WO2010084947A1 - 異種ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

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WO2010084947A1
WO2010084947A1 PCT/JP2010/050786 JP2010050786W WO2010084947A1 WO 2010084947 A1 WO2010084947 A1 WO 2010084947A1 JP 2010050786 W JP2010050786 W JP 2010050786W WO 2010084947 A1 WO2010084947 A1 WO 2010084947A1
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seq
polypeptide
dna
amino acid
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PCT/JP2010/050786
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久大 田淵
朋也 杉山
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中外製薬株式会社
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01002—Alanine transaminase (2.6.1.2), i.e. alanine-aminotransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a heterologous polypeptide, and more particularly to a method for producing a polypeptide using cells that strongly express pyruvate carboxylase and alanine aminotransferase.
  • Alanine is a protein-constituting amino acid and a non-essential amino acid. In vivo, biosynthesis is performed by transferring the amino group of glutamic acid to pyruvic acid. Moreover, it decomposes by reverse reaction.
  • Non-patent Document 1 Alanine aminotransferase (EC 2.6.1.2.) (Non-patent Document 1) is known as an alanine-degrading enzyme, but this enzyme transfers the amino group of alanine to 2-oxoglutarate to produce glutamic acid.
  • Alanine aminotransferase is also called glutamine-pyruvate transaminase and is abbreviated as GPT (Non-patent Document 2).
  • GPT glutamine-pyruvate transaminase and is abbreviated as GPT (Non-patent Document 2).
  • GPT together with GOP (aspartate aminotransferase), is an enzyme contained in the liver and released into the blood when liver cells are destroyed. Diagnosed with failure.
  • alanine aminotransferase is used as a marker for liver function, it is not known how the host cell such as CHO cell that strongly expresses alanine aminotransferase behaves.
  • Patent Document 1 a method for improving primary energy metabolism of mammalian cell systems by introducing a yeast pyruvate carboxylase gene is known.
  • Patent Document 3 Korean et al. Produced human erythropoietin (hEPO) in human BHK-21 cells that had been introduced with yeast PC, resulting in a doubled product concentration compared to controls, and the introduction of PC. It has been reported that high production efficiency culture under glucose restriction is possible, and this makes it possible to reduce the accumulation of lactic acid in the culture medium (Non-patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 Produced 200% human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF) in CHO cells introduced with yeast PC, resulting in a 200% increase in yield and 65% reduction in lactic acid production.
  • Non-Patent Document 4 Elias et al. Show that introduction of the yeast PC gene into mammalian cells (HEK cells) and insect cells (Trichoplusia ni High-Five cells) increases the efficiency of glucose and glutamine utilization and suppresses the production of lactic acid and ammonia.
  • Non-patent document 5 Kim et al. Reported that the amount of lactic acid produced was suppressed in CHO cells into which human PC was introduced.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of producing a natural protein or a recombinant protein in a high production amount.
  • PC pyruvate carboxylase
  • ALT alanine aminotransferase
  • the reaction to biosynthesize pyruvate and glutamate from alanine can be promoted by strong ALT expression, it can be used for metabolism in the TCA cycle and glucose production by gluconeogenesis, improving cell culture behavior and High production is expected. Further, when the culture scale is increased (for example, from 1 L to 500 L), the production rate of lactic acid increases even under the same culture condition, so that the survival rate is lowered early. If the reaction to biosynthesize oxaloacetate and malic acid from cytoplasmic pyruvate can be promoted by strong PC expression, lactic acid production will be suppressed, and the culture behavior of cells will be improved. High production of the desired polypeptide is expected.
  • a desired polypeptide such as an antibody
  • the cells are in a considerably high density state (approximately 1 ⁇ 10 7 cells / ml) in the later stage of culture, and the influence of waste products such as lactic acid is extremely high.
  • a desired polypeptide is produced from cultured cells that strongly express PC and ALT, a high survival rate can be maintained even in the later stage of culture, and an improvement in the production amount of the desired polypeptide can be expected.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for producing a polypeptide comprising culturing cells in which DNA that strongly expresses pyruvate carboxylase and alanine aminotransferase and DNA encoding the desired polypeptide is introduced, and producing the desired polypeptide.
  • DNA encoding pyruvate carboxylase is any of the following (a1) to (e1): (a1) DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, or 94 (b1) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 94, one or more amino acids are substituted, deleted, added or / and DNA encoding a polypeptide having an inserted amino acid sequence and having pyruvate carboxylase activity (c1) having at least 70% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, or 94, and having pyruv
  • DNA encoding pyruvate carboxylase which is any of the following (a11) to (e11) (provided that SEQ ID NOs: 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91) And DNA having a base sequence of 93).
  • the production amount of a desired polypeptide can be increased.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a hamster pyruvate carboxylase (PC) gene cloned from CHO-DXB11 cells.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence identity of hamster pyruvate carboxylase (PC).
  • FIG. 3 is a Hygromycin selection plasmid expressing hamster pyruvate carboxylase (PC).
  • FIG. 4 is a Zeocin selection plasmid expressing hamster pyruvate carboxylase (PC).
  • FIG. 5 is an anti-glypican-3 antibody production amount plot on the 8th day of 50 ml shaker flask Fed-Batch culture.
  • FIG. 6 is a plot of anti-glypican-3 antibody production on the 7th day of 50-ml shaker flask Fed-Batch culture.
  • FIG. 7 is a plot of the amount of accumulated lactic acid on the 7th day of 50-ml shaker flask Fed-Batch culture.
  • FIG. 8 is a plasmid for puromycin selection in which human ALT1 (496 amino acids) is expressed.
  • FIG. 9 shows a plasmid for selection of Hygromycin in which human ALT1 (496 amino acids) was expressed.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide, comprising culturing cells into which DNA that strongly expresses PC and ALT and introducing a desired polypeptide is introduced, and producing the desired polypeptide.
  • the cell may be a natural cell capable of producing a desired polypeptide or a transformed cell into which DNA encoding the desired polypeptide is introduced. Transformed cells into which the encoding DNA has been introduced are preferred.
  • the desired polypeptide is not particularly limited, and antibodies (for example, anti-IL-6 receptor antibody, anti-IL-6 antibody, anti-glypican-3 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD20 antibody, anti-GPIIb / IIIa antibody, anti-TNF antibody, anti-CD25 antibody, anti-EGFR antibody, anti-Her2 / neu antibody, anti-RSV antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD52 antibody, anti-IgE antibody, anti-CD11a antibody, anti-VEGF antibody, anti-VLA4 antibody, etc.) And bioactive proteins (granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin, interferon, IL-1, IL-6 and other interleukins, t-PA, urokinase, Any polypeptide such as serum albumin, blood coagulation factor, and PTH may be used, but an antibody is particularly preferable.
  • the antibody may be used, but an
  • the amount of polypeptide produced by cells can be increased by using cells that strongly express PC and ALT of the present invention.
  • PC is a ligase group enzyme that irreversibly carboxylates pyruvate into oxaloacetate, and this reaction is the most important carbon fixation replenishment reaction that supplies the oxaloacetate necessary to rotate the citric acid cycle.
  • the present inventors believe that if the biosynthesis of oxaloacetate from pyruvate can be promoted in the cytoplasm by strongly expressing PC, lactic acid production is suppressed, cell culture behavior is further improved, and high production of the desired polypeptide is possible. This has been proved and the present invention has been completed.
  • ALT is originally known as an enzyme that transfers the amino group of alanine to 2-oxoglutarate to produce glutamic acid. If the present inventors can promote the reaction of biosynthesis of pyruvate or glutamate from alanine by strongly expressing it in a host cell such as CHO cells, it can be used for metabolism in the TCA cycle and glucose production by gluconeogenesis. Thus, the cell culture behavior was improved, and high production of the desired polypeptide was expected.
  • the cell that strongly expresses PC and ALT is not particularly limited as long as the expression level of PC and ALT is increased as compared with natural cells.
  • Natural cells are not particularly limited, and examples include cells that are used as hosts when producing recombinant proteins such as CHO cells.
  • the cells of the present invention may be any cells such as eukaryotic cells such as animal cells, plant cells and yeast; prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and animal cells such as CHO cells and COS cells are preferred, as will be described later.
  • CHO cells are preferred.
  • a cell suitable for introducing a desired gene such as a CHO dhfr-cell is preferred.
  • Examples of cells that strongly express PC and ALT include cells into which a PC gene and an ALT gene have been artificially introduced.
  • Cells into which the PC gene and ALT gene have been artificially introduced can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, by incorporating the PC gene and ALT gene into a vector and transforming the vector into the cell Can be produced.
  • endogenous PC genes and ALT genes are activated by gene activation technology (for example, see WO94 / 12650 pamphlet).
  • ALT gene is included in the artificially introduced cells.
  • the PC that is strongly expressed in the cells is not particularly limited and may be any organism-derived PC. Specifically, humans, rodents such as mice, rats and hamsters, mammals such as cows, yeast (Saccharomyces cerevisiae), fission yeast (Schizosaccharomyces) pombe), yeast Pichia stippitis, chicken, zebrafish, nematode, and Xenopus laevis organisms, preferably PCs derived from the same species as humans, rodents or host cells.
  • the strongly expressed cells are Chinese hamster ovary cells (CHO cells), it is preferably a human or hamster-derived PC.
  • the ALT that is strongly expressed in cells is not particularly limited and may be any ALT derived from any organism. Specifically, human, mouse, rat, dog, Xenopus, Drosophila, nematode, Japanese rice, atomic red algae, baker's yeast, filamentous fungus Ashbyabygossypii, fungus Candida albicans, fission yeast, fungus Aspergillus nidulans, fungus Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, fungus Cryptococcus neoformans, cellular slime mold Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, intracellular parasitic protozoa Leishmania major, Shigella amoeba Entamoeba histolytica or intracellular parasitic protozoa Trypanosoma cruzi, etc.
  • ALT1 is an ALT derived from the same species as the human, rodent or host cell.
  • the cell that strongly expresses ALT is a Chinese hamster ovary cell (CHO cell)
  • Variants exist in ALTs such as humans, mice, and yeasts.
  • ALT2 has 80% or more homology with ALT1 at the amino acid level. In the examples described below, ALT1 was forcibly expressed.
  • the order of introduction of the gene encoding the PC gene, the ALT gene, and the desired polypeptide is not particularly limited.
  • a gene encoding a desired polypeptide may be introduced after introducing the gene and the ALT gene, or a PC gene and an ALT gene may be introduced after introducing a gene encoding the desired polypeptide.
  • a PC gene and / or ALT gene and a gene encoding a desired polypeptide may be introduced simultaneously.
  • the introduction of the PC gene and the ALT gene may be performed simultaneously using a single vector, or may be performed separately using a plurality of vectors.
  • the introduction of the gene encoding the PC gene, the ALT gene, and the desired polypeptide may be introduced simultaneously using a single vector, or may be introduced separately using a plurality of vectors.
  • the cells that strongly express PC and ALT preferably further strongly express the taurine transporter in order to produce the desired polypeptide.
  • the taurine transporter is a membrane protein having an osmotic pressure regulating function capable of taking taurine, ⁇ -alanine and various amino acids into cells.
  • the cell that strongly expresses the taurine transporter is not particularly limited as long as the expression level of the taurine transporter is increased compared to natural cells.
  • Natural cells are not particularly limited, and examples include cells that are used as hosts when producing recombinant proteins such as CHO cells.
  • Examples of cells that strongly express the taurine transporter include cells into which a taurine transporter gene has been artificially introduced.
  • Cells into which the taurine transporter gene has been artificially introduced can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, by incorporating the taurine transporter gene into a vector and transforming the vector into the cell. Is possible.
  • endogenous taurine transporter gene is activated by gene activation technology (for example, see WO94 / 12650 pamphlet), and as a result, taurine transporter strongly expresses taurine transporter. Included in cells into which a gene has been artificially introduced.
  • the taurine transporter gene that is strongly expressed in cells is not particularly limited and may be any organism-derived taurine transporter gene. Specific examples include taurine transporters derived from organisms such as rodents such as humans, mice, rats, and hamsters, and are preferably taurine transporters derived from the same species as humans, rodents, or host cells. For example, when the cell that strongly expresses the taurine transporter is a Chinese hamster ovary cell (CHO cell), it is preferably a human or hamster-derived taurine transporter.
  • CHO cell Chinese hamster ovary cell
  • Examples of the taurine transporter gene may include any of the following DNAs (a3) to (e3) encoding the taurine transporter.
  • (a3) DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, 64, 66 or 68 (b3) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, 64, 66 or 68, having an amino acid sequence in which one or more (for example, several) amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted, and taurine trans DNA encoding a polypeptide having porter activity (c3) DNA encoding a polypeptide having at least 70% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, 64, 66 or 68 and having taurine transporter activity (d3) DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61, 63, 65 or 67 (e3) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61, 63, 65, or 67 and encodes a polypeptide having taurine transporter activity
  • a desired polypeptide can be produced by introducing a gene
  • a gene that encodes an endogenous desired polypeptide of the cell is activated by a gene activation technique (for example, see WO94 / 12650 pamphlet), so that a desired polypeptide is activated. It is also possible to produce a desired polypeptide using cells that produce the peptide.
  • the taurine transporter gene, the PC gene, the ALT gene, and the gene encoding the desired polypeptide The order of introduction is not particularly limited, and a gene encoding a desired polypeptide may be introduced after introducing a taurine transporter gene, a PC gene, and an ALT gene, or a gene encoding a desired polypeptide is introduced. Later, taurine transporter gene, PC gene and ALT gene may be introduced. A taurine transporter gene, a PC gene, an ALT gene, and a gene encoding a desired polypeptide may be introduced simultaneously.
  • the taurine transporter gene, PC gene and ALT gene may be introduced simultaneously by a single vector or may be introduced separately using a plurality of vectors.
  • the introduction of the taurine transporter gene, PC gene, ALT gene and the gene encoding the desired polypeptide may be introduced simultaneously by a single vector or may be introduced separately using a plurality of vectors.
  • a medium used in normal cell (preferably animal cell) culture can be used.
  • These usually include amino acids, vitamins, lipid factors, energy sources, osmotic regulators, iron sources, pH buffers.
  • the content of these ingredients is usually 0.05-1500 mg / L for amino acids, 0.001-10 mg / L for vitamins, 0-200 mg / L for lipid factors, 1-20 g / L for energy sources, 0.1 for osmotic pressure regulators.
  • 10000mg / L 10000mg / L, iron source 0.1-500mg / L, pH buffer 1-10000mg / L, trace metal elements 0.00001-200mg / L, surfactant 0-5000mg / L, growth cofactors 0.05-
  • the range of 10000 ⁇ g / L and nucleoside is suitably 0.001-50 mg / L, but is not limited thereto, and can be determined appropriately depending on the type of cells to be cultured and the type of desired polypeptide.
  • trace metal elements for example, trace metal elements, surfactants, growth cofactors, nucleosides and the like may be added.
  • L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-ornithine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, etc.
  • L-alanine , L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L- Amino acids such as phenylalan
  • trace metal elements such as copper sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, nickel chloride, tin chloride, magnesium chloride, sodium silicate and the like, preferably copper sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate and the like; Surfactants such as Tween80 and Pluronic F68; and recombinant insulin, recombinant IGF-1, recombinant EGF, recombinant FGF, recombinant PDGF, recombinant TGF- ⁇ , ethanolamine hydrochloride, Sodium selenate, retinoic acid, putrescine hydrochloride, etc., preferably sodium selenite, ethanolamine hydrochloride, recombinant IGF-1, putrescine hydrochloride and other growth cofactors; deoxyadenosine, deoxycytidine, deoxyguanosine,
  • pyruvic acid serving as a PC substrate may be added to the medium. Addition of pyruvic acid can increase the production of a desired polypeptide (eg, antibody).
  • the amount of pyruvic acid added at this time is usually in the range of 0.01 to 1000 mM, preferably 0.1 to 100 mM, more preferably 1 to 10 mM.
  • ⁇ -ketoglutaric acid serving as an ALT substrate may be added to the medium. Addition of ⁇ -ketoglutaric acid can increase the production of a desired polypeptide (eg, antibody).
  • the amount of ⁇ -ketoglutaric acid added at this time is usually in the range of 0.01 to 1000 mM, preferably 0.1 to 100 mM, and more preferably 1 to 10 mM.
  • pH of the medium varies depending on the cells to be cultured, generally pH 6.8 to 7.6 is appropriate, and in many cases pH 7.0 to 7.4 is appropriate.
  • the medium may be a commercially available animal cell culture medium such as D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), D-MEM / F-12 1: 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), RPMI1640, CHO-S-SFM II (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL 301 (JRH biosciences), IS CHO-V (Irvine Scientific Medium) such as PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich) can also be used.
  • D-MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • D-MEM / F-12 1 1 Mixture
  • RPMI1640 CHO-S-SFM II (Invitrogen)
  • CHO-SF Sigma-Aldrich
  • EX-CELL 301 JRH biosciences
  • IS CHO-V Irvine Scientific Medium
  • PF-ACF-CHO Sigma-Al
  • the medium may be a serum-free medium, for example, CD-CHO® (Invitrogen).
  • CHO cells When cells that strongly express PC and ALT (may express taurine transporter strongly) are CHO cells, CHO cells can be cultured using methods known to those skilled in the art. For example, the culture can be usually carried out at 30-39 ° C., preferably about 37 ° C., in an atmosphere having a gas phase CO 2 concentration of 0-40%, preferably 2-10%.
  • An appropriate culture period for producing a desired polypeptide using cells that strongly express PC and ALT is usually 1 day to 3 months, preferably 1 day to 2 months, more preferably 1 day to 1 day. Months.
  • fermenter tank culture apparatus for example, fermenter tank culture apparatus, air lift culture apparatus, culture flask culture apparatus, spinner flask culture apparatus, microcarrier culture apparatus, fluidized bed culture Culture can be performed using an apparatus, a holofiber type culture apparatus, a roller bottle type culture apparatus, a filled tank type culture apparatus, or the like.
  • Culture is batch culture or fed-batch culture. Any method such as culture) or continuous culture may be used, but fed-batch culture or continuous culture is preferred, and fed-batch culture is more preferred.
  • taurine is added to the medium to promote taurine uptake into the cells. May be.
  • concentration of taurine added to the medium is not particularly limited, but is usually 0 g / L to 100 g / L, preferably 0 g / L to 20 g / L, more preferably 0 g / L to 10 g / L.
  • the polypeptide produced by the method of the present invention has a pharmaceutically usable biological activity
  • the polypeptide is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or additive and formulated.
  • Pharmaceutical products can be manufactured.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water soluble Dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA) , Mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, and the like.
  • water pharmaceutically acceptable organic solvents
  • collagen collagen
  • polyvinyl alcohol polyvinyl pyrrolidone
  • carboxyvinyl polymer sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water soluble Dextran, sodium carboxy
  • the purified polypeptide when used as an injectable preparation, is dissolved in a solvent such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc., and an adsorption inhibitor such as Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. Can be used. Alternatively, it may be lyophilized to obtain a dosage form that is reconstituted before use, and as an excipient for lyophilization, for example, sugar alcohols or saccharides such as mannitol and glucose are used. be able to.
  • a solvent such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • an adsorption inhibitor such as Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc.
  • Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. Can be used.
  • it may be lyophilized to obtain a dosage form that is reconstituted before use, and as an excipient for lyophilization, for example, sugar alcohols or saccharides such
  • the effective dose of the polypeptide is appropriately selected depending on the type of polypeptide, the type of disease to be treated or prevented, the age of the patient, the severity of the disease, and the like.
  • the polypeptide is an antibody such as an anti-glypican antibody
  • the effective dose is selected in the range of 0.001 mg to 1000 mg per kg body weight.
  • a dosage of 0.01 to 100,000 mg / body per patient can be selected.
  • it is not limited to these doses.
  • the polypeptide can be administered either orally or parenterally, but is preferably administered parenterally.
  • injection for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection
  • Systemic or local administration by injection nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration and the like.
  • DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, or 94 is used as a gene encoding PC. Use it.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, or 94 one or more amino acids are substituted, deleted, added, or /
  • a DNA encoding a polypeptide having an inserted amino acid sequence and having PC activity may be used.
  • a polypeptide having an amino acid sequence and having PC activity is a polypeptide that is functionally equivalent to a hamster, human, mouse, or rat PC (hereinafter also referred to as “PC such as hamster”).
  • ligase activity in which pyruvate is added and reversely carboxylated to oxaloacetate.
  • polypeptides include, for example, PC variants such as hamsters.
  • a DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence may be used as a gene encoding ALT.
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 , 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, or 60 a DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence may be used.
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 Polyamino acid sequence having 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 or 60 amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted, and having ALT activity DNA encoding a peptide may be used.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted in the amino acid sequence of 50, 52, 54, 56, 58 or 60 and having ALT activity is human , Mouse, rat, dog, Xenopus, Drosophila, nematode, Japanese rice, atomic red algae, baker's yeast, filamentous fungus Ashbya gossypii, fungus Candida albicans, fission yeast, fungus Aspergillus Cryptococcus neoformans, cellular slime mold Dictyostelium discoideum, Trypanosoma brucei, intracellular parasitic protozoa Leishmania major, dysentery amoeba Entamoeba histolytica or intracellular Raw protozoan Trypanosoma cru
  • ALT of humans Functionally equivalent to ALT of humans, etc. means that it has the same activity as that of human ALTs, such as the action of transferring the amino group of alanine to 2-oxoglutarate and generating glutamic acid.
  • Such polypeptides include, for example, ALT variants such as humans.
  • mutants in which 4 amino acids (R53S, Q72R, F286S, M332K) were substituted in 496 amino acids encoded by the public human ALT1 gene were used.
  • a method for introducing a mutation into the polypeptide is known.
  • a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100 , 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • an amino acid sequence of a PC such as a hamster for example, SEQ ID NOs: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 94
  • a PC such as a hamster
  • amino acid sequence of a PC such as a hamster (for example, SEQ ID NOs: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 94) 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 10 or less amino acids, or the amino acid sequence of a PC such as a hamster 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 10 or less amino acids, 1 or 2 or more in the amino acid sequence of a PC such as a hamster, preferably One or more and 30 or less, more preferably one or more and 10 or less amino acids are substituted with other
  • ALT As a polypeptide functionally equivalent to ALT such as human, specifically, the amino acid sequence of ALT such as human (for example, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 or 60),
  • 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 10 or less amino acids are deleted, or 1 or 2 or more, preferably 1 or more and 30 or less in the amino acid sequence of ALT such as human More preferably, 1 to 10 amino acids added, 1 or 2 or more, preferably 1 to 30 in the amino acid sequence of ALT such as human, more preferably 1 to 10
  • the following amino acids are substituted with other amino acids Etc. The.
  • amino acid residue to be mutated is not particularly limited, but is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids with amino acids (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino groups with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (all parentheses represent single letter symbols of amino acids).
  • Examples of the polypeptide in which one or a plurality of amino acid residues are added to a PC such as a hamster or an ALT such as a human include a fusion polypeptide containing a PC such as a hamster or an ALT such as a human.
  • the fusion polypeptide is obtained by fusing a PC such as a hamster or an ALT such as human and another polypeptide.
  • a method for producing a fusion polypeptide includes linking a gene encoding an ALT such as a PC such as a hamster or human and a gene encoding another polypeptide so that the frames coincide with each other, and introducing this into an expression vector. And any method known to those skilled in the art can be used. There are no particular limitations on the other polypeptides that are subjected to fusion with PCs such as hamsters or ALTs such as humans.
  • peptides that are subjected to fusion with PCs such as hamsters or ALTs such as humans include, for example, FLAG (Hopp, T.P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 ⁇ His, 10 ⁇ His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV consisting of 6 His (histidine) residues Fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag , SV40T antigen fragment, lck tag, ⁇ -tubulin fragment, B-tag, Protein C 2 fragments, GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, MBP (maltose binding polypeptide) and the like.
  • FLAG Hopp, T.P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-12
  • a fusion polypeptide is prepared by fusing a gene encoding these commercially available polypeptides with a gene encoding ALT such as PC or human such as hamster, and expressing the prepared fusion gene. Can do.
  • a DNA sequence encoding ALT such as human (eg, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 or 59) or a part thereof, DNA having high homology with this is isolated, It is usually possible to isolate a polypeptide functionally equivalent to a PC such as a hamster or an ALT such as a human from the DNA.
  • a PC such as a hamster
  • ALT such as a human
  • hybridization conditions include low stringency conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included. Examples of highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, not only DNA having high homology as the temperature is lowered but also DNA having low homology can be obtained comprehensively.
  • Polypeptides encoded by DNA isolated by these hybridization techniques may be those that have 70% or more identity in amino acid sequence with PCs such as hamsters or ALTs such as humans. Alternatively, it has high homology in amino acid sequence with ALT such as human. High homology usually refers to 97% or more identity, preferably 98% or more identity, more preferably 99% or more identity.
  • the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730).
  • Polypeptides may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of sugar chains, form, etc., depending on the cells, hosts or purification methods that produce them. However, as long as the obtained polypeptide has a function equivalent to that of PC such as hamster or ALT such as human, DNA encoding it can be used in the present invention. For example, when a polypeptide is expressed in a prokaryotic cell such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original polypeptide amino acid sequence. Further, when expressed in a eukaryotic cell such as a mammalian cell, the N-terminal signal sequence is removed. DNA encoding such a polypeptide can also be used in the present invention.
  • Polypeptides can be prepared as recombinant polypeptides or natural polypeptides by methods known to those skilled in the art. If it is a recombinant polypeptide, the DNA encoding the polypeptide is incorporated into an appropriate expression vector, and this is introduced into an appropriate host cell. The transformant obtained is recovered, an extract is obtained, and then ion exchange is performed. Or purified by chromatography such as reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the polypeptide of the present invention is immobilized on the column, or by further combining a plurality of these columns. Is possible.
  • polypeptide is expressed in a host cell (eg, animal cell or Escherichia coli) as a fusion polypeptide with a glutathione S-transferase polypeptide or as a recombinant polypeptide to which a plurality of histidines are added, it is expressed.
  • a host cell eg, animal cell or Escherichia coli
  • the recombinant polypeptide can be purified using a glutathione column or a nickel column.
  • the region other than the target polypeptide in the fusion polypeptide can be cleaved with thrombin or factor Xa as necessary.
  • a natural polypeptide for example, a hamster PC or an extract of a tissue or cell expressing a polypeptide having a function equivalent to that of a human ALT by a method well known to those skilled in the art. It can be isolated by purifying by acting an affinity column to which an antibody that binds to human ALT is bound.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, or 93 may be used as the DNA encoding PC.
  • DNA encoding a polypeptide that is soy and has PC activity may be used.
  • DNA encoding ALT SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 , 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 or 59 may be used.
  • SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to DNA having a base sequence of 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, or 59 and that encodes a polypeptide having ALT activity May be.
  • the DNA encoding PC or ALT can be used for the production of the desired polypeptide as described above in “in vivo” and “in vitro”, as well as in the production of cells that strongly express PC or ALT.
  • the DNA encoding PC or ALT may be in any form as long as it can encode PC or ALT. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA. Moreover, as long as it can code DNA which codes PC or ALT, DNA which has arbitrary base sequences based on the degeneracy of a genetic code is contained.
  • DNA encoding PC or ALT can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from cells expressing ALT, and the DNA sequence of PC (eg, SEQ ID NOs: 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 or 93) or the DNA sequence of ALT (for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, or 59) as a probe, and can be prepared by hybridization.
  • cDNA libraries can be obtained from, for example, Sambrook, J.
  • RNA is prepared from cells expressing PC or ALT, and the DNA sequence of PC (eg, SEQ ID NOs: 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 or 93) or the DNA sequence of ALT (for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 or 59), and using this as a primer, a PCR reaction was performed, and a cDNA encoding PC or ALT was obtained. It is also possible to prepare by amplification.
  • PC eg, SEQ ID NOs: 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 or 93
  • DNA sequence of ALT for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33
  • genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells or tissues that express PC or ALT. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Total RNA is prepared by Biochem. (1987) 162, 156-159) etc., and mRNA is purified from the total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia) etc. QuickPrep mRNA Purification Kit MRNA can also be prepared directly by using (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • AMV Reverse Transcriptase It can also be performed using First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku).
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • 5'-RACE method using polymerase chain reaction (PCR) (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), cDNA can be synthesized and amplified.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • DNA encoding PC or ALT a base sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nucelic Acids). Research (1981) 9, r43-74).
  • the DNA encoding PC or ALT can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of modifications include digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides and appropriate DNA fragments, addition of linkers, insertion of start codon (ATG) and / or stop codon (TAA, TGA, or TAG). .
  • DNA encoding PC is also stringent with DNA complementary to DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 or 93. DNA that hybridizes under conditions and that encodes a polypeptide functionally equivalent to PC.
  • DNA encoding ALT is also SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, DNA which hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to DNA having a base sequence of 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 or 59, and functionally with ALT Contains DNA encoding an equivalent polypeptide.
  • Stringent conditions can be appropriately selected by those skilled in the art, and examples thereof include low stringent conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included. Examples of highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased.
  • Said hybridizing DNA may preferably be naturally derived DNA, such as cDNA or chromosomal DNA.
  • DNA isolated by these hybridization techniques usually has high identity in nucleotide sequence with DNA encoding ALT such as PC or human such as hamster.
  • PC or ALT-encoding DNA encodes a functionally equivalent polypeptide such as a hamster PC or human ALT, and has high identity with a hamster PC or human ALT DNA DNA is also included.
  • High identity usually refers to an identity of 96% or higher, preferably 98% or higher, more preferably 99% or higher.
  • the identity of the base sequence is determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol.
  • the DNA encoding PC or the DNA encoding ALT may be inserted into a vector.
  • the vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli (for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue), etc. And a transformed gene of E. coli (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)).
  • Escherichia coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue
  • a transformed gene of E. coli for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)
  • Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful when the vector is used for the purpose of producing a desired polypeptide.
  • the host is E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue, etc.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E.
  • coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or a T7 promoter or the like.
  • such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase).
  • BL21 is preferred).
  • the vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379).
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
  • vectors used for producing a desired polypeptide include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system "(manufactured by GIBCO BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (for example, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, , PZIpneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia Expression Kit “(manufactured by Invitrogen), pNV11, SP-Q01), expression vectors derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50), and the like.
  • Bacillus subtilis for example, pPL608, pKTH50
  • promoters required for expression in cells such as SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., preferably selected for transformation into cells It is more preferable to have a gene (eg, a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.)). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PCHOI, etc.
  • amplifying with methotrexate (MTX) for example, COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome
  • COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using cells.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • DNA encoding PC and DNA encoding ALT which may be incorporated into a vector
  • E. coli and various animal cells can be used.
  • a DNA encoding a desired polypeptide is introduced into a host cell into which DNA encoding PC and DNA encoding ALT are introduced, the host cell can strongly express PC and ALT. Peptide production can be increased.
  • a host cell into which DNA encoding PC and DNA encoding ALT are introduced may be further introduced with a DNA encoding a taurine transporter (which may be incorporated into a vector).
  • Production systems for producing polypeptides include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, 64, 66 or 68 may be used as DNA encoding a taurine transporter.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, 64, 66 or 68 has an amino acid sequence in which one or a plurality of (for example, several) amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted, and taurine DNA encoding a polypeptide having transporter activity may be used.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, 64, 66 or 68 has an amino acid sequence in which one or more (for example, several) amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted, and has taurine transporter activity
  • the polypeptide possessed is a polypeptide functionally equivalent to a hamster, rat, mouse and human taurine transporter (hereinafter also referred to as “taurine transporter such as hamster”). Examples of such polypeptides include mutants of taurine transporters such as hamsters.
  • a method for introducing a mutation into the polypeptide is known.
  • a person skilled in the art can perform site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100 , 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • a polypeptide functionally equivalent to a taurine transporter such as a hamster specifically, 1 or 2 or more, preferably 2 or more and 30 or less in the amino acid sequence of a taurine transporter such as a hamster, Preferably, 1 or 2 or more, preferably 2 or more and 30 or less, more preferably 2 or more and 10 or less in a taurine transporter amino acid sequence such as hamster or the like, in which 2 or more and 10 or less amino acids are deleted 1 or 2 or more, preferably 2 or more and 30 or less, more preferably 2 or more and 10 or less amino acids in the amino acid sequence of taurine transporter such as hamster is substituted with another amino acid And the like.
  • amino acid residue to be mutated is not particularly limited, but is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids with amino acids (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino groups with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (all parentheses represent single letter symbols of amino acids).
  • polypeptides in which one or more amino acid residues are added to taurine transporters such as hamsters include fusion polypeptides containing taurine transporters such as hamsters.
  • the fusion polypeptide is a fusion of a taurine transporter such as hamster and another polypeptide, and is included in the present invention.
  • a method for producing a fusion polypeptide is to link a gene encoding a taurine transporter such as a hamster and a gene encoding another polypeptide so that the frames coincide with each other, introduce it into an expression vector, and express it in a host. Any method known to those skilled in the art can be used. There are no particular limitations on other polypeptides that are subjected to fusion with taurine transporters such as hamsters.
  • Examples of other peptides that are subjected to fusion with taurine transporters such as hamsters include FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and 6 His (histidine) residues.
  • influenza agglutinin HA
  • human c-myc fragment VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag , SV40T antigen fragment, lck tag, ⁇ -tubulin fragment, B-tag, Protein C 2 fragments, GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, MBP (maltose binding polypeptide) and the like.
  • a fusion polypeptide can be prepared by fusing a commercially available gene encoding these polypeptides with a gene encoding a taurine transporter such as hamster and expressing the prepared fusion gene.
  • Hybridization conditions for isolating a DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to a taurine transporter such as a hamster can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • hybridization conditions include low stringency conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included.
  • Examples of highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, not only DNA having high homology as the temperature is lowered but also DNA having low homology can be obtained comprehensively.
  • the polypeptide encoded by the DNA isolated by these hybridization techniques is preferably one having at least 70% identity in amino acid sequence with a taurine transporter such as a hamster, and usually a taurine transporter such as a hamster and an amino acid. Has high homology in sequence.
  • the polypeptide includes a polypeptide that is functionally equivalent to the hamster taurine transporter of the present invention and has high homology with the taurine transporter amino acid sequence such as hamster. High homology usually refers to 97% or more identity, preferably 98% or more identity, more preferably 99% or more identity.
  • the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730).
  • Polypeptides may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of sugar chains, form, etc., depending on the cells, hosts or purification methods that produce them.
  • a DNA encoding it can be used in the present invention.
  • a polypeptide when expressed in a prokaryotic cell such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original polypeptide amino acid sequence.
  • a eukaryotic cell such as a mammalian cell, the N-terminal signal sequence is removed.
  • DNA encoding such a polypeptide can also be used in the present invention.
  • Polypeptides can be prepared as recombinant polypeptides or natural polypeptides by methods known to those skilled in the art. If it is a recombinant polypeptide, the DNA encoding the polypeptide is incorporated into an appropriate expression vector, and this is introduced into an appropriate host cell. The transformant obtained is recovered, an extract is obtained, and then ion exchange is performed. It can be purified and prepared by chromatography such as reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the polypeptide is immobilized on the column, or by combining a plurality of these columns. is there.
  • polypeptide is expressed in a host cell (eg, animal cell or Escherichia coli) as a fusion polypeptide with a glutathione S-transferase polypeptide or as a recombinant polypeptide to which a plurality of histidines are added, it is expressed.
  • a host cell eg, animal cell or Escherichia coli
  • the recombinant polypeptide can be purified using a glutathione column or a nickel column.
  • the region other than the target polypeptide in the fusion polypeptide can be cleaved with thrombin or factor Xa as necessary.
  • an affinity column in which an antibody that binds to a taurine transporter such as hamster is applied to tissue or cell extracts expressing the polypeptide. And can be isolated by purification.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61, 63, 65 or 67 may be used as DNA encoding the taurine transporter.
  • DNA that hybridizes with DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61, 63, 65, or 67 under stringent conditions and encodes a polypeptide having taurine transporter activity is used. May be.
  • the DNA encoding the taurine transporter can be used for production of the desired polypeptide as described above in in vivo or in ⁇ vitro, as well as for the production of cells that strongly express the taurine transporter.
  • the DNA encoding the taurine transporter may be in any form as long as it can encode the taurine transporter. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode a taurine transporter.
  • DNA encoding a taurine transporter can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from cells expressing taurine transporter, and hybridization is performed using a part of the DNA sequence encoding taurine transporter (for example, SEQ ID NO: 61, 63, 65 or 67) as a probe.
  • cDNA libraries can be obtained from, for example, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or a commercially available gene library may be used.
  • RNA is prepared from cells expressing taurine transporter, oligo DNA is synthesized based on the taurine transporter DNA sequence (eg, SEQ ID NO: 61, 63, 65 or 67), and this is used as a primer. It can also be prepared by performing a PCR reaction and amplifying the cDNA encoding the taurine transporter.
  • genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, etc. that express taurine transporter. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc. Purify mRNA from total RNA using Purification Kit (Pharmacia). QuickPrep mRNA Purification Kit MRNA can also be prepared directly by using (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • AMV Reverse Transcriptase It can also be performed using First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku).
  • 5'-RACE method Frohman, MA et al., Proc. Natl.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech)
  • PCR polymerase chain reaction
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a nucleotide sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nucelic Acids). Research (1981) 9, r43-74).
  • the DNA encoding the taurine transporter can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of modifications include digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides and appropriate DNA fragments, addition of linkers, insertion of start codon (ATG) and / or stop codon (TAA, TGA, or TAG). .
  • the DNA encoding the taurine transporter is also a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61, 63, 65 or 67, and functions as a taurine transporter. DNA encoding the identical polypeptide.
  • Stringent conditions can be appropriately selected by those skilled in the art, and examples thereof include low stringent conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. More preferably, highly stringent conditions are included. Examples of highly stringent conditions include 65 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, DNA having high homology can be obtained as the temperature is increased.
  • Said hybridizing DNA may preferably be naturally derived DNA, such as cDNA or chromosomal DNA.
  • DNAs isolated by these hybridization techniques usually have high identity in base sequence with DNAs encoding taurine transporters such as hamsters. These DNAs include a DNA that encodes a polypeptide functionally equivalent to a taurine transporter such as a hamster and has a high identity with a DNA encoding a taurine transporter such as a hamster. High identity usually refers to an identity of 96% or higher, preferably 98% or higher, more preferably 99% or higher. The identity of the base sequence can be determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul.
  • the DNA encoding the taurine transporter may be inserted into a vector.
  • the vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli (for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue), etc. And a transformed gene of E. coli (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)).
  • Escherichia coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue
  • a transformed gene of E. coli for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)
  • Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful when the vector is used for the purpose of producing a desired polypeptide.
  • the host is E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue, etc.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E.
  • coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or a T7 promoter or the like.
  • such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase).
  • BL21 is preferred).
  • the vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379).
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
  • vectors used for producing a desired polypeptide include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system "(manufactured by GIBCO BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (for example, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, , PZIpneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia Expression Kit “(manufactured by Invitrogen), pNV11, SP-Q01), expression vectors derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50), and the like.
  • Bacillus subtilis for example, pPL608, pKTH50
  • promoters required for expression in cells such as SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., preferably selected for transformation into cells It is more preferable to have a gene (eg, a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.)). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PCHOI, etc.
  • amplifying with methotrexate (MTX) for example, COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome
  • COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using cells.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the present invention also provides a cell into which DNA encoding PC and DNA encoding ALT have been introduced (both DNAs may be incorporated into a vector).
  • the cell of the present invention may further be introduced with a DNA encoding a taurine transporter (this DNA may be incorporated into a vector).
  • a DNA encoding a desired polypeptide is introduced into these cells is as described above.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • Animal cells include mammalian cells such as CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells such as Xenopus eggs Mother cell (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), or insect cells such as Sf9, Sf21, Tn5 are known.
  • CHO cells dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980), which is a CHO cell deficient in the DHFR gene, in particular.
  • CHO cells are particularly preferred for mass expression purposes.
  • introduction of DNA (which may be incorporated into a vector) into a host cell includes, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, lipofection, etc. It is possible to carry out by this method.
  • Nicotiana tabacum cells derived from Nicotiana tabacum are known as polypeptide production systems, and these may be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces. cerevisiae), filamentous fungi such as Aspergillus genus such as Aspergillus niger are known.
  • E. coli E. coli
  • JM109 JM109
  • DH5 ⁇ HB101
  • Bacillus subtilis is also known.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEMMI, RPMI1640, or IMDM can be used as a culture medium for animal cells.
  • a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • examples of the system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants. A gene of interest is introduced into these animals or plants to produce and recover the polypeptide in the body of the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mammals there are production systems using mammals and insects.
  • mammals goats, pigs, sheep, mice, and cows can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • a transgenic animal can be used.
  • a target gene is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat ⁇ casein. Subsequently, the gene fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat.
  • the polypeptide of interest can be obtained from the milk produced by a transgenic goat born from a goat that has received the embryo or its offspring. In order to increase the amount of milk containing the polypeptide produced from the transgenic goat, hormones may be used in the transgenic goat as appropriate (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702 ).
  • silkworms can be used as insects.
  • the target polypeptide can be obtained from the body fluid of this silkworm by infecting a silkworm with a baculovirus into which a gene encoding the target polypeptide is inserted (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco when using plants, for example, tobacco can be used.
  • a gene encoding the desired polypeptide is inserted into a plant expression vector such as pMON 530, and this vector is inserted into Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens)).
  • This bacterium is transformed into tobacco, for example Nicotiana Tabacam. tabacum) and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et. Al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • polypeptide thus obtained can be isolated from inside or outside the host cell (eg, medium) and purified as a substantially pure and uniform polypeptide. Separation and purification of polypeptides may be carried out using separation and purification methods used in usual polypeptide purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, polypeptides can be separated and purified.
  • separation and purification methods used in usual polypeptide purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, polypeptides
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. The present invention also encompasses polypeptides that are highly purified using these purification methods.
  • the peptide can be partially removed by arbitrary modification by allowing an appropriate polypeptide modifying enzyme to act before or after purification of the polypeptide.
  • an appropriate polypeptide modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like.
  • a cell into which DNA has been introduced refers to a cell in which exogenous DNA has been incorporated by a genetic recombination technique, as well as a gene activation technique (for example, refer to WO94 / 12650 pamphlet). It is also a concept that encompasses cells in which sex DNA is activated, and as a result, expression of a protein corresponding to the DNA or transcription of the DNA is initiated or increased.
  • the present invention also provides a polypeptide that is any of the following (A) to (E) (provided that SEQ ID NOs: 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, and 94). Except for polypeptides having the amino acid sequence of
  • A a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70
  • B a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or / and inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 and having pyruvate carboxylase activity
  • C a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 and having pyruvate carboxylase activity
  • D a polypeptide encoded by a DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 69
  • E a polypeptide encoded by a DNA that hybridizes with a DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 under stringent conditions and encodes a polypeptide having pyruvate carboxylase activity
  • the novel polypeptide is hamster PC and a functionally equivalent polypeptide.
  • hamster PC has an activity similar to that of hamster PC, such as a ligase activity of addition and reverse carboxylation of pyruvate to oxaloacetate.
  • ligase activity of addition and reverse carboxylation of pyruvate to oxaloacetate.
  • polypeptides include mutants of hamster PC.
  • the present invention relates to a DNA encoding pyruvate carboxylase which is any of the following (a11) to (e11) (provided that SEQ ID NOs: 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, Except for DNAs having the base sequences of 89, 91 and 93).
  • DNA of the present invention contains the polypeptide of the present invention as described above. In addition to being used for production in vivo and in vitro, it can also be used to produce cells that strongly express hamster PC.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention in a host cell or expressing the polypeptide of the present invention (that is, hamster PC and a functionally equivalent polypeptide thereof). It is also useful for strongly expressing PC in host cells. By strongly expressing PC in the host cell, production of the desired polypeptide by the host cell can be increased.
  • the vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli (for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue), etc. And a transformed gene of E. coli (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)).
  • Escherichia coli for example, JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1Blue
  • a transformed gene of E. coli for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)
  • Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the polypeptide of the present invention.
  • the host is E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue, etc.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E.
  • coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or a T7 promoter or the like.
  • such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase).
  • BL21 is preferred).
  • the vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379).
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
  • E. coli as a host, for example, as a vector used for producing the polypeptide of the present invention, an expression vector derived from a mammal (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic) Acids. Res.
  • pcDNA3 manufactured by Invitrogen
  • pEGF-BOS Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors for example, “Bac-to-BAC baculovairus expression system "(manufactured by GIBCO BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIpneo), an expression vector derived from yeast (eg, “Pichia Expression Kit “(manufactured by Invitrogen), pNV11, SP-Q01), expression vectors derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50), and the like.
  • Bacillus subtilis for example, pPL608, pKTH50
  • promoters required for expression in cells such as SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., preferably selected for transformation into cells It is more preferable to have a gene (eg, a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.)). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PCHOI, etc.
  • amplifying with methotrexate (MTX) for example, COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome
  • COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using cells.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, E. coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for production and expression of the polypeptide of the present invention.
  • the host cell of the present invention can strongly express hamster PC and can increase production of a desired polypeptide.
  • Production systems for producing polypeptides include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host.
  • Animal cells include mammalian cells such as CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells such as Xenopus eggs Mother cell (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), or insect cells such as Sf9, Sf21, Tn5 are known.
  • CHO cells dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980), which is a CHO cell deficient in the DHFR gene, in particular.
  • CHO cells are particularly preferred for mass expression purposes.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, a lipofection method, or the like.
  • Nicotiana tabacum cells derived from Nicotiana tabacum are known as polypeptide production systems, and these may be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces. cerevisiae), filamentous fungi such as Aspergillus genus such as Aspergillus niger are known.
  • E. coli E. coli
  • JM109 JM109
  • DH5 ⁇ HB101
  • Bacillus subtilis is also known.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEMMI, RPMI1640, or IMDM can be used as a culture medium for animal cells.
  • a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • examples of the system for producing a polypeptide in vivo include a production system using animals and a production system using plants. A gene of interest is introduced into these animals or plants to produce and recover the polypeptide in the body of the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mammals there are production systems using mammals and insects.
  • mammals goats, pigs, sheep, mice, and cows can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • a transgenic animal can be used.
  • a target gene is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat ⁇ casein. Subsequently, the gene fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat.
  • the polypeptide of interest can be obtained from the milk produced by a transgenic goat born from a goat that has received the embryo or its offspring. In order to increase the amount of milk containing the polypeptide produced from the transgenic goat, hormones may be used in the transgenic goat as appropriate (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702 ).
  • silkworms can be used as insects.
  • the target polypeptide can be obtained from the body fluid of this silkworm by infecting a silkworm with a baculovirus into which a gene encoding the target polypeptide is inserted (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco when using plants, for example, tobacco can be used.
  • a gene encoding the desired polypeptide is inserted into a plant expression vector such as pMON 530, and this vector is inserted into Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens)).
  • This bacterium is transformed into tobacco, for example Nicotiana Tabacam. tabacum) and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • polypeptide thus obtained can be isolated from inside or outside the host cell (eg, medium) and purified as a substantially pure and uniform polypeptide. Separation and purification of polypeptides may be carried out using separation and purification methods used in usual polypeptide purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, polypeptides can be separated and purified.
  • separation and purification methods used in usual polypeptide purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, polypeptides
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. The present invention also encompasses polypeptides that are highly purified using these purification methods.
  • polypeptide can be arbitrarily modified or the peptide can be partially removed by allowing an appropriate polypeptide modifying enzyme to act before or after the polypeptide is purified.
  • polypeptide modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like.
  • WO Cell line (pPur-ALT1: 7 strains, pPur: 3 strains) introduced by electroporation in the presence of Puromycin (6 ⁇ g / ml) and highly proliferated by static culture. was selected. After expansion, total RNA was prepared from the pPur-ALT1 cell line, 6 strains that highly expressed human ALT1 were selected by the TaqMan method, and pPur-introduced cells (3 strains) as controls under shaking culture. 4 strains proliferating to the same extent as human ALT1-introduced cells were used to compare antibody production.
  • the anti-glypican-3 antibody production amount (1236 ⁇ 149 mg / L) of pPur-ALT1-introduced cells (4 strains) on the 17th day of the late shaker culture is PPur introduced cells (3 strains) (871 ⁇ 119 mg / L) (t test P ⁇ 0.01).
  • the anti-glypican-3 antibody production amount of the pHyg-ALT-introduced cells on the 10th day of the latter period of tube culture was 471 mg / L, 544 mg / L, and 588 mg / L, which were all higher than the parent strain (400 mg / L) ( data not shown).
  • PC CHO cell-derived hamster Pyruvate Carboxylase
  • the obtained PC gene had 3534 bases (not including the stop codon), and was used for cell modification as a hamster PC encoding 1178 amino acids, similar to mouse, rat and human PC (FIG. 1).
  • the amino acid sequence of Hamster PC is Mouse (98% Identity), Rat (98% Identity), and Human (97% Identity) have high homology to PCs, but yeast PC (1180 amino acids) has low homology with 52% Identity Therefore, when yeast PC was strongly expressed in higher eukaryotic cell systems, the effect on the metabolism of the cells (Journal of biotechnology 109 (2004) 179-191) caused hamster PC to be strongly expressed. It was expected to be different (Figure 2).
  • Example 2 Increase in antibody production due to strong expression of hamster pyruvate carboxylase Kozak sequence was added to the hamster pyruvate carboxylase (hereinafter PC) gene cloned in Example 1, and CMV promoter expression plasmid pHyg-PC (Fig. 3). PZeo-PC (FIG. 4) was constructed.
  • PC hamster pyruvate carboxylase
  • pHyg-PC or a pHyg-null expression plasmid containing no PC gene was introduced into pPur-ALT1 strongly expressing anti-glypican-3 antibody-producing CHO cells (A72) by electroporation, and in the presence of Hygromycin (200 ⁇ g / ml), Cell lines that were highly proliferated by static culture (pPur-ALT / pHyg-PC: 5 strains, pPur-ALT / pHyg-null: 11 strains) was selected.
  • RNA was prepared from 5 pHyg-PC-introduced strains, and antibody production was compared between 3 strains in which high PC expression was confirmed by the TaqMan method and control pHyg-introduced cells (11 strains).
  • pHyg-PC or pHyg-null expression plasmid is introduced into anti-glypican-3 antibody-producing CHO cells into which pPur-null has been introduced by electroporation, and is highly proliferated by static culture in the presence of Hygromycin (200 ⁇ g / ml) Cell lines (pHyg-PC: 5 strains, pHyg-null: 14 strains) were selected.
  • the present invention can be applied to all antibody-producing cells.
  • the present invention can be used for production of polypeptides.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of a gene encoding human alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (human): 2875).
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of human alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (human): 2875).
  • SEQ ID NO: 3 is a gene encoding a human alanine aminotransferase mutant (ALT2) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (human): 84706).
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the human alanine aminotransferase mutant (ALT2) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Homo sapiens (human): 84706).
  • SEQ ID NO: 5 is a gene encoding mouse alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (mouse): 76282).
  • SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of mouse alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (mouse): 76282).
  • SEQ ID NO: 7 is the nucleotide sequence of the gene encoding mouse alanine aminotransferase mutant (ALT2) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (mouse): 108682).
  • SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of a mouse alanine aminotransferase mutant (ALT2) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Mus musculus (mouse): 108682).
  • SEQ ID NO: 9 is the nucleotide sequence of the gene encoding rat alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Rattus norvegicus (rat): 81670).
  • SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of rat alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Rattus norvegicus (rat): 81670).
  • SEQ ID NO: 11 is the base sequence of the gene encoding canine alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Canis familiaris (dog): 609510).
  • SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of canine alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Canis familiaris (dog): 609510).
  • SEQ ID NO: 13 is the base sequence of the gene encoding Xenopus alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533).
  • SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence of Xenopus alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus laevis (African clawed frog): 444533).
  • SEQ ID NO: 15 is the base sequence of the gene encoding Drosophila alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640).
  • SEQ ID NO: 17 is the nucleotide sequence of the gene encoding nematode alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8).
  • SEQ ID NO: 18 is the amino acid sequence of nematode alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8).
  • SEQ ID NO: 19 is the nucleotide sequence of a gene encoding Japanese rice alanine aminotransferase (one of two) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210).
  • SEQ ID NO: 20> SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence of Japanese rice alanine aminotransferase (one of two) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210).
  • SEQ ID NO: 21 is the nucleotide sequence of a gene encoding Japanese rice alanine aminotransferase (one of two) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524).
  • SEQ ID NO: 22 is the amino acid sequence of Japanese rice alanine aminotransferase (one of two) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524).
  • SEQ ID NO: 23 is the nucleotide sequence of the gene encoding the primordial red alga cyanidiosizone alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C).
  • SEQ ID NO: 24 is the amino acid sequence of the primordial red alga cyanidiosizone alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C).
  • SEQ ID NO: 25 is the base sequence of the gene encoding baker's yeast alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Saccharomyces cerevisiae: YLR089C).
  • SEQ ID NO: 26 is the amino acid sequence of baker's yeast alanine aminotransferase (ALT1) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Saccharomyces cerevisiae: YLR089C).
  • SEQ ID NO: 27 is the base sequence of the gene encoding baker's yeast alanine aminotransferase mutant (ALT2) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Saccharomyces cerevisiae: YDR111C).
  • SEQ ID NO: 28 is the amino acid sequence of the baker's yeast alanine aminotransferase mutant (ALT2) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/ Saccharomyces cerevisiae: YDR111C).
  • SEQ ID NO: 29 is the base sequence of the gene encoding the filamentous fungus Ashbya gossypii alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W).
  • SEQ ID NO: 30 is the amino acid sequence of the filamentous fungus Ashbya gossypii alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii): AGOS_AGR085W).
  • SEQ ID NO: 32 shows the amino acid sequence of the fungus Candida albicans alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Candida albicans: CaO19_346).
  • SEQ ID NO: 33> SEQ ID NO: 33 is the nucleotide sequence of a gene encoding fission yeast alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08).
  • SEQ ID NO: 34 is the amino acid sequence of a fission yeast alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08).
  • SEQ ID NO: 35 shows the nucleotide sequence of a gene encoding the fungus Aspergillus nidulans alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus nidulans: AN1923.2).
  • SEQ ID NO: 36 shows the amino acid sequence of the fungus Aspergillus nidulans alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus nidulans: AN1923.2).
  • SEQ ID NO: 37 shows the base sequence of the gene encoding the fungus Aspergillus fumigatus alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus fumigatus: AFUA — 6G07770).
  • SEQ ID NO: 38 shows the amino acid sequence of the fungus Aspergillus fumigatus alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus fumigatus: AFUA — 6G07770).
  • SEQ ID NO: 39 shows the base sequence of the gene encoding Aspergillus oryzae alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus oryzae: AO090003000164).
  • SEQ ID NO: 40 shows the amino acid sequence of Aspergillus oryzae alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Aspergillus oryzae: AO090003000164).
  • SEQ ID NO: 41 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the fungus Cryptococcus neoformans alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490).
  • SEQ ID NO: 42 shows the amino acid sequence of the fungus Cryptococcus neoformans alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490).
  • SEQ ID NO: 44 shows the amino acid sequence of the cellular slime mold Dictyostelium discoideum alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Dictyostelium discoideum: DDB — 0232139).
  • SEQ ID NO: 45 shows the nucleotide sequence of a gene encoding Trypanosoma brucei alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950).
  • SEQ ID NO: 46 shows the amino acid sequence of Trypanosoma brucei alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950).
  • SEQ ID NO: 47 shows the nucleotide sequence of a gene encoding the intracellular parasitic protozoan Leishmania major alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Leishmania major: LmjF12.0630).
  • SEQ ID NO: 48 shows the amino acid sequence of the intracellular parasitic protozoan Leishmania major alanine aminotransferase (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630).
  • SEQ ID NO: 49 shows the nucleotide sequence of the gene encoding dysentery amoeba Entamoeba histolytica alanine aminotransferase (one of two) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Entamoeba histolytica: 233.t00009).
  • SEQ ID NO: 50 is the amino acid sequence of dysentery amoeba Entamoeba histolytica alanine aminotransferase (one of two) (KEGG) / ENZYME: 2.6.1.2 / Entamoeba histolytica: 233.t00009).
  • SEQ ID NO: 51 shows the base sequence of the gene encoding dysentery amoeba Entamoeba histolytica alanine aminotransferase (one of two) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Entamoeba histolytica: 24.t00016).
  • SEQ ID NO: 52 is the amino acid sequence of dysentery amoeba Entamoeba histolytica alanine aminotransferase (one of two) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Entamoeba histolytica: 24.t00016)
  • SEQ ID NO: 53 shows the base sequence (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.420) of the gene encoding the intracellular parasitic protozoan Trypanosoma cruzi alanine aminotransferase (one of four).
  • SEQ ID NO: 54 is the amino acid sequence (KEGG) of the intracellular parasitic protozoan Trypanosoma cruzi alanine aminotransferase (one of four) / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420).
  • SEQ ID NO: 55 shows the base sequence (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2/Trypanosoma cruzi: 506529.430) of the gene encoding the intracellular parasitic protozoan Trypanosoma cruzi alanine aminotransferase (one of four species).
  • SEQ ID NO: 56 is the amino acid sequence (KEGG) of the intracellular parasitic protozoan Trypanosoma cruzi alanine aminotransferase (one of four) / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430).
  • SEQ ID NO: 58 is the amino acid sequence (KEGG) of the intracellular parasitic protozoan Trypanosoma cruzi alanine aminotransferase (1 of 4) / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120).
  • SEQ ID NO: 60 is the amino acid sequence (KEGG) of the intracellular parasitic protozoan Trypanosoma cruzi alanine aminotransferase (one of four) / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140).
  • KEGG the amino acid sequence of the intracellular parasitic protozoan Trypanosoma cruzi alanine aminotransferase (one of four) / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140) (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140).
  • ⁇ SEQ ID NO: 61> SEQ ID NO: 61 shows the base sequence of the gene encoding hamster taurine transporter.
  • SEQ ID NO: 75 shows the base sequence of the gene encoding human pyruvate carboxylase (GenBank BC011617).
  • SEQ ID NO: 77> SEQ ID NO: 77 is the nucleotide sequence SGD (Saccharomyces Genome) of the gene encoding the isoform PYC1 of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) pyruvate carboxylase Database) PYC1 / YGL062W is shown.
  • SEQ ID NO: 78 is the amino acid sequence SGD (Saccharomyces Genome) of the isoform PYC1 of Saccharomyces cerevisiae pyruvate carboxylase Database) PYC1 / YGL062W is shown.
  • SEQ ID NO: 79> SEQ ID NO: 79 is the base sequence SGD (Saccharomyces Genome) of the gene encoding the isoform PYC2 of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) pyruvate carboxylase Database) PYC2 / YBR218C.
  • SEQ ID NO: 80 is the amino acid sequence SGD (Saccharomyces Genome) of isoform PYC2 of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) pyruvate carboxylase Database) PYC2 / YBR218C.
  • SEQ ID NO: 81 shows the nucleotide sequence (GeneID: 2539661) (GenBank NM — 001021807) of the gene encoding Schizosaccharomyces pombe pyruvate carboxylase.
  • SEQ ID NO: 82 shows the amino acid sequence of Schizosaccharomyces pombe pyruvate carboxylase (UniProtKB / Swiss-Prot Q9UUE1).
  • SEQ ID NO: 83> SEQ ID NO: 83 is the base sequence of the gene encoding chicken pyruvate carboxylase (GeneID: 374263) (GenBank AF509529).
  • SEQ ID NO: 84> SEQ ID NO: 84 is the amino acid sequence of chicken pyruvate carboxylase (UniProtKB / TrEMBL Q8JHF6).
  • SEQ ID NO: 85 is the base sequence of the gene encoding zebrafish pyruvate carboxylase (GeneID: 58068) (GenBank AF295372).
  • SEQ ID NO: 86> SEQ ID NO: 86 is the amino acid sequence of zebrafish pyruvate carboxylase (UniProtKB / TrEMBL Q9DDT1).
  • SEQ ID NO: 87> SEQ ID NO: 87 is the base sequence of the gene encoding bovine pyruvate carboxylase (GeneID: 338471) (GenBank BC114135).
  • SEQ ID NO: 88 is the amino acid sequence of bovine pyruvate carboxylase (UniProtKB / Swiss-Prot Q29RK2).
  • SEQ ID NO: 89 is the base sequence of the gene encoding Nematode pyruvate carboxylase (GeneID: 179616) (GenBank NM_073576).
  • SEQ ID NO: 90 is the amino acid sequence of the nematode pyruvate carboxylase (UniProtKB / Swiss-Prot O17732).
  • SEQ ID NO: 91 is the base sequence of the gene encoding Xenopus pyruvate carboxylase (GenBank GenBank BC059308) is shown.
  • SEQ ID NO: 92 is the amino acid sequence of Xenopus pyruvate carboxylase (UniProtKB / TrEMBL Q6PCI8).
  • SEQ ID NO: 93 is the base sequence of the gene encoding the yeast Pichia stipitispiruvate carboxylase (GeneID: 4840453) (GenBank XM_001386192).
  • SEQ ID NO: 94> SEQ ID NO: 94 is the amino acid sequence of yeast Pichia stipitispiruvate carboxylase (UniProtKB / TrEMBL A3LYM8).

Abstract

　天然型タンパク質又は組換えタンパク質を高生産量で製造することができる方法を提供する。　ピルビン酸カルボキシラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法。

Description

異種ポリペプチドの製造方法
　本発明は、異種ポリペプチドの製造方法に関し、より詳細には、ピルビン酸カルボキシラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現する細胞を用いてポリペプチドを製造する方法に関する。
　遺伝子組換え技術を用いて、医薬として有用なタンパク質を生産する際に、動物細胞を用いると、原核細胞が行い得ないような複雑な翻訳後修飾やフォールディングが可能となるため、動物細胞は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として多用されてきている。
　近年、抗体や生理活性タンパク質などの多くのバイオ医薬品が排出されているが、組換えタンパク質を効率よく動物細胞に生産させる技術は、バイオ医薬品の低コスト化につながり、患者への安定な供給を約束するものである。
　従って、より生産効率の高いタンパク質の製造方法が望まれている。
　アラニンは、蛋白質構成アミノ酸のひとつで、非必須アミノ酸である。生体内では、ピルビン酸にグルタミン酸のアミノ基が転移することにより生合成される。また、逆反応で分解する。
　アラニンの分解酵素としては、アラニンアミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.2.)（非特許文献１）が知られているが、この酵素は、アラニンのアミノ基を2-オキソグルタル酸に転移させ、グルタミン酸を生成させる。アラニンアミノトランスフェラーゼはグルタミン-ピルビン酸トランスアミナーゼとも呼ばれ、GPTと略称される（非特許文献２）。GPTはGOP（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）とともに、肝臓の中に含まれる酵素であり、肝臓の細胞が破壊されると血液中に放出されるため、GPTとGOTが異常高値を示す場合は肝臓になんらかの障害があると診断される。
　このように、アラニンアミノトランスフェラーゼは肝機能のマーカーとして利用されているが、アラニンアミノトランスフェラーゼを強発現させたCHO細胞などの宿主細胞がどのような挙動を示すのかについては知られていない。
　また、ピルビン酸カルボキシラーゼ（PC）に関しては、酵母ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を導入することで、哺乳類細胞系の一次エネルギー代謝を改良する方法が知られている（特許文献１）。Iraniらは、酵母PCを導入したヒトBHK-21細胞でヒトエリスロポエチン(hEPO)を生産させることにより、コントロールと比して生成物濃度が2倍になったこと、さらに、PCを導入することでグルコース制限下における高生成効率培養が可能となり、これにより培養液中の乳酸の蓄積を低減させることが可能となったことを報告している（非特許文献３）。Fogolinらは、酵母PCを導入したCHO細胞でヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(hGM-CSF)を産生させることにより、コントロールと比して収量が200%増加し、乳酸の産生が65%に抑えられたと報告している（非特許文献４）。Eliasらは、酵母PC遺伝子を哺乳類細胞(HEK細胞)や昆虫細胞(Trichoplusia ni High-Five細胞)に導入すると、グルコースとグルタミンの利用効率が上昇し、乳酸とアンモニアの生成が抑制されることを報告している（非特許文献５）。Kimらは、ヒトPCを導入したCHO細胞で乳酸の生成量が抑制されたことを報告している（非特許文献６）。
　このように、酵母PC遺伝子を哺乳類細胞に導入した例は報告されているが、PCをアラニンアミノトランスフェラーゼとともに細胞に強発現させたという報告はない。
Sanjay B. J., et. al., Hepatology(2004) 39(5), 1297-1302 Melanie M. S., et. al., Genomics(1997) 40, 247-252 Journal of Biotechnology 93 (2002) 269-282 Journal of biotechnology 109 (2004) 179-191 Biotechnol. Prog. 2003, 19, 90-97 Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:659-665
国際公開第WO2000/46378号パンフレット
　本発明は、天然型タンパク質又は組換えタンパク質を高い生産量で製造することができる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「PC」と記すこともある）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、「ALT」と記すこともある）を強発現する細胞を用いることによって、所望のポリペプチドの生産量を増加させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。細胞培養において、アラニンは経時的に多量に産生されるため、細胞内で蓄積したアラニンは、培地中へ分泌される。ALT強発現により、アラニンからピルビン酸やグルタミン酸を生合成する反応を促進できれば、TCA回路での代謝や、糖新生によるグルコース生成に利用されて、細胞の培養挙動が改善し、所望のポリペプチドの高生産が期待される。
また培養スケールを大きくすると（たとえば１Lから５００L）、同一培養条件下でも乳酸産生量が増加するため生存率の低下が早期にみられる。PC強発現により、細胞質のピルビン酸からオキサロ酢酸、さらにリンゴ酸を生合成する反応を促進できれば、乳酸産生が抑制されて、細胞の培養挙動が改善し、より培養スケールの大きい実生産レベルでの所望のポリペプチドの高生産が期待される。
　さらには培養細胞で抗体などの所望のポリペプチドを産生する場合、培養後期においては細胞がかなり高密度の状態（およそ1 x 10７cells/ml）となり、乳酸などの老廃物の影響が極めて高くなる。PCとALTを強発現する培養細胞により所望のポリペプチドを製造すれば、培養後期においても高い生存率を維持し、所望のポリペプチドの産生量の向上についても期待できる。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ピルビン酸カルボキシラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法。
（２）ピルビン酸カルボキシラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現する細胞が、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡとアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入した細胞である（1）記載の製造方法。
（３）上記細胞がさらにタウリントランスポーターを強発現する（１）又は（２）記載の製造方法。
（４）タウリントランスポーターを強発現する細胞が、タウリントランスポーターをコードするＤＮＡを導入した細胞である（３）記載の製造方法。
（５）ピルビン酸カルボキシラーゼが哺乳類由来のピルビン酸カルボキシラーゼである（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）ピルビン酸カルボキシラーゼがヒト、マウス又はハムスター由来のピルビン酸カルボキシラーゼである（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法。
（７）ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡが以下の(a1)～(e1)のいずれかである（２）～（６）のいずれかに記載の製造方法。
(a1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d1) 配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡ
(e1) 配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（８）アラニンアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが以下の(a2)～(e2)のいずれかである（２）～（７）のいずれかに記載の製造方法。
(a2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d2) 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡ
(e2) 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（９）細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である（１）～（８）記載の製造方法。
（１０）所望のポリペプチドが抗体である（１）～（９）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）（１）～（１０）のいずれかに記載の方法で製造されたポリペプチドを含有する医薬品を製造する方法。
（１２）ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡとアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが導入されている細胞。
（１３）さらにタウリントランスポーターをコードするＤＮＡが導入されている（１２）記載の細胞。
（１４）さらに所望のポリペプチドをコードするＤＮＡが導入されている（１２）又は（１３）記載の細胞。
（１５）以下の(a11)～(e11)のいずれかであるピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ（但し、配列番号７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１及び９３の塩基配列を有するＤＮＡを除く）。
(a11) 配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b11) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c11) 配列番号７０のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d11) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡ
(e11) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（１６）以下の(A)～(E)のいずれかであるポリペプチド（但し、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２及び９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを除く）。
(A) 配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチド
(B) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド
(C) 配列番号７０のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド
(D) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるポリペプチド
(E) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡによりコードされるポリペプチド
（１７）（１５）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（１８）（１５）記載のＤＮＡが導入されている細胞。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2009‐013418の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、所望のポリペプチドの生産量を増加させることができるようになった。
図１は、CHO-DXB11細胞からクローニングされたハムスターピルビン酸カルボキシラーゼ(PC)遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を示している。 図２は、ハムスターピルビン酸カルボキシラーゼ(PC)のアミノ酸配列同一性を示している。 図３は、ハムスターピルビン酸カルボキシラーゼ(PC)を発現させたHygromycin選抜プラスミドである。 図４は、ハムスターピルビン酸カルボキシラーゼ(PC)を発現させたZeocin選抜プラスミドである。 図５は、50mlシェーカーフラスコFed-Batch培養８日目における抗グリピカン-3抗体産生量プロットである。pPur-ALT1/pHyg-PC導入細胞(n=3)は、pPur-ALT1/pHyg-null導入細胞(n=11)に対して優位であった。 図６は、50mlシェーカーフラスコFed-Batch培養７日目における抗グリピカン-3抗体産生量プロットである。pPur-null/ pHyg-PC導入細胞(n=5)は、pPur-null/ pHyg-null導入細胞(n=14)に対して劣勢であった。 図７は、50mlシェーカーフラスコFed-Batch培養７日目における乳酸蓄積量プロットである。pPur-null/ pHyg-PC導入細胞(n=5)は、pPur-null/ pHyg-null導入細胞(n=14)に対して優位であった。 図８は、ヒト ALT1（４９６アミノ酸）を発現させたPuromycin選抜用のプラスミドである。 図９は、ヒト ALT1(４９６アミノ酸）を発現させたHygromycin選抜用のプラスミドである。
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
　本発明は、PCとALTを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法を提供する。
　本発明の方法において、細胞は、所望のポリペプチドを産生できる天然の細胞であっても、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞であってもよいが、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞が好ましい。
　本発明の方法において、所望のポリペプチドは特に限定されず、抗体（例えば、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体など）や生理活性タンパク質（顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、エリスロポエチン、インターフェロン、IL-1やIL-6等のインターロイキン、t-PA、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子、PTHなど）など如何なるポリペプチドでもよいが、特に抗体が好ましい。抗体は、天然抗体、Fab、scFv、sc(Fv)2などの低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの如何なる抗体であってもよい。
　本発明のPCとALTを強発現する細胞を用いることにより、細胞によるポリペプチドの産生量を増加させることができる。
　PCは、ピルビン酸を不可逆的にカルボキシル化してオキサロ酢酸にするリガーゼ群の酵素であり、この反応はクエン酸回路を回転させるために必要なオキサロ酢酸を供給する最も重要な炭酸固定補充反応である。ALT強発現により、アラニンからピルビン酸やグルタミン酸が生合成され、所望のポリペプチドを高生産するようになった細胞は、同時に細胞質のピルビン酸から乳酸が生合成される。本発明者らは、PC強発現により細胞質でピルビン酸からオキサロ酢酸の生合成を促進できれば、乳酸産生は抑制されて、細胞の培養挙動はより改善され所望のポリペプチドの高生産が可能と考え、それを実証し、本発明を完成させるに至った。
　ALTは、本来、アラニンのアミノ基を2-オキソグルタル酸に転移させ、グルタミン酸を生成させる酵素として知られている。本発明者らは、CHO細胞などの宿主細胞内で強発現させることにより、アラニンからピルビン酸やグルタミン酸を生合成する反応を促進できれば、TCA回路での代謝や、糖新生によるグルコース生成に利用されて、細胞の培養挙動が改善し、所望のポリペプチドの高生産が期待されると考えた。
　PCとALTを強発現する細胞は、天然の細胞と比較してPCとALTの発現量が増加している細胞であれば特に限定されない。天然の細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。
　本発明の細胞は、後述のごとく、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞；大腸菌、枯草菌などの原核細胞など如何なる細胞でもよく、CHO細胞、COS細胞などの動物細胞が好ましく、特にCHO細胞が好ましい。また、所望のポリペプチドを製造するためには、CHO dhfr－細胞など所望の遺伝子を導入するのに適した細胞であることが好ましい。　
　PCとALTを強発現する細胞としては、例えば、PC遺伝子とALT遺伝子が人為的に導入された細胞を挙げることができる。PC遺伝子とALT遺伝子が人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、PC遺伝子とALT遺伝子をベクターに組込み、該ベクターを細胞に形質転換することにより作製することが可能である。さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性PC遺伝子とALT遺伝子が活性化され、その結果、PCとALTが強発現した細胞もPC遺伝子とALT遺伝子が人為的に導入された細胞に包含される。
　細胞に強発現させるPCとしては、如何なる生物由来のPCでもよく特に限定されない。具体的には、ヒト、或いはマウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、ウシなどの哺乳類、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces
pombe)、酵母ピチア　スティピティス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、線虫、アフリカツメガエルの生物由来のPCが挙げられ、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のPCであることが好ましく、例えば、PCを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）である場合には、ヒト或いはハムスター由来のPCであることが好ましい。
　細胞に強発現させるALTとしては、如何なる生物由来のALTでもよく特に限定されない。具体的には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、センチュウ、日本米、原子紅藻、パン酵母、糸状菌Ashbya gossypii、真菌Candida albicans、分裂酵母、真菌Aspergillus nidulans、真菌Aspergillus fumigatus、清酒麹菌Aspergillus oryzae、真菌Cryptococcus neoformans、細胞性粘菌 Dictyostelium discoideum、Trypanosoma brucei、細胞内寄生性原虫Leishmania major、赤痢アメーバEntamoeba histolytica又は細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziなどのALTが公知であり、これらを利用することができるが、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のALTであることが好ましく、例えば、ALTを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）である場合には、ヒト或いはハムスター由来のALTであることが好ましい。ヒト、マウス、酵母などのＡＬＴは、Variant(ALT1とALT2)が存在する。ALT2は、ALT1に対してアミノ酸レベルで８０％以上の相同性がある。後述の実施例では、ALT1を強制発現させた。
　PC遺伝子としては、以下の(a1)～(e1)のいずれかのＤＮＡを挙げることができる。
(a1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d1) 配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡ
(e1) 配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
　ALT遺伝子としては、以下の(a2)～(e2)のいずれかのＤＮＡを挙げることができる。
(a2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d2) 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡ
(e2) 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ　
　PC遺伝子とALT遺伝子が人為的に導入された細胞を用いて所望のポリペプチドを製造する場合、PC遺伝子とALT遺伝子と所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入の順序は特に制限されず、PC遺伝子とALT遺伝子を導入した後に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入してもよいし、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入した後にPC遺伝子とALT遺伝子を導入してもよい。又、PC遺伝子及び/又はALT遺伝子と所望のポリペプチドをコードする遺伝子を同時に導入してもよい。
　PC遺伝子とALT遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　PC遺伝子とALT遺伝子及び所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　PCとALTを強発現する細胞は、所望のポリペプチドを製造するために、さらにタウリントランスポーターを強発現していることが好ましい。当該細胞に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、該細胞を培地中で培養することにより、より大量に所望のポリペプチドを製造することが可能である（WO2007/119774）。
　PCとALT並びにタウリントランスポーターを強発現する細胞を用いることにより、細胞内アンモニア濃度を抑制することも可能である。
　タウリントランスポーターは、タウリン、β-アラニンや各種アミノ酸を細胞内に取り込むことができる、浸透圧調節機能をもつ膜タンパク質である。
　タウリントランスポーターを強発現する細胞は、天然の細胞と比較してタウリントランスポーターの発現量が増加している細胞であれば特に限定されない。天然の細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。
　タウリントランスポーターを強発現する細胞としては、例えば、タウリントランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞を挙げることができる。タウリントランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、タウリントランスポーター遺伝子をベクターに組込み、該ベクターを細胞に形質転換することにより作製することが可能である。さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性タウリントランスポーター遺伝子が活性化され、その結果、タウリントランスポーターが強発現した細胞もタウリントランスポーター遺伝子が人為的に導入された細胞に包含される。
　細胞に強発現させるタウリントランスポーター遺伝子としては、如何なる生物由来のタウリントランスポーターでもよく特に限定されない。具体的には、ヒト、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類などの生物由来のタウリントランスポーターが挙げられ、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のタウリントランスポーターであることが好ましく、例えば、タウリントランスポーターを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）である場合には、ヒト或いはハムスター由来のタウリントランスポーターであることが好ましい。
　タウリントランスポーター遺伝子としては、タウリントランスポーターをコードする以下の(a3)～(e3)のいずれかのＤＮＡを挙げることもできる。
(a3) 配列番号６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b3) 配列番号６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c3) 配列番号６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d3) 配列番号６１、６３、６５または６７の塩基配列を有するＤＮＡ
(e3) 配列番号６１、６３、６５または６７の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
　所望のポリペプチドを製造するには、タウリントランスポーターとPCとALTを強発現する細胞に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、該細胞を培地中で培養することにより製造することが可能である。さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により、該細胞の内因性の所望のポリペプチドをコードする遺伝子が活性化されることにより、所望のポリペプチドを産生する細胞を用いて、所望のポリペプチドを製造することも可能である。
　タウリントランスポーター遺伝子とPC遺伝子とALT遺伝子が人為的に導入された細胞を用いて所望のポリペプチドを製造する場合、タウリントランスポーター遺伝子とPC遺伝子とALT遺伝子と所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入の順序は特に制限されず、タウリントランスポーター遺伝子とPC遺伝子とALT遺伝子を導入した後に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入してもよいし、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入した後にタウリントランスポーター遺伝子とPC遺伝子とALT遺伝子を導入してもよい。又、タウリントランスポーター遺伝子とPC遺伝子とALT遺伝子と所望のポリペプチドをコードする遺伝子を同時に導入してもよい。
　タウリントランスポーター遺伝子、PC遺伝子及びALT遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　タウリントランスポーター遺伝子、PC遺伝子、ALT遺伝子及び所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
　PCとALTを強発現する細胞（タウリントランスポーターを強発現してもよい）の培養には、通常の細胞（好ましくは、動物細胞）培養で使用されている培地を用いることができる。これらには通常、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、pH緩衝剤を含む。これらの成分の含量は、通常、アミノ酸は0.05－1500mg/L、ビタミン類は0.001－10mg/L、脂質因子は0－200mg/L、エネルギー源は1－20g/L、浸透圧調節剤は0.1－10000mg/L、鉄源は0.1－500mg/L、pH緩衝剤は1－10000mg/L、微量金属元素は0.00001－200mg/L、界面活性剤は0－5000mg/L、増殖補助因子は0.05－10000μg/Lおよびヌクレオシドは0.001－50mg/Lの範囲が適当であるが、これらに限定されず、培養する細胞の種類、所望のポリペプチドの種類などにより適宜決定できる。
　上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシドなどを添加しても良い。
　具体的には、例えば、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等、好ましくはL-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン等のアミノ酸類；ｉ－イノシトール、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、p-アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等、好ましくはビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、オレイン酸、コレステロール等、好ましくは塩化コリン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源；塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム等、好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤；EDTA鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好ましくは塩化第二鉄、EDTA鉄、クエン酸鉄等の鉄源類；炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、HEPES、MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等のpH緩衝剤を含む培地を例示できる。
　上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケイ酸ナトリウム等、好ましくは硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微量金属元素；Tween80、プルロニックF68等の界面活性剤；および組換え型インスリン、組換え型IGF-1、組換え型EGF、組換え型FGF、組換え型PDGF、組換え型TGF-α、塩酸エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、レチノイン酸、塩酸プトレッシン等、好ましくは亜セレン酸ナトリウム、塩酸エタノールアミン、組換え型IGF-1、塩酸プトレッシン等の増殖補助因子；デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン等のヌクレオシドなどを添加してもよい。なお上記培地の好適例においては、ストレプトマイシン、ペニシリンGカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フェノールレッド等のpH指示薬を含んでいても良い。
　また、培地には、PCの基質となるピルビン酸を添加してもよい。ピルビン酸の添加により、所望のポリペプチド（例えば、抗体）の産生量が増加しうる。この際のピルビン酸の添加量は、通常0.01～1000mMの範囲であればよく、0.1～100mMが好ましく、さらに1～10mMが好ましい。
　さらに、培地には、ALTの基質となるα-ケトグルタル酸を添加してもよい。α-ケトグルタル酸の添加により、所望のポリペプチド（例えば、抗体）の産生量が増加しうる。この際のα-ケトグルタル酸の添加量は、通常0.01～1000mMの範囲であればよく、0.1～100mMが好ましく、さらに1～10mMが好ましい。
　培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．８～７．６、多くの場合ｐＨ７．０～７．４が適当である。
　培地は、市販の動物細胞培養用培地、例えば、D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium)、 D-MEM/F-12 1:1 Mixture (Dulbecco's Modified
Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12)、 RPMI1640、CHO-S-SFM II(Invitrogen社)、 CHO-SF (Sigma-Aldrich社)、 EX-CELL 301 (JRH biosciences社)、IS CHO-V (Irvine Scientific社)、 PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich社)などの培地を用いることも可能である。
　又、培地は、無血清培地、例えば、CD-CHO  (Invitrogen社)であってもよい。
　PCとALTを強発現する細胞（タウリントランスポーターを強発現してもよい）がCHO細胞である場合、CHO細胞の培養は当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、通常、気相のCO2濃度が0－40%、好ましくは、2－10%の雰囲気下、30－39℃、好ましくは37℃程度で、培養することが可能である。
　PCとALTを強発現する細胞を用いて所望のポリペプチドを産生するために適当な培養期間は、通常１日～３ヶ月であり、好ましくは1日～2ヶ月、さらに好ましくは1日～1ヶ月である。
　また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することができる。
　培養は、バッチ培養(batch culture)、流加培養(fed-batch
culture)、連続培養(continuous culture)などのいずれの方法を用いてもよいが、流加培養又は連続培養が好ましく、流加培養がより好ましい。
　さらに、PCとALTを強発現する細胞（タウリントランスポーターを強発現してもよい）を強発現する細胞を培養する際に、細胞へのタウリンの取り込みを促進するために培地中にタウリンを添加してもよい。培地に添加するタウリンの濃度は特に限定されないが、通常0g/L～100g/L、好ましくは0g/L～20g/L、さらに好ましくは0g/L～10g/Lである。
　本発明の方法により製造されたポリペプチドが医薬として利用可能な生物学的活性を有する場合には、このポリペプチドを医薬的に許容される担体又は添加剤と混合して製剤化することにより、医薬品を製造することができる。
　医薬的に許容される担体及び添加剤の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
　実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたポリペプチドを溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
　ポリペプチドの有効投与量は、ポリペプチドの種類、治療や予防の対象とする疾患の種類、患者の年齢、疾患の重篤度などにより適宜選択される。例えば、ポリペプチドが抗グリピカン抗体等の抗体である場合、その有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、これらの投与量に制限されるものではない。
　ポリペプチドの投与方法は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによる全身又は局所投与）、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。
　本発明において、PCをコードする遺伝子として、配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いるとよい。その他にも、配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつPC活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。
　配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつPC活性を有するポリペプチドは、ハムスター、ヒト、マウス又はラットPC（以下、「ハムスター等のPC」と記すこともある）と機能的に同等なポリペプチドである。ハムスター等のPCと機能的に同等とは、ピルビン酸を付加逆的にカルボキシル化してオキサロ酢酸にするリガーゼ活性などのハムスター等のPCが有する活性と同様の活性を有していることを言う。このようなポリペプチドには、例えば、ハムスター等のPCの変異体などが含まれる。
　本発明において、ALTをコードする遺伝子として、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いるとよい。その他にも、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。
　配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつALT活性を有するポリペプチドは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、アフリカツメガエル、ショウジョウバエ、センチュウ、日本米、原子紅藻、パン酵母、糸状菌Ashbya gossypii、真菌Candida albicans、分裂酵母、真菌Aspergillus nidulans、真菌Aspergillus fumigatus、清酒麹菌Aspergillus oryzae、真菌Cryptococcus neoformans、細胞性粘菌 Dictyostelium discoideum、Trypanosoma brucei、細胞内寄生性原虫Leishmania major、赤痢アメーバEntamoeba histolytica又は細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruzi ALT（以下、「ヒト等のALT」と記すこともある）と機能的に同等なポリペプチドである。ヒト等のALTと機能的に同等とは、アラニンのアミノ基を2-オキソグルタル酸に転移させ、グルタミン酸を生成させる作用などのヒト等のALTが有する活性と同様の活性を有していることを言う。このようなポリペプチドには、例えば、ヒト等のALTの変異体などが含まれる。後述の実施例では、公開されているヒトALT1遺伝子がコードしているアミノ酸496個中、４アミノ酸（R53S、Q72R、F286S、M332K）が置換されている変異体が用いられた。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、ハムスター等のPCやヒト等のALTのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ハムスター等のPCやヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
　ハムスター等のPCと機能的に同等なポリペプチドとしては、具体的には、ハムスター等のPCのアミノ酸配列（例えば、配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４）中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したもの、ハムスター等のPCのアミノ酸配列に１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したもの、ハムスター等のPCのアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等が挙げられる。
　ヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドとしては、具体的には、ヒト等のALTのアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０）中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したもの、ヒト等のALTのアミノ酸配列に１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したもの、ヒト等のALTのアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等が挙げられる。
　変異するアミノ酸残基は、特に限定されないが、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　なお、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10,
6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982)
79, 6409-6413 ）。
　ハムスター等のPC又はヒト等のALTに１又は複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドとしては、例えば、ハムスター等のPC又はヒト等のALTを含む融合ポリペプチドが挙げられる。融合ポリペプチドは、ハムスター等のPC又はヒト等のALTと他のポリペプチドとが融合したものである。融合ポリペプチドを作製する方法は、ハムスター等のPC又はヒト等のALTをコードする遺伝子と他のポリペプチドをコードする遺伝子をフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。ハムスター等のPC又はヒト等のALTとの融合に付される他のポリペプチドとしては、特に限定されない。
　ハムスター等のPC又はヒト等のALTとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology
(1988) 6, 1204-1210 ）、6 個のHis （ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc の断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag
、SV40T 抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Protein
C の断片、GST （グルタチオン－S－トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP （マルトース結合ポリペプチド）等が挙げられる。
　市販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子をハムスター等のPC又はヒト等のALTをコードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
　また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring
Harbor Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ハムスター等のPCをコードするDNA配列（例えば、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３のDNA配列）又はヒト等のALTをコードするDNA配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９のDNA配列）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAからハムスター等のPC又はヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドを単離することも通常行いうることである。
　ハムスター等のPC又はヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を下げる程に高い相同性を有するDNAのみならず、低い相同性しか有していないDNAまでも包括的に得ることができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有するDNAのみを得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAがコードするポリペプチドは、ハムスター等のPC又はヒト等のALTとアミノ酸配列において70%以上の同一性を有するものであればよいが、通常、ハムスター等のPC又はヒト等のALTとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、97％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。ポリペプチドの同一性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)
80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
　ポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたポリペプチドが、ハムスター等のPC又はヒト等のALTと同等の機能を有している限り、それをコードするDNAを本発明で利用することができる。例えば、ポリペプチドを原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のポリペプチドのアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。また、真核細胞、例えば哺乳動物細胞で発現させた場合、N末端のシグナル配列は除去される。このようなポリペプチドをコードするDNAも本発明で利用することができる。
　ポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドであれば、ポリペプチドをコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
　また、ポリペプチドをグルタチオンSトランスフェラーゼポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
　融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
　天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば、ハムスターPC又はヒトALTと同等の機能を有しているポリペプチドを発現している組織や細胞の抽出物に対し、ハムスターPC又はヒトALTに結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
　本発明において、PCをコードするＤＮＡとして、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡを用いてもよい。その他にも、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつPC活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。
　本発明において、ALTをコードするＤＮＡとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡを用いてもよい。その他にも、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつALT活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。
　PC又はALTをコードするＤＮＡは、上述したような所望のポリペプチドの in vivo や in vitroにおける生産に利用される他、PC又はALTを強発現する細胞の作製に用いることができる。PC又はALTをコードするＤＮＡは、PC又はALTをコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、PC又はALTをコードするＤＮＡをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。
　PC又はALTをコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ALTを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、PCのＤＮＡ配列（例えば、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３）又はALTのDNA配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えばSambrook, J. et al.,
Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)に記載の方法により調製してもよいし、市販の 遺伝子ライブラリーを用いてもよい。また、PC又はALTを発現している細胞よりRNAを調製し、PCのＤＮＡ配列（例えば、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３）又はALTのDNA配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９）に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、PC又はALTをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
　また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、PC又はALTのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
　具体的には、次のようにすればよい。まず、PC又はALTを発現する細胞、組織などから、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal.
Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit
(Pharmacia) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase
First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業)等を用いて行うこともできる。また、プライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85,
8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
　得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
　また、PC又はALTをコードするＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 ）。また、PC又はALTをコードするＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTAG）の挿入等が挙げられる。
　PCをコードするＤＮＡはまた、配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつPCと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを含む。
　ALTをコードするＤＮＡはまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつALTと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを含む。
　ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAを得ることができる。上記のハイブリダイズするDNAは好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体DNAであってよい。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAは、通常、ハムスター等のPC又はヒト等のALTをコードするＤＮＡと塩基配列において高い同一性を有する。PC又はALTをコードするＤＮＡには、ハムスター等のPC又はヒト等のALTと機能的に同等なポリペプチドをコードし、ハムスター等のPC又はヒト等のALTをコードするDNAと高い同一性を有するDNAも含まれる。高い同一性とは、通常、96％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは、例えば、score = 100、wordlength = 12とする。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
　PCをコードするDNA又はALTをコードするＤＮＡはベクターに挿入されるとよい。
　ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有することが好ましい。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。所望のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら,
Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら,
Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
　また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.
(1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
　大腸菌を宿主とする場合以外にも、例えば、所望のポリペプチドを製造するために用いられるベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic
Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC
baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression
Kit」（ Invitrogen社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）などが挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら,
Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが好ましく、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH ）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　PCをコードするＤＮＡとALTをコードするＤＮＡ（ベクターに組み込まれていてもよい）が導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。PCをコードするＤＮＡとALTをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入すれば、この宿主細胞は、PCとALTを強発現することができ、所望のポリペプチドの生産を増加させることができる。PCをコードするＤＮＡとALTをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞には、タウリントランスポーターをコードするＤＮＡ（ベクターに組み込まれていてもよい）がさらに導入されてもよい。PCをコードするＤＮＡとALTをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡとタウリントランスポーターをコードするＤＮＡを導入することにより、所望のポリペプチドの産生量を向上させることができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　本発明において、タウリントランスポーターをコードするＤＮＡとして、配列番号６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いるとよい。その他にも、配列番号６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。
　配列番号６２、６４、６６または６８のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドは、ハムスター、ラット、マウス及びヒトタウリントランスポーター（以下、「ハムスター等のタウリントランスポーター」と記すこともある）と機能的に同等なポリペプチドである。このようなポリペプチドには、例えば、ハムスター等のタウリントランスポーターの変異体などが含まれる。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、ハムスター等のタウリントランスポーターのアミノ酸に適宜変異を導入することによりハムスター等のタウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
　ハムスター等のタウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドとしては、具体的には、ハムスター等のタウリントランスポーターのアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したもの、ハムスター等のタウリントランスポーターアミノ酸配列に１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が付加したもの、ハムスター等のタウリントランスポーターアミノ酸配列中の１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等が挙げられる。
　変異するアミノ酸残基は、特に限定されないが、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　ハムスター等のタウリントランスポーターに１又は複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドとしては、例えば、ハムスター等のタウリントランスポーターを含む融合ポリペプチドが挙げられる。融合ポリペプチドは、ハムスター等のタウリントランスポーターと他のポリペプチドとが融合したものであり、本発明に含まれる。融合ポリペプチドを作製する方法は、ハムスター等のタウリントランスポーターをコードする遺伝子と他のポリペプチドをコードする遺伝子をフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。ハムスター等のタウリントランスポーターとの融合に付される他のポリペプチドとしては、特に限定されない。
　ハムスター等のタウリントランスポーターとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6 個のHis （ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc の断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag
、SV40T 抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Protein
C の断片、GST （グルタチオン－S－トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP （マルトース結合ポリペプチド）等が挙げられる。
　市販されているこれらのポリペプチドをコードする遺伝子をハムスター等のタウリントランスポーターをコードする遺伝子と融合させ、これにより調製された融合遺伝子を発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
　また、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring
Harbor Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ハムスター等のタウリントランスポーターをコードするDNA配列もしくはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAからハムスター等のタウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドを単離することも通常行いうることである。
　ハムスター等のタウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を下げる程に高い相同性を有するDNAのみならず、低い相同性しか有していないDNAまでも包括的に得ることができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有するDNAのみを得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAがコードするポリペプチドは、ハムスター等のタウリントランスポーターとアミノ酸配列において70%以上の同一性を有するものであるとよく、通常、ハムスター等のタウリントランスポーターとアミノ酸配列において高い相同性を有する。前記ポリペプチドには、本発明のハムスタータウリントランスポーターと機能的に同等であり、ハムスター等のタウリントランスポーターアミノ酸配列と高い相同性を有するポリペプチドも含まれる。高い相同性とは、通常、97％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。ポリペプチドの同一性を決定するには、文献（Wilbur, W.
J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
　ポリペプチドは、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたポリペプチドが、ハムスター等のタウリントランスポーターと同等の機能を有している限り、それをコードするＤＮＡを本発明で利用することができる。例えば、ポリペプチドを原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のポリペプチドのアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。また、真核細胞、例えば哺乳動物細胞で発現させた場合、N末端のシグナル配列は除去される。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明で利用することができる。
　ポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドであれば、ポリペプチドをコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは前記ポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
　また、ポリペプチドをグルタチオンSトランスフェラーゼポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
　融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
　天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば、ポリペプチドを発現している組織や細胞の抽出物に対し、ハムスター等のタウリントランスポーターに結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
　本発明において、タウリントランスポーターをコードするＤＮＡとして、配列番号６１、６３、６５または６７の塩基配列を有するＤＮＡを用いてもよい。その他にも、配列番号６１、６３、６５または６７の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタウリントランスポーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いてもよい。
　タウリントランスポーターをコードするＤＮＡは、上述したような所望のポリペプチドの in vivo や in vitroにおける生産に利用される他、タウリントランスポーターを強発現する細胞の作製に用いることができる。タウリントランスポーターをコードするＤＮＡは、タウリントランスポーターをコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、タウリントランスポーターをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。
　タウリントランスポーターをコードするＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、タウリントランスポーターを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、タウリントランスポーターをコードするDNAの配列（例えば、配列番号６１、６３、６５または６７）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えばSambrook, J. et al.,
Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)に記載の方法により調製してもよいし、市販の 遺伝子ライブラリーを用いてもよい。また、タウリントランスポーターを発現している細胞よりRNAを調製し、タウリントランスポーターのDNAの配列（例えば、配列番号６１、６３、６５または６７）に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、タウリントランスポーターをコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
　また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、タウリントランスポーターのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
　具体的には、次のようにすればよい。まず、タウリントランスポーターを発現する細胞、組織などから、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M.
et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162,
156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA
Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit
(Pharmacia) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase
First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、プライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR）を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85,
8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
　得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
　また、タウリントランスポーターをコードするＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 ）。また、タウリントランスポーターをコードするＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTAG）の挿入等が挙げられる。
　タウリントランスポーターをコードするＤＮＡはまた、配列番号６１、６３、６５または６７の塩基配列を有するDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつタウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを含む。
　ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、例えば42℃、2×SSC、0.1％SDSが挙げられ、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、2×SSC及び0.1％SDSが挙げられる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAを得ることができる。上記のハイブリダイズするDNAは好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体DNAであってよい。
　これらハイブリダイゼーション技術により単離されるDNAは、通常、ハムスター等のタウリントランスポーターをコードするＤＮＡと塩基配列において高い同一性を有する。これらのＤＮＡには、ハムスター等のタウリントランスポーターと機能的に同等なポリペプチドをコードし、ハムスター等のタウリントランスポーターをコードするDNAと高い同一性を有するDNAも含まれる。高い同一性とは、通常、96％以上の同一性、好ましくは98％以上の同一性、さらに好ましくは99％以上の同一性を指す。塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは、例えば、score = 100、wordlength = 12とする。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
　タウリントランスポーターをコードするＤＮＡはベクターに挿入されるとよい。
　ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有することが好ましい。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。所望のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら,
Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら,
Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
　また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.
(1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
　大腸菌を宿主とする場合以外にも、例えば、所望のポリペプチドを製造するために用いられるベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic
Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC
baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression
Kit」（ Invitrogen社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）などが挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら,
Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが好ましく、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH ）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　本発明は、PCをコードするＤＮＡとALTをコードするＤＮＡが導入されている細胞（どちらのＤＮＡもベクターに組み込まれていてもよい）も提供する。本発明の細胞には、さらにタウリントランスポーターをコードするＤＮＡ（このＤＮＡはベクターに組み込まれていてもよい）が導入されてもよい。これらの細胞に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したものは前述した通りである。
　真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS 、3T3、ミエローマ、BHK （baby hamster kidney ）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al.,
Nature (1981) 291, 358-340 ）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9 、Sf21、Tn5が知られている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980)
77, 4216-4220 ）やCHO K-1 （Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのDNA（ベクターに組み込まれていてもよい）の導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
　植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）が知られている。
　原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli ）、例えば、JM109、DH5α、HB101 等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
　これらの細胞を目的とする遺伝子により形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより、目的とする遺伝子がコードするポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM 、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6～8であるのが好ましい。培養は、通常、約30～40℃で約15～200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
　一方、in vivo でポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする遺伝子を導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
　動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 ）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
　例えば、目的とする遺伝子を、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含む遺伝子断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。
　また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594 ）。
　さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium
tumefaciens ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana
tabacum ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Julian K.-C.
Ma et. al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
　これにより得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A
Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたポリペプチドも包含する。
　なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えて部分的にペプチドを除去することもできる。ポリペプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
　なお、本発明において、「ＤＮＡを導入した細胞」とは、遺伝子組み換え技術により外来性ＤＮＡが組み込まれた細胞の他、遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性ＤＮＡが活性化され、その結果、当該ＤＮＡに対応する蛋白質の発現もしくは当該ＤＮＡの転写が開始或いは増加した細胞も包含する概念である。
　また、本発明は、以下の(A)～(E)のいずれかであるポリペプチド（但し、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２及び９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを除く）を提供する。
(A) 配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチド
(B) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド
(C) 配列番号７０のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド
(D) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるポリペプチド
(E) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡによりコードされるポリペプチド
　本発明の新規ポリペプチドは、ハムスターPC及びそれと機能的に同等なポリペプチドである。
　本発明において、ハムスターPCと機能的に同等とは、ピルビン酸を付加逆的にカルボキシル化してオキサロ酢酸にするリガーゼ活性などのハムスターPCが有する活性と同様の活性を有していることを言う。このようなポリペプチドには、例えば、ハムスターPCの変異体などが含まれる。
　ハムスターPC等と機能的に同等なポリペプチドについては前述した。
　さらに、本発明は、以下の(a11)～(e11)のいずれかであるピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ（但し、配列番号７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１及び９３の塩基配列を有するＤＮＡを除く）を提供する。
(a11) 配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(b11) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(c11) 配列番号７０のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(d11) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡ
(e11) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
　本発明のDNAは、上述したような本発明のポリペプチドの in
vivo や in vitroにおける生産に利用される他、ハムスターPCを強発現する細胞の作製に用いることができる。
　また、本発明は、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持したり、本発明のポリペプチド（すなわち、ハムスターPC及びそれと機能的に同等なポリペプチド）を発現させるために有用である。また、宿主細胞にPCを強発現させるために有用である。宿主細胞にPCを強発現させることにより、宿主細胞による所望のポリペプチドの生産を増加させることができる。
　ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有することが好ましい。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら,
Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら,
Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
　また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.
(1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
　大腸菌を宿主とする場合以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するために用いられるベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic
Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus
expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression
Kit」（ Invitrogen社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）などが挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら,
Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが好ましく、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH ）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。また、本発明の宿主細胞は、ハムスターPCを強発現することができ、所望のポリペプチドの生産を増加させることができる。ポリペプチド製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS 、3T3、ミエローマ、BHK （baby hamster kidney ）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al.,
Nature (1981) 291, 358-340 ）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9 、Sf21、Tn5が知られている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980)
77, 4216-4220 ）やCHO K-1 （Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
　植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）が知られている。
　原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli ）、例えば、JM109、DH5α、HB101 等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
　これらの細胞を目的とする遺伝子により形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより、目的とする遺伝子がコードするポリペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM 、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6～8であるのが好ましい。培養は、通常、約30～40℃で約15～200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
　一方、in vivo でポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする遺伝子を導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
　動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993 ）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
　例えば、目的とする遺伝子を、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含む遺伝子断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。
　また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594 ）。
　さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium
tumefaciens ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana
tabacum ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Julian K.-C.
Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
　これにより得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A
Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたポリペプチドも包含する。
　なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。ポリペプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
　以下、本発明を参考例及び実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
〔参考例１〕ヒト肝細胞アラニンアミノトランスフェラーゼ(Alanine aminotransferase)遺伝子クローニング
　市販のHuman Liver QUICK-Clone cDNA（Clontech社）を鋳型にして、ヒト肝由来Alanine
aminotransferase（ALT1）遺伝子をPCR法によって得た。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、公開されているヒトALT1との相同性からALT1をコードしていることを確認した。得られたALT1遺伝子は、1488塩基中、５箇所（c157a,a215g,c765t,t857c,t995a）に変異がみられ、コードするアミノ酸は、496個中、４アミノ酸(R53S、Q72R,　F286S,　M332K)が異なっていたが、ヒト肝由来ALT1 PCRクローンとして細胞改変に用いた。
〔参考例２〕ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ導入による抗体産生量増加
　参考例１のクローニングにより取得したヒトALT1（以下ALT1）遺伝子にKozak配列を加え、ＣＭＶプロモーター発現プラスミドpPur-ALT1（図８）、pHyg-ALT1（図９）を構築した。pPur-ALT1あるいはALT1遺伝子を含まないpPur発現プラスミドを、親株である抗グリピカン-３抗体産生CHO細胞（国際公開第WO
2006/006693号パンフレットを参照）にエレクトロポレーション法で導入し、Puromycin(6μg/ml)存在下、静置培養で高増殖であった細胞株（pPur-ALT1：７株, pPur：３株）を選抜した。拡大後、pPur-ALT1細胞株からTotal RNAを調製し、TaqMan法によってヒトALT1を高発現していた６株を選抜し、さらに、振とう培養下で、コントロールであるpPur導入細胞（３株）と同程度に増殖する４株をヒトALT1導入細胞とし、抗体産生量比較をおこなった。初発密度２ｘ１０５cells/mLの５０ｍlシェーカーフラスコによる流加培養において、シェーカー培養後期１７日目のpPur-ALT１導入細胞（４株）の抗グリピカン-3抗体産生量（1236±149 mg/L）は、pPur導入細胞（３株）（871±119 mg/L）に対して優位であった（ｔ検定 Ｐ＜0.01）。シェーカー流加培養検討において、それぞれ最も抗体高産生であったpPur-ALT1発現株A72およびPur発現株P41を初発１０ｘ１０５cells/mLで１Lジャー流加培養をおこなうと、A72の抗体産生量は、培養１９日目で2.9g/Lであり、P41の抗体産生量（2.2g/L）以上に高産生であった。培養１４日目以降にP41の産生量増加がみられないことから、A72の抗体高産生は生存率維持効果によるものと考えられた（培養14日目生存率は、pPur-ALT1発現株(A72)で60%、pPur発現株(P41)で23%であった）。また、Hygromycin(200μg/ml)存在下で上記と同様の手法で薬剤選抜されたpHyg/ALT導入細胞（３株）を親株とともに、初発密度１ｘ１０５cells/mLで１５ｍlチューブによる流加培養をおこなうと、チューブ培養後期１０日目におけるpHyg-ALT導入細胞の抗グリピカン-3抗体産生量は、471mg/L、544mg/L、588mg/Lと、いずれも親株(400mg/L)以上であった(data not shown)。
〔実施例１〕ハムスターピルビン酸カルボキシラーゼ(Pyruvate Carboxylase)遺伝子クローニング
　CHO DXB11細胞に抗IL-6レセプター抗体遺伝子を導入した抗IL-6レセプター抗体産生細胞（特開平8-99902号公報）からtotal RNAを抽出し、ポリＡに依存するcDNAを合成した。さらに、そのcDNAを鋳型にPCRをおこなって、CHO細胞由来ハムスター Pyruvate Carboxylase（PC）遺伝子を得た。クローニングされた候補遺伝子はその塩基配列を決定したのち、公開済みのマウスおよびラットPCとの相同性の高さからハムスターPCをコードする遺伝子であると推定された。得られたPC遺伝子は３５３４塩基（終止コドンを含まない）であり、マウス、ラットおよびヒトPC と同様に１１７８アミノ酸をコードするハムスター PCとして細胞改変に用いられた（図１)。ハムスター PCのアミノ酸配列は、Mouse(９８%
Identity)、Rat(９８% Identity)、Human(９７% Identity)などのPCに対して高い相同性を有しているが、酵母PC（１１８０アミノ酸）に対しては５２％Identityと相同性が低いことから、高等真核生物の細胞系で酵母PCを強発現させた場合、その細胞の代謝に及ぼされた影響は（Journal of biotechnology 109 (2004) 179-191）、ハムスターPCを強発現させた場合とは異なると予想された（図２）。
〔実施例２〕ハムスターピルビン酸カルボキシラーゼ強発現による抗体産生量の増加
　実施例１でクローニングされたハムスターピルビン酸カルボキシラーゼ（以下PC）遺伝子にKozak配列を加え、ＣＭＶプロモーター発現プラスミドpHyg-PC（図３）、pZeo-PC（図４）を構築した。pHyg-PCあるいはPC遺伝子を含まないpHyg-null発現プラスミドを、pPur-ALT１強発現 抗グリピカン-３抗体産生CHO細胞（A72）にエレクトロポレーション法で導入し、Hygromycin(200μg/ml)存在下、静置培養で高増殖であった細胞株（pPur-ALT /pHyg-PC：5株,
pPur-ALT /pHyg-null：11株）を選抜した。拡大後、pHyg-PC導入５株からTotal RNAを調製し、TaqMan法によってPC高発現が確認された3株と、コントロールであるpHyg導入細胞（11株）との抗体産生量比較をおこなった。初発培地にピルビン酸(5mM)を添加した初発密度５ｘ１０５cells/mLの５０ｍlシェーカーフラスコによる流加培養において、シェーカー培養後期８日目のpHyg-PC強発現株（n=3）の抗グリピカン-3抗体産生量は、pHyg-null導入株（n=11）に対して優位であった（ｔ検定 Ｐ＜0.05, 図５）。また、pHyg-PC導入５株うちPC発現量の低かった2株の培養後期８日目の抗体産生量は738 mg/L, 747 mg/L　であり、PC高発現3株の抗体産生量（924
mg/L, 929 mg/L, 1073 mg/L）よりもあきらかに低く、ｔ検定 Ｐ＜0.05であった培養１５日目においてもPC低発現株の抗体産生量は1046 mg/L, 1046 mg/L であり、PC高発現3株の抗体産生量（1191
mg/L, 1247 mg/L, 11126 mg/L）よりも低かった。以上の結果は、ALT高発現株にPCを高発現させることによって抗体高産生株が得られることを示している。
　一方、pPur-ALT１強発現細胞（A72）ではなく、pPur-nullを導入した高増殖細胞でPCを高発現させると、抗体産生量に関しては負の効果を示した。pHyg-PCあるいはpHyg-null発現プラスミドを、pPur-nullを導入した抗グリピカン-３抗体産生CHO細胞にエレクトロポレーション法で導入し、Hygromycin(200μg/ml)存在下、静置培養で高増殖な細胞株（pHyg-PC：5株, pHyg-null：14株）を選抜した。初発培地にピルビン酸を含まない初発密度５ｘ１０５cells/mLの５０ｍlシェーカーフラスコによる流加培養をおこなうと、シェーカー培養後期７日目のpHyg-PC強発現株（n=5）の抗グリピカン-3抗体産生量はコントロールのpHyg-null導入株（n=14）に対して劣勢であった（ｔ検定 Ｐ＜0.0001、図６）。また、初発培地にピルビン酸を含む流加培養にでもpHyg-PC強発現株（n=5）の抗グリピカン-3抗体産生量はコントロールに対して劣勢であった（ｔ検定 Ｐ＜0.000001、 data not shown ）。PCの機能発現による乳酸蓄積量の抑制効果は、ヒトPC (Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:659-665)や　酵母PC（Journal of biotechnology 109 (2004)
179-191, Journal of Biotechnology 93 (2002) 269-282）で発表されているが、ハムスターPCを導入した上記pHyg-PC強発現株（n=5）においても、初発培地にピルビン酸を含まない初発密度５ｘ１０５cells/mLの５０ｍlシェーカーフラスコによる流加培養７日目での乳酸蓄積量は、コントロールのpHyg-null導入株（n=14）に対して優位に抑制された（ｔ検定 Ｐ＜0.05、図７）。初発培地にピルビン酸を含む流加培養では、PC高発現による乳酸蓄積量がさらに優位であった（ｔ検定
Ｐ＜0.01、data not shown ）。
　以上の結果は、ALT高発現株にハムスターPCを人為的に共発現させることによって抗体を高産生する細胞が得られることを示唆している。
　本発明は、あらゆる抗体産生細胞へ応用可能である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、ポリペプチドの生産に利用することができる。
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT１)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875）を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT１)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo sapiens (human): 2875）を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ変異体(ALT２) をコードする遺伝子（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo
sapiens (human): 84706）の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ変異体(ALT２)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Homo
sapiens (human): 84706）を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、マウスアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)をコードする遺伝子（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus
musculus (mouse): 76282）の塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、マウスアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus
musculus (mouse): 76282）を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、マウスアラニンアミノトランスフェラーゼ変異体(ALT２)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus
musculus (mouse): 108682）を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、マウスアラニンアミノトランスフェラーゼ変異体(ALT２)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Mus
musculus (mouse): 108682）を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、ラットアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１) をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Rattus norvegicus (rat): 81670）を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、ラットアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Rattus
norvegicus (rat): 81670）を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、イヌアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Canis familiaris (dog): 609510）を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、イヌアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Canis
familiaris (dog): 609510）を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、アフリカツメガエルアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)をコードする遺伝子の塩基配列 (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Xenopus laevis (African clawed frog): 444533）を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、アフリカツメガエルアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)のアミノ酸配列 (KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Xenopus
laevis (African clawed frog): 444533）を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、ショウジョウバエアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Drosophila melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640）を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、ショウジョウバエアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Drosophila
melanogaster (fruit fly): Dmel_CG1640）を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、センチュウアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8）を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、センチュウアラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT１)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Caenorhabditis elegans (nematode): C32F10.8）を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、日本米アラニンアミノトランスフェラーゼ (２種のうちの１つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4342210）を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、日本米アラニンアミノトランスフェラーゼ (２種のうちの１つ)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza
sativa japonica (Japanese rice): 4342210）を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、日本米アラニンアミノトランスフェラーゼ (２種のうちの１つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Oryza sativa japonica (Japanese rice): 4348524）を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、日本米アラニンアミノトランスフェラーゼ (２種のうちの１つ)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Oryza
sativa japonica (Japanese rice): 4348524）を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、原始紅藻シアニディオシゾン　アラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C）を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、原始紅藻シアニディオシゾン　アラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG /
ENZYME: 2.6.1.2 / Cyanidioschyzon merolae: CMM066C）を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、パン酵母アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT１)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Saccharomyces cerevisiae: YLR089C）を示す。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、パン酵母アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT１)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Saccharomyces cerevisiae: YLR089C）を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、パン酵母アラニンアミノトランスフェラーゼ変異体(ALT２)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Saccharomyces cerevisiae: YDR111C）を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、パン酵母アラニンアミノトランスフェラーゼ変異体(ALT２)のアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /
Saccharomyces cerevisiae: YDR111C）を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、糸状菌Ashbya gossypiiアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii):
AGOS_AGR085W）を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、糸状菌Ashbya gossypiiアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Ashbya gossypii (Eremothecium gossypii):
AGOS_AGR085W）を示す。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、真菌Candida albicansアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346）を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、真菌Candida albicansアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Candida albicans: CaO19_346）を示す。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、分裂酵母アラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG /
ENZYME: 2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08）を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、分裂酵母アラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME:
2.6.1.2 / Schizosaccharomyces pombe: SPBC582.08）を示す。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、真菌Aspergillus nidulansアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2）を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、真菌Aspergillus nidulansアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus nidulans: AN1923.2）を示す。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、真菌Aspergillus fumigatusアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770）を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、真菌Aspergillus fumigatusアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus fumigatus: AFUA_6G07770）を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、清酒麹菌Aspergillus oryzae　アラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164）を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、清酒麹菌Aspergillus oryzae　アラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Aspergillus oryzae: AO090003000164）を示す。
＜配列番号４１＞
配列番号４１は、真菌Cryptococcus neoformansアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490）を示す。
＜配列番号４２＞
配列番号４２は、真菌Cryptococcus neoformansアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Cryptococcus neoformans JEC21: CNG01490）を示す。
＜配列番号４３＞
配列番号４３は、細胞性粘菌 Dictyostelium discoideumアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139）を示す。
＜配列番号４４＞
配列番号４４は、細胞性粘菌 Dictyostelium discoideumアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Dictyostelium discoideum: DDB_0232139）を示す。
＜配列番号４５＞
配列番号４５は、Trypanosoma bruceiアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950）を示す。
＜配列番号４６＞
配列番号４６は、Trypanosoma bruceiアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma brucei: Tb927.1.3950）を示す。
＜配列番号４７＞
配列番号４７は、細胞内寄生性原虫Leishmania majorアラニンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630）を示す。
＜配列番号４８＞
配列番号４８は、細胞内寄生性原虫Leishmania majorアラニンアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Leishmania major: LmjF12.0630）を示す。
＜配列番号４９＞
配列番号４９は、赤痢アメーバEntamoeba histolyticaアラニンアミノトランスフェラーゼ(２種のうちの一つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009）を示す。
＜配列番号５０＞
配列番号５０は、赤痢アメーバEntamoeba histolyticaアラニンアミノトランスフェラーゼ(２種のうちの一つ)のアミノ酸配列（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 233.t00009）を示す。
＜配列番号５１＞
配列番号５１は、赤痢アメーバEntamoeba histolyticaアラニンアミノトランスフェラーゼ(２種のうちの一つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016）を示す。
＜配列番号５２＞
配列番号５２は、赤痢アメーバEntamoeba histolyticaアラニンアミノトランスフェラーゼ(２種のうちの一つ)のアミノ酸配列（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 /Entamoeba histolytica: 24.t00016）を示す。
＜配列番号５３＞
配列番号５３は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420）を示す。
＜配列番号５４＞
配列番号５４は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)のアミノ酸配列（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.420）を示す。
＜配列番号５５＞
配列番号５５は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430）を示す。
＜配列番号５６＞
配列番号５６は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)のアミノ酸配列（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 506529.430）を示す。
＜配列番号５７＞
配列番号５７は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120）を示す。
＜配列番号５８＞
配列番号５８は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)のアミノ酸配列（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.120）を示す。
＜配列番号５９＞
配列番号５９は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)をコードする遺伝子の塩基配列（KEGG / ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140）を示す。
＜配列番号６０＞
配列番号６０は、細胞内寄生性原虫Trypanosoma cruziアラニンアミノトランスフェラーゼ(４種のうちの一つ)のアミノ酸配列（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140）（KEGG
/ ENZYME: 2.6.1.2 / Trypanosoma cruzi: 510889.140）を示す。
＜配列番号６１＞
配列番号６１は、ハムスタータウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
＜配列番号６２＞
配列番号６２は、ハムスタータウリントランスポーターのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号６３＞
配列番号６３は、ラットタウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列（GenBank NM_017206）を示す。
＜配列番号６４＞
配列番号６４は、ラットタウリントランスポーターのアミノ酸配列（GenBank NM_017206）を示す。
＜配列番号６５＞
配列番号６５は、マウスタウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列（GenBank NM_009320）を示す。
＜配列番号６６＞
配列番号６６は、マウスタウリントランスポーターのアミノ酸配列（GenBank NM_009320）を示す。
＜配列番号６７＞
配列番号６７は、ヒトタウリントランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列（GenBank NM_003043）を示す。
＜配列番号６８＞
配列番号６８は、ヒトタウリントランスポーターのアミノ酸配列（GenBank NM_003043）を示す。
＜配列番号６９＞
配列番号６９は、ハムスターピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
＜配列番号７０＞
配列番号７０は、ハムスターピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７１＞
配列番号７１は、ラットピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（GenBank  U36585）を示す。
＜配列番号７２＞
配列番号７２は、ラットピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（Swiss-Prot P52873）を示す。
＜配列番号７３＞
配列番号７３は、マウスピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（GenBank L09192）を示す。
＜配列番号７４＞
配列番号７４は、マウスピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（Swiss-Prot Q05920）を示す。＜配列番号７５＞
配列番号７５は、ヒトピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列（GenBank BC011617 ）を示す。
＜配列番号７６＞
配列番号７６は、ヒトピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（Swiss-Prot P11498）を示す。
＜配列番号７７＞
配列番号７７は、パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)ピルビン酸カルボキシラーゼのアイソフォームPYC1をコードする遺伝子の塩基配列SGD(Saccharomyces Genome
Database)PYC1/YGL062Wを示す。
＜配列番号７８＞
配列番号７８は、パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)ピルビン酸カルボキシラーゼのアイソフォームPYC1のアミノ酸配列SGD(Saccharomyces Genome
Database)PYC1/YGL062Wを示す。
＜配列番号７９＞
配列番号７９は、パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)ピルビン酸カルボキシラーゼのアイソフォームPYC2をコードする遺伝子の塩基配列SGD(Saccharomyces Genome
Database) PYC2/YBR218Cを示す。
＜配列番号８０＞
配列番号８０は、パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)ピルビン酸カルボキシラーゼのアイソフォームPYC2のアミノ酸配列SGD(Saccharomyces Genome
Database) PYC2/YBR218Cを示す。
＜配列番号８１＞
配列番号８１は、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe ）ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列(GeneID: 2539661)(GenBank NM_001021807)を示す。
＜配列番号８２＞
配列番号８２は、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe ）ピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（UniProtKB/Swiss-Prot Q9UUE1）を示す。
＜配列番号８３＞
配列番号８３は、ニワトリピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列(GeneID:
374263)(GenBank  AF509529)を示す。
＜配列番号８４＞
配列番号８４は、ニワトリピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（UniProtKB/TrEMBL
Q8JHF6）を示す。
＜配列番号８５＞
配列番号８５は、ゼブラフィッシュピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列(GeneID:
58068)(GenBank  AF295372)を示す。
＜配列番号８６＞
配列番号８６は、ゼブラフィッシュピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（UniProtKB/TrEMBL
Q9DDT1）を示す。
＜配列番号８７＞
配列番号８７は、ウシピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列(GeneID:
338471)(GenBank  BC114135)を示す。
＜配列番号８８＞
配列番号８８は、ウシピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（UniProtKB/Swiss-Prot
Q29RK2）を示す。
＜配列番号８９＞
配列番号８９は、線虫ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列(GeneID:
179616)(GenBank  NM_073576)を示す。
＜配列番号９０＞
配列番号９０は、線虫ピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（UniProtKB/Swiss-Prot
O17732）を示す。
＜配列番号９１＞
配列番号９１は、アフリカツメガエルピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列
(GenBank  GenBank  BC059308)を示す。
＜配列番号９２＞
配列番号９２は、アフリカツメガエルピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（UniProtKB/TrEMBL
Q6PCI8）を示す。
＜配列番号９３＞
配列番号９３は、酵母ピチア スティピティスピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列(GeneID:
4840453)(GenBank  XM_001386192)を示す。
＜配列番号９４＞
配列番号９４は、酵母ピチア スティピティスピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列（UniProtKB/TrEMBL
A3LYM8）を示す。
 

Claims (18)

  1. ピルビン酸カルボキシラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞を培養し、所望のポリペプチドを産生させることを含む、ポリペプチドの製造方法。
  2. ピルビン酸カルボキシラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼを強発現する細胞が、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡとアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを導入した細胞である請求項1記載の製造方法。
  3. 上記細胞がさらにタウリントランスポーターを強発現する請求項１又は２記載の製造方法。
  4. タウリントランスポーターを強発現する細胞が、タウリントランスポーターをコードするＤＮＡを導入した細胞である請求項３記載の製造方法。
  5. ピルビン酸カルボキシラーゼが哺乳類由来のピルビン酸カルボキシラーゼである請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. ピルビン酸カルボキシラーゼがヒト、マウス又はハムスター由来のピルビン酸カルボキシラーゼである請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  7. ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡが以下の(a1)～(e1)のいずれかである請求項２～６のいずれかに記載の製造方法。
    (a1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (b1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (c1) 配列番号７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２又は９４のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (d1) 配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡ
    (e1) 配列番号６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１又は９３の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
  8. アラニンアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが以下の(a2)～(e2)のいずれかである請求項２～７のいずれかに記載の製造方法。
    (a2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (b2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (c2) 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０のアミノ酸配列と70％以上の同一性を有し、かつアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (d2) 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡ
    (e2) 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
  9. 細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１～８記載の製造方法。
  10. 所望のポリペプチドが抗体である請求項１～９のいずれかに記載の製造方法。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載の方法で製造されたポリペプチドを含有する医薬品を製造する方法。
  12. ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡとアラニンアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが導入されている細胞。
  13. さらにタウリントランスポーターをコードするＤＮＡが導入されている請求項１２記載の細胞。
  14. さらに所望のポリペプチドをコードするＤＮＡが導入されている請求項１２又は１３記載の細胞。
  15. 以下の(a11)～(e11)のいずれかであるピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ（但し、配列番号７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１及び９３の塩基配列を有するＤＮＡを除く）。
    (a11) 配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (b11) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (c11) 配列番号７０のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
    (d11) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡ
    (e11) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
  16. 以下の(A)～(E)のいずれかであるポリペプチド（但し、配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２及び９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを除く）。
    (A) 配列番号７０のアミノ酸配列を有するポリペプチド
    (B) 配列番号７０のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は／及び挿入されたアミノ酸配列を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド
    (C) 配列番号７０のアミノ酸配列と70％以上の相同性を有し、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド
    (D) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるポリペプチド
    (E) 配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡによりコードされるポリペプチド
  17. 請求項１５記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  18. 請求項１５記載のＤＮＡが導入されている細胞。
     
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