WO2006028063A1 - プロモーター機能を有するｄｎａ断片 - Google Patents

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WO2006028063A1
WO2006028063A1 PCT/JP2005/016269 JP2005016269W WO2006028063A1 WO 2006028063 A1 WO2006028063 A1 WO 2006028063A1 JP 2005016269 W JP2005016269 W JP 2005016269W WO 2006028063 A1 WO2006028063 A1 WO 2006028063A1
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WO
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acid
dna
expression
dna fragment
promoter
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Application number
PCT/JP2005/016269
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hideaki Yukawa
Masayuki Inui
Original Assignee
Research Institute Of Innovative Technology For The Earth
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Research Institute Of Innovative Technology For The Earth filed Critical Research Institute Of Innovative Technology For The Earth
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Priority to US11/662,358 priority patent/US8604180B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing expression of a promoter functioning in an aerobic coryneform bacterium, and a DNA sequence having the promoter function. More specifically, for the purpose of highly efficient production of useful substances such as various organic acids and ethanol, the function-induced expression enhancement and Z or suppression method of various gene promoters functioning in coryneform bacteria, and the promoter It relates to a functional DNA sequence.
  • coryneform bacteria are industrially important aerobic Gram-positive bacteria that have been used to produce useful organic compounds such as various amino acids and lactic acid succinic acid.
  • coryneform bacteria have a specific metabolic function that the metabolic pathway for producing substances is not impaired even under conditions in which cell division is suppressed by methods such as limiting oxygen supply.
  • nutrient sources such as saccharides given to coryneform bacteria are efficiently diverted to the target product without being consumed for growth, and effective use of raw material nutrient sources is achieved.
  • the ease of control of target substance production technology due to the suppression of division is the reason why coryneform bacteria are attracting industrial attention.
  • a DNA fragment having a stronger promoter function than the tac promoter derived from E. coli is found on the chromosome of coryneform bacteria, and the DNA sequence is known.
  • a method for controlling the expression of the promoter function there has been proposed a method of changing the carbon source composition such as saccharides and ethanol contained in the medium (see Patent Document 1).
  • a promoter DNA sequence relating to a specific enzyme protein (aspartase) gene expressed in coryneform bacteria has been found (see Patent Document 2;).
  • Patent Document 5 a recombinant DNA sequence containing a pfl (pyruvate formate lyase gene) promoter that is induced by pyruvate and repressed by oxygen
  • yeast Saccharomyces Stress-responsive promoters such as cerebral saccharomayce s cerevisiae 2-deoxyglucose-6 phosphatase deoxidase gene oxidative stress (peracid-lipid addition), osmotic stress and glucose starvation stress (patented) Reference 6) is also known.
  • Patent Document 6 also mentions methods for inducing various gene promoters other than those described above, such as a phosphoric acid deficiency induction method, a copper addition induction method, a chemical substance induction method, and a heat shock induction method.
  • promoter DNA sequences and promoter functions such as those described above and methods for inducing expression by stress are known, but induction enhancement and Z or induction suppression are performed in the reaction medium under anaerobic conditions of the present invention.
  • promoter function control method that functions in coryneform bacteria and a DNA fragment having a promoter function are known.
  • Patent Document 1 JP-A-7-95891
  • Patent Document 2 JP-A-7-31478
  • Patent Document 3 International Publication No. 95Z23224 Pamphlet
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-61485
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 3-80088
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-78977
  • Aerobic coryneform bacteria (including recombinants) have been used for the production of useful organic compounds under aerobic conditions (various amino acids) and anaerobic conditions (lactic acid, succinic acid, ethanol, etc.). ing.
  • the present invention relates to the production of useful organic compounds under anaerobic conditions, and various gene promoters in coryneform bacteria involved in the functioning of the coryneform bacteria under high efficiency to exhibit the functions of the coryneform bacteria under such conditions.
  • the present invention provides a method for enhancing and / or suppressing the promoter function related to a gene.
  • the present invention intends to provide DNA fragments having enhanced promoter functions and promoter functions that are suppressed or suppressed.
  • the present inventors consider that various gene promoter function expression induction techniques in coryneform bacteria are important in order to exert the substance production function of coryneform bacteria under anaerobic conditions. As a result of intensive studies, the present invention has been achieved.
  • Gene promoters are roughly classified into constitutive promoters and inducible promoters. When useful substances are produced under anaerobic conditions, promoters that are induced under anaerobic conditions rather than enhancing the functions of constitutive promoters.
  • the discovery of functional expression control technology enables more efficient expression of the target gene, and thus becomes a highly efficient substance production technology.
  • the degree of expression of various gene promoters can be known quantitatively, for example, by measuring the amount of mRNA produced using a DNA chip, and the amount produced under aerobic conditions is compared with the amount produced under anaerobic conditions.
  • the present inventors have found that a DNA fragment having the promoter function of the present invention can be obtained. The inventors have further researched and completed the present invention.
  • the present invention provides:
  • DNA fragment having a promoter function that induces and enhances the expression of proteins involved in the production of useful substances in aerobic coryneform bacteria under anaerobic conditions DNA fragment having a promoter function that induces and enhances the expression of proteins involved in the production of useful substances in aerobic coryneform bacteria under anaerobic conditions
  • DNA fragment according to (1) wherein the DNA fragment having a promoter function that induces and enhances the expression of a protein involved in the production of a useful substance is any of the following DNAs:
  • DNA containing at least one base sequence selected from SEQ ID NOs: (1) to (394) in the sequence listing has a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, or added A promoter that functions to induce and enhance the expression of proteins involved in the production of useful substances;
  • DNA fragment according to (1) wherein the DNA fragment having the ability is any one of the following DNAs;
  • a DNA comprising at least one base sequence selected from SEQ ID Nos. (395) to (595) in the sequence listing, having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, or added; And a promoter function that induces and suppresses the expression of proteins involved in the production of useful substances;
  • the level of enhancement and Z or suppression of promoter function expression indicated by the expression level of mRNA is increased or Z or decreased by at least 50% or more than the level expressed in the reaction medium under aerobic conditions.
  • Enzymes are divided into glycolytic pathway, reductive tricarboxylic acid pathway, anaprerotic pathway, amino acid synthesis pathway, purine synthesis pathway, pyrimidine synthesis pathway, cholesterol synthesis pathway, fatty acid synthesis pathway and pathways derived from these pathways.
  • the organic acid is pyruvic acid, citrate, isocitrate, aconitic acid, 2-oxoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxalate acetic acid, itaconic acid, lactic acid, acetic acid, darco Acid, 2-ketogluconic acid, 5-ketogluconic acid, D-araboascorbic acid, kojic acid, tetradecane-1,14-dicarboxylic acid, cumic acid and inosinic acid power At least one organic acid selected The DNA fragment according to (7) above,
  • the amino acid is aspartic acid, threonine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, cysteine, norine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanin, histidine, lysine, anoleginin, serine, asparagine, glutamine, hydroxy Lysine, cystine, methionine, tryptophan, ⁇ -alanin, ⁇ -aminobutyric acid (GABA), homosysteme, ornithine, 5-hydroxytryptophan, 3, 4-dihydroxyphenylalanine (dopa), triyoidothyronine
  • the DNA fragment according to (7) above which is at least one amino acid selected from 4-hydroxyproline and thyroxine power,
  • the DNA fragment having a promoter function of the present invention can efficiently and highly express target genes necessary for production of useful substances under anaerobic conditions, it can suppress the expression of unnecessary genes. It can be produced efficiently.
  • by strengthening the functional expression of various protein gene promoters necessary for the production of target useful substances, or by suppressing the functional expression of unnecessary protein gene promoters specialized in the target product in coryneform bacteria (Aggregated) metabolic pathways can be created, and the flow of substances to unnecessary metabolic pathways can be suppressed. Specifically, the productivity of the target substance is improved and the production of unnecessary substances such as by-products can be suppressed.
  • the DNA fragment having a promoter function according to the present invention is located in the coryneform bacterium so as to function upstream of a gene encoding a protein (for example, an enzyme) that produces a target useful substance whose expression should be enhanced or suppressed.
  • a protein for example, an enzyme
  • a transformant of coryneform bacterium that can efficiently produce a desired useful substance under anaerobic conditions can be created.
  • the coryneform bacterium transformed using the DNA fragment having a promoter function of the present invention produces highly effective organic acids such as lactic acid succinic acid or alcohols and amino acids such as amino acid.
  • the purified useful substance can be used as a raw material for polymer synthesis or as a pharmaceutical raw material, or in a wide range of fields such as cosmetics and food additives.
  • FIG. 1 shows the correlation of fluorescence signal intensities of Cy3 and Cy5.
  • promoter refers to a region on DNA to which RNA polymerase specifically binds in order to initiate transcription of a gene.
  • a “DNA fragment having a promoter function” is a DNA fragment that can also obtain chromosomal DNA of an aerobic coryneform bacterium, or a DNA fragment that is artificially synthesized, and the DNA fragment is a function that initiates transcription of a gene. In other words, it means a DNA fragment presumed to have a gene transcription ability and contain the above promoter in the DNA fragment.
  • induction is generally used when the expression is enhanced, but in the present invention, the increase or decrease of the expression is caused by factors inside and outside the cell.
  • induction is used to mean triggered.
  • the degree can also be indicated by the expression level of mRNA.
  • induction enhancement in the present invention means that the expression of a DNA sequence having an induced promoter function is increased, that is, enhanced because the reaction medium is under a specific condition (anaerobic condition)
  • the level of expression of the promoter function indicated by the expression level of mRNA means that the level is enhanced to at least about 50% or more, preferably about 100% or more than the expression level in the reaction medium under aerobic conditions.
  • “Inhibition of induction” means that since the reaction medium is under specific conditions (anaerobic conditions), the expression of the DNA sequence containing the induced motor site is reduced, ie, suppressed.
  • the level of expression of the promoter function expressed by the expression level of at least about 50% is reduced to at least about 50%, preferably about 90%, than the level expressed in the reaction medium under aerobic conditions. Say what you are.
  • the coryneform bacterium used in the present invention is a Bursey's 'Mual' Determinant.
  • Corynebacterium Brevibaterium, Arthrobacter, Mycobacteria, and Micrococcus.
  • Corynebacterium Corynebataterum dartamicum
  • Brevibacterium spp. include Brevibac terium lactofermentum ATCC13869, Breviba cterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) or MJ-233AB-41 (F ERM BP-1498) or Brevibacterium ammoniagenes ATCC6872 and the like.
  • Arthrobacter examples include Arthrobacter globiformis ATCC8010, ATCC4336, ATCC21056, ATCC31250, ATC C31738, and ATCC35698.
  • Micrococcus examples include Micrococcus freudenreichii No. 239 (FERM P— 13221), Micro coccus luteus No. 240 (FERM P— 13222), Micrococcus ureae. (Micr ococcus ureae) IAM1010 or Micrococcus roseus IF03764 etc. are mentioned.
  • Corynebacterium glutamicur R (FERM P-18976), Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and the like are particularly preferable.
  • the aerobic coryneform bacterium used in the present invention is a wild strain existing in nature.
  • Artificial strains using biotechnology such as genetic recombination (for example, FERM P-17189, FERM P-17888, FERM P-18977, FERM P-18978, etc.) FERM P—18979 etc.)).
  • a coryneform bacterium cell under aerobic conditions used in the following method is obtained by growing and culturing the above-mentioned coryneform bacterium under aerobic conditions.
  • Cultivation of coryneform bacteria can be performed using a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • a carbon source for example, glucose or molasses as a carbon source
  • a nitrogen source for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium salt, ammonium nitrate or urea, respectively. They can be used alone or in combination.
  • the inorganic salt for example, potassium monohydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate-magnesium or magnesium sulfate can be used.
  • nutrients such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, various vitamins such as piotin or thiamine, and the like can be appropriately added to the medium.
  • Cultivation can be obtained by culturing while aerating air using a jar armor, and collecting and collecting cells under aerobic conditions with DO (dissolved oxygen concentration) of 6 ppm or more.
  • the culture temperature can be about 20 ° C to 40 ° C, preferably about 25 ° C to 35 ° C.
  • the pH during culture is about 5-10, preferably about 7-8, and pH adjustment during culture can be performed by adding acid or alkali.
  • the carbon source concentration at the start of the culture is about 1 to 20% (W / V), preferably about 2 to 5% (W / V).
  • Examples of a method for obtaining coryneform bacterial cells under anaerobic conditions include a method of washing and recovering bacterial cells cultured aerobically using the above-mentioned jar mentorer and the like.
  • the method for recovering and separating the cultured cells from the culture obtained as described above is not particularly limited, and known methods such as centrifugation and membrane separation can be used.
  • the cultured cells of the coryneform bacterium recovered and separated as described above can be obtained under reduced conditions (reaction solution), for example, as disclosed in JP 2004-194570 A. It is subjected to the reaction conditions for the formation of organic compounds with an acid reduction potential of about -200 millivolts to -500 millivolts, and is separated and recovered.
  • the cells thus obtained can be used in the present invention as coryneform bacterial cells under anaerobic conditions.
  • the method for obtaining a DNA fragment having a promoter function that enhances or suppresses induction under anaerobic conditions according to the present invention includes coryneform bacterial cells under aerobic conditions and coryneform bacterial cells under anaerobic conditions. The most efficient method is to extract mRNA from each of them and use a DNA chip for all genes to comprehensively analyze changes in the amount of individual mRNA in the cell.
  • Examples of the DNA fragment having a promoter function that enhances induction under anaerobic conditions according to the present invention include the DNA fragments represented by SEQ ID NOs: (1) to (394) in the sequence listing.
  • Examples of the DNA fragment having a promoter function include the DNA fragments shown in the above SEQ ID NOs: (395) to (595).
  • Each DNA sequence shown in the above SEQ ID No. has a base sequence with one or several bases deleted, substituted, or added, and induces and enhances the expression of proteins involved in the production of useful substances Alternatively, DNA having a promoter function that suppresses induction is included.
  • DNA having a promoter function that suppresses induction is included.
  • the nucleotide sequence when “one or several bases are deleted, substituted, or added”, the number is determined by a well-known technical method such as site-directed mutagenesis, or the number that can occur naturally ( 1 to several bases) is deleted, substituted, or added.
  • the DNA fragment having a promoter function under anaerobic conditions includes a DNA fragment represented by the above-mentioned SEQ ID NO. And a DNA comprising a complementary base sequence under stringent conditions.
  • DNA that can be hybridized under stringent conditions means that the above-mentioned DNA is used as a probe, and the hybrid-method, plaque-hybridization method, or Southern blot hybrid method is used. It means DNA obtained by using the session method.
  • the stringent conditions include, for example, an SSC solution with a salt concentration of about 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution with a concentration of 1 consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium quenate), temperature. Hybridization conditions at about 65 ° C.
  • the DNA fragment having a promoter function under anaerobic conditions according to the present invention has at least about 80% homology with each of the DNA sequences shown in SEQ ID NOs. And DNA having a promoter function that induces, enhances or suppresses the expression of proteins involved in the production of useful substances.
  • the homologous DNA is preferably a DNA having a homology of about 80% or more, more preferably a DNA having a homology of about 90% or more, more preferably about 95%, under non-stringent conditions. This DNA has the above homology.
  • the high stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C.
  • a sodium concentration of about 19 to 40 mM preferably about 19 to 20 mM
  • a temperature of about 50 to 70 ° C preferably about 60 to 65 ° C.
  • the most preferable condition is when the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the degree of enhancement or suppression of the promoter function in a DNA fragment having a promoter function under anaerobic conditions can be determined using the expression level of mRNA as an index.
  • “enhanced expression” refers to the ability to express mRNA in a reaction medium under anaerobic conditions in coryneform bacteria, at least about 50% more than the expression level of mRNA in a reaction medium under aerobic conditions, In other words, it means about 1.5 times or more increase.
  • “suppression of expression” means that the expression level of mRNA in the reaction medium under anaerobic conditions of coryneform bacteria is reduced by at least about 50% or more than the expression level of mRNA in the reaction medium under aerobic conditions. That is, it is reduced to about 1 Z2 or less.
  • the method for obtaining a DNA fragment having a promoter function that enhances or suppresses induction under non-aerobic conditions includes coryneform bacterial cells under aerobic conditions and coryneform under non-aerobic conditions.
  • the most efficient method is to extract mRNA from each bacterial cell and comprehensively analyze changes in the amount of individual mRNA in the cell using a DNA chip for all genes.
  • the above DNA chip is, for example, whole genome analysis of coryneform bacteria (C. glutamicum R strain)
  • the method for extracting total RNA of coryneform bacterial cell force is performed, for example, by lysozyme treatment of the cell suspension, shaking with glass beads, for example, QIAGEN RNeasy Mini Kit (manufactured by Qiagen).
  • RNA extraction kit eg MORA- eXTRACT (Cosmo 'Bio Inc.), Total RNA Isolation Mini kit (manufactured by Agilent Co.), RNA isolation Kit (Stratagene), Isogen (-Tubongene), Trizol (Invitrogen), QuickPick mRNA-mini kit (BIO NOBILE) and the like can be preferably used.
  • the labeling of the probe used for the DNA chip is performed by synthesizing cDNA using random primers and labeling with a marker (eg, fluorescent label or radioisotope) using the total RNA as a standard method. Can be created.
  • a marker eg, fluorescent label or radioisotope
  • the total RNA total RNA (Cy5) extracted from coryneform bacterial cell force under aerobic conditions or RNA (Cy3) extracted from coryneform bacterial cell forces under anaerobic conditions is used.
  • Hybridization, washing, and drying of the DNA chip are preferably performed automatically by, for example, Amersham Biosciences Lucidea SlidePro in order to suppress variation in data as much as possible.
  • the detected image data is preferably subjected to numerical value and normal value by Axon Instruments GenePix Pro 5.0 or the like. It is preferable to use an average value of at least three experimental data.
  • the obtained data (Ratio of Meands (Cy3ZCy5); signal intensity under non-aerobic condition Z signal intensity under aerobic condition) is about 1.5 times (about 50% increase) or more or about 0.5 times (about 50 times)
  • Genomic intelligence is also extracted for the genes corresponding to the following samples, from the lbp upstream of the start codon of each gene to the end of the upstream gene of that gene (in the case of co-directional transcription; lbp downstream of the start codon of the upstream gene)
  • Up to the reverse transcription gene up to lbp upstream of the start codon of the upstream gene) can be selected as the inducible promoter.
  • the protein involved in the production of useful substances is preferably an enzyme involved in metabolism in coryneform bacteria.
  • examples of such enzymes include glycolysis pathway, reductive tricarboxylic acid pathway. , Anaprerotic pathway, amino acid synthesis pathway, purine synthesis pathway, pyrimidine synthesis pathway, cholesterol synthesis pathway or fatty acid synthesis pathway, are enzymes involved in pathways derived from these pathways, glycolysis pathway, reduction More preferred are enzymes involved in the chemical tricarboxylic acid pathway, the anaprerotic pathway or the amino acid synthesis pathway.
  • Enzymes involved in the glycolytic pathway include, for example, hexokinase, dalcokinase, phosphoglucose isomerase, phosphofructose kinase, aldolase, triosephosphate isomerase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase, phosphodarine Powers including, but not limited to, cellomase, enolase or pyruvate kinase.
  • Examples of the enzymes involved in the reductive tricarboxylic acid pathway include pyruvate synthase, citrate synthase, aconite hydratase, isocitrate dehydrogenase, 2-oxoglutarate dehydrogenase, succil CoA synthase, succinate dehydrogenase, Forces such as fumarate hydratase, malate dehydrogenase, isocitrate lyase or malate synthase are not limited to these.
  • Enzymes involved in the anaprerotic pathway include, but are not limited to, for example, pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, or phosphoenolpyruvate carboxykinase.
  • Enzymes involved in the amino acid synthesis pathway include all enzymes that generate amino acids including amino acid synthase, amino acid synthetase, and the like. Specifically, for example, aspartate aminotransferase, asparaginase, glutamate-alanine aminotransferase, phosphoglycerate dehydrokinase, phosphoserine aminotransferase, phosphoserine phosphatase, serine dehydratase, glycine hydroxymethyltransferase, glycine synthase, threo -Aldolase, threonine dehydratase, threonine synthase, homoserine kinase, homoserine dehydrogenase, aspartate semialdehyde dehydrogenase, cystine reductase, histidinol dehydrogenase, phenylalanine hydroxylase, glutamine synthetas
  • Examples of enzymes involved in the purine synthesis pathway include enzymes involved in the pentose phosphate cycle (eg, gnolecose 6-phosphate dehydrogenase, lactonase, 6-phosphognoleconate dehydrogenase, ribulose acid 3-epimerase, ribose phosphate isomerase, etc.) ), Ribose phosphate pyrophosphokinase, amide phosphoribosyltransferase, glycine amide ribotide synthase, glycine amide ribotide formyltransferase, formylstructure amide ribotide synthetase, AIR (5-aminoimidazole ribotide) synthetase, 5-aminoimidazole -4 (N-succinocarboxamide) ribotide synthetase, ade-losuccinate lya
  • Examples of the enzyme involved in the pyrimidine synthesis pathway include force ruvamoyl phosphate synthase II, aspartate force rubamoyl transferase, dihydrorotase, orotate reductase, dihydrorotate dehydrogenase, phosphorate phosphoroyltransferase.
  • Examples thereof include OMP (orotidine monophosphate) decarboxylase, cytidine deaminase, uridine phosphorylase, deoxyuridine phosphorylase, dihydrouracil dehydrogenase, dihydropyrimidinase and thymidine phosphorylase.
  • Examples of enzymes involved in the cholesterol synthesis pathway include 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase, lanosterol synthase, and the like.
  • Examples of the enzymes involved in the fatty acid synthesis pathway include fatty acid synthase, long-chain fatty acid acylated coenzyme A, acetyl CoA carboxylase, and acyltransferase.
  • Examples of enzymes involved in pathways derived from the above pathways include lactate dehydrogenase that produces pyruvate lactic acid, pyruvate decarboxylase or alcohol dehydrogenase that produces alcohol from pyruvate, and pyrubin that produces acetate from pyruvate. Examples thereof include, but are not limited to, malic acid synthase or isocitrate lyase in the darioxyl cycle.
  • the DNA fragment having a promoter function of the present invention is involved in the production of the useful substance. It should be introduced on a plasmid or chromosome that can replicate autonomously in coryneform bacteria so that it is located upstream of the gene encoding the protein. Thus, by placing a DNA fragment having a promoter function upstream of a gene encoding a protein involved in the production of a useful substance, the target useful substance can be produced efficiently and highly efficiently under anaerobic conditions.
  • an expression gene for example, a gene encoding a useful protein produced in plants, which is not possessed by a coryneform bacterium, is arranged. You can also
  • Examples of useful substances include organic acids, amino acids, alcohols, steroids, nucleic acids, fatty acids, and physiologically active substances.
  • organic acids examples include pyruvic acid, citrate, isocitrate, aconitic acid, 2-oxoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxalate acetic acid, itaconic acid, lactic acid, acetic acid, darconic acid, 2 Examples include ketogluconic acid, 5 ketogluconic acid, D-araboascorbic acid, kojic acid, tetradecane 1,14-dicarboxylic acid, or cumic acid.
  • Organic acids also include, but are not limited to, purine nucleotides such as inosinic acid.
  • amino acids aspartic acid, threonine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, cysteine, norine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanin, histidine, lysine, anoleginin, serine, wasparagine, glutamine, hydroxy
  • amino acids aspartic acid, threonine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, cysteine, norine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanin, histidine, lysine, anoleginin, serine, wasparagine, glutamine, hydroxy
  • Examples include lysine, cystine, methionine or tributophan.
  • ⁇ -alanine for example, ⁇ -alanine, ⁇ -alanine (GABA), homocystine, orthine, 5-hydroxytryptophan, 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa), triodothyronine, 4- Special amino acids such as hydroxyproline or thyroxine are not limited to these.
  • any alcohol that is produced by alcohol fermentation is preferable.
  • methanol, ethanol, butanol and the like are not limited thereto.
  • a steroid having a perhydrocyclopentanophenanthrene skeleton as a basic structure.
  • cholesterol eg, taurocholic acid, glycocholic acid, etc.
  • sex hormone eg, lutein hormone, male steroid, follicular steroid, etc.
  • adrenal cortex hormone eg, cortisol, corticosterone, aldosterone
  • plant saponins such as digitoxin are also included, but not limited thereto.
  • nucleic acid examples include RNA and DNA.
  • fatty acids examples include normitic acid, myristic acid, stearic acid, and the like. Fatty acids also include, but are not limited to, for example, sphingoids, prostaglandins, arachidonic acids or eicosatetraenoic acids.
  • physiologically active substances include hormones (eg, insulin, growth hormone, ACTH, oxytocin, vasopressin, thyroxine, TRH, LHRH, etc.), vitamins (eg, vitamin B, vitamin B, vitamin B, nontetonic acid). , Folic acid, vivid chin, vitamin K etc.), histamine,
  • Powers including serotonin or interleukins, but not limited to these.
  • the useful substance of the present invention is not limited to those described above, and any substance that can be produced by the coryneform bacterium of the present invention can be preferably used.
  • reaction stock solution having 0 g of distilled water and lOOOmL force was prepared and autoclaved at 120 ° C for 20 minutes. 500 mL of this reaction stock solution was introduced into a 1 L glass reaction vessel.
  • This reaction vessel is equipped with a pH adjusting device, a temperature maintaining device, an in-vessel reaction liquid stirring device, and a reduction potential measuring device.
  • the coryneform bacteria prepared after the culturing were suspended in 500 mL of the reaction stock solution in the reaction vessel. Glucose 200 mM was added and the reaction temperature was maintained at 33 ° C., and an organic compound production reaction was started. The oxidation-reduction potential during the reaction was initially 200 mV, but decreased immediately after the start of the reaction, and was maintained at ⁇ 400 mV to continue the reaction. After 4 hours of reaction, the cells were collected and used as coryneform bacterial cells under anaerobic conditions. When the reaction medium solution at this time was analyzed using a liquid chromatography, 186 mM (16.7 g / L) of lactic acid (this value after 3 hours) was produced.
  • Degradation of contaminating genomic DNA was performed on the column using Set.
  • 350 L of Buffer RW1 was applied to the column, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, centrifuged at 10, OOOrpm for 15 seconds, and the effluent was discarded.
  • 500 L Buffer RPE was added to the column and centrifuged at 10, OOOrpm for 15 seconds, and the effluent was discarded.
  • 500 L Buffer RPE was added to the column and centrifuged at 10, OOOrpm for 2 minutes, and the effluent was discarded.
  • RNA concentration was calculated by measuring the O. D. absorbance with a spectrophotometer (
  • the DNA chip adopts the Stanford method.
  • Whole genome solution of C. glutamicum R strain Analysis (Hiroshi Nonaka, Kaori Nakata, Naoko Okai, Mariko Wada, Yumiko Sato, Kos Peter, Masayuki Inui, Hideaki Yukawa, Japan Society for Agricultural Chemistry, April 2003, Yokohama, Japan Agricultural Chemistry Society Estimate the presence of 3080 genes from the 2003 Annual Meeting Abstracts (see p20).
  • PCR is a pair consisting of a 20 base sequence downstream from the third base (ATG) of the start codon of each gene and a 20 base sequence upstream of the first base (TAA) force of the stop codon.
  • Primers were designed for all genes, and DNA fragments containing each gene ORF sequence were amplified by PCR.
  • the amplified product was confirmed to show the desired size in a single band by electrophoresis on a 1% agarose gel. When multiple bands were confirmed, repeated experiments were performed to obtain a single band by optimizing the PCR conditions such as annealing temperature.
  • the finally obtained DNA sample was spotted on an IX 3 inch Takara Slide by a spotter, and then fixed by the Takara array slide standard method. To obtain quantitative properties, two spots were performed for each gene.
  • the DNA chip uses the total RNA of the Corynebacterium glutamicum R strain as a cocoon type, cDNA synthesis with a random primer (9mer) and fluorescent labeling (Cy5 is the total RNA extracted from coryneform bacterial cells under aerobic conditions. 3 was performed using RNA extracted from coryneform bacterial cells under anaerobic conditions) to prepare a labeled probe. Amersham Biosciences CyScribe cDNA Post Labeling Kit (Amersham Biosciences Corp. USA) was used for cDNA synthesis and labeling reaction, and the protocol was followed. 8 ⁇ L of total RNA (30 ⁇ g) was supplemented with 3 ⁇ L of random nonamer primers, heated at 70 ° C. for 5 minutes, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes to anneal the primers to RNA. This RNA was added to the reaction reagent (5x CyScript buffer, 0.1M DTT, 2 ⁇ L, Cy5 is the total RNA extracted from coryneform bacterial
  • Digitization and normalization were performed using GenePix Pro 5.0 (Axon Instruments, Inc., CA, USA). After adjusting the color tone (Cy5; green, Cy3; red) for each channel and synthesizing images, the spots were surrounded by a grid and digitized. For normalization, global normalization was adopted. Assuming that the total expression intensity of all genes is the same among the cells being compared, the fluorescence intensity ratio of the entire array is set so that the median of the fluorescence intensity ratio of all signals of Cy5 and Cy3 (Median) is equal. Fixed (normalized).
  • Genome information is extracted from this Ratio of Meands (Cy3ZCy5) corresponding to a sample whose expression ratio is 1.5 times (50% rise) or more or 0.5 times (50% rise) or less, and each gene starts. From lbp upstream of the codon to the end of the upstream gene of the gene (in the case of co-directional transcription; lbp downstream of the termination codon of the upstream gene; reverse transcription gene; lbp upstream of the start codon of the upstream gene) This sequence was selected as an inducible promoter. As a result, the ratio of Meands (Cy3ZCy5) with an expression ratio of 1.5 times (50% increase) is 394 species (Table 1), and 0.5 or less (50% decrease) is 201 species (Table 1). 2) existed.
  • the expression ratio was analyzed by real-time quantitative RT-PCR.
  • the target samples were randomly selected from 3 types of SEQ ID NOs: 3, 22, 47 (numbers in Table 1), 0. Less than 5 times induction suppression Promoter 201 kinds of medium strengths Randomly selected 3 kinds of SEQ ID NO: 410, 474, 502 (numbers in Table 2).
  • Real-time quantitative RT-PCR analysis was performed with QIAGEN QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen) using total RNA as a saddle. Gene-specific primers were designed using Applied Biosystems Primer Express Software v2.0 (Applied Biosystems, USA). Real-time PCR experiments were performed with ABI PRIS M 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA), and PCR was performed using 96- Well Optical Reaction Plate (Applied Biosystems) and Optical Adhesive Covers (Applied Biosystems).
  • PCR reaction mixture is sample); Total RNA, 60 ng, 2 x QuantiTect S YBR Green RT—PCR Master Mix, 25 ⁇ L ⁇ , Primer Forward, 0.5 ⁇ M, Primer Reverse, 0.5 ⁇ M, QuantiTect RT Mix, adjusted with 0.5 ⁇ L.
  • the PCR reaction was performed at 50 ° C 30 min, 95 ° C 15 min, (95 ° C 15 sec, 57 ° C 20 sec, 60 ° C 1 min) x 40 cycles. After the PCR reaction is completed, the expression level is calculated by quantifying the ratio of expression levels for each sample and comparing the samples with each other using the expression ratio.
  • the induction-enhanced promoter SEQ ID NO: 3, 22, 47 (number in Table 1) showing the expression ratio of 1.5 times or more (the result is Table 3), the induction repressing promoter SEQ ID NO: 410 less than 0.5 times,
  • the expression ratios of 474 and 502 (numbers in Table 2) (results are in Table 4) matched the DNA chip analysis results very well.
  • the DNA fragment of the present invention is useful as a primer to be introduced into a transformed coryneform bacterium that highly efficiently produces a useful substance such as lactic acid succinic acid.
  • the coryneform bacterium into which the DNA fragment of the present invention has been introduced can be used for the production of organic acids, alcohols or amino acids.
  • the produced organic acid can be used in a wide range of fields such as a polymer synthesis raw material or a pharmaceutical raw material, a cosmetic use or a food additive use.
  • succinic acid and its derivatives are useful for biodegradable plastic raw materials and clean cleaning solvent applications that do not cause environmental pollution.

Abstract

　本発明は、嫌気条件下での有用な有機化合物の生産のため、該条件下でのコリネ型細菌の機能を高度に効率的に発揮させるべく、機能発揮に係わるコリネ型細菌内の各種遺伝子プロモーター機能発現誘導化方法に関連し、さらに、詳しくは目的物質生産に必要な各種蛋白遺伝子の効率的な高発現を図り、不要な蛋白遺伝子の発現の抑制を図ることを目的として、これら遺伝子に係わるプロモーター機能の強化及び／又は抑制する方法を提供するものである。 　本発明のＤＮＡ断片は、乳酸やコハク酸等の有用物質を高効率に高生成する形質転換コリネ型細菌に導入されるプライマーとして有用である。  

Description

プロモーター機能を有する DNA断片
技術分野
[0001] 本発明は好気性コリネ型細菌内で機能するプロモーター機能誘導発現方法及び そのプロモーター機能を有する DNA配列に関する。さらに詳しくは、各種有機酸や エタノール等の有用物質生産を高効率に行うことを目的として、コリネ型細菌内で機 能する各種遺伝子プロモーターの機能誘導発現強化及び Z又は抑制方法、そして 、そのプロモーター機能を有する DNA配列に関する。
背景技術
[0002] 従来よりコリネ型細菌は各種アミノ酸、乳酸ゃコハク酸等有用な有機化合物を製造 するために用いられている工業的に重要な好気性グラム陽性細菌である。特に、コリ ネ型細菌は酸素供給を制限する等の方法により細胞分裂が抑制された条件に於い ても物質生産を行う為の代謝経路が損なわれないと言う特異的な代謝機能を有して いる事より、コリネ型細菌に与えられた糖類等の栄養源が増殖に消費されずに効率 的に目的生産物に振り向けられることになり、原料栄養源の有効利用が図れること、 そして、細胞分裂が抑制されていることから来る目的物質生産技術制御の容易性等 が、コリネ型細菌が工業的に注目されて 、る由縁となつて 、る。
このような特徴あるコリネ型細菌の機能をさらに高度に発揮させるには、目的物質 生産に必要な各種蛋白遺伝子の効率的な高発現を図り、さらには、不要な蛋白遺伝 子の発現の抑制を図ることが必要となる。そのためには、これら蛋白遺伝子に係わる プロモーター機能の強化及び Z又は抑制を図ることのできる技術が重要となる。 コリネ型細菌内でプロモーター機能を有する DNA断片についてはいくつかの DN A断片が知られている。
[0003] 例えば、大腸菌由来の tacプロモーターよりも強いプロモーター機能を有する DNA 断片がコリネ型細菌の染色体上より見出され、その DNA配列が知られている。そし て、プロモーター機能発現の制御方法としては培地にカ卩える糖類やエタノール等の 炭素源組成を変える方法が提案されている (特許文献 1参照。 )o また、コリネ型細菌内で発現する特定の酵素蛋白（ァスパルターゼ)遺伝子に関す るプロモーター DNA配列が見出されている（特許文献 2参照。；)。しかし、そのプロモ 一ター機能発現方法としては、「タンパク質をコードする遺伝子とともにプラスミドべク ターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に導入された時に、該遺伝子の発現強度の増 加作用を有する」とのみ述べられており、プロモーター機能発現の強化方法や制御 方法に関しては言及されて 、な 、。
また、コリネ型細菌内で機能する外来性及び内在性の L グルタミン酸や L リジン 生産に関与する遺伝子のプロモーターが見出されているが (特許文献 3参照。）、そ れらの機能発現強化方法にっ 、ては全く言及されて 、な 、。
L—リジンの生産に dapA遺伝子（ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子）のプロモ 一ターが突然変異誘発方法により機能強化されたコリネ型細菌を用いる技術が提案 されている (特許文献 4参照。 )0しかし、嫌気条件下での機能強化については全く言 及されていない。
[0004] プロモーター機能発現誘導方法に関しては、ピルビン酸により誘導され、かつ、酸 素により抑制される pfl (ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子)プロモーターを含有する組 換え DNA配列（特許文献 5)や酵母サッカロマイセス ·セレピシェ (Saccharomayce s cerevisiae)の 2 デォキシグルコース— 6 リン酸脱リン酸化酵素遺伝子の酸化 的ストレス (過酸ィ匕脂質添加）、浸透圧ストレスそしてグルコース飢餓ストレス等のスト レス応答性プロモーター（特許文献 6)も知られている。特許文献 6には各種遺伝子 プロモーターの上記以外の誘導方法として、リン酸欠乏誘導法、銅添加誘導法等の 化学物質誘導法や熱ショック誘導法等も言及されて!ヽる。
[0005] 上記した如ぐ各種のプロモーター DNA配列及びプロモーター機能の各種薬剤や ストレスによる誘導発現方法が知られているが、本発明の嫌気条件下にある反応培 地で誘導強化及び Z又は誘導抑制され、コリネ型細菌内で機能するプロモーター機 能制御方法やプロモーター機能を有する DNA断片は知られて 、な 、。
特許文献 1 :特開平 7— 95891号公報
特許文献 2：特開平 7 - 31478号公報
特許文献 3：国際公開第 95Z23224号パンフレット 特許文献 4：特開 2001— 61485号公報
特許文献 5：特開平 3 - 80088号公報
特許文献 6：特開 2000— 78977号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 好気性コリネ型細菌 (組換え型を含む）は従来より好気条件下 (各種アミノ酸)や嫌 気条件下 (乳酸、コハク酸やエタノール等)で有用な有機化合物の生産に用いられて いる。
本発明は、嫌気条件下での有用な有機化合物の生産のため、該条件下でのコリネ 型細菌の機能を高度に効率的に発揮させるベぐ機能発揮に係わるコリネ型細菌内 の各種遺伝子プロモーター機能発現誘導ィ匕方法に関連し、さらに、詳しくは目的物 質生産に必要な各種蛋白遺伝子の効率的な高発現を図り、不要な蛋白遺伝子の発 現の抑制を図ることを目的として、これら遺伝子に係わるプロモーター機能の強化及 び Z又は抑制する方法を提供するものである。また、それら機能の強化及び Z又は 抑制されるプロモーター機能を有する DNA断片を提供しょうとするものである。 本発明の技術を用いる事により、嫌気条件での有用物質生産を効率的に実施する ことが可能となる。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、コリネ型細菌の嫌気条件下での物質生産機能を高度に発揮させる には、それに係わるコリネ型細菌内の各種遺伝子プロモーター機能発現誘導ィ匕技術 が重要と考え、鋭意検討した結果、本発明に到達した。
遺伝子プロモーターは構成的プロモーターと誘導的プロモーターとに大別されるが 、嫌気条件下で有用物質生産を行う場合には、構成的プロモーターの機能強化を図 るよりも嫌気条件下で誘導されるプロモーター機能の発現制御技術を見出すことの 方がよりターゲットとする遺伝子の発現を効率的に行なえるので、高効率な物質生産 技術となる。
すなわち、目的物質生産に必要な各種蛋白遺伝子プロモーターの機能発現を誘 導強化し、及び Z又は不要な蛋白遺伝子プロモーターの機能発現を誘導抑制する ことで、コリネ型細菌内に目的生産物質へ特化 (集約)された代謝経路を造り出し、不 必要な代謝経路への物質の流れを抑制できる。具体的には、目的物質の生産性が 向上し、副生成物等の不要な物質生成を抑えることができることになる。
[0008] 各種遺伝子プロモーターの発現の程度は、例えば、 DNAチップを用いる mRNA 生成量の測定により定量的に知り得ることができ、好気条件下の生成量と嫌気条件 下の生成量を比較する事により本発明のプロモーター機能を有する DNA断片を得 ることができることを本発明者らは知見した。本発明者らは、さらに研究をすすめ本発 明を完成するにいたった。
[0009] すなわち、本発明は、
(1) 嫌気条件下において、好気性コリネ型細菌内で有用物質の生成に関与するタ ンパク質の発現を誘導強化及び Z又は誘導抑制する、プロモーター機能を有する D NA断片、
(2) 有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導強化するプロモーター機 能を有する DNA断片が次のいずれかの DNAである前記（1)に記載の DNA断片；
(a)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNA;
(b)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNAにおいて、 1又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を 有し、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導強化するプロモータ 一機能を有する DNA;
(c)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズし、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導強化するプロモータ 一機能を有する DNA；又は
(d)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNAと少なくとも 80%以上の相同性を有し、かつ有用物質の生成に関与するタン パク質の発現を誘導強化するプロモーター機能を有する DNA、
(3) 有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導抑制するプロモーター機 能を有する DNA断片が次のいずれかの DNAである前記（1)に記載の DNA断片；
(a)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNA;
(b)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNAにおいて、 1又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列 を有し、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導抑制するプロモー ター機能を有する DNA;
(c)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダ ィズし、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導抑制するプロモー ター機能を有する DNA;又は
(d)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNAと少なくとも 80%以上の相同性を有し、かつ有用物質の生成に関与する タンパク質の発現を誘導抑制するプロモーター機能を有する DNA、
(4) mRNAの発現量で示されるプロモーター機能発現の強化及び Z又は抑制の 程度が、好気条件下の反応培地で発現される量よりも少なくとも 50%以上増大及び Z又は減少して 、ることを特徴とする前記（1)〜（3)の 、ずれかに記載の DNA断片
(5) 有用物質の生成に関与するタンパク質がコリネ型細菌内の代謝に係わる酵素 であることを特徴とする前記（1)〜 (4)の 、ずれかに記載の DNA断片、
(6) 酵素が、解糖経路、還元的トリカルボン酸経路、アナプレロティック経路、ァミノ 酸合成経路、プリン合成経路、ピリミジン合成経路、コレステロール合成経路、脂肪 酸合成経路及びこれら経路より派生する経路に関与する少なくとも 1の酵素又は補 酵素であることを特徴とする前記（5)に記載の DNA断片、
(7) 有用物質が有機酸、アミノ酸、アルコール、ステロイド、核酸、脂肪酸又は生理 活性物質であることを特徴とする前記（6)に記載の DNA断片、
(8) 有機酸が、ピルビン酸、クェン酸、イソクェン酸、アコニット酸、 2—ォキソグルタ ル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ォキサ口酢酸、ィタコン酸、乳酸、酢酸、ダルコ ン酸、 2—ケトグルコン酸、 5—ケトグルコン酸、 D—ァラボアスコルビン酸、コウジ酸、 テトラデカン一 1, 14—ジカルボン酸、クミン酸及びイノシン酸力 選択される少なくと も 1の有機酸であることを特徴とする前記（7)に記載の DNA断片、
(9) アミノ酸が、ァスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、ァラ ニン、システィン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニールァラニン、ヒス チジン、リジン、ァノレギニン、セリン、ァスパラギン、グルタミン、ヒドロキシリシン、シス チン、メチォニン、トリプトファン、 β—ァラニン、 γ—ァミノ酪酸（GABA)、ホモシステ イン、オル二チン、 5—ヒドロキシトリプトファン、 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（ド ーパ）、トリヨ一ドチロニン、 4—ヒドロキシプロリン及びチロキシン力 選択される少なく とも 1のアミノ酸であることを特徴とする前記（7)に記載の DNA断片、
(10) アルコールが、メタノール、エタノール及びブタノールから選択される少なくと も 1のアルコールであることを特徴とする前記（7)に記載の DNA断片、及び
(11) 好気性コリネ型細菌が、嫌気条件下、反応培地の酸ィ匕還元電位を— 200ミリ ボルト乃至— 500ミリボルトにおいて培養されることを特徴とする、前記（1)に記載の プロモーター機能を有する DNA断片のプロモーター機能を誘導する方法、 に関する。
発明の効果
本発明のプロモーター機能を有する DNA断片は、嫌気条件下での有用物質生産 に必要なターゲット遺伝子を高効率に高発現でき、不要な遺伝子の発現を抑制でき るので、目的とする有用物質を高効率で生産できる。すなわち、目的とする有用物質 生産に必要な各種蛋白遺伝子プロモーターの機能発現強化を図り、又は不要な蛋 白遺伝子プロモーターの機能発現抑制を図ることで、コリネ型細菌内に目的生産物 質へ特化 (集約)された代謝経路を造り出し、不必要な代謝経路への物質の流れを 抑制できる。具体的には、目的物質の生産性が向上し、副生成物等の不要な物質生 成を抑えることができることになる。
本発明のプロモーター機能を有する DNA断片は、発現強化又は抑制すべき目的 とする有用物質を生産するタンパク質 (例えば酵素等)をコードする遺伝子の上流に 位置して機能するように、コリネ型細菌内で自律複製が可能なプラスミドや染色体上 に導入すれば、嫌気条件下において、目的とする有用物質を効率的に高生産できる コリネ型細菌の形質転換体を創製することができる。
本発明のプロモーター機能を有する DNA断片を使用して形質転換されたコリネ型 細菌は乳酸ゃコハク酸等の有機酸又は、アルコールゃアミノ酸等の有用物質を高効 率に高生産する。精製された有用物質は高分子合成原料又は医薬原料として、ある いは化粧品用途そして食品添加剤用途等広い分野で使用できる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は Cy3及び Cy 5の蛍光シグナル強度の相関を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明にお 、て、「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するために RNAポリメ ラーゼが特異的に結合する DNA上の領域を 、う。「プロモーター機能を有する DNA 断片」とは、好気性コリネ型細菌の染色体 DNA力も得られる DNA断片又は人工的 に合成される DNA断片であり、該 DNA断片は遺伝子の転写を開始する機能、すな わち遺伝子の転写能力を有しており、該 DNA断片中に上記プロモーターが含まれ て ヽると推定される DNA断片を意味する。
また、プロモーター機能の発現に関して、「誘導」なる語句は一般的にはその発現 が強化される場合に使用されることが多いが、本発明では細胞内外の要因によりそ の発現の増大又は減少が誘発されることの意味で「誘導」なる語句が使用される。ま た、その程度は mRNAの発現量によって示すことができる。
従って、本発明における「誘導強化」とは、反応培地が特定の条件 (嫌気条件）下に あるため、誘発されるプロモーター機能を有する DNA配列の発現が増大、即ち強化 されることを意味し、 mRNAの発現量で示されるプロモーター機能発現の程度力 好 気条件下の反応培地で発現される量よりも、少なくとも約 50%以上、好ましくは約 10 0%以上に強化されることをいう。
「誘導抑制」とは、反応培地が特定の条件 (嫌気条件）下にあるため、誘発されるプ 口モーター部位を含む DNA配列の発現が減少、即ち、抑制されることを意味し、 mR NAの発現量で示されるプロモーター機能発現の程度が、好気条件下の反応培地 で発現される量よりも、少なくとも約 50%以上、好ましくは約 90%程度にまで減少し ているものをいう。
[0013] 本発明で使用されるコリネ型細菌とは、バージーズ 'マ-ユアル'デターミネイティブ
'ノヽクァリオロン ~~ (Bargeys Manual of Determinative Bacteriology,第 8 卷， p. 599、 1974年）に定義されている一群の微生物のことをいう。
具体的には、コリネバタテリゥム属菌、ブレビバタテリゥム属菌、アースロバクター属 菌、マイコバクテリューム属菌又はマイクロコッカス属菌等が挙げられる。
[0014] さらに具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバタテリゥム ダルタミカム
(Corynebacterium glutamicum) FERM P— 18976、 ATCC13032、 ATCC 13058、 ATCC13059, ATCC 13060, ATCC13232, ATCC13286、 ATCC1 3287、 ATCC13655, ATCC13745, ATCC 13746, ATCC13761、 ATCC 14 020又は ATCC31831等が挙げられる。
[0015] ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバタテリゥム ラタトフアーメンタム（Brevibac terium lactofermentum) ATCC13869、ブレビバタテリゥム フラバム（Breviba cterium flavum) MJ - 233 (FERM BP— 1497)もしくは MJ— 233AB— 41 (F ERM BP— 1498)、又はブレビバタテリゥム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes) ATCC6872等が挙げられる。
[0016] アースロバクター属菌としては、アースロバクタ一 グロビフオルミス（Arthrobacter globiformis) ATCC8010、 ATCC4336、 ATCC21056、 ATCC31250、 ATC C31738又は ATCC35698等力挙げられる。
[0017] マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus fr eudenreichii) No. 239 (FERM P— 13221)、マイクロコッカス ルテウス（Micro coccus luteus) No. 240 (FERM P— 13222)、マイクロコッカス ウレァェ（Micr ococcus ureae) IAM1010又はマイクロコッカス ロゼウス (Micrococcus roseu s) IF03764等が挙げられる。
[0018] 本発明で用いられる好気性コリネ型細菌としては、 Corynebacterium glutamic urn R (FERM P— 18976)、 Corynebacterium glutamicum ATCC 1303 2等が特に好ましい。
また、本発明で用いられる好気性コリネ型細菌としては自然界に存在する野生株の 変異株（例えば、 FERM P- 18977, FERM P— 18978株等）であってもよぐま た遺伝子組換え等のバイオテクノロジーを利用した人為株 (例えば、 FERM P- 17 887、 FERM P— 17888、 FERM P— 18979等;)であってもよい。
[0019] 本発明において、下記手法に用いる好気条件下のコリネ型細菌細胞は、上述した コリネ型細菌を好気条件下で増殖培養することにより取得する。
[0020] コリネ型細菌の培養は、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む通常の栄養培地を用 いて行うことが出来る。培養には、炭素源として、例えばグルコース又は廃糖蜜等を、 そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ-ゥム、塩ィ匕アンモ-ゥム、硝 酸アンモ-ゥム又は尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。ま た、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸-水素カリウム又は硫酸マグ ネシゥム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、 酵母エキス、コーンスティープリカ一、カザミノ酸又はピオチンもしくはチアミン等の各 種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。
培養は、ジャーフアーメンターを用いてエアーを通気しながら培養し、 DO (溶存酸 素濃度）が 6ppm以上の好気条件下の細胞を集菌回収することにより得ることができ る。培養温度は、約 20°C〜40°C、好ましくは約 25°C〜35°Cの温度で行うことが出来 る。培養時の ρΗは約 5〜10付近、好ましくは約 7〜8付近の範囲がよぐ培養中の p H調整は酸又はアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養開始時の炭素 源濃度は、約 1〜20% (W/V)、好ましくは約 2〜5% (W/V)である。
[0021] 嫌気条件下のコリネ型細菌細胞の取得方法としては、上述のジャーフアーメンター 等を用いて好気的に培養した菌体を、洗菌、回収する方法等が挙げられる。上記の 如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず 、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。ついで、上記の 如くして得られる培養物力 回収分離されたコリネ型細菌の培養菌体は、例えば特 開 2004 - 194570号公報で開示されて 、る方法と同様の、還元状態下 (反応液の 酸ィ匕還元電位が約— 200ミリボルト乃至— 500ミリボルト）での有機化合物の生成反 応条件下に供せられ、分離、回収される。このようにして取得された菌体を嫌気条件 下コリネ型細菌細胞として本発明に用いることができる。 [0022] 本発明に係る嫌気条件下で誘導強化又は誘導抑制するプロモーター機能を有す る DNA断片の取得方法としては、好気条件下のコリネ型細菌細胞と嫌気条件下のコ リネ型細菌細胞それぞれカゝら mRNAを抽出して、全遺伝子対応の DNAチップを用 いて、網羅的に細胞内の個々の mRNA量変化を解析する方法によって行うのが最 も効率的である。
[0023] 本発明に係る嫌気条件下で誘導強化するプロモーター機能を有する DNA断片と しては、例えば配列表の配列番号（1)〜（394)で示される DNA断片等が挙げられ、 誘導抑制するプロモーター機能を有する DNA断片には、上記した配列番号（395) 〜（595)に示される DNA断片等が挙げられる。
上記した配列番号に示される各 DNA配列において、 1又は数個の塩基が欠失、置 換、若しくは付加された塩基配列を有し、かつ有用物質の生成に関与するタンパク 質の発現を誘導強化又は誘導抑制するプロモーター機能を有する DNAが含まれる 。塩基配列について、「1又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加」というときは、 部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程 度の数（1〜数個）の塩基が、欠失、置換、若しくは付加等されていることを意味する
[0024] また本発明に係る嫌気条件下でプロモーター機能を有する DNA断片には、上記 した配列番号に示される各 DNA断片と、それぞれ相補的な塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ有用物質の生成に関与するタン パク質の発現を誘導強化又は誘導抑制するプロモーター機能を有する DNAが含ま れる。ストリンジェントな条件下でハイブリダィズ可能な DNAとは、上記 DNAをプロ一 ブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、あ るいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを 意味する。ストリンジェントな条件とは、例えば、塩濃度、約 0. 1〜2倍程度の濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸 ナトリウムよりなる。）、温度約 65°C程度でのハイブリダィズ条件をいう。
[0025] さらに本発明に係る嫌気条件下でプロモーター機能を有する DNA断片には、上記 した配列番号に示される各 DNA配列と、それぞれ少なくとも約 80%以上の相同性を 有し、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導強化又は誘導抑制 するプロモーター機能を有する DNAが含まれる。相同性を有する DNAとは、ノ、イス トリンジヱントな条件において、好ましくは約 80%以上の相同性を有する DNA、より 好ましくは、約 90%以上の相同性を有する DNA、さらに好ましくは約 95%以上の相 同性を有する DNAをいう。なお、ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム 濃度が約 19〜40mM程度、好ましくは約 19〜20mM程度で、温度が約 50〜70°C 程度、好ましくは約 60〜65°C程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約 19mMで 温度が約 65°C程度の場合が最も好ましい条件である。
[0026] 本発明に係る嫌気条件下でプロモーター機能を有する DNA断片における、プロモ 一ター機能の強化又は抑制の程度は、 mRNAの発現量を指標とすることができる。 例えば「発現の強化」とは、コリネ型細菌の嫌気的条件下での反応培地での mRNA の発現量力 好気的条件下の反応培地での mRNAの発現量よりも少なくとも約 50 %以上増大、すなわち約 1. 5倍以上に増大することをいう。また、「発現の抑制」とは 、コリネ型細菌の嫌気的条件下での反応培地での mRNAの発現量力 好気的条件 下の反応培地での mRNAの発現量よりも少なくとも約 50%以上減少、すなわち約 1 Z2以下に減少することをいう。
[0027] 本発明に係る非好気条件下で誘導強化又は誘導抑制するプロモーター機能を有 する DNA断片の取得方法としては、好気条件下のコリネ型細菌細胞と非好気条件 下のコリネ型細菌細胞それぞれカゝら mRNAを抽出して、全遺伝子対応の DNAチッ プを用いて、網羅的に細胞内の個々の mRNA量変化を解析する方法が最も効率的 である。
[0028] 上記 DNAチップは、例えばコリネ型細菌（C. glutamicum R株）の全ゲノム解析
(野中 寛、中田 かおり、岡井 直子、和田 真利子、佐藤 由美子、 Kos Peter, 乾 将行、湯川 英明 「Corynebacterium glutamicum R ゲノム解析」 日本 農芸化学会、 2003年 4月、横浜、日本農芸化学会 2003年度大会講演要旨集、 p2 0参照）から得られた遺伝子情報に基づき、 PCRによりそれぞれの遺伝子 ORF (ォー プンリーディングフレーム）を増幅し、増幅された DNA断片をアレイスライドにスポット し、例えば Takaraアレイスライド標準法等により固定ィ匕処理することにより作製できる [0029] コリネ型細菌細胞力 のトータル RNAの抽出方法は、例えば細胞縣濁液をリゾチ ーム処理、ガラスビーズをカ卩えて振動破砕する、例えば QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen社製）により行うことができる（詳細は実施例に記載した。 ) 0また、前記 キットの他、市販の RNA抽出キット例えば MORA— EXTRACT (コスモ'バイオ社 製）、 Total RNA Isolation Mini Kit (Agilent社製）、 RNA isolation Kit ( Stratagene社製）、アイソジェン（-ツボンジーン社製）、トライゾール（Invitrogen社 製）、 QuickPick mRNA-mini kit (BIO NOBILE社製）等も好ましく使用でき る力 これらに限定されない。
[0030] DNAチップに用いるプローブのラベル化は、通常の方法であるトータル RN Aを铸 型として、ランダムプライマーによる cDNA合成とマーカー（例.蛍光標識または放射 性同位元素など)標識を行うことにより作成できる。本発明においては、前記トータル RNAとしては、好気条件下のコリネ型細菌細胞力 抽出したトータル RNA(Cy5)ま たは嫌気条件下のコリネ型細菌細胞力 抽出した RNA(Cy3)が用いられる。
[0031] DNAチップのハイブリダィゼーシヨン、洗浄及び乾燥は、データのばらつきを極力 抑えるために、例えば Amersham Biosciences Lucidea SlidePro等により自動 化処理することが好ましい。
[0032] 検出した画像データは、例えば Axon Instruments GenePix Pro 5. 0等に より数値ィ匕および正規ィ匕を行うのがよい。実験は、少なくとも 3回の実験データを平均 化した値を採用するのが好ま 、。
得られたデータ（Ratio of Meands (Cy3ZCy5)；非好気条件下シグナル強度 Z好気条件下シグナル強度）が、約 1. 5倍 (約 50%上昇）以上又は約 0. 5倍 (約 50 %降下)以下のサンプルに対応する遺伝子をゲノム情報力も抽出し、その各遺伝子 の開始コドンの lbp上流から、その遺伝子の上流遺伝子の末端（同方向転写の場合 ；上流遺伝子の終始コドンの lbp下流まで。逆方向転写遺伝子の場合;上流遺伝子 の開始コドンの lbp上流まで)までの配列を誘導プロモーターとして選択できる。
[0033] 有用物質の生成に関与するタンパク質としては、コリネ型細菌内の代謝に係わる酵 素が好ましい。このような酵素としては、例えば解糖経路、還元的トリカルボン酸経路 、アナプレロティック経路、アミノ酸合成経路、プリン合成経路、ピリミジン合成経路、 コレステロール合成経路又は脂肪酸合成経路、ある 、はこれら経路より派生する経 路等に関与する酵素が挙げられ、解糖経路、還元的トリカルボン酸経路、アナプレロ ティック経路又はアミノ酸合成経路に関与する酵素がより好ましい。
[0034] 解糖経路に関与する酵素としては、例えばへキソキナーゼ、ダルコキナーゼ、ホス ホグルコースイソメラーゼ、ホスホフルクトースキナーゼ、アルドラーゼ、トリオースリン 酸イソメラーゼ、グリセリンアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸 キナーゼ、ホスホダリセロムターゼ、エノラーゼ又はピルビン酸キナーゼ等が挙げられ る力 これらに限定されない。
[0035] 還元的トリカルボン酸経路に関与する酵素としては、例えばピルビン酸シンターゼ、 クェン酸シンターゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、イソクェン酸デヒドロゲナーゼ、 2—ォ キソグルタル酸デヒドゲナーゼ、スクシ-ル CoAシンターゼ、コハク酸デヒドロゲナー ゼ、フマル酸ヒドラターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、イソクェン酸リアーゼ又はリンゴ 酸シンターゼ等が挙げられる力 これらに限定されない。
[0036] アナプレロティック経路に関与する酵素としては、例えばピルビン酸カルボキシラー ゼ、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ又はホスホェノールピルビン酸カル ボキシキナーゼ等が挙げられる力 これらに限定されない。
[0037] アミノ酸合成経路に関与する酵素としては、アミノ酸シンターゼ、アミノ酸シンテター ゼなどを含むアミノ酸を生じるすべての酵素が挙げられる。具体的には、例えば、ァ スパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ァスパラギナーゼ、グルタミン酸ーァラニンアミ ノトランスフェラーゼ、ホスホグリセリン酸デヒドロキナーゼ、ホスホセリンアミノトランスフ エラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンデヒドラターゼ、グリシンヒドキシメチルト ランスフェラーゼ、グリシンシンターゼ、トレオ-ンアルドラーゼ、トレオ-ンデヒドラタ ーゼ、トレオ-ンシンターゼ、ホモセリンキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ァス パラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、シスチンレダクターゼ、ヒスチジノールデ ヒドロゲナーゼ、フエ二ルァラニンヒドロキシラーゼ、グルタミンシンテターゼ、リガーゼ 、ァスパラギンシンテターゼ又はトリプトファンシンターゼ等が挙げられる力 これらに 限定されない。 [0038] プリン合成経路に関与する酵素としては、例えば、ペントースリン酸回路に関与する 酵素（例.グノレコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼ、ラクトナーゼ、 6—ホスホグノレコン 酸デヒドロゲナーゼ、リブロース酸 3—ェピメラーゼ、リボースリン酸イソメラーゼ等）、リ ボースリン酸ピロホスホキナーゼ、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリシンアミ ドリボチドシンターゼ、グリシンアミドリボチドホルミルトランスフェラーゼ、ホルミルダリ シンアミドリボチドシンテターゼ、 AIR (5—ァミノイミダゾールリボチド）シンテターゼ、 5—ァミノイミダゾールー 4一（N—スクシノカルボキサミド）リボチドシンテターゼ、アデ -ロコハク酸リアーゼ、 5—ァミノイミダゾールー 4 カルボキサミドリボチドホルミルトラ ンスフェラーゼ、イノシン一リン酸（IMP)シクロヒドロラーゼ、アデ-口コハク酸シンタ ーゼ、アデ-口コハク酸リアーゼ、アデ-ル酸キナーゼ、 IMPデヒロゲナーゼ、 GMP (グアノシン 5'—リン酸)シンテターゼ、グァ -ル酸キナーゼ等が挙げられる。
[0039] ピリミジン合成経路に関与する酵素としては、例えば、力ルバモイルリン酸シンター ゼ II、ァスパラギン酸力ルバモイルトランスフェラーゼ、ジヒドロォロターゼ、ォロト酸レ ダクターゼ、ジヒドロォロト酸デヒドロゲナーゼ、ォロト酸ホスホリボシルトランスフェラー ゼ、 OMP (ォロチジン一リン酸）デカルボキシラーゼ、シチジンデァミナーゼ、ゥリジン ホスホリターゼ、デォキシゥリジンホスホリラーゼ、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ、 ジヒドロピリミジナーゼ又はチミジンホスホリラーゼ等が挙げられる。
コレステロール合成経路に関与する酵素としては、例えば、 3—ヒドロキシー3—メチ ルグルタリル CoAレダクターゼ、ラノステロールシンターゼ等が挙げられる。
[0040] 脂肪酸合成経路に関与する酵素としては、例えば、脂肪酸シンターゼ、長鎖脂肪 酸ァシル化補酵素 A、ァセチル CoAカルボキシラーゼ、ァシルトランスフェラーゼ等 が挙げられる。
[0041] 上記各経路より派生する経路に関与する酵素としては、例えばピルビン酸力 乳酸 をつくる乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸からアルコールを生成するピルビン酸デカ ルボキシラーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸から酢酸をつくるピルビ ン酸ォキシダーゼ等が挙げられ、またダリオキシル回路におけるリンゴ酸シンターゼ 又はイソクェン酸リア一ゼ等も挙げられるが、これらに限定されない。
[0042] 本発明のプロモーター機能を有する DNA断片は、上記有用物質の生成に関与す るタンパク質をコードする遺伝子の上流に位置するよう、コリネ型細菌内で自律複製 が可能なプラスミドや染色体上に導入されるのがよい。このように有用物質の生成に 関与するタンパク質をコードする遺伝子の上流にプロモーター機能を有する DNA断 片を配することにより、嫌気条件下において、 目的とする有用物質を効率的に高生産 できる。
また、本発明においては、上記有用物質の生成に関与するタンパク質をコードする 遺伝子のかわりにコリネ型細菌が有しな 、発現遺伝子、例えば植物で生産される有 用タンパク質をコードする遺伝子などを配することもできる。
[0043] 有用物質としては、例えば有機酸、アミノ酸、アルコール、ステロイド、核酸、脂肪酸 又は生理活性物質等が挙げられる。
有機酸としては、例えば、ピルビン酸、クェン酸、イソクェン酸、アコニット酸、 2—ォ キソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ォキサ口酢酸、ィタコン酸、乳酸、酢 酸、ダルコン酸、 2 ケトグルコン酸、 5 ケトグルコン酸、 D—ァラボアスコルビン酸、 コウジ酸又はテトラデカン 1, 14ージカルボン酸又はクミン酸等が挙げられる。また 、有機酸には、例えばイノシン酸等のプリンヌクレオチドも含まれるが、これらに限定さ れない。
[0044] アミノ酸としては、ァスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、ァ ラニン、システィン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニールァラニン、ヒ スチジン、リジン、ァノレギニン、セリン、ァスパラギン、グルタミン、ヒドロキシリシン、シス チン、メチォニン又はトリブトファン等が挙げられる。また、本発明においては、例えば βーァラニン、 γ—ァラニン（GABA)、ホモシスティン、オル-チン、 5—ヒドロキシト リプトフアン、 3, 4—ジヒドロキシフエ-ルァラニン（ドーパ）、トリョードチロニン、 4—ヒ ドロキシプロリン又はチロキシン等の特殊アミノ酸もアミノ酸に含まれる力 これらに限 定されない。
[0045] アルコールとしては、アルコール発酵により生産されるアルコールであればいずれ も好ましぐ例えばメタノール、エタノール、ブタノール等が挙げられる力 これらに限 定されない。
[0046] ステロイドとしては、ペルヒドロシクロペンタノフエナントレン骨格を基本構造にもつも の、例えば、コレステロール、コール酸類（例.タウロコール酸、グリココール酸等）、性 ホルモン (例.黄体ホルモン、男性ステロイド、卵胞ステロイド等)又は副腎皮質ホル モン（例.コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン等）などが挙げられる。また 、植物性のサポニン類ゃジギトキシン等も含まれるが、これらに限定されない。
[0047] 核酸としては、例えば、 RNA又は DNAが挙げられる。
[0048] 脂肪酸としては、例えば、ノルミチン酸、ミリスチン酸又はステアリン酸等が挙げられ る。また、脂肪酸には、例えばスフインゴイド、プロスタグランジン、ァラキドン酸又はェ ィコサテトラエン酸等も包含されるが、これらに限定されない。
[0049] 生理活性物質としては、例えばホルモン（例.インスリン、成長ホルモン、 ACTH, ォキシトシン、バソプレシン、チロキシン、 TRH, LHRH等）、ビタミン類（例.ビタミン B、ビタミン B、ビタミン B 、 ノ ンテトン酸、葉酸、ビ才チン、ビタミン K等）、ヒスタミン、
1 2 6
セロトニン又はインターロイキン等が挙げられる力 これらに限定されない。
また、本発明の有用物質は、上記したものに限定されず、本発明のコリネ型細菌で 生成される物質であればいずれも好ましく利用することができる。
[0050] 以下に具体的実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限 定されることはない。
実施例 1
[0051] 好気条件下及び嫌気条件下のコリネ型細菌細胞の取得
(1)コリネ型細菌 Corynebacterium glutamicum R(FERM P— 18976)の 好気条件による培養：
(培養基の調製）；尿素 2g、硫安 7g、 KH PO 0. 5g、 K ΗΡΟ 0. 5g、 MgSO
2 4 2 4 4
•7H O 0. 5gゝ FeSO - 7H O 6mgゝ MnSO - 7H O 4. 2mgゝ Biotinビォチ
2 4 2 4 2
ン） 200 μ gゝ塩酸チアミン 200 μ gゝ酵母エキス 2gゝカザミノ酸 7gゝ蒸留水 lOOOmL 力 なる培地 500mLを容量 1Lフラスコに分注し、 120°Cで 10分間加熱滅菌後、室 温に冷却した該フラスコを種培養基とした。同じく同組成の培地 lOOOmLを 2L容ガ ラス製ジャーフアーメンターに入れ、 120°C、 10分間加熱滅菌し、本培養基とした。
[0052] (培養）：上記種培養基 1ケに、コリネ型細菌 Corynebacterium glutamicum R
(FERM P— 18976)を無菌条件下にて接種し、 33°Cにて 12時間好気的振盪培 養を行い、種培養液とした。この種培養液 50mLを上記ジャーフアーメンターに接種 し、通気量 lwm (VolumeZVolumeZMinute)、温度 33°Cで培養を開始した。溶 存酸素濃度 (DO)は 7付近力もスタートし、増殖と共に DOが徐々に低下し始めるの で、 DO値が 6に達した時点でコリネ型細菌を回収し、好気条件下のコリネ型細菌細 胞とした。一方、好気的培養はそのまま継続し、一昼夜培養を実施した。培養液 200 mLを遠心分離機にかけ（5000回転、 15分）、上澄み液を除去した。このようにして 得られた wet菌体を、以下の反応に用いた。
[0053] (2)嫌気反応用反応溶液の調製：
硫安 7g、 KH PO 0. 5g、 K ΗΡΟ 0. 5g、 MgSO · 7Η O 0. 5g、 FeSO - 7
2 4 2 4 4 2 4
H O 6mg、 MnSO - 7H O 4. 2mg、 Biotin (ビォチン） g、塩酸チアミン 20
2 4 2
0 g、蒸留水 lOOOmL力もなる反応原液を調製し、 120°Cで 20分間、オートクレー ブした。この反応原液 500mLを容量 1Lのガラス製反応容器に導入した。この反応 容器は pH調整装置、温度維持装置、容器内反応液攪拌装置及び還元電位測定装 置を備えている。
[0054] (3)反応の実施：
前記培養後調製されたコリネ型細菌菌体を反応容器内の反応原液 500mLに懸濁 した。グルコース 200mMを加え、反応温度 33°Cに維持し、有機化合物生成反応を 開始した。反応時の酸化還元電位は初期 200mVであったが反応開始後直ちに 低下し、—400mVに維持して反応が継続された。 4時間反応後、菌体を回収し、嫌 気条件下のコリネ型細菌細胞とした。尚、このときの反応培地溶液を液体クロマトダラ フィーを用いて分析したところ、乳酸 186mM (16. 7g/L) (これは 3時間後の値）が 生成していた。
実施例 2
[0055] 嫌気条件下で誘導促進又は誘導抑制されるプロモーターの選抜
(1)好気条件下及び嫌気条件下のコリネ型細菌細胞からのトータル RNAの抽出 RNAの抽出は、 QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen)により行った。実施 例 1で回収した好気条件下及び嫌気条件下のコリネ型細菌細胞を、回収後ただちに QIAGEN RNA protect Bacteria Reagentを培養液の 2倍量カ卩え、よく攪拌 後、室温で 5分間インキュベートすることにより RNAを安定化させた。遠心後、上清を 取り除き、 j8— mercaptoethanolを含んだ RLT Buffer (QIAGEN RNeasy Mi ni Kit)で最終濃度が 15— 20 dry cell weightZLになるように懸濁した。 2mL
FastPrep Tube (Qbiogene, Inc.じ A, USA)【こ 0. 1mm zirconia/ silica b eads (BioSpec Products, Inc. ) 0. 5mgと細胞懸濁液 lmLを入れ FastPrep 'F PI 20 (Qbiogene)で speed 6. 0、 45秒破砕後、氷中で 1分間冷却する操作を 3回 繰り返すことにより、菌体の機械的破砕を行った。 15, OOOrpmで 2分間遠心後、上 清を別の容器に移し、上清の 0. 56倍の 99%EtOHを添カ卩しゅつくり混合した。 RNe asy mini columnにサンプルをアプライし、 10, OOOrpmで 15秒間遠心後、排出 液を捨てた。 350 Lの Buffer RW1をカラムにアプライし室温で 5分間静置後、洗 浄のため 10, OOOrpmで 15秒間遠心し、排出液を捨てた。 RNase— Free DNase
Setを用いてカラム上で混入ゲノム DNAの分解を行った。 10 /z Lの DNase Iストツ ク溶液を Buffer RDD 70 Lに添カ卩した DNasel溶液をカラムにアプライし、室温 で 15分間インキュベートし、 DNA分解を行った。 350 Lの Buffer RW1をカラム にアプライし室温で 5分間放置後、 10, OOOrpmで 15秒間遠心し、排出液を捨てた。 カラムに 500 Lの Buffer RPEを添カ卩し、 10, OOOrpmで 15秒間遠心し、排出液 を捨てた。もう一度、カラムに 500 Lの Buffer RPEを添カロし、 10, OOOrpmで 2分 間遠心し、排出液を捨てた。 Buffer RPEを完全に除去するため、 15, OOOrpmで 1 分間遠心した。溶出のため、カラムを新しい 1. 5mLチューブに移し、 60 /z Lの RNas e free waterを添加後、 15, OOOrpmで 1分間遠心した。より高濃度の RNAを得る ため、溶出液をもう一度カラムに添カ卩し、 15, OOOrpmで 1分間遠心した。
RNAの濃度は、分光光度計で O. D. の吸光度を測定することにより算出した（
260
O. D. X 40 g/mL) 0また、それぞれのサンプルは 95°C、 5分の熱変性後、
260
ァガロースゲル電気泳動を行い、 DNAの混入と、 RNAの分解の有無を調べた。全 てのサンプルは O. D. ZO. D. の値が 1. 8-2. 1の範囲内であることを確認
260 280
した。
(2)全遺伝子対応 DNAチップ製作
DNAチップはスタンフォード方式を採用した。 C. glutamicum R株の全ゲノム解 析 (野中 寛、中田 かおり、岡井 直子、和田 真利子、佐藤 由美子、 Kos Peter 、乾 将行、湯川 英明「Corynebacterium glutamicum R ゲノム解析」日本農 芸化学会、 2003年 4月、横浜、 日本農芸化学会 2003年度大会講演要旨集、 p20 参照)から 3080個の遺伝子の存在を推定して 、る。該遺伝子 (ORF)情報に基づき 、各遺伝子の開始コドンの 3塩基目（ATG)から下流へ 20塩基の配列と終止コドンの 1塩基目（TAA)力 上流へ 20塩基の配列を対とする PCRプライマーを全遺伝子に 対して設計し、 PCRによりそれぞれの遺伝子 ORF配列を含む DNA断片を増幅した 。増幅産物は 1%ァガロースゲル上で電気泳動を行うことにより、単一バンドで目的サ ィズを示すことを確認した。複数のバンドが確認された場合はアニーリング温度等、 P CR条件を最適化することで単一バンドが得られるよう、繰り返し実験を行った。最終 的に得られた DNA試料は、スポッターにより I X 3 inchの Takara Slideにスポッテ イング後、 Takaraアレイスライド標準法にて固定ィ匕処理された。定量性を得るために 、各遺伝子について 2点のスポットを行った。
(3) DNAチップ解析
DNAチップは、 Corynebacterium glutamicum R株のトータル RN Aを铸型と して、ランダムプライマー（9mer)による cDNA合成と蛍光標識 (Cy5は好気条件下 のコリネ型細菌細胞から抽出したトータル RNAを、 Cy 3は嫌気条件下のコリネ型細 菌細胞から抽出した RNAを用いた）を行い、ラベル化プローブを作成した。 cDNA 合成及び標識反応には Amersham Biosciences CyScribe cDNA Post La belling Kit (Amersham Biosciences Corp. USA)を使用し、プロトコ一ノレに 従った。 8 μ Lの全 RNA (30 μ g)に 3 μ Lの random nonamer primersをカ卩え、 7 0°Cで 5分間加熱後、室温に 10分間放置し、プライマーを RNAにアニーリングさせた 。この RNAに、反応試薬（5x CyScript buffer, 0. 1M DTT, 2 ^ L, Cy
Scribe Post― Labelling nucleotide mix, 1 μ L, CyScribe Post— Labellin g Amino Allyl— dUTP, 1 ^ L, lOOUZ μ L CyCcript reverse transcript ase, l ^ L)を加え 42°Cで 3時間インキュベートした。反応液を氷上で冷却後、 RNA をアルカリ分解するために、 2. 5M NaOHを 2 L添カ卩し、 37°Cで 15分間インキュ ペートした。次に 2M HEPES Bufferを 10 L添カ卩することにより中和した。 CySc ribe GFX Purification Kit (Amersham Biosciences)を用いて AA修飾 cD NAプローブの精製を行った。精製操作の際の遠心は全て室温で行った。反応液を 500 Lの Capture Bufferと混合後、 GFXカラムにアプライし、 13, 800 X gで 30 禾少間遠 、した。 出液を捨て、 600 /z Lの 80%EtOHをカラムにカロ免、 13, 800 X g で 30秒間遠心する操作を 3回繰り返した。カラムを 13, 800 X gで 10秒間遠心後、力 ラムを新しい 1. 5mLチューブに移し、 0. 1M NaHCO (pH9. 0)を 添加し
3
室温で 5分間静置した。 13, 800 X gで 1分間遠心後、高濃度の溶液を回収するため 、溶出液をもう一度カラムに添加し、 13, 800 X gで 1分間遠心した。精製後の反応 液を Cy3又は Cy5 reactive dyeの入っているチューブに加え、完全に溶解後、遮 光して室温で 3時間インキュベートした。
[0058] 4M Hydroxylamine HC1を 15 L添カ卩し、攪拌して混合後、遮光して室温で 1 5分間インキュベートした。 CyScribe GFX Purification Kit (Amersham)を用 V、て CyDye標識 cDNAの精製を行った。反応液を 500 μ Lの Capture Bufferと混 合後、 GFXカラムにアプライし、 13, 800 X gで 30秒間遠心した。排出液を捨て、 60 0 μ LOWash Bufferをカラムに加え、 13, 800 X gで 30秒間遠心する操作を 3回 繰り返した。カラムを 13, 800 X gで 10秒間遠心後、カラムを新しい 1. 5mLチューブ に移し、 60 Lの Elution Bufferを添カ卩し室温で 5分間静置した。 13, 800 8で1 分間遠心後、高濃度の溶液を回収するため、溶出液をもう一度カラムに添加し、 13, 800 X gで 1分間遠心し、精製済みの CyDye標識 cDNAプローブを回収した。 Cy3 及び Cy5標識 cDNAを 1本のチューブに入れ、 100 /z Lの 2x Hybridizatiion bu ffer (12x SSC, 0. 4%SDS, 10 x Denhardt' s solution, 0. 2mg/mL de natured salmon sperm DNA)を添カ卩し、 95°Cで 2分間加熱後、室温で冷却し た。マイクロアレイのハイブリダィゼーシヨン、洗浄及び乾燥の工程は Lucidea Slide Pro (Amersham Biosciences Corp. USA)を用いて行った。ノヽイブリダィゼー シヨン ίま、 60°Cで 14時 行った。洗净 ίま、 Wash l (2xSSC, 0. 20/0SDS)で 6分、 Wash 2 (0. 2xSSC, 0. 2%SDS)で 6分、 Wash 3 (0. 2xSSC)で 2回、イソプロ パノールで一回行った。
[0059] (4)マイクロアレイデータ解析 マイクロアレイの蛍光シグナルは FUJIFILM Fluorescent Image Analyzer FLA- 8000 (Fuji, Tokyo, Japan)により検出、画像化を行った。検出条件は、 Cy 5を 635nm、 Cy3を 532nmで行った。検出した画像データは Axon Instruments
GenePix Pro 5. 0 (Axon Instruments, Inc. , CA, USA)を用いて数値化 及び正規化を行った。チャンネル毎に色調 (Cy5；緑， Cy3；赤）を調節し、画像を合 成した後、スポットをグリッドで囲み数値化を行った。正規化は、 global normalizati onを採用した。比較する細胞間で全遺伝子の発現強度の総和は同じであると仮定し 、 Cy5と Cy3の全シグナルの蛍光強度比の中央値（Median)が等しくなるように、ァ レイ全体の蛍光強度比を修正 (正規化)した。また、再現性、定量性に欠けると思わ れるスポット（スポットのサイズが半分以下のもの、汚れや傷が入っているもの、バック グラウンドが高くなつている領域のもの）は、解析段階において値を除外した。 Gene Pix Proにより算出された値から、 Ratio of Meands (Cy3ZCy5)を発現比率と して用いた。
[0060] (5)嫌気条件下にお!/、て誘導強化プロモーター及び誘導抑制プロモーターの選抜 上記 (4)で得た発現比率をスキヤッタープロットで表した（図 1参照)。中央の斜線は Cy3ZCy5の値が 1、つまり培養条件の違いにより遺伝子発現の増減が無い事を表 している。一方、これを挟む様に位置する二本の斜線は Cy3ZCy5の値が 2もしくは 0. 5となり、 2倍の増減を表している。この実験は複数回実施し、再現性良くデータが 得られることを確認した。
この Ratio of Meands (Cy3ZCy5)を発現比率が 1. 5倍（50%上昇）以上又は 0. 5倍（50%降下）以下のサンプルに対応する遺伝子をゲノム情報力 抽出し、その 各遺伝子の開始コドンの lbp上流から、その遺伝子の上流遺伝子の末端（同方向転 写の場合;上流遺伝子の終始コドンの lbp下流まで。逆方向転写遺伝子の場合;上 流遺伝子の開始コドンの lbp上流まで)までの配列を誘導プロモーターとして選択し た。その結果、 Ratio of Meands (Cy3ZCy5)を発現比率が 1. 5倍（50%上昇） のものが、 394種 (表 1)、 0. 5倍（50%降下）以下のものが 201種 (表 2)存在した。
[0061] [表 1] 嫌気条件下誘導強化プロモーターと発現比率
番号 Cy3/Cy5 番号 Cy3/Cy5 番号 Cy3/Cy5 番号 Cy3/Cy5 番号 Cy3/Cy5
1 26.64 67 2.41 133 1.85 1 99 1.71 265 1.62
2 19.47 68 2.37 134 1.85 200 1.71 266 1.62
3 15.27 69 2.37 135 1.84 201 1.71 267 1.62
4 10.48 70 2.28 136 1.84 202 1.71 268 1.62
5 10.39 71 2.26 137 1.84 203 1.71 269 1.61
6 8.04 72 2.25 138 1.84 204 1.70 270 1.61
7 6.16 73 2.24 139 1.83 205 1.70 271 1.61
8 6.12 74 2.23 140 1.83 206 1.69 272 1.61
9 6.00 75 2.22 141 1.83 207 1.69 273 1.61
10 5.49 76 2.20 142 1.83 208 1.69 274 1.61
1 1 5.30 77 2.20 143 1.82 209 1.69 275 1.61
12 4.87 78 2.20 144 1..82 210 1.69 276 1 ,60
13 4.86 79 2.19 145 1.82 21 1 1.69 277 1.60
14 4.86 80 2.18 146 1.82 212 1.69 278 1.60
15 4.84 81 2.17 147 1.82 213 1.69 279 1.60
16 4.71 82 2.17 148 1.82 214 1.69 280 1.60
17 4.68 83 2.17 149 1.82 215 1.69 281 1.60
18 4.60 84 2.15 150 1.82 216 1.68 282 1.60
19 4.54 85 2.15 151 1 ,82 217 1.68 283 1.60
20 4.50 86 2.15 152 1.81 218 1.68 284 1.59
21 4.42 87 2.14 153 1.81 219 1.68 285 1.59
22 4.36 88 2.14 154 1.81 220 1.68 286 1.59
23 4.17 89 2.14 155 1.80 221 1.68 287 1.59
24 4.09 90 2.13 156 1.80 222 1.68 288 1.59
25 3.92 91 2.12 157 1.80 223 1.68 289 1.59
26 3.89 92 2.10 158 1.80 224 1.68 290 1.58
27 3.76 93 2.10 159 1.79 225 1.67 291 1.58
28 3.69 94 2.10 160 1.79 226 1.67 292 1.58
29 3.59 95 2.07 161 1.78 227 1.67 293 1.58
30 3.52 96 2.06 162 1.78 228 1.67 294 1.58
31 3.49 97 2.05 163 1.78 229 1.67 295 1.58
32 3.49 98 2.05 164 1.77 230 1.67 296 1.58
33 3.37 99 2.04 1 65 1.77 231 1 ,66 297 1.58
34 3.30 100 2.03 166 1.77 232 1.66 298 1.58
35 3.29 101 2.02 167 1.77 233 1.66 299 1.58
36 3.21 102 2.02 168 1.77 234 1.66 300 1.57
37 3.10 103 2.01 1 69 1.77 235 1.66 301 1.57
38 3.10 104 1.99 1 70 1.77 236 1.66 302 1.57
39 3.08 105 1.99 1 71 1.77 237 1.65 303 1.57
40 3.00 106 1.99 1 72 1.76 238 1.65 304 1.57
41 3.00 107 1.97 173 1.76 239 1.65 305 1.57
42 3.00 108 1.97 174 1.76 240 1.65 306 1.57
43 2.98 109 1.95 175 1.76 241 1.65 307 1.57
44 2.96 1 10 1.94 176 1.76 242 1.65 308 1.57
45 2.95 1 1 1 1.94 177 1.76 243 1.65 309 1.57
46 2.95 1 12 1.93 178 1.76 244 1.65 310 1.56
47 2.93 1 13 1.93 1 79 1.75 245 1.65 311 1.56
48 2.91 1 14 1.92 180 1.75 246 1.65 312 1.56
49 2.88 1 15 1.92 181 1.75 247 1.65 313 1.56
50 2.77 1 16 1.92 182 1.74 248 1.65 314 1.56
51 2.74 1 17 1.92 183 1.74 249 1.65 315 1.56
52 2.66 1 18 1.91 184 1.74 250 1.65 316 1.56
53 2.63 1 19 1.91 185 1.73 251 1.65 31 7 1.56
54 2.62 120 1.89 186 1.73 252 1.65 318 1.56
55 2.57 121 1.89 187 1.73 253 1.64 319 1.55
56 2.56 1 22 1.89 188 1.73 254 1.64 320 1.55
57 2.56 123 1.88 189 1.73 255 1.64 321 1.55
58 2.55 124 1.88 190 1.73 256 1.64 322 1.55
59 2.54 125 1.88 191 1.72 257 1.64 323 1.55
60 2.53 1 26 1.88 92 1.72 258 1.64 324 1.55
61 2.51 127 1.87 193 1.72 259 1.64 325 1.55
62 2.51 128 1.87 1 94 1.72 260 1.63 326 1.55
63 2.46 129 1 ,87 195 1.72 261 1.63 327 1.55
64 2.45 130 1.87 196 1.72 262 1.63 328 1.55
Figure imgf000023_0001
65 2.44 131 1.86 197 1.71 263 1.63 329 1.55
66 2.43 132 1.85 98 1.71 264 1.62 330 1.55 表 2]
嫌気条件下発現抑制プロモーターと発現比率
Figure imgf000024_0004
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000024_0003
番号 ； 配列番号, C y 3 / C y 5 ； 発現比率 実施例 3 [0063] リアルタイム定量 RT— PCR解析による誘導強化及び誘導抑制の確認
DNAチップ解析により得られた誘導プロモーターの強化又は抑制データを検証す るため、リアルタイム定量 RT—PCRによりその発現比率を解析した。対象としたサン プルは、 1. 5倍以上の発現比率を示した誘導強化プロモーター 394種の中から、ラ ンダムに配列番号 3、 22、 47 (表 1の番号）の 3種を、一方、 0. 5倍以下の誘導抑制 プロモーター 201種の中力 ランダムに配列番号 410、 474、 502 (表 2の番号）の 3 種をそれぞれ選び出した。
リアルタイム定量 RT— PCR解析は、全 RNAを铸型として、 QIAGEN QuantiTe ct SYBR Green RT—PCR Kit (Qiagen)により行った。遺伝子特異的なプラ イマ ~~は、 Applied Biosystems Primer Express Software v2. 0 (Applied Biosystems, USA)を用いてデザインした。リアルタイム PCR実験は ABI PRIS M 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)で行 い、 96— Well Optical Reaction Plate (Applied Biosystems)と Optical A dhesive Covers (Applied Biosystems)を用いて PCR反応を行った。 PCR反応 液の糸且成は、 sample)； Total RNA, 60ng, 2 x QuantiTect S YBR Green RT—PCR Master Mix, 25 μ L·, Primer Forward, 0. 5 ^ M , Primer Reverse, 0. 5 ^ M, QuantiTect RT Mix, 0. 5 ^ Lで調整した。 PC R反応は、 50°C 30min, 95°C 15min, (95°C 15sec, 57°C 20sec, 60°C 1 min) x 40 cycleで行った。 PCR反応終了後、発現量の算定には、それぞれの検 体毎に発現量比を定量し、その発現比で検体どうしを比較する comparative C法
T
を用いた。全てのサンプルが指数関数的に増幅しているところ (増幅曲線が直線にな つて増幅しているところ）の中央に Threshold lineを設定し、この線と交わるサイク ル数を C値として発現量の比率計算を行った。
T
この結果、 1. 5倍以上の発現比率を示した誘導強化プロモーター配列番号 3、 22 、 47 (表 1の番号）（結果は表 3)、 0. 5倍以下の誘導抑制プロモーター配列番号 410 、 474、 502 (表 2の番号）（結果は表 4)の発現比率は、それぞれ DNAチップ解析結 果と非常によく一致した。
[0064] [表 3] リアルタイム定量 R T— P C R解析による誘導強化プロモーターの発現比率
Figure imgf000026_0001
[0065] [表 4]
リアルタイム定量 R T— P C R解析による誘導抑制プロモーターの発現比率
Figure imgf000026_0002
産業上の利用可能性
[0066] 本発明の DNA断片は、乳酸ゃコハク酸等の有用物質を高効率に高生成する形質 転換コリネ型細菌に導入されるプライマーとして有用である。本発明の DNA断片が 導入されたコリネ型細菌は、有機酸、アルコール又はアミノ酸等の製造に利用できる 。また、製造された有機酸は高分子合成原料又は医薬原料として、あるいは化粧品 用途又は食品添加剤用途等広い分野で使用できる。例えば、コハク酸及びその誘 導体は生分解性プラスチック原料や環境汚染をもたらさないクリーンな洗浄溶剤用途 等に有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 嫌気条件下において、好気性コリネ型細菌内で有用物質の生成に関与するタンパ ク質の発現を誘導強化及び Z又は誘導抑制する、プロモーター部位を有する DNA 断片。
[2] 有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導強化するプロモーター部位を 有する DNA断片が次のいずれかの DNAである請求の範囲第 1項に記載の DNA断 片；
(a)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNA;
(b)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNAにおいて、 1又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を 有し、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導強化するプロモータ 一部位を有する DNA;
(c)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズし、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導強化するプロモータ 一機能を有する DNA；又は
(d)配列表の配列番号（1)〜（394)から選択される少なくとも一つの塩基配列を含 む DNAと少なくとも 80%以上の相同性を有し、かつ有用物質の生成に関与するタン パク質の発現を誘導強化するプロモーター機能を有する DNA。
[3] 有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導抑制するプロモーター機能を 有する DNA断片が次のいずれかの DNAである請求の範囲第 1項に記載の DNA断 片；
(a)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNA;
(b)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNAにおいて、 1又は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列 を有し、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導抑制するプロモー ター機能を有する DNA;
(c)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダ ィズし、かつ有用物質の生成に関与するタンパク質の発現を誘導抑制するプロモー ター機能を有する DNA;又は
(d)配列表の配列番号（395)〜（595)から選択される少なくとも一つの塩基配列を 含む DNAと少なくとも 80%以上の相同性を有し、かつ有用物質の生成に関与する タンパク質の発現を誘導抑制するプロモーター機能を有する DNA。
[4] mRNAの発現量で示されるプロモーター機能発現の強化及び Z又は抑制の程度 力 好気条件下で発現される量よりも少なくとも 50%以上増大及び Z又は減少して いることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の DNA断片。
[5] 有用物質の生成に関与するタンパク質がコリネ型細菌内の代謝に係わる酵素であ ることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれかに記載の DNA断片。
[6] 酵素が、解糖経路、還元的トリカルボン酸経路、アナプレロティック経路、アミノ酸合 成経路、プリン合成経路、ピリミジン合成経路、コレステロール合成経路、脂肪酸合 成経路及びこれら経路より派生する経路に関与する少なくとも 1の酵素又は補酵素で あることを特徴とする請求の範囲第 5項に記載の DNA断片。
[7] 有用物質が有機酸、アミノ酸、アルコール、ステロイド、核酸、脂肪酸又は生理活性 物質であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の DNA断片。
[8] 有機酸が、ピルビン酸、クェン酸、イソクェン酸、アコニット酸、 2—ォキソダルタル酸 、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ォキサ口酢酸、ィタコン酸、乳酸、酢酸、ダルコン酸、 2 ケトグルコン酸、 5 ケトグルコン酸、 D ァラボアスコルビン酸、コウジ酸、テトラ デカン 1, 14ージカルボン酸、クミン酸及びイノシン酸力 選択される少なくとも 1の 有機酸であることを特徴とする請求の範囲第 7項に記載の DNA断片。
[9] アミノ酸が、ァスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、了ラニン 、システィン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニールァラニン、ヒスチジ ン、リジン、ァノレギニン、セリン、ァスノ ラギン、グルタミン、ヒドロキシリシン、シスチン、 メチォニン、トリプトファン、 β—ァラニン、 γ—ァミノ酪酸（GABA)、ホモシスティン、 オル二チン、 5—ヒドロキシトリプトファン、 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン（ドーパ ) ,トリョードチロニン、 4—ヒドロキシプロリン及びチロキシン力も選択される少なくとも 1のアミノ酸であることを特徴とする請求の範囲第 7項に記載の DNA断片。
[10] アルコールが、メタノール、エタノール及びブタノールから選択される少なくとも 1の アルコールであることを特徴とする請求の範囲第 7項に記載の DNA断片。
[11] 好気性コリネ型細菌が、嫌気条件下、反応培地の酸ィ匕還元電位を— 200ミリボルト 乃至— 500ミリボルトにおいて培養されることを特徴とする、請求の範囲第 1項に記載 のプロモーター機能を有する DNA断片のプロモーター機能を誘導する方法。
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