基後之多肽，可舉出例如含人類等之SLC4陰離子交換蛋白之融合多肽。融合多肽係人類等之SLC4陰離子交換蛋白，與其他多肽進行融合者。製作融合多肽之方法，可使編碼人類等之SLC4陰離子交換蛋白之基因與編碼其他多肽之基因之框架一致而進行連結，再將其導入表現載體，於宿主內使其表現，可使用相關業者周知之方法。並未特別限定與人類等之SLC4陰離子交換蛋白進行融合所附加的其他多肽。
與人類等之SLC4陰離子交換蛋白進行融合所附加的其他多肽可舉出例如FLAG(Hopp,T. P. et al.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、由6個His(組胺酸)殘基所構成之6×His、10×His、流感病毒血凝素(HA)、人類c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-tubulin片段、B-tag、Protein C片段、GST(麩胺基硫轉移酶)、HA(流感病毒血凝素)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。
使市售之編碼該等多肽之基因，與編碼人類等之SLC4陰離子交換蛋白之基因進行融合，藉由使該等經調製後之融合基因進行表現，而可調製融合多肽。
相關業者熟知之調製與某些多肽具同等功能之多肽之方法，可舉出利用雜交技術(Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)之方法。亦即，相關業者一般會進行以編碼人類等之SLC4陰離子交換蛋白之DNA序列(例如序列編號1之DNA序列)或其一部分為基礎，分離出與其相似性高之DNA，再自該DNA中分離出與人類等之SLC4陰離子交換蛋白同等功能之多肽。
為分離出編碼具有與人類等之SLC4陰離子交換蛋白同等功能之多肽之DNA，相關業者可適當地選擇進行雜交之條件。雜交的條件可舉出例如低限制條件。低限制條件係可舉出例如於42℃，2×SSC，0.1%SDS，以50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件，不僅可於溫度降低時，可獲得具有高相似性的DNA，亦可獲得僅具有低相似的DNA。反之，升高溫度時，可期待僅獲得具有高相似性的DNA。然而，影響雜交嚴格條件的要素認為除溫度之外，尚有鹽濃度等複數個要素，相關業者可適宜地藉由選擇該等要素，而可實現相同的嚴格條件。
藉由該等雜交技術分離之DNA所編碼的多肽，若為與人類等之SLC4陰離子交換蛋白之胺基酸序列具70%以上之相似性者為佳，一般具有與人類等之SLC4陰離子交換蛋白高相似性的胺基酸序列。高相似性一般係指具有97%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。決定多肽之相似性係以遵循文獻(Wilbur W. J,and Lipman D. J. Proc Natl Acad Sci USA(1983)80,726-730)所記載之規則系統為佳。
本發明之多肽，可藉由後述之生產細胞及宿主，或是純化方法，可獲得不同的胺基酸序列、分子量、等電點或有無糖鏈及形態等。然而所得之多肽不限於與人類等之SLC4陰離子交換蛋白具同等功能，亦可於本發明中利用編碼其之DNA。例如使用原核細胞例如大腸桿菌表現多肽時，於原本的多肽之胺基酸序列N端末端上附加甲硫胺酸殘基。另外，以真核細胞例如哺乳動物細胞進行表現時，N端末端之訊息序列會被除去。可於本發明中利用編碼該類型多肽之DNA。
本發明中，編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA，亦可使用編碼具有序列編號1之鹼基序列之DNA。其他亦可使用編碼使具有序列編號1之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA。序列編號1之鹼基序列係人類AE1之鹼基序列。針對AE1，除人類以外，小鼠、大鼠、黑猩猩、牛、馬、犬、狼、雞、斑馬魚等之序列資訊，係登錄為小鼠GenBank NM_011403、大鼠GeneBank NM_012651、黑猩猩GenBank XM_001151353、牛GeneBank NM_181036、馬GeneBank NM_001081788、犬GenBank AB242566、狼GeneBank NM_001048031、雞GenBank NM_205522、斑馬魚GenBank NM_198338等，而可加以利用。針對其他SLC4陰離子交換蛋白亦於各種數據資料中登錄有序列之資訊可加以利用。
編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA，除可利用於如上所述之所期望的多肽於in vivo及in vitro之生產之外，亦可用於製作大量表現SLC4陰離子交換蛋白之細胞。編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA若為可編碼SLC4陰離子交換蛋白，可為任何一種形態。亦即，不限制為自mRNA所合成之cDNA、染色體DNA，或是化學合成DNA。另外，可編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA，包含具有以基因密碼之退化程度為基礎之任意鹼基序列之DNA。
編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA可根據相關業者周知之方法進行調製。例如以表現SLC4陰離子交換蛋白之細胞製作cDNA庫，再將編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA序列(例如序列編號1)之一部分做為探針，藉由進行雜交而可調製。cDNA庫可根據例如Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)記載之方法進行調製，亦可使用市售之基因庫。藉由表現SLC4陰離子交換蛋白之細胞製作RNA，再以SLC4陰離子交換蛋白之DNA序列(例如序列編號1)為基礎而合成寡DNA，再將其使用為引子進行PCR反應，藉由使編碼SLC4陰離子交換蛋白之cDNA增幅而可進行調製。
藉由決定所得之cDNA之鹼基序列，可決定編碼其之轉譯區域，而可獲得SLC4陰離子交換蛋白的胺基酸序列。藉由將所得之cDNA做為探針篩選染色體DNA庫，可分離出染色體DNA。
具體以如下所述為佳。首先，自表現SLC4陰離子交換蛋白的細胞、組織等分離出mRNA。mRNA之分離方法可使用周知之方法，例如胍超離心法(Chirgwin,J. M. et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、AGPC法(Chomczynski,P. and Sacchi,N.,Anal. Biochem.(1987)162,156-159)等而調製全RNA，再使用mRNA Purification Kit(Pharmacia)等自全RNA中純化mRNA。另外，亦可藉由使用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia)而直接調製mRNA。
使用逆轉錄酵素自所得之mRNA合成cDNA。cDNA之合成可使用AMV Reverse Transcriptase First-strandcDNA Synthesis Kit(生化學工業)而進行。另外，使用引子等，遵循使用了5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)以及聚合脢連鎖反應(Polymerase chainreaction；PCR)之5’-RACE法(Frohman,M. A.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(1988)85,8998～9002；Belyavsky,A. et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)，可進行cDNA之合成以及增幅。
自所得之PCR產物調製目標之DNA片段，再與載體DNA進行連結。進而，再根據製作重組載體，導入大腸桿菌後選擇菌落後，可調製所期望的重組載體。目標DNA之鹼基序列可根據周知之方法例如雙去氧核醣核酸鏈停止法而加以確認。
編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA中，考慮表現時所使用之宿主之密碼子使用頻度，可設計更高表現效率之鹼基序列(Grantham,R. et.al.,Nucelic Acids Research(1981)9,r43-74)。編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA可根據市售之試劑組及周知之方法而改變。改變係可舉出藉由限制酶進行消化、合成寡核苷酸及插入適當的DNA質體，連結子之附加，起始密碼子(ATG)以及/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)之插入等。
編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA又包含使具有序列編號1之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交之DNA，且編碼具有與SLC4陰離子交換蛋白同等功能之多肽之DNA。
嚴格的條件，相關業者可適當地選擇，可舉出例如低限制條件。低限制條件可舉出例如42℃，2×SSC，0.1%SDS，50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件中，溫度上升愈高，可獲得具有高相似性的DNA。上述進行雜交之DNA以天然來源之DNA為佳，例如cDNA或染色體DNA。
該等因雜交技術而被分離之DNA，一般具有與編碼人類等之SLC4陰離子交換蛋白之DNA於鹼基序列具有高相似性。編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA，可編碼與人類等之SLC4陰離子交換蛋白具同等功能之多肽，亦包含與編碼人類等之SLC4陰離子交換蛋白之DNA具有高相似性的DNA。高相似性一般係指具有96%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。鹼基序列之相似性係可根據Karlin and Altschul之規則系統BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5877,1993)而加以決定。以該規則系統為基礎，開發了稱作BLASTN及BLASTX之軟體(Altschul et al.,J. Mol. Biol.,215：403-410,1990)。根據以BLAST為基礎之BLASTN解析鹼基序列時，參數為例如score=100，wordlength=12。該等解析方法之具體步驟可見於網頁(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
導入細胞之Bicarbonate輸送蛋白基因，亦可為SLC26陰離子交換蛋白基因。SLC26陰離子交換蛋白基因之鹼基序列以及編碼其之肢基酸序列之資訊，登錄為GenBank AF331525(人類putati ve SLC26A9)，GenBank NM_052934(人類SLC26A9 variant 1)，GenBank NM_134325(人類SLC26A9 variant 2)，GenBank NM_134420(小鼠SLC26A6)，GenBank NM_177243(小鼠SLC26A6)，GenBank AY240025(果蠅Slc26d9702)，GenBank AY240023(果蠅Slc26d6928)，GenBank AY240022(果蠅Slc26d6125)，GenBank AY240021(果蠅Slc26d5002)，GenBank AB084425(鰻魚Slc26A6)等，而可加以利用。
亦可將編碼Bicarbonate輸送蛋白之DNA插入載體。
所使用之載體，於例如以大腸桿菌做為宿主時，為使以大腸桿菌(例如JM109、DH5α、HB101、XL1Blue)等大量增幅且大量調製載體，於大腸桿菌中具有為進行增幅之「ori」，進而以具有轉化後大腸桿菌選擇基因(例如可藉由某些藥劑(氨比西林及四環黴素、克耐黴素、氯絲菌素)而可進行判別之耐藥劑性基因)者為佳。載體可舉出M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外以cDNA之次擇殖、切出為目的時，除上述載體之外，可舉出例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。於生產所期望的多肽此一目的而使用載體時，特別適合表現載體。表現載體為例如以於大腸桿菌進行表現為目的時，載體除了具有如可使大腸桿菌進行增幅之上述特徵，以JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等做為宿主時，以具有可使大腸桿菌以高效率表現之啟動子，例如lacZ啟動子(Ward等人，Nature(1989)341,544-546；FASEB J.(1992)6,2422-2427)、araB啟動子(Better等人，Science(1988)240,1041-1043)或T7啟動子等為佳。該等載體除上述載體外可舉出pGEX-5X-1(Pharmacia公司製)、「QIAexpress system」(Qiagen公司製)、pEGFP或pET(此時宿主為表現T7 RNA聚合酶之BL21為佳)等。
於載體亦可含有為分泌多肽之訊息序列。為分泌多肽之訊息序列，於使大腸桿菌之胞質週緣區生產時，可使用pelB訊息序列(Lei,S. P. et al J. Bacteriol.(1987)169,4379)。對宿主細胞導入載體時，可使用氯化鈣法，電穿孔法進行。
於使用大腸桿菌為宿主之外時，例如為製造所期望之多肽所使用之載體，可舉出來自哺乳動物之表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen公司製)，及pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990,18(17),p5322)，pEF，pCDM8)，來自昆蟲細胞之表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL公司製，pBacPAK8)，來自植物之表現載體(例如pMH1，pMH2)，來自動物病毒之表現載體(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，來自輪狀病毒之表現載體(例如pZIpneo)，來自酵母菌之表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen公司製)，pNV11，SP-Q01)，來自枯草桿菌之表現載體(例如pPL608，pKTH50)等。
以於CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞進行表現為目的時、為使於細胞內進行表現所必須的啟動子以具有例如SV40啟動子(Mulligan等人,Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)、CMV啟動子等為佳，以具有選殖轉化細胞之基因(例如藉由藥劑(紐奧黴素、G418等)可判別之耐藥劑性基因)為佳。具有該特性之載體，可舉出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
進而為使基因安定地進行表現，並且，以使細胞內之基因拷貝數增加為目的時，可舉出於核酸合成路徑缺損之CHO細胞，導入具有可與其互補之DHFR基因之載體(例如pCHOI)，藉由滅殺除癌錠(MTX)使其增幅之方法。另外，以使基因短暫表現為目的時，可舉出使用於染色體上具有表現SV40 T抗原基因之COS細胞，以具有SV40複製起點之載體(pcD等)進行轉化之方法。複製起點可使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等者。進而為於宿主細胞系增幅基因之拷貝數，表現載體之選擇標記為可含有肢基糖磷酸轉移酶(APH)基因、胸腺核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhrf)基因等。
導入有編碼Bicarbonate輸送蛋白之DNA(可為已插入載體者)之宿主細胞並無特別限制，可使用例如大腸桿菌等各種動物細胞。將可編碼所期望之多肽之DNA導入已導入有編碼Bicarbonate輸送蛋白之DNA之宿主細胞時，該宿主細胞可大量表現Bicarbonate輸送蛋白，可增加所期望之多肽之生產。亦可於已導入有編碼Bicarbonate輸送蛋白之DNA之宿主細胞中，進而導入可編碼CSAD或ALT之DNA(可為已插入載體者)。藉由於已導入有編碼Bicarbonate輸送蛋白之DNA之宿主細胞中，再導入編碼所期望之多肽之DNA與編碼CSAD或ALT之DNA，可增加所期望之多肽之生產量。為製造多肽之生產系有invitro及in vivo之生產系。in vitro之生產系可舉出使用真核細胞之生產系及使用原核細胞之生產系。
使用經人為地導入Bicarbonate輸送蛋白基因之細胞而製造所期望之多肽時，Bicarbonate輸送蛋白基因與編碼所期望之多肽之基因導入之順序並無特別限定，可於導入Bicarbonate輸送蛋白基因後，再導入編碼所期望之多肽之基因，亦可於導入編碼所期望之多肽之基因後，再導入Bicarbonate輸送蛋白基因。另外亦可同時導入Bicarbonate輸送蛋白基因與編碼所期望之多肽之基因。
可以單一個載體同時導入Bicarbonate輸送蛋白基因與編碼所期望之多肽之基因，亦可使用複數個載體分別進行導入。
大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞，為製造所期望之多肽，以進而可大量表現半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)或丙肢酸轉肢酵素(ALT)的細胞為佳。於除Bicarbonate輸送蛋白外亦大量表現CSAD或ALT之細胞導入可編碼所期望之多肽之基因，藉將該細胞於培養基中進行培養，可製造更大量的所期望的多肽。
已知CSAD係將3-半胱亞磺酸丙肢酸變換為次牛磺酸之酵素，藉由使其於CHO細胞內大量表現，而可合成過剩量之β-丙肢酸。
大量表現CSAD之細胞，若為與天然的細胞相比為CSAD的表現量增加之細胞則無特限定。未限定為天然的細胞，例如可舉出CHO細胞等製造重組蛋白質時使用為宿主之細胞。
使細胞大量表現之CSAD，並未特別限定為來自何種生物之CSAD。具體可舉出來自人類、小鼠、大鼠、倉鼠等囓齒類，河豚類之虎豚，海鞘類之玻璃海鞘等來自生物的CSAD，以來自人類、囓齒類或與宿主細胞相同種來源的CSAD為佳，例如使細胞大量表現CSAD之細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)，以來自人類或倉鼠之CSAD為佳。
大量表現CSAD的細胞，可舉出例如經人為導入CSAD基因的細胞。可根據相關業者周知之方法，製作經人為導入CSAD基因的細胞，例如可藉由將CSAD之基因插入載體，再以該載體使細胞成為轉化細胞而進行製作。進而，於本說明書中，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號冊子)，使內源性CSAD基因被活化，其結果包含大量表現CSAD之細胞，及經人為導入CSAD基因之細胞。
導入細胞之CSAD基因，可舉出編碼CSAD之下列(a1)~(e1)之任一種DNA。
(a1)可編碼具序列編號4或UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot and TrEMBL)小鼠CSAD(Q64611)，小鼠CSAD_(Q9DBE0)或人類CSAD_(Q9Y600)之胺基酸序列的多肽之DNA
(b1)編碼於具序列編號4或UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot and TrEMBL)小鼠CSAD(Q64611)，小鼠CSAD_(Q9DBE0)或人類CSAD_(Q9Y600)之肢基酸序列中，具有1個或複數個(例如有數個)肢基酸被取代、缺失、附加及/或被插入的肢基酸序列，且具有CSAD活性的多肽之DNA
(c1)編碼具有與具序列編號4或UniProtKnowledgebase(Swiss-Prot and TrEMBL)小鼠CSAD(Q64611)，小鼠CSAD_(Q9DBE0)或人類CSAD_(Q9Y600)之肢基酸序列70%以上相同性，且具有CSAD活性的多肽之DNA
(d1)具有序列編號3之鹼基序列或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSADNM_015989之鹼基序列之DNA
(e1)於具有序列編號3之鹼基序列或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSAD NM_015989之鹼基序列之DNA，與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有CSAD活性的多肽之DNA
CSAD 活性係包含將3-sulfino-L-alanine=hypotaurine+CO2 做為觸媒，並使碳酸脫去之活性此一概念。L-cysteic acid亦具有使碳酸脫去之活性(EC-Number4.1.1.29)。
CSAD活性可依下述方式進行測定。
如Davis K.et.al.,J Biomed Sci 2001；8:359-364所示，定量自L-[1-14 C]cysteic acid，根據CSAD之去碳酸酵素活性所生成之14 CO2 。
本發明中編碼CSAD之DNA係以使用編碼具序列編號4之肢基酸序列或UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot and TrEMBL)小鼠CSAD(Q64611)，小鼠CSAD_(Q9DBE0)或人類CSAD_(Q9Y600)之胺基酸序列之多肽之DNA為佳。其他亦可使用編碼於具序列編號4或UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot and TrEMBL)小鼠CSAD(Q64611)，小鼠CSAD_(Q9DBE0)或人類CSAD_(Q9Y600)之胺基酸序列中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或被插入的胺基酸序列，且具有CSAD活性的多肽之DNA。
具序列編號4或UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot and TrEMBL)小鼠CSAD(Q64611)，小鼠CSAD_(Q9DBE0)或人類CSAD_(Q9Y600)之胺基酸序列中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、附加及/或被插入的胺基酸序列，且具有CSAD活性的多肽，係與倉鼠、大鼠、小鼠、人類(以下亦有記做「倉鼠等之CSAD」)功能相同的多肽。於該類型之多肽中亦包含倉鼠等之CSAD之異型體等。
為調製與某種多肽功能相同的多肽，相關業者熟知之方法已知有將突變導入多肽之方法。例如該領域之業者可使用特定部位的誘發突變法(Hashimoto-Gotoh,T. et al.(1995)Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Methods Enzymo,. 100,468-500、Kramer,W. et al.(1984) Nucleic Acids Res.12，9441-9456、KramerW，and Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82,488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85,2763-2766)等，藉由於倉鼠等之CSAD之肢基酸導入適當的突變，可調製與倉鼠等之CSAD功能相同的多肽。自然界亦會產生肢基酸之突變。
與倉鼠等之CSAD功能相同的多肽，具體而言可舉出倉鼠等之CSAD之肢基酸序列(例如序列編號4之肢基酸序列或UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot and TrEMBL)小鼠CSAD(Q64611)，小鼠CSAD_(Q9DBE0)或人類CSAD_(Q9Y600)之肢基酸序列)中，具有1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之肢基酸為缺失者，倉鼠等之CSAD之肢基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之肢基酸為附加者，倉鼠等之CSAD之肢基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之肢基酸為被取代者。
突變的肢基酸殘基並未特別加以限定，但希望是保存肢基酸側鏈性質而變異為其他肢基酸。肢基酸側鏈性質可舉出例如為疏水性肢基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性肢基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族側鏈之肢基酸(G、A、V、L、I、P)，具含羥基側鏈之肢基酸(S、T、Y)，具含硫磺原子側鏈之胺基酸(C、M)，具含有碳酸及醯胺之胺基酸(D、N、E、Q)，具含鹼基側鏈之胺基酸(R、K、H)，具含芳香族側鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內係表示各胺基酸之縮寫)。
對某些胺基酸，具有藉由1個或複數個胺基酸殘基之缺失、附加及/或以其他胺基酸取代修飾後之胺基酸序列之多肽，已知其如何維持生物學上的活性(Mark,D. F.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81,5662-5666、Zoller,M. J. & Smith,M. Nucleic Acids Research(1982)10,6487-6500、Wang,A. et al.,Science 224,1431-1433、Dalbadie-McFarland,G. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79,6409-6413)。
倉鼠等之CSAD經附加1個或複數個胺基酸殘基後之多肽，可舉出例如含倉鼠等之CSAD之融合多肽。融合多肽係倉鼠等之CSAD與其他多肽進行融合者。製作融合多肽之方法，可使編碼倉鼠等之CSAD之基因與編碼其他多肽之基因之框架一致而進行連結，再將其導入表現載體，於宿主內使其表現，可使用相關業者周知之方法。並未特別限定與倉鼠等之CSAD進行融合所附加的其他多肽。
與倉鼠等之CSAD進行融合所附加的其他多肽可舉出例如FLAG(Hopp,T. P. et al.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、由6個His(組胺酸)殘基所構成之6×His、10×His、流感病毒血凝素(HA)、人類c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、、T7-tag、HSV-tag、E-tag 、SV40T抗原片段、lck tag、α-tubulin片段、B-tag、Protein C、GST(麩肢基硫轉移酶)、HA(流感病毒血凝素)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。
使市售之編碼該等多肽之基因，與編碼倉鼠等之CSAD之基因進行融合，藉由使該等經調製後之融合基因進行表現，而可調製融合多肽。
相關業者熟知之調製與某些多肽具同等功能之多肽之方法，可舉出利用雜交技術(Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)之方法。亦即，相關業者一般會進行以編碼倉鼠等之CSAD之DNA序列(例如序列編號3之DNA序列或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSAD NM_015989之DNA序列)或其一部分為基礎，分離出與其相似性高之DNA，再自該DNA中分離出與倉鼠等之CSAD同等功能之多肽。
為分離出編碼具有與倉鼠等之CSAD同等功能之多肽之DNA，相關業者可適當地選擇進行雜交之條件。雜交的條件可舉出例如低限制條件。低限制條件係可舉出例如於42℃，2×SSC，0.1%SDS，以50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件，不僅可於溫度降低時，可獲得具有高相似性的DNA，亦可獲得僅具有低相似的DNA。反之，升高溫度時，可期待僅獲得具有高相似性的DNA。然而，影響雜交嚴格條件的要素認為除溫度之外，尚有鹽濃度等複數個要素，相關業者可適宜地藉由選擇該等要素，而可實現相同的嚴格條件。
藉由該等雜交技術分離之DNA所編碼的多肽，若為與倉鼠等之CSAD具70%以上之相似性者為佳，一般具有與倉鼠等之CSAD之胺基酸序列高相似性。高相似性一般係指具有97%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。決定多肽之相似性係以遵循文獻(Wilbur W. J,and Lipman D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80,726-730)所記載之規則系統為佳。
本發明之多肽，可藉由後述之生產細胞及宿主，或是純化方法，可獲得不同的胺基酸序列、分子量、等電點或有無糖鏈及形態等。然而所得之多肽不限於與倉鼠等之CSAD具同等功能，亦可於本發明中利用編碼其之DNA。例如大腸桿菌表現多肽時，於原本的多肽之胺基酸序列N端末端上附加甲硫胺酸殘基。另外，以真核細胞例如哺乳動物細胞進行表現時，N端末端之訊息序列會被除去。可於本發明中利用編碼該類型多肽之DNA。
本發明中，編碼CSAD之DNA，亦可使用編碼具有序列編號3之鹼基序列或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSAD NM_015989之鹼基序列之DNA。其他亦可使用編碼使具有序列編號3之鹼基序列或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSAD NM_015989之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有CSAD活性之多肽之DNA。
編碼CSAD之DNA，除可利用於如上所述之所期望的多肽於in vivo及in vitro之生產之外，亦可用於製作大量表現CSAD之細胞。編碼CSAD之DNA若為可編碼CSAD，可為任何一種形態。亦即，不限制為自mRNA所合成之cDNA、染色體DNA，或是化學合成DNA。另外，可編碼CSAD之DNA，包含具有以基因密碼之退化程度為基礎之任意鹼基序列之DNA。
編碼CSAD之DNA可根據相關業者周知之方法進行調製。例如以表現CSAD之細胞製作cDNA庫，再將編碼CSAD之DNA序列(例如序列編號3或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSAD NM_015989之鹼基序列)之一部分做為探針，藉由進行雜交而可調製。cDNA庫可根據例如Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)記載之方法進行調製，亦可使用市售之基因庫。藉由表現CSAD之細胞製作RNA，再以CSAD之DNA序列(例如序列編號3或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSAD NM_015989之鹼基序列)為基礎而合成寡DNA，再將其使用為引子進行PCR反應，藉由使編碼CSAD之cDNA增幅而可進行調製。
藉由決定所得之cDNA之鹼基序列，可決定編碼其之轉譯區域，而可獲得CSAD的肢基酸序列。藉由將所得之cDNA做為探針篩選染色體DNA庫，可分離出染色體DNA。
具體以如下所述為佳。首先，自表現CSAD的細胞、組織等分離出mRNA。mRNA之分離方法可使用周知之方法，例如胍超離心法(Chirgwin,J. M. et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、AGPC法(Chomczynski,P. and Sacchi,N.,Anal. Biochem.(1987)162,156-159)等而調製全RNA，再使用mRNAPurification Kit(Pharmacia)等自全RNA中純化mRNA。另外，亦可藉由使用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia)而直接調製mRNA。
使用逆轉錄酵素自所得之mRNA合成cDNA。cDNA之合成可使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業)而進行。另外，使用引子等，遵循使用了5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)以及聚合脢連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)之5’-RACE法(Frohman,M. A.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(1988)85,8998～9002；Belyavsky,A. et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)，可進行cDNA之合成以及增幅。
自所得之PCR產物調製目標之DNA片段，再與載體DNA進行連結。進而，再根據製作重組載體，導入大腸桿菌後選擇菌落後，可調製所期望的重組載體。目標DNA之鹼基序列可根據周知之方法例如雙去氧核醣核酸鏈停止法而加以確認。
編碼CSAD之DNA中，考慮表現時所使用之宿主之密碼子使用頻度，可設計更高表現效率之鹼基序列(Grantham,R. et. al.,Nucelic Acids Research(1981)9,r43-74)。編碼CSAD之DNA可根據市售之試劑組及周知之方法而改變。改變係可舉出藉由限制酶進行消化、合成寡核苷酸及插入適當的DNA質體，連結子之附加，起始密碼子(ATG)以及/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)之插入等。
編碼CSAD之DNA又包含使具有序列編號3之鹼基序列或GenBank小鼠CSAD NM_021750，小鼠CSAD NM_144942或人類CSAD NM_015989之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交之DNA，且編碼具有與CSAD同等功能之多肽之DNA。
嚴格的條件，相關業者可適當地選擇，可舉出例如低限制條件。低限制條件可舉出例如42℃，2×SSC，0.1%SDS，50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件中，溫度上升愈高，可獲得具有高相似性的DNA。上述進行雜交之DNA以天然來源之DNA為佳，例如cDNA或染色體DNA。
該等因雜交技術而被分離之DNA，一般具有與編碼倉鼠等之CSAD之DNA於鹼基序列具有高相似性。編碼ALT之DNA，可編碼與倉鼠等之CSAD具同等功能之多肽，亦包含與編碼與倉鼠等之CSAD之DNA具有高相似性的DNA。高相似性一般係指具有96%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。鹼基序列之相似性係可根據Karlin and Altschul之規則系統BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5877,1993)而加以決定。以該規則系統為基礎，開發了稱作BLASTN及BLASTX之軟體(Altschul et al.,J. Mol. Biol.,215：403-410,1990)。根據以BLAST為基礎之BLASTN解析鹼基序列時，參數為例如score=100，wordlength=12。該等解析方法之具體步驟可見於網頁(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
ALT已知為使丙胺酸之胺基轉移至2-氧戊二酸而使麩胺酸生成之酵素，藉由使其於CHO細胞等宿主細胞中大量表現，若可促進自丙胺酸合成丙酮酸及麩胺酸之反應，可期待TCA循環之代謝，及因糖新生而使葡萄糖被利用於合成，改善細胞培養的動向，而使所期望之多肽大量產生。
大量表現ALT之細胞，若為與天然的細胞相比為ALT的表現量增加之細胞則無特別限定。未特別限定為天然的細胞，例如可舉出CHO細胞等製造重組蛋白質時使用為宿主之細胞。
大量表現ALT之細胞，例如可舉出經人為地導入ALT基因之細胞。經人為導入ALT基因之細胞可根據相關業者周知之方法而進行製作，例如將ALT基因置入載體，再將以該載體使細胞進行轉化而可進行製造。進而，於本說明書中，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號冊子)，藉由使該細胞內源性的ALT基因被活化，其結果包含大量表現ALT之細胞及經人為地導入ALT基因之細胞。
於細胞內大量表現之ALT並未特別限定來自何種生物。具體而言已知有人類、小鼠、大鼠、犬類、非洲爪蟾、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲、日本米、原始紅藻、麵包酵母、棉蚜、白色念珠菌、裂殖酵母菌、小巢狀麴菌、煙色麴菌、清酒麴菌米麴菌、新型隱球菌、黏黴菌、錐蟲、細胞內寄生性原蟲利什曼原蟲大型亞種、痢疾阿米巴或細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲等之ALT，並可加以利用，以人類、囓齒類或與宿主細胞相同種來源之ALT為佳，例如使細胞大量表現ALT之細胞為中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)，以來自人類或倉鼠之ALT為佳。人類、小鼠、酵母等之ALT存在有Variant(ALT1與ALT2)。ALT2具有與ALT1相比於肢基酸尚有80%以上之相似性。於後述之實施例以及參考例中，強制使ALT進行表現。
導入細胞之ALT基因可舉出編碼ALT之下述之(a2)～(e2)之任一種DNA。
(a2)係編碼具有KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homosapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZY ME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZY ME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZY ME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Candida albican:CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergi11us oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之肢基酸序列之多肽之DNA
(b2)編碼於KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albican：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之胺基酸序列中，具有1個或複數個(例如為數個)胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有ALT活性之多肽之DNA
(c2)編碼具有與KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae:CMM066C、KEGG/ENZY ME:2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae:YLR089C、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae:YDR111C、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGRO85W、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Candida albicans:CaO19_346、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe:SPBC582.08、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Aspergillus nidulans:AN1923.2、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Aspergillus fumigatus:AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Aspergillus oryzae:AO090003000164、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21:CNG01490、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Dictyostelium discoideum:DDB_0232139、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma brucei:Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Leishmania major:LmjF12.0630、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histo1ytica:233.t00009、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histolytica:24.t00016、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:506529.420、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:506529.430、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:510889.120或KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:510889.140之肢基酸序列70%以上之相似性，且具有ALT活性之多肽之DNA
(d2)具有KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之鹼基序列之DNA
(e2)編碼使具有KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZY ME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有ALT活性之多肽之DNA。
ALT活性係包含催化肢基酸與α-酮酸間轉移肢基之酵素活性概念。
ALT之活性可如下述方式進行測定。
使用自動分析用丙肢酸轉肢酵素測定試藥(RAMPIA Liquid S-ALT許可編號20900AMZ00597000)，並以Rajamohan F. et. al. Protein Expression amd Purification(2006)48,81-89所示之方法求得ALT之活性值。
本發明中，編碼ALT之基因係以使用編碼具有KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major:LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之肢基酸序列之多肽之DNA為佳。其他亦可使用於上述之肢基酸序列中，具有1個或複數個肢基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之肢基酸序列，且具有ALT活性之多肽之DNA。
於KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae:YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZY ME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:510889.140之肢基酸序列中，具有1個或複數個肢基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之肢基酸序列，且具有ALT活性之多肽，有人類、小鼠、大鼠、犬類、非洲爪蟾、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲、日本米、原始紅藻、麵包酵母、棉蚜、白色念珠菌、裂殖酵母菌、小巢狀麴菌、煙色麴菌、清酒麴菌米麴菌、新型隱球菌、黏黴菌、錐蟲、細胞內寄生性原蟲利什曼原蟲大型亞種、痢疾阿米巴或細胞內寄生性原蟲克氏錐蟲等之ALT(以下亦記做「人類等之ALT」)功能相同的多肽。於該類型之多肽包含例如人類等之ALT之異型體。於後述之實施例以及參考例中，已公開之編碼人類ALT1基因之496個肢基酸中，使用4個肢基酸(R53S、Q72R、F286S、M332K)被取代之異型體。
為調製與某種多肽功能相同的多肽，相關業者熟知之方法已知有將突變導入多肽之方法。例如該領域之業者可使用特定部位的誘發突變法(Hashimoto-Gotoh,T. et al. (1995)Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M. (1983)Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82,488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85,2763-2766)等，藉由於人類等之ALT之肢基酸導入適當的突變，可調製與人類等之ALT功能相同的多肽。自然界亦會產生胺基酸之突變。
與人類等之ALT功能相同的多肽，具體而言可舉出人類等之ALT之胺基酸序列(例如KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZY ME：2.6.1.2/xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZY ME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candidaalbicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之肢基酸序列)中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之肢基酸為缺失者，人類等之ALT之肢基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之肢基酸為附加者，人類等之ALT之肢基酸序列中之1個或2個以上，1個以上30個以下更佳，最佳為1個以上10個以下之肢基酸為被其他胺基酸取代者。
突變的胺基酸殘基並未特別加以限定，但希望是保存胺基酸側鏈性質而變異為其他胺基酸。胺基酸側鏈性質可舉出例如為疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族側鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)，具含羥基側鏈之胺基酸(S、T、Y)，具含硫磺原子側鏈之胺基酸(C、M)，具含有碳酸及醯胺之胺基酸(D、N、E、Q)，具含鹼基側鏈之胺基酸(R、K、H)，具含芳香族側鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內係表示各胺基酸之縮寫)。
對某些胺基酸，具有藉由1個或複數個胺基酸殘基之缺失、附加及/或以其他胺基酸取代修飾後之胺基酸序列之多肽，已知其如何維持生物學上的活性(Mark,D. F. et a1.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81,5662-5666、Zoller,M. J. & Smith,M. Nucleic Acids Research(1982)10,6487-6500、Wang,A. et al.,Science 224,1431-1433、Dalbadie-McFarland,G. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79,6409-6413)。
於人類等之ALT經附加1個或複數個胺基酸殘基後之多肽，可舉出例如含人類等之ALT之融合多肽。融合多肽係人類等之ALT，與其他多肽進行融合者。製作融合多肽之方法，可使編碼人類等之ALT之基因與編碼其他多肽之基因之框架一致而進行連結，再將其導入表現載體，於宿主內使其表現，可使用相關業者周知之方法。並未特別限定與人類等之ALT進行融合所附加的其他多肽。
與人類等之ALT進行融合所附加的其他多肽可舉出例如FLAG(Hopp,T. P. etal.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、由6個His(組肢酸)殘基所構成之6×His、10×His、流感病毒血凝素(HA)、人類c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-tubulin片段、B-tag、Protein C的片段、GST(麩肢基硫轉移酶)、HA(流感病毒血凝素)、免疫球蛋白恆定區、p-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。
使市售之編碼該等多肽之基因，與編碼人類等之ALT之基因進行融合，藉由使該等經調製後之融合基因進行表現，而可調製融合多肽。
相關業者熟知之調製與某些多肽具同等功能之多肽之方法，可舉出利用雜交技術(Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,2nd ed.，9.47-9.58，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)之方法。亦即，相關業者一般會進行以編碼人類等之ALT之DNA序列(例如KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Homo sapiens(human):2875、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Mus musculus(mouse):76282、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei:Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Leishmania major:LmjF12.0630、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histolytica:233.t00009、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histolytica:24.t00016、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:506529.420、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:506529.430、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:510889.120或KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:510889.140之DNA序列)或其一部分為基礎，分離出與其相似性高之DNA，再自該DNA中分離出與人類等之ALT同等功能之多肽。
為分離出編碼具有與人類等之ALT同等功能之多肽之DNA，相關業者可適當地選擇進行雜交之條件。雜交的條件可舉出例如低限制條件。低限制條件係可舉出例如於42℃，2×SSC，0.1%SDS，以50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件，不僅可於溫度降低時，可獲得具有高相似性的DNA，亦可獲得僅具有低相似的DNA。反之，升高溫度時，可期待僅獲得具有高相似性的DNA。然而，影響雜交嚴格條件的要素認為除溫度之外，尚有鹽濃度等複數個要素，相關業者可適宜地藉由選擇該等要素，而可賃現相同的嚴格條件。
藉由該等雜交技術分離之DNA所編碼的多肽，若為與人類等之ALT之胺基酸序列具70%以上之相似性者為佳，一般具有與人類等之ALT高相似性的胺基酸序列。高相似性一般係指具有97%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。決定多肽之相似性係以遵循文獻(Wilbur W. J,and Lipman D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80,726-730)所記載之規則系統為佳。
本發明之多肽，可藉由後述之生產細胞及宿主，或是純化方法，可獲得不同的胺基酸序列、分子量、等電點或有無糖鏈及形態等。然而所得之多肽不限於與人類等之ALT具同等功能，亦可於本發明中利用編碼其之DNA。例如使用原核細胞例如大腸桿菌表現多肽時，於原本的多肽之胺基酸序列N端末端上附加甲硫胺酸殘基。另外，以真核細胞例如哺乳動物細胞進行表現時，N端末端之訊息序列會被除去。可於本發明中利用編碼該類型多肽之DNA。
本發明中，編碼ALT之DNA，亦可使用編碼具有KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human )：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog) ：609510、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Xenopus laevis(African clawed frog):444533、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly):Dmel-CG1640、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之鹼基序列之DNA。其他亦可使用編碼使具有前述之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有ALT活性之多肽之DNA。
編碼ALT之DNA，除可利用於如上所述之所期望的多肽於in vivo及in vitro之生產之外，亦可用於製作大量表現ALT之細胞。編碼ALT之DNA若為可編碼ALT，可為任何一種形態。亦即，不限制為自mRNA所合成之cDNA、染色體DNA，或是化學合成DNA。另外，可編碼ALT之DNA，包含具有以基因密碼之退化程度為基礎之任意鹼基序列之DNA。
編碼ALT之DNA可根據相關業者周知之方法進行調製。例如以表現ALT之細胞製作cDNA庫，再將編碼ALT之DNA序列(例如KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/xenopuslaevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dme1_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryzae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei：Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Leishmania major：LmjF12.0630、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：233.t00009、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Entamoeba histolytica：24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之DNA序列)之一部分做為探針，藉由進行雜交而可調製。cDNA庫可根據例如Sambrook,J. et al. Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)記載之方法進行調製，亦可使用市售之基因庫。藉由表現ALT之細胞製作RNA，再以ALT之DNA序列(例如KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly):Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F 10.8、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice):4342210、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice):4348524、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae:CMM066C、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae:YLR089C、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae:YDR111C、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Candida albicans:CaO19_346、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe:SPBC582.08、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Aspergillus nidulans:AN1923.2、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Aspergillus fumigatus:AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Aspergillusoryzae:AO090003000164、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21:CNG01490、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/ Dictyostelium discoideum :DDB_0232139、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma brucei:Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Leishmania major:LmjF12.0630、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histolytica:233.t00009、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histolytica:24.t00016、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.420、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：506529.430、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.120或KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma cruzi：510889.140之DNA序列)為基礎而合成寡DNA，再將其使用為引子進行PCR反應，藉由使編碼ALT之cDNA增幅而可進行調製。
藉由決定所得之cDNA之鹼基序列，可決定編碼其之轉譯區域，而可獲得ALT的肢基酸序列。藉由將所得之cDNA做為探針篩選染色體DNA庫，可分離出染色體DNA。
具體以如下所述為佳。首先，自表現ALT的細胞、組織等分離出mRNA。mRNA之分離方法可使用周知之方法，例如胍超離心法(Chirgwin,J. M. et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、AGPC法(Chomczynski,P. and Sacchi,N.,Anal. Biochem.(1987)162,156-159)等而調製全RNA,再使用mRNAPurification Kit(Pharmacia)等自全RNA中純化mRNA。另外,亦可藉由使用QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)而直接調製mRNA。
使用逆轉錄酵素自所得之mRNA合成cDNA。cDNA之合成可使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業)而進行。另外,使用引子等,遵循使用了5’一Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)以及聚合脢連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)之5’-RACE法(Frohman,M. A.,et.al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(1988)85,8998～9002；Belyavsky,A. et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)，可進行cDNA之合成以及增幅。
自所得之PCR產物調製目標之DNA片段，再與載體DNA進行連結。進而，再根據製作重組載體，導入大腸桿菌後選擇菌落後，可調製所期望的重組載體。目標DNA之鹼基序列可根據周知之方法例如雙去氧核醣核酸鏈停止法而加以確認。
編碼ALT之DNA中，考慮表現時所使用之宿主之密碼子使用頻度，可設計更高表現效率之鹼基序列(Grantham,R. et. al.,Nucelic Acids Research(1981)9,r43-74)。編碼ALT之DNA可根據市售之試劑組及周知之方法而改變。改變係可舉出藉由限制酶進行消化、合成寡核苷酸及插入適當的DNA質體，連結子之附加，起始密碼子(ATG)以及/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)之插入等。
編碼ALT之DNA又包含使具有KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：84706、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：76282、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Mus musculus(mouse)：108682、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Rattus norvegicus(rat)：81670、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Canis familiaris(dog)：609510、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/xenopus laevis(African clawed frog)：444533、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Drosophila melanogaster(fruit fly)：Dmel_CG1640、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Caenorhabditis elegans(nematode)：C32F10.8、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4342210、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Oryza sativa japonica(Japanese rice)：4348524、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cyanidioschyzon merolae：CMM066C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YLR089C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Saccharomyces cerevisiae：YDR111C、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Ashbya gossypii(Eremothecium gossypii)：AGOS_AGR085W、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Candida albicans：CaO19_346、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Schizosaccharomyces pombe：SPBC582.08、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus nidulans：AN1923.2、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus fumigatus：AFUA_6G07770、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Aspergillus oryZae：AO090003000164、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21：CNG01490、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Dictyostelium discoideum：DDB_0232139、KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Trypanosoma brucei:Tb927.1.3950、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Leishmania major:LmjF12.0630、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histolytica:233.t00009、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Entamoeba histolytica:24.t00016、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:506529.420、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:506529.430、KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:510889.120或KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Trypanosoma cruzi:510889.140之之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交之DNA，且編碼具有與ALT同等功能之多肽之DNA。
嚴格的條件，相關業者可適當地選擇，可舉出例如低限制條件。低限制條件可舉出例如42℃，2×SSC，0.1%SDS，50℃，2×SSC，0.1%SDS為佳。更佳者可舉出高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65℃，2×SSC，0.1%SDS。於該等條件中，溫度上升愈高，可獲得具有高相似性的DNA。上述進行雜交之DNA以天然來源之DNA為佳，例如cDNA或染色體DNA。
該等因雜交技術而被分離之DNA，一般具有與編碼人類等之ALT之DNA於鹼基序列具有高相似性。編碼ALT之 DNA，可編碼與人類等之ALT具同等功能之多肽，亦包含與編碼人類等之ALT之DNA具有高相似性的DNA。高相似性一般係指具有96%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上之相似性最佳。鹼基序列之相似性係可根據Karlin and Altschul之規則系統BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5877，1993)而加以決定。以該規則系統為基礎，開發了稱作BLASTN及BLASTX之軟體(Altschul et al.,J. Mol. Biol.,215：403-410,1990)。根據以BLAST為基礎之BLASTN解析鹼基序列時，參數為例如score=100，wordlength=12。該等解析方法之具體步驟可見於網頁(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
為製造所期望之多肽，可對大量表現Bicarbonate輸送蛋白與CSAD或ALT之細胞，導入可編碼所期望之多肽之基因，藉由將該細胞於培養基中進行培養，而可進行製造。
使用經人為地導入Bicarbonate輸送蛋白基因與CSAD或ALT基因之細胞而製造所期望之多肽時，Bicarbonate輸送蛋白基因與CSAD或ALT之基因及編碼所期望之多肽之基因之導入順序並無特別限定，可於導入Bicarbonate輸送蛋白基因與CSAD或ALT之基因後，再導入編碼所期望之多肽之基因，亦可於導入編碼所期望之多肽之基因後，再導入Bicarbonate輸送蛋白基因與CSAD或ALT之基因。另外亦可同時導入Bicarbonate輸送蛋白基因與CSAD或ALT之基因及編碼所期望之多肽之基因。
可以單一個載體同時導入Bicarbonate輸送蛋白基因、CSAD或ALT之基因與編碼所期望之多肽之基因，亦可使用複數個載體分別進行導入。
於培養大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞(亦可大量表現CSAD或ALT)時，可使用於培養一般的細胞(動物細胞為佳)時所使用的培養基。一般於該等培養基中包含胺基酸、維他命類、脂質因子、能量來源、滲透壓調節劑、鐵質來源、pH緩衝劑。該等成分的含量一般適當的範圍在胺基酸為0.05-1500mg/L、維他命類0.001-10mg/L、脂質因子0-200mg/L、能量來源1-20g/L、滲透壓調節劑0.1-10000mg/L、鐵質來源0.1-500mg/L、pH緩衝劑1-10000mg/L、微量金屬元素0.00001-200mg/L、界面活性劑0-5000mg/L、增殖輔助因子0.05-10000μg/L以及核苷酸0.001-50mg/L，但並未限定在此範圍，可根據培養的細胞種類、期望的多肽種類等而適宜地決定。
除上述成分外，亦可添加微量金屬元素、界面活性劑、增殖輔助因子、核苷酸等。
具體而言可舉例為含有L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天門冬醯胺、L-天門冬胺酸、L-半胱胺酸、L-胱胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-鳥胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-羥丁胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸等，以L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天門冬醯胺、L-天門冬胺酸、L-胱胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L一白肢酸、L一離肢酸、L一甲硫肢酸、L一苯丙肢酸、L一脯肢酸、L一絲肢酸、L一羥丁肢酸、L一色肢酸、L一酪肢酸、L一纈肢酸等肢基酸類為佳；i-肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、菸鹼肢、菸鹼酸、對肢基安息香酸、泛酸鈣、哆醛鹽酸鹽、維他命B6、維他命B2、維他命B1、維他命B12、抗壞血酸等，以生物素、葉酸、硫辛酸、菸鹼肢、泛酸鈣、哆醛鹽酸鹽、維他命B2、維他命B1、維他命B12、抗壞血酸等維他命類為佳；氯化膽鹼、酒石酸膽鹼、亞麻油酸、油酸、膽固醇等，以氯化膽鹼等脂質因子為佳；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，以葡萄糖等能量來源為佳；氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等，以氯化鈉等滲透壓調節劑為佳；EDTA鐵、檸檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等，以氯化鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等鐵質來源為佳；碳酸氫鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等，以碳酸氫鈉等pH緩衝劑的培養基為佳。
除上述成分外，亦可添加例如硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞矽酸鈉等，以硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等微量金屬元素為佳；Tween80、Pluronic F68等界面活性劑；以及重組型胰島素、重組型IGF-1、重組型EGF、重組型FGF、重組型PDGF、重組型TGF-α、鹽酸乙醇肢、亞硒酸鈉、維他命A酸、鹽酸四甲烯二肢等，以亞硒酸鈉、鹽酸乙醇肢、重組型IGF-1、鹽酸四甲烯二肢等增殖輔助因子為佳；去氧腺苷、去氧胞苷、去氧鳥糞嘌呤、腺苷酸、胞嘧啶、鳥糞嘌呤、尿嘧啶等核苷酸。於適合上述培養基之例中，含有鏈黴素、苄青黴素鉀以及紫黴素等抗生素，及酚紅等pH指示劑亦可。
培養基的pH依培養細胞而有所不同，但一般為pH6.8～7.6，大部分以pH7.0～7.4為適當。
培養基係市售之動物細胞培養用培養基，亦可使用例如D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle medium)、D-MEM/F-12 1:1 Mixture(Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMⅡ(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL 301(JRH biosciences公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、IS CHO-V(Irvine Scientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等培養基。
培養基亦可為無血清培養基。
大量表現Bicarbonate輸送蛋白細胞(亦可大量表現CSAD或ALT)為CHO細胞時，CHO細胞之培養可使用相關業者周知之方法進行培養。例如一般可於氣相CO2 濃度0-40%，2-10%為佳，以30-39℃，37℃為佳之下進行培養。
為使用大量表現Bicarbonate輸送蛋白之細胞(亦可大量表現CSAD或ALT)而產生所期望的多肽，適當的培養期間一般為1天～3個月，以1天～2個月為佳，1天～1個月更佳。
動物細胞培養用的各種培養裝置，可使用例如發酵槽型桶狀培養裝置、air lift型培養裝置、培養瓶型培養裝置、攪拌式反應瓶型培養裝置、微載體型培養裝置、流動層型培養裝置、中空纖維型培養裝置、旋轉瓶型培養裝置、充填槽型培養裝置等進行培養。
培養時可使用批次培養(batch culture)、饋料批次培養(fed-batch culture)、連續培養(continuous culture)等任一種方法，但以饋料批次培養或連續培養為佳，饋料批次培養更佳。
根據本發明之方法所製造之多肽，具有可利用為醫藥的生物學活性時，可藉由將該多肽與醫藥上所容許的載體或添加劑進行混合而製劑化，而可製造為醫藥品。
醫藥上所容許的載體以及添加劑可舉出例如水、醫藥上所容許之有機溶劑、膠質、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯聚合物、羧基甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡萄聚糖、羧基甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、洋菜、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、十八烷醇、硬酯酸、人類血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、被容許為醫藥添加物之界面活性劑等。
賃際之添加物可因應本發明治療劑之劑型，自上述之成分中以單一成分或適宜地組合選擇，當然亦未限定於該等物質。例如使用為注射用劑時，可使用將經純化的多肽溶解於溶劑例如生理食鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液等中，再將其與加入防止吸附劑例如Tween 80、Tween 20、明膠、人類血清白蛋白等者混合所得之溶液。亦可以為了於使用前再構成之劑型而經凍結乾燥者，提供為凍結乾燥之賦形劑可使用例如甘露醇、葡萄糖等糖醇及糖類。
多肽之有效投予量可根據多肽之種類、做為治療及預防對象之疾病的種類、患者年齡、疾病嚴重程度等適宜地加以選擇。例如多肽為抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白抗體時，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白抗體之有效投予量為每回每公斤之體重可選擇自0.001mg至1000mg之範圍。或可選擇每位患者0.01～100000mg/body之投予量。然而並未限制於該等投與量。
多肽之投予方法可為經口、非經口投予之任一種，以非經口投予為佳，具體而言可舉出注射(例如藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等進行全身或局部投予)、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。
本發明亦提供導入有編碼Bicarbonate輸送蛋白之DNA與編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙胺酸轉胺酵素之DNA之細胞(DNA均可為已插入載體者)。
使用真核細胞時，可使用動物細胞、植物細胞、真菌細胞做為宿主。動物細胞已知有哺乳動物細胞例如CHO(J. Exp. Med.(1995)108,945)、COS、3T3、骨髓瘤細胞、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero、兩棲類細胞例如非洲爪蛙卵母細胞(Valle,et a1.,Nature(1981)291,340-358)、或昆蟲細胞例如Sf9、Sf21、Tn5。CHO細胞則特別適合使用有DHFR基因缺損之CHO細胞dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980)77,4216-4220)及CHO K-1(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1968)60,1275)。動物細胞中，以大量表現為目的時以CHO細胞細胞為特佳。對宿主細胞導入DNA(可為已插入載體者)時可使用例如磷酸鈣法，DEAE葡聚醣法，陽離子脂質體DPTAP(Boehringer-mannheim公司製)之方法，電穿孔法，微脂粒感染等方法進行。
植物細胞已知有例如來自菸草(Nicotiana tabacum)之細胞做為多肽之生產系，可將其進行癒創組織培養。真菌細胞之酵母菌，已知有例如酵母菌(Saccharomyces)屬，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、線狀菌，例如麴菌(Aspergillus)屬，例如黑麴菌(Aspergillus niger)。
使用原核細胞時有使用細菌細胞之生產系。細菌細胞可舉出大腸桿菌(E. coli)，例如JM109、DH5 α、HB101等，其他已知有枯草桿菌。
該等細胞藉由目標之基因進行轉化，經進行轉化後之細胞可藉由in vitro培養，而得編碼目標基因之多肽。培養係可遵循周知之方法。例如動物細胞之培養液可使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此時可倂用牛胎兒血清(FCS)等血清輔助液，亦可為無血清培養。培養時之pH以約6~8為佳。培養一般於約30~40℃下進行15~200小時，可根據需要加入更換培養液、通氣、攪拌。
另外，於invivo多肽之生產系可舉出例如使用動物之生產系及使用植物之生產系。將目標之基因導入該等動物或植物中，於動物或植物體內使多肽產生，再進行回收。於本發明中「宿主」係包含該等動物、植物。
使用動物時有使用哺乳類動物、昆蟲之生產系。哺乳類動物可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。使用哺乳動物時可使用基因轉殖動物。
例如，將目標之基因，調製為與可編碼如山羊β一酪蛋白般於乳汁中原本會產生之多肽之基因之融合基因。其次，將含有該融合基因之基因片段注入山羊之胚胎中，再將該胚胎移植入雌山羊體內。自接受胚胎隻山羊所產出之轉殖山羊或其後代所生產的乳汁中，可獲得目標之多肽。為增加自轉殖山羊所生產的含有多肽之乳汁量，亦可適當地對轉殖山羊使用荷爾蒙(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
昆蟲可使用例如蠶。使用蠶時可藉由使蠶感染已插入可編碼目標多肽之基因之桿狀病毒，而可自該蠶肢體液中獲得目標之多肽(Susumu,M.et al.,Nature(1985)315,592-594)。
進而，使用植物時可使用例如菸草。使用菸草時，將可編碼目標多肽之基因插入植物表現用載體，例如pMON530，再將該載體導入如農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)般之細菌中。使該細菌感染菸草，例如菸草(Nicotiana tabacum)，可自該菸草之葉子獲得所期望之多肽(Julian K.-C.Ma et al.,Eur. J. Immunol.(1994)24,131-138)。
如此所得之多肽可自宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離出來，可純化為實質的純粹且均一的多肽。多肽之分離與純化一般係可使用用於多肽純化時之分離、純化方法，並無任何特別的限定。例如可適宜地選擇層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、溶媒沉澱、溶媒萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯肢膠體電泳、等電點電泳、透析、再結晶等，亦可將其組合而進行多肽之分離與純化。
層析法可舉出例如親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。該等層析方法中，可使用液相層析例如HPLC、FPLC等液相層析而進行。本發明使用該等純化方法，亦包含經高度純化之多肽。
可藉由於多肽純化前或純化後，使適當的多肽修飾酵素進行作用，而除去任意地加上修飾之部分的多肽。多肽修飾酵素可使用胰蛋白醯、糜蛋白酶、離肢基內切酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。
本發明中「經使DNA導入之細胞」或「經導入DNA之細胞」係指以基因重組技術將外來性DNA納入細胞之外，根據基因活化技術(例如參照國際公開第WO94/12650號冊子)，使內源性之DNA被活化，其結果係包含細胞開始或增加對應相關DNA之蛋白質之表現或相關DNA之轉錄此一概念。
 實施例
以下根據實施例具體說明本發明。且該等實施例係為說明本發明，並未限定本發明之範圍。
[實施例1]選殖人類肝細胞陰離子交換蛋白(Anion Exchanger 1,band 3)之基因
以市售之Human Liver QUICK-Clone cDNA(Clontech公司)為鑄型，以PCR法獲得來自人類肝細胞Anion Exchanger(AE1)基因。決定被選殖基因之鹼基序列，自與已公開之人類AE1之相似性，確認可編碼AE1。所得之AE1基因，發現2733鹼基中有8個位置(t263 g、t357c、a645t、a672c、c951t、a2078g、t2195c、c2500t)產生變異，編碼的肢基酸，911個中有4個肢基酸(L88R、E693G、V712A、H834Y)不同。但因被預測為具有13個膜貫穿區域之轉運蛋白(圖1)，將其做為來自人類肝細胞之AE1基因用於改變細胞。
[實施例2]藉由導入人類陰離子交換蛋白基因而使抗體產生量增加
將實施例1之藉由PCR選殖所取得之人類AE1(以下記為AE1)基因中加入Kozak序列，構築CMV啟動子表現質體pHyg-AE1(圖2)，pPur-AE1(圖3)。將未含有pHyg-AE1或AE1基因之pHyg表現質體(係將Clontech公司之源自pTK5之耐Hygromycin基因表現單位導入pSV2-dhrf質體(ATCC No.37146)後，經構築質體後，再去除dhrf表現單位者)，以電穿孔法，導入做為母株之可產生抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之CHO細胞(參照國際公開第WO2006/006693號冊子)，於Hygromycin(200μg/mL)存在下，並於靜置培養下高增殖之擴大之細胞株中，以pHyg-AE1細胞株調製Total RNA，再根據TaqMan法選拔大量表現人類AE1之5株。進而於震動培養下，將做為控制組之pHyg導入細胞(4株)與相同程度增殖之4株做為人類AE1導入細胞，進行抗體產生量比較。於初始密度為2×105 cells/mL之50mL搖瓶饋料批次培養中，搖動培養後期第12天之pHyg-AE1導入細胞(4株)之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量，較pHyg導入細胞(4株)有優勢表現(t檢定P<0.05，圖4)。
將pHyg-AE1導入細胞4株中抗體產生量最高之AE1表現株做為母株，以電穿孔法，導入含耐Puromycin基因之半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)表現質體之pPur-CSAD(圖10，後述之參考例2)，及含耐Puromycin基因之丙肢酸轉肢酵素(ALT1)表現質體之pPur-ALT1(圖11，後述之參考例4)，以及控制組表現質體pPur(Clontech公司之pPUR(a puromycin resistance expression vector))。於Puromycin(6μg/ml)存在下，並於靜置培養下高增殖之擴大之細胞株中，調製Total RNA，選拔大量表現了經新導入之基因之AE1/CSAD共同表現株(9株)、AE1/ALT1共同表現株(10株)、AE1/pPur共同表現株(8株)，再進行抗體生產量以及生存率之比較。初始為2×105 cells/mL之50mL搖瓶饋料批次培養中，AE1/CSAD共同表現株(9株)，相對於做為控制組之AE1/pPur共同表現株(8株)，於搖動培養後期第10天之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量(t檢定P<0.05，圖5)，及生存率(t檢定P<0.01，圖6)均佔優勢。3種共同表現株中，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量最高之細胞株為AE1/ALT1共同表現株(10株)，於搖動培養第8天，相對於做為控制組之AE1/pPur共同表現株(8株)佔優勢(t檢定P<0.01，圖7)。而當將AE1/ALT1共同表現株(10株)中於搖動培養檢討時產生最多抗體，且大量表現ALT1 mRNA之AA53(1497mg/L/8days))，以初始10×105 cells/mL進行1L瓶中饋料批次培養時，於培養第7天有1.9g/L/7day之短期培養下所產生最大量之抗體(圖8)。於培養第21天為5.3g/L之TauT/ALT1表現株TA41(後述之參考例4)，因於培養第7天為1.5g/L，故AA53為較TA41具有在短期間可產生更大量抗體之潛能，而認為適用於實際的生產。
上述結果顯示藉由人為地使陰離子交換蛋白(AE1)大量表現，或藉由同時使AE1與CSAD或ALT1大量表現，可獲得大量產生抗體之細胞。
大量表現AE1效果，可進而以使用大量表現AE1之宿主細胞構築抗IL-6R抗體產生株而揭示。對一般之宿主細胞DXB11，將pHyg-AE1(圖2)以電穿孔法進行導入，於Hygromycin(200μg/mL)存在下，選拔於靜置培養下高增殖之擴大之細胞株，將細胞株擴大者，以TaqMan法，將大量表現人類AE1之細胞樹立為AE1/DXB11宿主細胞。於AE1/DXB11宿主細胞中導入抗IL-6R抗體表現質體，經單一選殖後之AE1-S08細胞係可產生大量抗IL-6R抗體，如圖12所示，初始密度為7×105 cells/mL之1L瓶中饋料批次培養第14天之生產量為3.0g/L。於連續培養時，大量產生抗體之細胞AE1-S08以及宿主細胞AE1/DXB11均於安定試驗中呈現安定結果，確認可維持大量表現AE1。
由上述結果顯示導入AE1基因之效果，於導入抗體基因之前或之後，均呈現正面作用。
本發明可應用於全部產生多肽(以抗體為佳)之細胞。
[參考例1]選殖來自CHO細胞之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶(CSAD)基因
自對CHO DXB11細胞導入抗IL-6接受器抗體基因後之抗IL-6接受器抗體產生細胞(特開平8-99902號公報)進行萃取total RNA後，合成依賴Poly A之cDNA。以經SalI、XhoI、EcoRI三種限制酶進行片段化後之cDNA為鑄型，藉由PCR獲得Hamster CSAD基因。PCR引子使用已知之設計Rat與Mouse間基因序列被保存之含有5’，3’者。決定被選殖基因之鹼基序列，自與已知之生物種CSAD之相似性，確認可編碼Hamster CSAD(圖9)。Hamster CSAD為Mouse(96% Identity)、Rat(96% Identity)、Human(91% Identity)，與已知之胺基酸序列具高相似性，預測為具相同活性之酵素。倉鼠CSAD鹼基序列示於序列編號3。倉鼠CSAD胺基酸序列示於序列編號4。
[參考例2]構築表現倉鼠CSAD之Puromycin選拔用之質體
將參考例1藉由選殖所取得之Hamster CSAD(以下記做CSAD)基因加入Kozak序列，構築CMV啟動子表現質體pPur/CSAD(圖10)。
[參考例3]選殖人類肝細胞丙胺酸轉胺酵素(Alanine aminotransferase)基因
以市售之Human Liver QUICK-Clone cDNA(Clontech公司)為鑄型，以PCR法獲得來自人類肝細胞Alanine aminotransferase(ALT1)基因。決定被選殖基因之鹼基序列，自與已公開之人類ALT1之相似性，確認可編碼ALT1。所得之ALT1基因，發現1488鹼基中有5個位置(c157a、a215g、c765t、t857c、t995a)產生變異，編碼的肢基酸，496個中有4個肢基酸(R53S、Q72R、F286S、M332K)不同，但將其做為來自人類肝細胞之ALT1PCR選殖株而用於改變細胞。
[參考例4]藉由導入人類丙肢酸轉肢酵素而使抗體產生量增加
將參考例3之藉由選殖所取得之人類ALT1(以下記做ALT1)基因加入Kozak序列，構築CMV啟動子表現質體pPur-ALT1(圖 11)。將未含有pPur-ALT1或ALT1基因之pPur表現質體以電穿孔法導入做為母株之可產生抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之CHO細胞(參照國際公開第WO2006/006693號冊子)，於Puromycin(6μg/mL)存在下，選拔靜置培養下高增殖之細胞株(pPur-ALT1:7株，pPur:3株)。擴大後，以pPur-ALT1細胞株調製Total RNA，再根據TaqMan法選拔大量表現人類ALT1之6株，進而於震動培養下，將做為控制組之pPur導入細胞(3株)與相同程度增殖之4株做為人類ALT1導入細胞，進行抗體產生量比較。於初始密度為2×105 cells/mL之50mL搖瓶饋料批次培養中，搖動培養後期第17天之pPur-ALT1導入細胞(4株)之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量(1236±149mg/L)，較pPur導入細胞(3株)之抗體產生量(871±119mg/L)，有優勢表現(t檢定P<0.01)。當將於搖動培養檢討時產生最多抗體之pPur-ALT1表現株之A72以及Pur表現株之P41進行初始10×105 cells/mL之1L瓶中饋料批次培養時，A72之抗體產生量於培養第19天為2.9g/L，較P41之抗體產生量(2.2g/L)為高。於培養第14天以後因末發現P41之產生量增加，認為A72之高抗體產生量係由於維持生存率之效果(於培養第14天之生存率，表現pPur-ALT1之A72為60%，表現pPur之P41株為23%)。
將pHyg-TauT導入細胞T10(參照後述之參考例6)做為母株，將pPur-ALT1或pPur共同導入，選拔高增殖且大量表現人類ALT1之TauT/ALT1共同表現細胞(6株)，以及高增殖之TauT/pPur共同表現細胞(8株)，並進行初始密度為10×105 cells/mL之50mL搖瓶饋料批次培養。為表現ALT之TauT/ALT1共同表現株之搖動培養第4天之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量(745±87mg/L)，較TauT/pPur共同表現株之搖動培養第4天之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量(616±29mg/L)，有優勢表現(t檢定P<0.01)。
於搖動培養檢討時產生最多抗體，且大量表現ALT1 mRNA之TauT/ALT1共同表現株TA41(881mg/L/4days)，以初始10×105 cells/mL進行1L瓶中饋料批次培養時，期抗體產生量於培養第7天有1.3g/L，於培養第10天為3.0g/L，培養第12天為3.5g/L，培養第17天為4.6g/L，培養第21天為5.3g/L，相對於TauT/pPur共同表現株中生產量最高之控制組株之TP08(656mg/L/4days)明顯為高(於培養第10天為2.4g/L)。
[參考例5]選殖來自CHO細胞之倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因
自於CHO DXB11細胞導入抗IL-6接受器抗體基因之抗IL-6接受器抗體產生細胞(特開平8-99902號公報)，進行萃取totalRNA後，合成依賴Poly A之cDNA。以經SalI、XhoI、EcoRI三種限制酶進行片段化後之cDNA為鑄型，藉由PCR獲得Hamster牛磺酸轉運蛋白(TauT)基因。所使用之PCR引子係已知之設計為於Rat/Mouse TauT被保存之基因序列之含有5’，3’者。決定被選殖之基因之鹼基序列，自與已知之生物種的TauT之相似性，確認可編碼Hamster TauT(圖 13)。Hamster TauT胺基酸序列為Mouse(96% Identity)、Rat(96%Identity)、Hu man(93%Identity)，與TauT具高相似性，預測具12之膜貫穿區域之轉運蛋白(圖14)。
[參考例6]藉由導入倉鼠牛磺酸轉運蛋白而使生存細胞密度增加、抑制乳酸產生量以及增加抗體產生量
將參考例5之藉由選殖所取得之Hamster TauT(以下稱做TauT)基因中加入Kozak序列，構築CMV啟動子表現質體pHyg/TauT(圖15)。將除去pHyg/TauT或TauT基因之控制組質體pHyg，以電穿孔法，導入做為母株之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生CHO細胞(參照國際公開第WO2006/006693號冊子)。於Hygromycin(400μg/mL)存在下選拔導入表現質體之細胞後，將安定後增殖之細胞株全部擴大(pHyg/TauT：8株，pHyg；7株)。調製TauT mRNA後根據TaqMan法，將可確認相對於母株具優勢表現之7株做為pHyg/TauT導入細胞。導入細胞(7株)之mRNA平均表現量為控制組(7株)之約40倍。將共計14株之細胞以初始密度為2×105 cells /mL，進行50mL之搖瓶批次(batch)培養以及饋料批次(Fed-batch)培養，並比較培養後期第7天之生存細胞密度，乳酸產生量，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量。批次培養中伴隨細胞增殖，於培養液中會蓄積乳酸等阻礙生長物質，使增殖被抑制，但pHyg/TauT導入細胞之生存細胞密度(9.28±3.27×105 cells/mL)以及乳酸產生量(1.54±0.20g/L)，係相對於pHyg導入細胞(生存細胞密度：5.69±2.09×105 cells/mL，乳酸產生量1.75±0.15g/L)為優勢(t檢定P<0.05)。關於抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之生產量，pHyg/TauT導入細胞之7株中有4株(平均抗體生產量：440.6mg/L)，為pHyg導入細胞之最高值(389.6mg/L)以上。進而pHyg/TauT導入細胞之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之生產量之優勢性(t檢定P<0.01)可自饋料批次培養明確得知，前述4株中增殖能最高之pHyg/TauT導入細胞(T10)與母株進行1L之瓶中饋料批次培養之後，T10於培養第32天亦維持80%以上之生存率，且抑制乳酸產生。該結果，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之生產量於培養第35天達成2.9g/L。而以流式細胞儀分析可確認TauT導入之T10細胞於其細胞膜上表現TauT分子。上述結果顯示藉由經人為地使Hamster TauT表現，可提高產生抗體細胞之潛能，而可獲得大量產生抗體株。
本說明書所引用之全部刊物、專利以及專利申請，係直接參考而加入本說明書中。
[產業上之可利用性]
本發明可利用於多肽之生產。
序列表之非關鍵文字
<序列編號1>序列編號1係編碼人類AE1基因之鹼基序列(GenBank M27819)。
<序列編號2>序列編號2係人類AE1之胺基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot p02730)。
<序列編號3>序列編號3係編碼倉鼠CSAD基因之鹼基序列。
＜序列編號4＞序列編號4係倉鼠CSAD之胺基酸序列。
＜序列編號5＞序列編號5係編碼人類ALT1基因之鹼基序列(KEGG/ENZYME:2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875)。
＜序列編號6＞序列編號6係人類ALT1之胺基酸序列(KEGG/ENZYME：2.6.1.2/Homo sapiens(human)：2875)。
＜序列編號7＞序列編號7係編碼倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因之鹼基序列。
＜序列編號8＞序列編號8係倉鼠牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列。
[圖1]圖1係由來自人類肝臟細胞AE1之胺基酸序列，根據TMpred program所預測之膜貫穿區域以及方向為基礎，並參考Exo Physiol 91. 1 pp153-161,2006,Seth L. Alper之FIG.1.所做成之AE1膜之拓僕(topology)。
[圖2]圖2係為使人類AE1(911胺基酸)表現之Hygromycin選拔用質體。
[圖3]圖3係為使人類AE1(911胺基酸)表現之Puromycin選拔用質體。
[圖4]圖4係於50ml搖瓶饋料批次培養第12天，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。pHyg-AE1導入細胞(n=4)之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之產生量，較pHyg導入細胞(n=4)佔優勢(P<0.05)。
[圖5]圖5係於50ml搖瓶饋料批次培養第10天，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。於pHyg-AE1導入大量產生抗體細胞之pHyg-AE1-42株中導入pPur-CSAD之共同表現細胞AE1/CSAD株(n=9)，其抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之產生量，較於pHyg-AE1-42株中導入pPur之共同表現細胞之AE1/pPur(n=8)佔優勢(P<0.05)。
[圖6]圖6係於50ml搖瓶饋料批次培養第10天之生存率圖。於pHyg-AE1導入大量產生抗體細胞之pHyg-AE1-42株中導入pPur-CSAD之共同表現細胞AE1/CSAD株(n=9)之生存率，較於pHyg-AE1-42株中導入pPur之共同表現細胞AE1/pPur(n=8)佔優勢(P<0.01)。於培養第7天之生存率亦為P<0.01(data not shown)。
[圖7]圖7係係於50ml搖瓶饋料批次培養第8天，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。於為pHyg-AE1導入大量產生抗體細胞之pHyg-AE1-42株中導入pPur-ALT1之共同表現細胞AE1/ALT株(n=10)之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體，為AE1/CSAD株(n=9)以上，較於pHyg-AE1-42株中導入pPur之共同表現細胞AE1/pPur(n=8)佔優勢(P<0.01)。
[圖8]圖8係AE1/ALT1共同表現株之AA53之1L瓶中饋料批次培養之抗體產生量圖。於培養第7天抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量為1.9g/L。
[圖9]圖9係新穎地經選殖之來自CHO細胞之倉鼠CSAD基因之鹼基序列以及肢基酸序列。
[圖10]圖10係為使Hamster CSAD(493肢基酸)表現之Puromycin選拔用質體。
[圖11]圖11係為使人類ALT1(496肢基酸)表現之Puromycin選拔用質體。
[圖12]圖12係來自大量表現AE1宿主之抗IL-6R抗體產生細胞AE1-S08細胞之1L瓶中饋料批次培養之抗體產生量圖。於培養第14天抗IL-6R抗體產生量為3.0g/L。
[圖13]圖13係係新穎地經選殖之來自CHO細胞之倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因之鹼基序列以及肢基酸序列。
[圖14]圖14係由來自新穎地經選殖之來自CHO細胞之Hamster TauT之肢基酸序列，根據TMpred program所預測之膜貫穿區域以及方向為基礎，並參考Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.89，pp.8230-8234,September 1992,Shinichi Uchida et.al.之FIG.5.所做成之牛磺酸轉運蛋白膜之拓僕。◎係Hamster TauT特異之肢基酸殘基，於第2環(EX：細胞膜外區域)，第12個膜貫穿區域(TM)以及C端末端(1C：細胞內區域)中，存在大量與Human TauT相異之肢基酸。
[圖15]圖15係為使Hamster TauT(622肢基酸)表現之Hygromycin選拔用質體。

Claims (12)

  1. 一種抗體之製造方法，其係包含培養可大量表現碳酸氫根離子輸送蛋白，且經導入編碼所期望抗體之DNA之細胞，並使其產生所期望的抗體。
  2. 如申請專利範圍第1項之製造方法，其中可大量表現碳酸氫根離子輸送蛋白之細胞，係經導入編碼碳酸氫根離子輸送蛋白之DNA之細胞。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之製造方法，其中可大量表現碳酸氫根離子輸送蛋白之細胞，進而可大量表現半胱亞磺酸脫羧酶或丙胺酸轉胺酶。
  4. 如申請專利範圍第1項之製造方法，其中碳酸氫根離子輸送蛋白，係SLC4陰離子交換蛋白或SLC26陰離子交換蛋白。
  5. 如申請專利範圍第1項之製造方法，其中碳酸氫根離子輸送蛋白係SLC4陰離子交換蛋白。
  6. 如申請專利範圍第5項之製造方法，其中SLC4陰離子交換蛋白係AE1。
  7. 如申請專利範圍第1項之製造方法，其中細胞係中國倉鼠卵巢細胞。
  8. 如申請專利範圍第4項之製造方法，其中編碼SLC4陰離子交換蛋白之DNA係下述(a)~(e)之任何一種，(a)編碼具有序列編號2之胺基酸序列的多肽之DNA (b)在序列編號2之胺基酸序列中，編碼具有1個以上10個以下之胺基酸被取代、缺失、附加或/以及插入之胺基酸序列，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA(c)編碼具有與序列編號2之胺基酸序列97%以上之相似性，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA(d)具有序列編號1之鹼基序列之DNA(e)編碼使具有序列編號1之鹼基序列之DNA與互補之DNA於高度嚴格的條件下進行雜交，且具有SLC4陰離子交換蛋白活性之多肽之DNA。
  9. 一種醫藥品之製造方法，其係含有以申請專利範圍第1~8項中任一項之方法所製造之抗體。
  10. 一種細胞，其係導入有編碼碳酸氫根離子輸送蛋白之DNA與編碼所期望的抗體之DNA。
  11. 如申請專利範圍第10項之細胞，其係進而導入有編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙胺酸轉胺酶之DNA。
  12. 一種細胞，其係導入有編碼碳酸氫根離子輸送蛋白之DNA與編碼半胱亞磺酸脫羧酶或丙胺酸轉胺酶之DNA。
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