JP2013524781A - ＬｙｓＥ過剰発現細菌の使用下にＬ−オルニチンを製造する方法 - Google Patents

Abstract

本発明の対象は、アミノ酸の高い輸送により特徴づけられる微生物を用いるＬ−オルニチンの発酵による製法に関する。

Description

Ｌ−オルニチンは、その肝機能の刺激作用に関して公知であり、かつ医薬品の成分として及びスポーツ栄養において頻繁に使用されている。

今日ではＬ−オルニチンは様々な方法により製造されている。１つの方法は、微生物を用いる培養法である。もう１つの方法は、例えば、水酸化バリウムを用いるアルギニンのアルカリ加水分解である（ＣＮ１５９４２８２Ａ）。もう１つの方法は、アルギナーゼ活性を有する固定化微生物によるアルギニンのバイオトランスフォーメーションである（ＫＲ５８９１２１Ｂ１）。Ｌ−シトルリンからＬ−オルニチンを製造する方法も特許文献（ＪＰ４２００７７６７Ｂ４）に記載されている。

Ｌ−オルニチンを培地に排出する点で傑出している微生物は文献に記載されている。前記微生物の例は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム、バチルス（ＪＰ４３０１０９９６Ｂ４、ＪＰ５７０４１９１２Ｂ）、エシェリキア（ＵＳ３６６８０７２Ａ）、プロビデンシア（ＪＰ０３１９５４９４）又はアントロバクター（ＵＳ３５７４０６１）の細菌である。

Ｌ−オルニチンを生産する微生物は、しばしばアミノ酸Ｌ−アルギニン又はＬ−シトルリンに栄養要求性であることにより傑出している（ブレビバクテリウム、バチルス、コリネバクテリウムに関しては、ＥＰ３９２７０８Ｂ１とＫＲ１６１１４７Ｂ１に記載されている、大腸菌に関してはＵＳ３６６０７２Ａに記載されている）。更に、２−チアゾール−アラニン、スルファグアニジン又は２−フルオロピルベートに耐性を有する微生物も記載されている（日本国公開公報第６１−１１９１９４号）。

ＥＰ０３９３７０８Ｂ１には、オルニトール及びミコフェノール酸に対する低い耐性により傑出しているＬ−オルニチン生産者が記載されている。前記特性は組み合わされた形で存在していてもよい。

細胞からの能動的拡散によるＬ−リジン、Ｌ−アルギニン及びＬ−オルニチンのような塩基性アミノ酸の放出は、極めて少ない（Bellmann et al.（Microbiology 2001;147:1765〜74））。このことは、リジンに関してよく記載されている。Vrlijcら（Journal of Bacteriology 1995; 177(14): 4021〜7）により、コリネバクテリウム・グルタミクムの多くの輸送欠陥変異体が研究された。１つの変異体に関して、Ｌ−リジン１７４mMの細胞内濃度が測定されたのに対して、細胞外では０．７mMだけの値が測定された。

Vrlijcら［Molecular Microbiology 1996；22（5）；815〜26）及びJournal of Molecular Microbiology and Biotechnology 1999; 1: 327〜336）］及びＥＰ０８６８５２７Ｂ１には、新規輸送体がＬ−リジンエクスポーター（LysE）として同定及び記載されている。同定されたLysE null突然変異体は、もはやＬ−リジンを細胞から輸送することができなかった。LysE遺伝子によりコードされるポリペプチドは、２３３個のアミノ酸又はアミノ酸残基の長さであり、かつ配列番号２に示されている。リジン生産者中でLysE遺伝子が過剰発現した後に、Ｌ−リジンの高い排出が見られた。

Bellmannら（Microbilogy 2001；147：1765〜74）により、グルタミクム中で種々の塩基性アミノ酸の輸送に関して、より詳細にLysEエクスポーターが特徴づけられた。著者らは、該トランスポーターが特にアミノ酸Ｌ−リジンとＬ−アルギニンを細胞から輸送することを証明した。著者らは、LysEがＬ−オルニチンを細胞から輸送するかどうかも更に調査した。このために、まずはじめに、ATCC13032：：argFと称されるＬアルギニン−栄養要求性Ｃ．コリネバクテリウム・グルタミクム株を製造した。

この株を４０ｇ／ｌグルコース含有のCGXIIと称される最小培地５０ml（回分培養）中で培養した。２４時間のインキュベーション時間の後に、７．９ｇ／ｌに相応する６０mMのＬ−オルニチンが測定された。細胞内では、約７０分のインキュベーションの間に、約２００mMのＬ−オルニチン濃度が株の細胞内で測定された。LysEが細胞からＬ−オルニチンを輸送するかどうかを明らかにするために、株１３０３２：：ａｒｇＦを複製プラスミドpEC71ysEで形質転換した。この手法により、該株が高いLysE活性を得て、かつそれによりこの株がより高い輸送率で培地中にＬ−オルニチンを輸送できるようにするのがよい。しかし、前記方法によってＬ−オルニチン輸送率は高まらなかった。コントロール株（１３０３２：：ａｒｇＦ）の場合でも、形質転換体（ｐＥＣ７LysE含有１３０３２：：ａｒｇＦ）の場合でもこの輸送率（０．６nmol／分（ｍｇ乾燥質量）^-1）が測定された。著者らは、Ｌ−オルニチンがエクスポーターLysEにより輸送されないことを結論付けた。更に彼らは、コリネバクテリウム・グルタミクム中のＬ−オルニチンにはもう１つの未知の輸送機能（輸送タンパク）があるに違いないことを記載した（Bellmann et al., 2001、1771頁、図５ｂ又は1772頁、21〜28行目）。

Ｃ.バクテリウムＲ中で変異体LysE（配列番号４参照）は同定され、これは配列番号２に記載されている株ATCC13032によるLysE−エクスポーターのアミの酸配列とは、アミノ残基が３個分だけ長くなったＮ−末端が異なっている。前記アミノ酸残基は以下の通りである：メチオニン、バリン、イソロイシン（ＭＶＩ）。株ＲのこのLysEポリペプチドは、ＥＰ１２６６９６６Ｂ１においてループ領域の形状が野生型とは異なるか、又は該ループを形成できず、従ってＬ−リジン及びＬ−アルギニンの改善された輸送を達成できる点で野生型タンパク質とは異なる変異体として記載されている。

他のLysE変異体は、Gunji and Yasuedaにより記載されている（Journal of Biotechnology 127, 2006、1〜13）。著者らは、メチロトロフィックバクテリウム、メチロフィルス・メチロトロファスの義務的なＬ−リジン形成に関心があった。これらはｐＳＥと称されるＣ.グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９からのlysE−遺伝子含有のプラスミドでＭ.メチロトロファスを形質転換し、Ｍ.メチロトロファスのリジン形成を改善した。しかし、著者らはこれらが突然変異した形のlysE遺伝子（lysE２４）だけがＭ.メチロトロファス中で安定した方法で確立できることを見出した。lysE遺伝子のオープンリーディングフレームは、チミン残基の挿入によりlysE２４対立遺伝子にシフトし、４３２ｂｐ後にリーディングフレーム末端を生じる。短くなったリーディングフレームは、Ｃ.グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９の野生型LysEタンパク質よりもＣ末端でアミノ酸残基が９２個分だけ短いLysEタンパク質をコードする。これは１４１個のアミノ酸残基の長さを有する。短くなったタンパク質の最後の６個のＣ−末端のアミノ酸（残基１３５〜１４１）は、野生型LysE−アミノ酸配列のアミノ酸とは異なる。プラスミド上に変性LysE対立遺伝子（ｐＳＥ２４）を有するＭ.メチロトロファス株をリジン形成に関して試験した。このために、この株をＳＥＩＩｃと称される流加回分培養の形で最小培地０．３リットル中で５０時間試験した。著者らは、０．５５mMのＬ−リジン及び０．１９mMのＬ−アルギニンの他に、形質転換体はＬ−オルニチンも僅かな量（０．０７mM、１１．８mg/lに相応）で形成されていることを見出した。著者らは、突然変異したトランスポーターの変化した基質特異性、又は株の変化した細胞内Ｌ−アルギニンプールが、観察されたＬ−オルニチンの形成を生じた可能性を明らかにした。特許ＥＰ１２６６９６６Ｂ１（発明者：Gunji and Yasueda）は、Ｌ−リジン及びＬ−アルギニンの排出においてLysE２４トランスポーターのポジティブな活性を記載している。

本発明の課題
本発明の課題は、Ｌ−オルニチンを発酵により製造するための新規方法を提供することである。

本発明の説明
本発明の対象は、Ｌ−オルニチンを製造するための方法に関し、該方法は以下：
ａ）Ｌ−オルニチンエクスポーターの活性を有し、かつそのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも（≧）３５％、≧４０％、≧５０％、≧５５％、≧６０％、≧６５％、≧７０％、≧７５％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％、有利には≧７０％、特に有利には≧９０％、極めて有利には≧９６％、及び最も有利には１００％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現して存在する、コリネバクテリウム属、バシラス属、ストレプトミセス属、アルスロバクター属及び腸内細菌科から成るグループから選択されるＬ−オルニチンを排出する細菌を培地中で発酵し、
ｂ）Ｌ−オルニチンを前記培地中で蓄積し、その際、発酵ブロスが得られ、
ｃ）その際、過剰発現にはＤＳＭ２３２３９に寄託されているプラスミドpEC7LysEを使用せず、
ｄ）かつ、その際場合により、コードされたポリペプチドの長さは、アミノ酸又はアミノ酸残基の≧１４６〜≦２８６である
の工程を行うことに特徴づけられる。

≧１７１〜≦２８６、≧１９６〜≦２６１、≧２０３〜≦２５８、≧２１８〜≦２４３、≧２２８〜≦２３６及び≧２２８〜≦２３３アミノ酸又はアミノ酸残基のグループから選択される長さの範囲が有利である。

≧２０３〜≦２５８、≧２１８〜≦２４３、≧２２８〜≦２３６及び≧２２８〜≦２３３の長さの範囲ならびに≧２２８〜≦２３６及び≧２２８〜≦２３３の長さの範囲が特に有利である。

以下にＬ−オルニチンが記載される場合には、該用語にはその塩、例えば、Ｌ−オルニチン一塩酸塩又はＬ−オルニチン−硫酸塩も含まれる。

本発明による方法には、コリネバクテリウム属、バシラス属、ストレプトミセス属、アルスロバクター属及び腸内細菌科のグループから選択される細菌が使用される。

更に、コリネバクテリウム属は、有利には以下の種類に基づく株が有利である：
コリネバクテリウム・エフィシエンス、例えばタイプ株ＤＳＭ４４５４９、コリネバクテリウム・グルタミクム、例えば、タイプ株ＡＴＣＣ１３０３２又は株Ｒ、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネス、例えば、株ＡＴＣＣ６８７１。その際、コリネバクテリウム・グルタミクム種が極めて有利である。

コリネバクテリウム・グルタミクム種の幾つかの代表は、他の名称で従来技術からも公知である。これらには、例えば以下のものが含まれる：
株ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムと称する、
株ＤＳＭ２０１３７、コリネバクテリウム・リリウムと称する、
株ＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・メラセコラと称する、
株ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・フラバムと称する、
株ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムと称する、
株ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・ディバリカツムと称する。

"ミクロコッカス・グルタミクス"という用語は、コリネバクテリウム・グルタミクムにも同様に使用されてきた。コリネバクテリウム・エフィシエンス種の幾つかの代表は、従来技術ではコリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（株ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）とも称されていた。

バシラス属の中では、バシラス・サブチリス種が有利である。

アルスロバクター属の中では、アルスロバクター・シトレウス種が有利である。

腸内細菌科の中では、エシェリキア属、エルウィニア属、プロビデンシア属、パントエア属及びセラチア属が有利である。エシェリキア属のエシェリキア・コリ種、セラチア属のセラチア・マルセッセンス種、及びプロビデンシア属のプロビデンシア・レットゲリ種が特に有利である。

Ｌ−オルニチンエクスポーターの過剰発現の手法に使用される細菌又は株（出発株）は、有利には、それを囲む栄養培地中にＬ−オルニチンを排出し、かつそこに蓄積する能力を既に持っているのが有利である。このために"生産する"という表現も以下に使用される。特に、前記過剰発現の手法に使用される株は、栄養培地中でＬ−オルニチンを≧０．１ｇ／ｌ、≧０．３ｇ／ｌ、≧１ｇ／ｌ、≧３ｇ／ｌ、≧１０ｇ／ｌまで富化又は蓄積する能力を有する。出発株とは、有利には突然変異及び選択により、組み換えＤＮＡ技法又は両方の方法の組み合わせにより製造される株である。

本発明の手法に適切な細菌が、まずＬ−オルニチンエクスポーターの活性を有し、かつそのアミノ酸配列が配列番号２と少なくとも（≧）３５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現し（その際、場合により、コードされたポリペプチドの長さは上記長さの範囲内にある）、かつ引き続き従来技術に記載されているような更なる遺伝子操作により、前記細菌にＬ−オルニチンを生産させることにより得られることは明らかであり説明するまでもない。上記のようなポリヌクレオチドを用いるだけで、野生型（例えば、株ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１７９６５のようなもの）を形質転換しても本発明による方法が生じない。

Ｌ−オルニチンを排出又は生産するコリネバクテリウム・グルタミクム種の株は、例えば次のものである：ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＦＥＲＭ−ＢＰ２３４４及びコリネバクテリウム・グルタミクムＦＥＲＭ−ＢＰ２３４５（ＵＳ５１８８９４７に記載）。

Ｌ−オルニチンを排出又は生産するアルスロバクター・シトレウス種の株は、例えば次のものである：アルスロバクター・シトレウスＦＥＲＭ−ＢＰ２３４２（ＵＳ５１８８９４７に記載）。

Ｌ−オルニチンを排出又は生産するバシラス・サブチリス種の株は、例えば次のものである：バシラス・サブチリスＢＯＲ−３２（ＦＥＲＭ−Ｐ３６４７）（ＵＳ５１８８９４７に記載）。

Ｌ−オルニチンを排出又は生産するプロビデンシア・レットゲリ種の株は、例えば次のものである：プロビデンシア・レットゲリＡＲＧＡ６（ＥＦＲＭＰ−１１１４７）（ＪＰ０３１９５４９４に記載）。

Ｌ−オルニチンを排出又は生産するエシェリキア・コリ種の株は、例えば次のものである：エシェリキア・コリＢ−１９−１９（ＡＴＣＣ２１１０４）（ＵＳ３６６８０７２に記載）。

Ｌ−オルニチン生産細菌は、通常アミノ酸Ｌ−シトルリン又はＬ−アルギニンに栄養要求性である。二者択一的に、Ｌ−シトルリン又はＬ−アルギニンにブラディトロフィック（bradytrophic）であるＬ−オルニチン生産細菌も考慮される。栄養要求及びブラディトロフィックという用語の定義は、ＷＯ０１／０９２８６の９頁に見出すことができる。ブラディトロフは当該分野では漏出突然変異体とも称される。ブラディトロフ細菌の場合に、特に野生型の活性と比べて、遺伝子産物ArgF（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ArgC（アルギノスクシネートシンターゼ）又はArgH（アルギノスクシネートリアーゼ）の活性が、０よりも大きく（＞）、１０パーセント以下（≦）、有利には＞０かつ≦１％である細菌が使用される。

従来技術では、lysE遺伝子とも称されるポリヌクレオチドが公知である（Ｌ−リジンエクスポーターの活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする）。これらのポリペプチドは、LysEとも省略される。

エクスポーターは、細胞の細胞膜中に存在し、かつ例えば、Ｌ−リジン又はＬ−オルニチンのような代謝物質を該細胞のサイトプラズマから周囲の培地に運搬するタンパク質である。このために必要なエネルギーがアデノシン三リン酸（ATP）の形で提供される場合には、これは第一活性トランスポート又はエクスポートと称される。前記エネルギーがイオングラジエント（例えばナトリウムイオン）の形で提供される場合には、第二活性トランスポート又はエクスポートと称される（Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and L. Stryer; Biochemie、第５版、３７８〜３８４頁、Spektrum Akademicher Verlag、ドイツ、ハイデルベルク、２００３）。Ｌ−オルニチン排出活性を決定する説明書は、Bellmannら（Microbiology 2001；147：1765〜74）に見出すことができる。

本発明につながる作業では、コリネバクテリウム属のリジンエクスポター、有利にはコリネバクテリウム・グルタミクム及びミクロコッカス、有利にはミクロコッカス・ルテウスは、Ｌ−リジンエクスポター活性の他に、Ｌ−オルニチンエクスポーターの活性も有する。

本発明の手法に関して、Ｌ−オルニチンに対して排出活性を有するポリペプチドをコードし、かつそのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも（≧）３５％、≧４０％、≧５０％、≧５５％、≧６０％、≧６５％、≧７０％、≧７５％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧１００％、有利には≧７０％、特に有利には≧９０％、極めて有利には≧９６％かつ最も有利には≧１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が使用され、その際、場合により、コードされたポリペプチドの長さは上記の長さの範囲内にある。

適切なＬ−オルニチンエクスポーターは、例えば
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２（配列番号２）、
コリネバクテリウム・グルタミクムＲ（配列番号４）、
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１４０６７（配列番号５）、
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９（配列番号７）、
コリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ−３１４（配列番号９）、
コリネバクテリウム・ジフテリアＮＣＴＣ１３１２９（配列番号１０）、
コリネバクテリウム・ストリアツムＡＴＣＣ６９４０（配列番号１１）、
コリネバクテリウム・アウリムコスムＡＴＣＣ７００９７５（配列番号１２）、
コリネバクテリウム・マツルショッティイＡＴＣＣ３３８０６（配列番号１３）、
コリネバクテリウム・シュードジェニタリウムＡＴＣＣ３３０３５（配列番号１４）、
コリネバクテリウム・アコレンスＡＴＣＣ４９７２５（配列番号１５）、
コリネバクテリウム・グルクロナリチクムＡＴＣＣ５１８６７（配列番号１６）、
ミクロコッカス・ルテウスＮＣＴＣ２６６５（配列番号１７）、
コリネバクテリウム・ツブクロステアリクムＳＫ１４１（配列番号１８）及び
コリネバクテリウム・マツルショッティイＡＴＣＣ１４２６６（配列番号１９）のリジンエクスポター又はLysEポリペプチドである。

配列番号１８と配列番号１９は、当該分野ではＡｒｇＯポリペプチドとも称される。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１４０６７及びコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９のlysE遺伝子のヌクレオチド配列をこの研究で決定した（配列番号６と配列番号８）。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１４０６７とコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９のアミノ酸配列は配列番号５と配列番号７に記載されている。これらは配列番号２に記載されているＣ.グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のLysEのアミノ酸配列と同一である。

第１表には、コリネバクテリウム属及びミクロコッカス・ルテウスの様々な代表のLysEポリペプチドの受入番号が記載されていて、これらはNational Center for Biotechnology Information（NCBI、Bethesda、MD、US）のデータバンクから引用することができる。更に、第１表には配列表に記載されているLysEポリペプチドのアミノ酸配列が示されている。最後に、第１表にはコードされたLysEポリペプチドの長さ（アミノ酸の数）が記載されている。

第１表

図１には、第１表中に記載された細菌のLysEポリペプチドのアミノ酸配列の多重比較アライメントが記載されている。図１に示されたアミノ酸配列の比較は、プログラムClone Manager 9、プロフェッショナル版を用いて作成した（Scientific & Educational Software 600 Pinner Weald Way Ste 202 Cary NC 27513 USA）。比較用の参照分子としてＡＴＣＣ１３０３２のLysEポリペプチド（LysE）を使用した。マトリックスのスコア付けには、設定"Blosum 62"（参照：Jermy M. Berg, John L. Tymoczko and L. Stryer; Biochemie、第５版、１９４〜１９７頁、Spektrum Akademischer Verlag、ハイデルベルク、ドイツ、２００３）を選択した。

場合により従来技術に記載されているプログラム、例えば、プログラムClustalXを使用することもできる［Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F. Jeanmougin, F. and Higgins, D. G.(1997)、ClustalX Windowsインターフェイス：クオリティー分析ツールにより補助された多重配列アライメント用のフレキシブルな方策、核酸リサーチ、25：4876〜4882頁］。

コリネバクテリウム・グルタミクムＲのLysEポリペプチドのアミノ酸残基４〜２３６（配列番号４参照）は、配列番号２に記載されたＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のLysEのアミノ酸配列に相応する。Ｃ．グルタミクムＲのポリペプチドは、Ｎ末端に３個のアミノ酸残基の配列を更に有する（メチオニン−バリン−イソロイシン）。これらの更なる残基は、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２（配列番号１参照）中のLysE遺伝子の出発コドンの代わりにlysE遺伝子の更に上流に存在する出発コドンの９個の塩基対が使用される場合に生産される。

Ｃ．エフィシエンスＹＳ−３１４のLysEポリペプチドのアミノ酸配列は、７１％、かつＣ．ジフテリアＮＣＴＣ１３１２９は４４％、コリネバクテリウム・ストリアツムＡＴＣＣ６９４０は４４％、コリネバクテリウム・アウリムコスムＡＴＣＣ７００９７５は４２％、コリネバクテリウム・マツルショッティイＡＴＣＣ３３８０６は４３％、コリネバクテリウム・シュードジェニタリウムＡＴＣＣ３３０３５は４３％、コリネバクテリウム・アコレンスＡＴＣＣ４９７２５は４３％、コリネバクテリウム・グルクロナリチクムＡＴＣＣ５１８６７は３６％、ミクロコッカス・ルテウスＮＣＴＣ２６６５は４０％、遺伝子配列表の番号２に記載されているＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のLysEのアミノ酸配列と同一である。

Ｃ．ツブクロステアリクムＳＫ４１のＡｒｇＯポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列と４３％同一である。

更に、Ｃ.マツリコッチＡＴＣＣ１４２６６のＡｒｇＯポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列と４４％同一である。同定のパーセンテージは、プログラムClone Manager 9により、設定Blosum 62（図２参照）の使用下にグローバルシーケンス・アライメントを作成することにより作った。

LysE遺伝子、すなわちＬ−オルニチンエクスポーターの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切なプライマーの使用下にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生物から単離することもできる。この説明は、特にNewton and Grahamによる実験マニュアル"ＰＣＲ"（Spektrum Akademischer Verlag、ハイデルベルク、ドイツ、１９９４）ならびにＷＯ２００６／１００２１１の１４〜１７頁に見出すことができる。

本発明による方法に関して、Ｌ−オルニチンエクスポート活性を有し、かつそのアミノ酸配列が、以下のグループ：
ａ）配列番号２又は配列番号４によるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２によるアミノ酸配列、１つ以上の、最大２５個、２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸の欠失を含む、
ｃ）配列番号２によるアミノ酸配列、１つ以上の、最大２５個、２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸の挿入を含む、
ｄ）配列番号２によるアミノ酸配列、１つ以上の、最大１４０個、１３０個、１２０個、１１０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個又は１個の置換、有利には５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸の交換（置換）を含む、
ｅ）配列番号２によるアミノ酸配列、Ｎ末端及び／又はＣ末端上の１つ以上の、最大２５個、２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個又は１個の、有利には最大５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸の付加を含む
から選択される特徴の１つ以上を含むポリペプチドをコードする遺伝子を使用することが有利である。

場合により、保存的アミノ酸置換が有利である。芳香族アミノ酸の場合には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが互いに置換されている場合には、保存的置換を意味する。疎水性アミノ酸の場合には、ロイシン、イソロイシン及びバリンが互いに置換される場合には保存的置換を意味する。極性アミノ酸の場合には、グルタミン及びアスパラギンが互いに置換されている場合には、保存的置換を意味する。塩基性アミノ酸の場合には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが互いに置換されている場合には、保存的置換を意味する。酸性アミノ酸の場合には、アスパラギン酸とグルタミン酸が互いに置換されている場合には、保存的置換を意味する。ヒドロキシル基含有アミノ酸の場合には、セリンとトレオニンが互いに置換されている場合には、保存的置換を意味する。

更に、ストリンジェントの条件下に、配列番号１と相補的な、有利には配列番号１のコード領域と相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつＬ−オルニチンエクスポート活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。その際、コードされたタンパク質のアミノ酸配列は≧７０％が配列番号２のアミノ酸配列と同一であり、かつその際、場合により、コードされたポリペプチドの長さは、上記の長さ範囲内に存在する。

核酸又はポリヌクレオチドをハイブリダイズする説明は、それぞれ当業者により特にベーリングマンハイム社（マンハイム、ドイツ、１９９３）のマニュアル書"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"及びLieblら（International Journal of Systematic Bacteriology 41：２５５〜２６０（１９９１））に見出すことができる。ハイブリダイジングはストリンジェントな条件下に行われる。すなわちハイブリッドだけが形成され、その際、プローブ、つまり配列番号１に相補的な、有利には配列番号１のコード領域に相補的なヌクレオチド配列、及びターゲット配列（つまり前記プローブで処理又は同定されたポリヌクレオチド）を含むポリヌクレオチドは、少なくとも７０％同一である。洗浄工程を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、バッファー組成物、温度及び塩濃度を変化させることにより影響又は決定できることが公知である。ハイブリダイジング反応は、一般に洗浄工程よりも比較的に低いストリンジェンシーで実施される（Hybaid Hybridisation Guide, Hybrid Limited, Teddington, UK, 1996）。

ハイブリダイジング反応には、約５０℃〜６８℃の温度で例えば５×ＳＳＣバッファーに相応するバッファーを使用することができる。この場合に、プローブをポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、使用されるプローブのヌクレオチド配列に７０％未満の同一性を有していてもよい。このようなハイブリッドは僅かにだけ安定性であり、かつストリンジェントな条件下に洗浄により取り除かれる。これは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣ又は１×ＳＳＣまで下げ、かつ場合により続いて０．５×ＳＳＣが達成される（DIG System User’s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim、マンハイム、ドイツ、１９９５）。その際、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃の温度に調節される。約６４℃〜６８℃又は約６６℃〜６８℃の温度範囲が有利である。場合により、塩濃度を０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣに相応する濃度まで下げることもできる。場合により、ＳＳＣバッファーは、ドデシル硫酸ナトリウムを０．１％の濃度で含有している。ハイブリダイジング温度を約１〜２℃の段階で５０℃〜６８℃まで段階的に上げることにより、ポリヌクレオチド断片を単離することができ、これは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％、場合により１００％使用されるプローブの配列又は相補配列と同一性を有し、かつＬ−オルニチンエクスポート活性を有するポリペプチドをコードする。ハイブリダイジングに関する更なる説明は、いわゆる"キット"の形で市販されている（例えば、Roche Diagnostics GmbH社のDIG Easy Hyb（カタログ番号１６０３５５８）、マンハイム、ドイツ）。

本発明の手法に関して、Ｌ−オルニチンエクスポート活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、Ｌ−オルニチン生産性細菌又は出発株又は親株中で過剰発現させ、その際コードされたタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列に≧３５％同一であり、かつ場合により、コードされたポリペプチドの長さは、上記の範囲内にある。

過剰発現とは、一般に出発株（親株）又は野生型株（これが出発株である場合には）と比べたときの、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）又は酵素の細胞内濃度又は活性の増大を意味すると解釈される。出発株（親株）とは、過剰発現につながる手法が実施された株を意味すると解釈される。

タンパク質とポリペプチドという用語は、互いに交換可能なものとして用いられる。

過剰発現では、組み換えられた過剰発現の方法が有利である。これらには、in vitroで用意されたＤＮＡ分子の使用下に微生物が製造される全ての方法が含まれる。このようなＤＮＡ分子の例には、例えばプロモーター、発現カセット、遺伝子、対立遺伝子、コード領域などが含まれる。これらは、形質転換、コンジュゲーション、トランスダクション又は類似した方法により所望の微生物に変換される。

過剰発現の手法により、相応するポリペプチドの活性又は濃度は、過剰発現を導く手法を行う前の菌株中のポリペプチドの活性又は濃度のレベルに対して、一般に少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、有利には最大１０００％、２０００％、４０００％、１０００００％又は２００００％まで高められる。

場合により、コリネバクテリウム・グルタミクム種の株を使用する際には、株ＡＴＣＣ１３０３２又はＡＴＣＣ１４０６７又はＡＴＣＣ１３８６９又はＡＴＣＣ１７９６５中のＬ−オルニチン−排出活性は、過剰発現を決定するための適切な基準点である。ＡＴＣＣ１３０３２に基づく又はこれに由来する株を使用する場合には、前記株ＡＴＣＣ１３０３２は適切な基準点である。このための一例は、本発明につながる作業の際に製造される株ATCC13032＿Delta＿argFRGH／pVWEx1＿lysEであり、これは株ＡＴＣＣ１３０３２に基づく。ＡＴＣＣ１４０６７に基づくか又はこれに由来する株を使用する場合には、前記株ＡＴＣＣ１４０６７は適切な基準点である。ＡＴＣＣ１３８６９に基づくか又はこれに由来する株を使用する場合には、前記株ＡＴＣＣ１３８６９は適切な基準点である。更に適切な基準点も相応して生じる。

場合によりエシェリキア・コリ種の株、有利にはエシェリキア・コリ株Ｋ１２が使用される場合には、株ＭＧ１６５５中のＬ−オルニチンエクスポート活性は、過剰発現を決定するための適切な基準点である。

過剰発現を達成するために、従来技術では多くの方法が使用可能である。

これらには、遺伝子の発現を操作又は制御するヌクレオチド配列のコピー数の増大及び変性が含まれる。遺伝子の転写は、特にプロモーターにより、及び場合により転写を抑制するタンパク質（リプレッサータンパク質）もしくは促進するタンパク質（アクチベータータンパク質）により制御される。形成されたＲＮＡの翻訳は、特にリボソーム結合部位及び出発コドンにより制御される。プロモーター及びリボソーム結合部位及び場合により出発コドンを含むポリヌクレオチド又はＤＮＡ分子は、発現カセットとも称される。

これには、高い触媒活性を有するポリペプチド又は酵素の変異体の使用も含まれる。

コピー数の増大は細菌のサイトプラズマ中で複製されるプラスミドにより行うことができる。このために、従来技術では多くのプラスミドが極めて様々なグループの微生物に関して記載されていて、そのプラスミドは遺伝子の所望するコピー数の増大を設定するために使用できる。エシェリキア属に適切なプラスミドは、例えば、マニュアル書Molecular Biology, Labfax（Ed.: T.A. Brown, Bios Scientific, Oxford, UK,1991）に記載されている。コリネバクテリウム属に適切なプラスミドは、例えば、Tauchら（Journal of Biotechnology 104（１〜３）、27〜40, 2003）又はStansenら（Applied and Environmental Microbiology 71, 5920〜5928（2005））に記載されている。

コリネバクテリウムン・グルタミクムにおけるコピー数を増大させるためのDSM23239に寄託されているプラスミドpEC7LysEの使用は、本発明につながる手法からは除外される。pEC7LysEプラスミドのヌクレオチド配列は決定され、かつ配列番号２９に示されている。

更に、少なくとも１個のコピーだけコピー数を増大することは、更なるコピーを細菌の染色体に挿入することにより行うことができる。コリネバクテリウム属、有利にはコリネバクテリウム・グルタミクムに適切な方法は、例えば、特許文献ＷＯ０３／０１４３３０、ＷＯ０３／０４０３７３及びＷＯ０４／０６９９９６に記載されている。ＷＯ０３／０１４３３０には、本来の遺伝子座に遺伝子をタンデムに倍化するための方法が記載されている。ＷＯ０３／０４０３７３には、更なる遺伝子座で遺伝子の２番目又は３番目のコピーを挿入する方法が記載されている。その際、それぞれの遺伝子座は、それぞれのアミノ酸（本発明の場合にはＬ−オルニチン）の成長又は生産には必須ではない。本発明による方法において、LysE遺伝子の二番目又は更なるコピーを挿入するための適切な遺伝子座は、例えば遺伝子ｏｄｈ、ｓｕｃＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄｄｈ、ｌｙｓＡ、ａｒｇＲ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ及びａｒｇＨである。ＷＯ０４／０６９９９６（表１２と１３参照）には、Ｃ．グルタミクムの遺伝子間領域及びファージ又はファージ成分をコードする遺伝子が記載されていて、これらはLysE遺伝子の更なるコピーを挿入するために適切である。

エシェリキア属に適切な方法は、例えばファージのａｔｔ部位への遺伝子コピーの挿入（Yu and Court, Gene 223, 77〜81(1998)）、ファージＭｕを用いた染色体増幅（例えばEP0332448に記載されている）、又はHamiltonらによる（Journal of Bacteriology 174, 4617〜4622（1989））又はLinkらによる（Journal of Bacteriology 179, 6228〜6237（1997））に記載されている、条件的な複製プラスミドを用いる遺伝子交換方法である。

遺伝子発現の増大は、発現すべき遺伝子に機能的に結合した強いプロモーターを用いて達成することもできる。有利には、天然のプロモーターよりも強いプロモーター、すなわち、野生型又は親株中に存在するプロモーターの使用が挙げられる。このために、従来技術では多くの方法が使用可能である。

コリネバクテリウム属に適切なプロモーターと発現系は、特に特許文献ＥＰ０６２９６９９Ａ２、ＵＳ２００７／０２５９４０８Ａ１（ギャッププロモーター）、ＷＯ２００６／０６９７１１、ＥＰ１８８１０７６Ａ１、ＷＯ２００８／０８８１５８、ＷＯ２００９／０２５４７０（ｂｕｔＡプロモーター、ｐｙｋプロモーター）、ＵＳ６８６１２４６（ｄａｐＡプロモーターのＭＣ２０とＭＡ１６変異体）、及びＥＰ１９１８３７８Ａ１（ｓｏｄプロモーター）及び概要、例えば、"Handbook of Corynebacterium glutamicun"［Eds.:Lothar Eggeling and Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)］又は、書籍"Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology"［Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK(2008)］に見出すことができる。コントロールされた、すなわち誘発可能又は抑制可能な発現を可能にするプロモーターは、例えば、Tsuchiya and Morinage（Bio／Technology 6, 428〜430（1988））に記載されている。

エシェリキア属に適切なプロモーターは、長い間公知である。これには、特に従来のプロモーターであるｌａｃ−プロモーター、ｔｒｐ−プロモーター、ハイブリッド−プロモーターｔａｃ及びｔｒｃ、ファージλのプロモーターＰＬ及びＰＲが属する。同様に、ファージＴ７のプロモーター、ギアーボックス−プロモーター、ｎａｒ−プロモーター、又は遺伝子ｒｒｓＧ、ｒｎｐＢ、ｃｓｒＡ、ｃｓｒＢ、ｏｍｐＡ、ｆｕｓＡ、ｐｅｐＱ、ｒｐＩＸ又はｒｐｓＧのプロモーターを使用することもできる。制御された発現は、例えば、ファージλのｃＩ８５７−ＰＲ−系又はｃＩ８５７−ＰＬ−系（Goetting et al., BioTechniques 24, 362〜366(1998)）により可能である。概要は、Makrides（Microbiological Reviews 60（3）、512〜538（1996））又はマニュアル書"Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology"［F. C. Neidhardt（Editor in Chief）, ASM Press, Washington, US(1996)］に見出すことができる。

このようなプロモーター又は発現カセットは、通常は遺伝子のコード領域の出発コドンの１番目のヌクレオチドの上流１〜１０００、有利には１〜５００ヌクレオチドの距離で用いられる。１の距離とは、プロモーター又は発現カセットが、コード領域の出発コドンの１番目の塩基の直前に位置することを意味する。

Ｃ．グルタミクムでlysE遺伝子の発現を増大するために、適切なプロモーター、例えば、Ｃ．グルタミクムからのｓｏｄプロモーター（ＥＰ１９１８３７８Ａの配列番号１を参照）又はＣ．グルタミクムからのｇａｐプロモーター（ＵＳ２００７／０２５９４０８の配列番号３を参照）を配列番号１の９３０位と９９０位の間に挿入することが有利に挙げられる。

プロモーターとリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含んでいる発現カセット、例えば、Ｃ.グルタミクムのｓｏｄ−遺伝子の発現単位（ＥＰ１９１８３７８Ａ１の配列番号２参照）又はＵＳ２００７／０２５９４０８に記載されていて、かつ配列番号２８に記載されている（そこにはＰｇａＲＢＳと記載されている）Ｃ.グルタミクムのｇａｐ−遺伝子の発現単位（配列番号３参照）を使用する際に、これはＣ．グルタミクムの場合には、配列番号１の９３０位と１００１位の間、特に有利には１０００位と１００１位の間に挿入される。このような発現カセット中の適切なリボソーム結合部位は、例えば、Amador（Microbiology 145, 915〜924（1999））により挙げられているヌクレオチド配列５’−ａｇａａａｇｇａｇｇ−３’である。

同様に、複数のプロモーターを所望する遺伝子の前に位置させるか又は発現させるべき遺伝子と機能的に結合させ、かつこのように高められた発現を達成することも可能である。このことは、例えばＷＯ２００６／０６９７１１に記載されている。

コリネバクテリウム・グルタミクム及びエシェリキア・コリのプロモーターの構造はよく知られている。従って、ヌクレオチドの１つ以上の置換及び／又は１つ以上の挿入及び／又は１つ以上の欠失によって、その配列を変えることでプロモーターの強さを高めることができる。この例は、特に"Herder Lexikon der Biologie"（Spektrum Akademischer Verlag, ハイデルベルク、ドイツ（1994））に見出すことができる。

従ってLysE遺伝子を過剰発現させる適切な手法は、LysE遺伝子のプロモーターの変性又は突然変異である。

コリネバクテリウム・グルタミクム及びエシェリキア・コリのリボソーム結合部位の構造もよく知られていて、かつ例えばAmador（Microbiology 145、915〜924（1999））で及び遺伝子学のテキスト及び教書、例えば、"Gene und klone"（Winnacker、Verlag Chemie、ヴァインハイム、ドイツ（1990））又は"Molecular Genetics of Bacteria"（"Dale und Park, Wiley and Sons Ltd. Chichester, UK(2004)"）に記載されている。良好な発現遺伝子、すなわち生物中で最も重要な構造遺伝子は、良好なリボソーム結合部位により入手可能である（Amador, Microbiology 145, 915〜924（1999））、すなわち、これはコンセンサス配列に対して高い類似性を有するか又はこれに相当する。文献では、高い発現遺伝子が強いリボソーム結合部位を有することが示されている（Karlin and Mrazek, Journal of Bacteriology 2000; 182(18)：5238〜50）。従って遺伝子又はm−RNAの翻訳効率は、リボソーム結合部位の調節により達成できる。

翻訳効率を高めるもう１つの可能性は、発現すべき遺伝子中でコドン出現頻度を調節することである（例えば、Najafabiad et al.；Nucleic Acids Research 2009, 37（21）：7014〜7023）。

過剰発現を達成するために、同様に活性化タンパク質の発現を高めるか、又はリプレッサータンパク質の発現を下げる又はスイッチオフすることができる。

LysEの発現に関する活性化タンパク質LysGは、Bellmannら（Microbiology 2001；147：1765〜74）により記載されている。そこには、"ポジティブレギュレーター"と示されている。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からのＬｙｓＧのアミノ酸配列は、配列番号３０に記載されている。グローバルシーケンス・アライメントでは、コリネバクテリウム・ジフテリアＮＣＴＣ１３１２９のＬｙｓＧポリペプチドのアミノ酸配列は６２％、コリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ−３１４のＬｙｓＧポリペプチドのアミノ酸配列は８１％、かつコリネバクテリウム・グルタミクムＲのＬｙｓＧポリペプチドのアミノ酸配列は９４％、配列番号３０のアミノ酸配列と同一である。

アクチベータータンパク質の場合に、ポリペプチドは有利には≧（少なくとも）５５％、有利には≧８０％、特に有利には≧９０％、≧９２％又は≧９４％、とりわけ有利には≧９９％及び最も有利には１００％配列番号３０に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸と同一である。

前記過剰発現の手法は、有利には、コピー数の増大、強いプロモーターの使用、プロモーターの突然変異、適切な発現カセットの使用及びアクチベータータンパク質の過剰発現から成るグループから選択され、適切な方法で互いに組み合わせることができる。従って、例えばコピー数の増大又はアクチベータータンパク質の過剰発現を有する適切なプロモーターの使用は、適切なプロモーター又は適切な発現カセットの使用と組み合わせることができる。

同様に、Ｌ−オルニチン排出活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する手法の他に、個々の生合成遺伝子を減衰することもできる。

場合により、Ｌ−オルニチン生産を改善するために、次のグループ：
ａ）α−ケトグルタル酸デドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．４．２）のＥ１サブユニットをコードするｏｄｈＡ遺伝子、
ｂ）ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．６１）をコードするｓｕｃＡ遺伝子、
ｃ）ジヒドロジピコリネート−シンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ４．２．１．５２）をコードするｄａｐＡ遺伝子、
ｄ）ジヒドロジピコリネート−シンターゼ（ＤａｐＢ、ＥＣ１．３．１．２６）をコードするｄａｐＢ遺伝子、
ｅ）メソ−ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（Ｄｄｈ，ＥＣ１．４．１．１６）をコードするｄｄｈ遺伝子、
ｆ）ジアミノピメレート−デヒドロカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ，ＥＣ４．１．１．２０）をコードするｌｙｓＡ遺伝子、
ｇ）Ｌ−アルギニンの生合成のリプレッサー（ＡｒｇＲ）をコードするａｒｇＲ遺伝子、
ｈ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ，ＥＣ２．１．３．３）をコードするａｒｇＦ遺伝子、
ｉ）アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｒｇＧ，ＥＣ６．３．４．５）をコードするａｒｇＧ遺伝子、
ｊ）アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＡＬ）（ＡｒｇＨ，ＥＣ４．３．２．１）をコードするａｒｇＨ遺伝子、
ｋ）アスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ，ＥＣ２．７．２．４）をコードするｌｙｓＣ遺伝子及び
ｌ）アスパラギン酸セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ，ＥＣ１．２．１．１）をコードするａｓｄ遺伝子
から選択される１つ以上の遺伝子を更に減衰させることが便利である。

有利にはｌｙｓＡ、ｏｄｈＡ、ａｒｇＲ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ及びａｒｇＨから成るグループから選択される１つ以上の遺伝子を減衰することが挙げられる。特に有利には、ｌｙｓＡ、ｏｄｈＡ及びａｒｇＦから成るグループから選択される１つ以上の遺伝子の減衰である。遺伝子ｌｙｓＡ及び／又はａｒｇＦの減衰がとりわけ有利である。

これに関連して、"減衰"という用語は、相応のDNAによりコードされた細菌中の１つ以上の酵素（タンパク質）の細胞内活性の減少又はスイッチオフを意味し、これは例えば、減衰したプロモーターを使用するか、又は低い活性を有する相応の酵素をコードする遺伝子又は対立遺伝子を使用することにより、又は相応の遺伝子又は酵素（タンパク質）を不活性化することにより、かつ場合によりこれらの手法を組み合わせて行われる。

コリネバクテリウム・グルタミクム中の様々な強さの公知のプロモーターに関する概要は、Patekら（Journal of Biotechnology 104, 311〜323（2003））に見出すことができる。その他の弱いプロモーターは、２００６年１２月の定期刊行物Research Disclosure（1616〜1618頁）の情報５１２０５７に記載されている。

減衰を発生すると考えられ得る突然変異として、該当する遺伝子のコード領域内の少なくとも１つの塩基対もしくはヌクレチドのトランジション、転位、挿入及び欠失が用いられる。タンパク質又は酵素の活性における突然変異により生じるアミノ酸置換の影響に応じて、ミスセンス突然変異又はノンセンス突然変異と称される。

ミスセンス突然変異は、タンパク質中での所定のアミノ酸の互いの置換を生じ、その際前記置換は、特に非保存的アミノ酸置換である。これによりタンパク質の官能性又は活性が損なわれ、かつ≧０〜７５％、≧０〜５０％、≧０〜２５％、≧０〜１０％又は≧０〜５％の値まで下がる。

ノンセンス突然変異は、遺伝子のコード領域中のストップコドンで生じ、かつ従って翻訳の早い中断及びそれによりスイッチオフを生じる。遺伝子中への少なくとも１つの塩基対の挿入又は欠失は、フレームシフト突然変異（"frame shift mutaions"）を生じ、そのために間違ったアミノ酸が挿入されてしまうか又は翻訳が早く終了してしまう。突然変異がコード領域中のストップコドンで生じる場合には、これは同様に早い翻訳の終了を生じる。ノンセンス突然変異を生じる手法は有利にはポリペプチドのＮ末端をコードするコード領域の５’−末端で行われる。本明細書の範囲内において、ポリペプチドの全長（化学的に結合したＬアミノ酸の数として測定）が１００％と称される場合には、ポリペプチドのＮ末端は、出発アミノ酸（Ｌ−ホルミル−メチオニン）から数えてアミノ酸配列のその部分は下流のＬ−アミノ酸の８０％を含む。

in vivoでの突然変異誘発法は、例えば、Methods for General Bacteriologyのマニュアル書（Gerhard et al.（Eds.）, American Society for Microbiology, Washington DC, USA, 1981）又はTosaka et al.（Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745〜752（1978））又はKonicek et al.（Folia Microbiologica 33, 337〜343（1988））に記載されている。

in−vitroでの突然変異誘発法に適切な方法は、特に、Millerによるヒドロキシルアミンでの処理［Miller, J. H.:A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and OxyRated Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor ,1992］、突然変異誘発剤オリゴヌクレオチドの使用［T.A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 und R. M. Horton: PCR−Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93〜99（1995）］及び高いエラー率を有するDNA−ポリメラーゼの使用下のポリメラーゼ連鎖反応の使用である。

このようなDNAポリメラーゼは、例えばStratagene（LaJolla, CA, USA）社のMutazyme DNAポリメラーゼ（GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, No. 600550）である。

in−vivo又はin−vitroでの突然変異を作成するための更なる説明及び概要は、従来技術及び遺伝子学ならびに分子生物学の公知の教書、例えば、ニッパー（knippers, "Molekulare Genetik", 第６版、Georg Thieme Verlag、シュトュットガルト、ドイツ、1995）、ヴィンナッカー（Winnacker, "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft、ヴァインハイム、ドイツ、）、ハーゲマン（Hagemann, "Allgemeine Genetil", Gustav Fischer Verlag、シュトュットガルト、１９８６）から引用することができる。

遺伝子交換又は対立遺伝子交換の公知の方法を用いて、この基本概念はシュヴァルツァー及びフューラー（Schwarzer and Puehler, Bio/Technology ９、84〜87（1991）において記載されていて、in−vitroで製造された突然変異又は所望の突然変異を含んでいるポリヌクレオチドは染色体に移されている。シェーファーら（Schaefer et al, Gene 145, 69〜73（1994））により、Ｃ．グルタミクムのhom−thrRオペロンに欠失を組み込むためにこの方法が使用されている。Nakagawaら（EP1108790）及びOhnishiら［Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217〜223（2002）］により、単離した対立遺伝子から出発してＣ．グルタミクムの染色体に種々の突然変異を挿入するために、この方法が使用されている。

目的を定めて遺伝子発現を減少させる１つの方法は、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の秤量した量の添加により誘発できるプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター又はｔａｃプロモーターの制御下に減衰させるべき遺伝子を設定することから成る。このために適切なベクターは、エッシャリキア・コリ発現ベクターpXK99E［（WO 0226787；ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSMZ、ブラウンシュバイク、ドイツ）においてブダペスト条約に従って、ＤＳＭ１４４４０（ＤＳＭＺ、ブルンスヴィック、ドイツ）としてDH5alpha/pXK99Eに２００１年７月３１日に寄託してある）］、pEKEx2（NCBI Accession No. AY585307）又はpVWEx2［Wendisch, ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums、Juelich, Juel−3397、ISSN0994〜2952、Juelich、ドイツ（1997）］であり、これはＩＰＴＧに依存して、コリネバクテリウム・グルタミクム中でクローン化遺伝子の発現を可能にする。

この方法は、例えば、特許文献ＷＯ０２２６７８７ではベクターpxk99EdeaDをコリネバクテリウム・グルタミクムのゲノム中へ挿入することによりｄｅａＤ遺伝子を規則正しく発現するために使用され、及びSimicら（Applied and Environmental Microbilogy 68：3321〜3327（2002））により、ベクターpK18mobglyA’のコリネバクテリウム・グルタミクム中への挿入により、ｇｌｙＡ遺伝子の規則正しい発現のために使用されていた。

遺伝子発現を特異的に減らすもう１つの方法は、アンチセンス技法であり、その際、短いオリゴデスオキシヌクレオチド又はベクターは、より長いアンチセンスＲＮＡを合成するために目的細胞に運ばれる。アンチセンス−ＲＮＡは、そこで特異的なｍＲＮＡの相補的断片と結合し、かつそれらの安定性が減少するか又は翻訳能力が遮断される。この一例は、Srivastavaら（Applied Environmental Microbiology 2000 Oct.; 66(10)：4366〜4371）において専門家により見出すことができる。

延長の速度は、コドンの使用により影響させることができる。親株中では滅多に生じないt−RNA用のコドンの使用により遺伝子発現を減衰させてもよい。これはＷＯ２００８０４９７８１とＷＯ２００９１３３０６３に詳細に記載されている。例えば、ATG出発コドンを滅多に生じないコドンGTG又はTTGと交換することは、翻訳に悪影響を与える。それというのも、コドンAUGは例えばコドンGUG及びUUGよりも２〜３倍効果的であるからである［Khudyakov et al., FEBS Letters 232（2）：369〜71(1988)Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17)：5656〜60（1985）］。

同様に、Ｌ−オルニチン排出活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する前記手法の他に、個々の生合成遺伝子を増強することもできる。

場合により、Ｌ−オルニチン生産を改善するために、更に次のグループ：
ａ）ｇｄｈ遺伝子によりコードされるグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．３）、
ｂ）ａｒｇＪ遺伝子によりコードされるグルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３５及びＥＣ２．３．１．１）、
ｃ）ａｒｇＢ遺伝子によりコードされるアセチルグルタメートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．８）、
ｄ）ａｒｇＣ遺伝子によりコードされるＮ−アセチル−γ−グルタミル−ホスフェートリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．３８）、
ｅ）ａｒｇＤ遺伝子によりコードされるアセチル−オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１１）、
ｆ）ｐｔｓＧ遺伝子によりコードされるグルコース取込み系のグルコース−特異的成分ＥＩＩＢ（ＰｔｓＧ）（ＥＣ２．７．１．６９）、
ｇ）ｐｔｓＳ遺伝子によりコードされるサッカロース取込み系のサッカロース特異的成分ＥＩＩＢ（ＰｔｓＳ）（ＥＣ２．７．１．６９）、
ｈ）ｚｗｆ遺伝子によりコードされるグルコース−６−ホスフェート１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）、
ｉ）ｐｇｉ遺伝子によりコードされるグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）、
ｊ）ｐｆｋＡ遺伝子によりコードされるホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１）、
ｋ）ｆｄａ遺伝子によりコードされるフルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１３）、
ｌ）ｇａｐ遺伝子によりコードされるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５９）、
ｍ）ｐｇｋ遺伝子によりコードされるホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．３）、
ｎ）ｐｙｋ遺伝子によりコードされるピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、
ｏ）ａｃｅＥ遺伝子によりコードされるピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニット（ＥＣ１．２．４．１）、
ｐ）ｐｐｃ遺伝子によりコードされるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３１）、
ｑ）ｐｙｃ遺伝子によりコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．１）、
ｒ）ａｃｎ遺伝子によりコードされるアコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）、及び
ｓ）ｉｃｄ遺伝子によりコードされるイソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４２）から選択される１つ以上のタンパク質の酵素活性を増強することが合理的である。

増強という用語には、過剰発現の手法ならびに野生型のタンパク質と比べて増大した触媒活性を有する変異体の使用が含まれる。

グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ及びアセチルグルタミン酸キナーゼのグループから選択される１つ以上の酵素の増強が特に有利である。

列挙された減衰の更なる手法を増強の更なる手法と組み合わせてもよい。

ＤＮＡ、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換及び形質転換体の選択を取り扱う説明は、特にサムブルックら［Sambrook et al."Molecular Cloning"：実験マニュアル、第二版（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）］による公知のマニュアル書で見出すことができる。

発現又は過剰発現の程度は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量又は濃度の測定により、ポリペプチドの量又は濃度の測定により、及び酵素活性の高さの測定により確定できる。

ｍＲＮＡの量を決定するために、特に"ノーザンブロッティング"の方法及び定量的ＲＴ−ＰＣＲが使用される。

定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、ポリメラーゼ連鎖反応が逆転写により行われる。このためにRoche Diagnostics社のLightCycler TM系（Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals、マンハイム、ドイツ）を、例えば、ユングウィルスら［Jungwirth et al.、FEMS Microbiology Letters 281, 190〜197（2008）］に記載されているように使用することができる。タンパク質の濃度は、１次元及び２次元のタンパク質ゲル分離により、かつ引き続き相応の評価ソフトウェアを用いてゲル中でタンパク質濃度の光学的同定により決定できる。コリネ型細菌においてタンパク質ゲルを調製及び該タンパク質を同定する一般的な方法は、ヘルマンら［Hermann et al.、（Electrophoresis, 22: 1712〜23（2001）］により記載されている。タンパク質濃度は同様に、ウェスタン−ブロット−ハイブリダイジングにより、検出すべきタンパク質に特異的な抗体を用いて、かつ引き続き濃度を決定するための相応のソフトウェアを用いて光学的評価により決定できる［Lohaus and Meyer（1998）Biospektrum 5:32〜39；Lottspeich, Angewandte Chemie 321：2630〜2647（1999）］。

製造された細菌は、Ｌ−オルニチンを製造するために連続的に（例えばＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように）、又は不連続的に回分法（回分培養）で、又は流加回分法（供給法）又は繰り返し流加回分法（例えば、US6562601に記載されている）で培養してもよい。公知の培養法に関する一般的な特徴の概要は、クミエル（Chmiel）による教書［BioprocessTechnology 1. Introduction to Bioprocess Engineering（Gustav Fischer Verlag、Stuttgart, 1991）］、又はストルハス（Storhas）による教書［Bioreavtors and Peripheral Equipment（Vieweg Verlag、ブルンスヴィック／ヴィースバーデン、ドイツ、1994）］から入手可能である。

使用すべき培地又は発酵培地は、適切な方法でそれぞれ株の要求を満たさなくてはならない。米国微生物学会のマニュアル書"Manual of Methods for General Bacteriology"（Washington D.C., USA, 1981）には、様々な微生物の培地の説明が含まれている。栄養培地、培地及び発酵培地又は媒質という用語は交換可能である。

炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、テンサイ又はサトウキビ処理からのサッカロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解産物及びセルロース、油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセロール、メタノール及びエタノール、ならびに有機酸、例えば酢酸又は乳酸が使用される。

糖は、グルコース、フルクトース、サッカロース、グルコースとフルクトースから成る混合物ならびにグルコース、フルクトース及びサッカロースの混合物が有利に挙げられる。場合により、サッカロースが特に有利である。アルコールはグリセリンが有利である。

窒素源として、窒素含有の有機化合物、例えばペプトン、イーストエクストラクト、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが使用される。窒素源は、個々に又は混合物として使用されてもよい。

リン源として、リン酸、リン酸カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応のナトリウム含有塩を使用することもできる。

培地は、更に塩を例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄のような金属の塩化物又は硫酸塩の形で、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含んでいなくてはならず、これは成長に不可欠なものである。最終的に、基本的な成長物質、例えばアミノ酸、例えばホモセリン及びビタミン、例えば、チアミン、ビオチン又はパントテン酸を前記物質の他に使用してもよい。

前記使用物質は、培地に一回分のバッチの形で添加されるか、又は培養中に適切な方法で供給されてもよい。

培地のｐＨの調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア又はアンモニア水、あるいは酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が適切に使用される。ｐＨは一般に６．０〜８．５、有利には６．５〜８の値に調節される。起泡調整のために消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するために、適した選択性作用物質、例えば抗生物質を培地に添加してもよい。発酵は有利には好気条件下に実施される。これを維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中に装入する。過酸化水素で富化した液体を使用することもできる。場合により発酵は高圧で、例えば０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で実施される。培養温度は、通常は２０℃〜４５℃であり、かつ有利には２５℃〜４０℃、特に有利には３０℃〜３７℃である。回分法では、所望のＬ−オルニチンの量を得る手法で十分な量が形成されたのが確認されるまで培養が行われる。この目的は、通常は１０時間〜１６０時間の範囲内で達成される。連続的な方法ではより長い培養時間が可能である。細菌の活動により、発酵培地中でＬ−オルニチンの濃度（蓄積）の富化又は増大が生じる。

適切な発酵培地の例は、特に特許文献ＪＰ４３０１０９９６Ｂ４（Ｂ．サブチリスに関して）、ＵＳ３６６８０７２Ａ（E．coliに関して）、及びＪＰ５７０４１９１２Ｂ(Ｂ．フラバムに関して)に挙げられている。

場合により、本発明による方法では発酵培地の体積は≧０．５リットル、≧１リットル、≧５リットル、≧１０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧５００リットル、≧１０００リットル、有利には≧１リットル、特に有利には≧１０リットル、とりわけ有利には≧１００リットル、最も有利には≧１０００リットルである。

発酵の過程で１つ以上の時点で濃度を測定するためのＬ−オルニチンの分析は、イオン交換クロマトグラフィーにより、有利にはカチオン交換クロマトグラフィーによるＬ−アミノ酸の分離により、引き続きニンヒドリンの使用下のポストカラム誘導体化により行われ、これはスパックマンら(Spackman et al)（Analytical Chemistry 30：1190〜1206（1958））に記載されている。ニンヒドリンの代わりに、ポストカラム誘導体化のためにオルト−フタジアルデヒドを使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィーに関する概要は、ピッケリング[Pickering（LC,GC（Magazine of Chromatographic Science）7(6）、484〜487（1989）]に見出すことができる。

同様に、例えばオルト−フタルジアルデヒド又はフェニルイソチオシアネートの使用下にプレカラム誘導体化を行うこともでき、かつ生じたアミノ酸誘導体は逆相クロマトグラフィー（RP）により、有利には高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）の形で分離される。このような方法は、例えば、lindrothら（Analytical Chemistry 51：1167〜1174（1979））に記載されている。検出は光度測定により行われる（吸着、蛍光）。

アミノ酸分析に関する文献は特にLottspeichとZorbasによる教書"Bioanalytik"（Spektrum Akademischer Verlag、ハイデルベルク、ドイツ、1998）に見出すことができる。

Ｌ−オルニチン濃度（体積あたりに形成されたＬ−オルニチン）、Ｌ−オルニチンの収率（消費された炭素源あたりに形成されたＬ−オルニチン）、Ｌ−オルニチンの形成（体積及び時間あたりに形成されたＬ−オルニチン）及び特異的Ｌ−オルニチンの形成（細胞の乾燥質量又はバイオ乾燥質量及び時間あたりに形成されたＬ−オルニチン、又は細胞タンパク質及び時間あたりに形成されたＬ−オルニチン）のグループから選択される１つ以上のパラメーター、もしくは他のプロセスパラメーター及びこれらの組み合わせに関する本発明による方法又は発酵プロセスの性能は、Ｌ−オルニチンエクスポート活性を有するタンパク質が過剰発現せずに存在するか又はその際、過剰発現の手法が実施されなかった細菌を用いる方法又は発酵プロセスに対して、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％又は少なくとも２％高い。

発酵の手法により所望のＬ−オルニチンを含有する発酵ブロスが得られる。

引き続き、Ｌ−オルニチン含有生成物の準備又は製造又は獲得が液体又は固体の形で行われる。

発酵ブロスとは、微生物が一定時間及び一定温度で培養された発酵培地又は栄養培地を意味すると解釈される。発酵培地又は発酵の間に使用される培地は、前記Ｌ−オルニチンの生産かつ通常は繁殖又は生存能力を確実にする全ての物質又は成分を含んでいる。

従って、発酵が完了した際に生じる発酵ブロスは次のものを含有する：
ａ）細菌の細胞の繁殖により生じる細菌のバイオマス（細胞質量）、ｂ）発酵の間に形成されるＬ−オルニチン、ｃ）発酵の間に形成される有機副生成物、及びｄ）発酵により消費されなかった使用発酵培地又は出発材料の成分、例えば、ビオチンのようなビタミン、又は硫酸マグネシウムのような塩。

有機副生成物には、Ｌ−オルニチンの他に発酵の際に使用された細菌が生産し、かつ場合により排出した物質が属する。これらには、トレハロースのような糖も含まれる。発酵ブロスは、培養容器又は発酵タンクから取り出され、場合により回収され、かつこのために液体又は固体の形でＬ−オルニチン含有生成物を提供するために使用される。このために"Ｌ−オルニチン含有生成物の回収"という用語も使用される。最も簡単な場合には、発酵容器から取り出されたＬ−オルニチン含有発酵ブロス自体が得られた前記生成物である。

次のグループ：
ａ）部分的（≧０％〜＜８０％）から完全（１００％）又は殆ど完全に（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％〜＜１００％）水を除去し、
ｂ）部分的（≧０％〜＜８０％）から完全（１００％）又は殆ど完全に（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％〜＜１００％）バイオマスを除去し、その際、場合によりこれが除去される前に不活性化され、
ｃ）部分的（≧０％〜＜８０％）から完全（１００％）又は殆ど完全に（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％、≧９９．３％又は≧９９．７％〜＜１００％）、発酵の間に形成された有機副生成物を除去し、かつ
ｄ）発酵により消費されなかった使用発酵培地又は出発物質の成分を部分的（＞０％）から完全に（１００％）又は殆ど完全に（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％又は≧９９．７％〜＜１００％）除去する
から選択される１つ以上の手法により、発酵ブロスからＬ−オルニチンの濃縮又は精製が達成される。このように、所望のＬ−オルニチンの含有量を有する生成物が単離される。

部分的（＞０％〜＜８０％）から完全（１００％）に、又は殆ど完全な（≧８０％〜＜１００％）水の除去を乾燥（手法ａ）と称する。該方法の１変法では、使用発酵培地の水、バイオマス、有機副生成物及び非消費成分の、完全な又は殆ど完全な除去により、純粋な（≧８０質量％又は≧９０質量％）、又は高度に純粋な（≧９５質量％、≧９７質量％、又は≧９９質量％）Ｌ−オルニチン生成物の形成が達成される。ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）による手法に関して多くの技術的な説明は従来技術で入手可能である。

アミノ酸Ｌ−オルニチン又はそれらの塩の場合には、従来技術では実質的に３つの異なる生成物が記載されている。

１つのグループは、Ｌ−オルニチンＨＣＬを記載していて、その際、イオン交換により細胞を除去した後に発酵培地からＬ−オルニチンは精製されていて、かつ次に結晶化によりＬ−オルニチン一塩化物として、及び再結晶化によりＬ−オルニチン一塩化物として結晶化される（ＵＳ２９８８４８９）。この場合に得られたＬ−オルニチンＨＬＣは、９０％を上回る、有利には９５％を上回る、特に有利には９８．０％を上回る、極めて有利には９９％を上回る純度を有する。

更なる方法は特許明細書ＥＰ１９９５３２２に記載されている。この場合に、バイオマス含有発酵溶液を＞３００μｍの粒子直径を有する弱酸イオン交換体の上から注ぎ、かつＬ−オルニチンはこの工程により精製される。相応の粒子直径の選択により、樹脂の遮断がバイオマスにより回避される。細胞分離の効率は９９％である。

精製されたＬ−オルニチンは、次に様々なＬ−オルニチン塩、例えば、モノ−又はジ−Ｌ−オルニチンα−ケトグルタール酸、Ｌ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩などの製造に使用できる。

例えば特許ＥＰ０４７７９９１には、Ｌ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩の製法が記載されている。この場合に、Ｌ−オルニチンとＬ−アスパラギン酸塩から成る水溶液に水溶性溶剤を添加し、少なくとも９０％の飽和又は過飽和溶液が得られる。これを結晶の形成が終わるまで還流下に加熱する。次に、塩結晶が形成されるまで還流下に水と混合可能な溶剤を更に加える。結晶は例えば遠心分離により分離され、かつ引き続き真空中で乾燥させることができる。生成物の純度は通常は９８．５％を上回る。

特許ＪＰ４６００３１９４には、Ｌ−オルニチンＬ−ケトグルタール酸塩の製造法が記載されている。この場合に、例えば、オルニチン−ＨＣＬが酸性イオン交換体での吸着、及びアンモニア水での溶出により遊離塩基に変換され、α−ケトグルタール酸塩が添加され、かつ生成物が結晶化されるまで真空下に溶液を蒸発させる。

プラスミドｐＥＣ７LysEは、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）においてブダペスト条約に従って、受入番号ＤＳＭ２３２３９でエシェリキア・コリ株ＤＨ５α／ｐＥＣ７LysE（ＤＭ２２０４）の形で２０１０年１月１５日に寄託されている。

図１は、第１表に挙げたLysEとＡｒｇＯタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを表す図であり、アライメントギャップは、"−"により示され、アミノ酸の同一性は"＊"により特徴づけられる。 図２は、グローバルシーケンス・アライメントにより２個のアミノ酸配列の同一性を決定するための、Scientific社のプログラムClone Manager９と教育用ソフトウェアの設定を表す図である。

実施例
例１：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からのLysE遺伝子のクローニングとシーケンシング
株ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子LysEをＥ．Ｃｏｌｉ／Ｃ．グルタミクムシャトルベクター及び発現ベクターｐＶＷＥｘ１（Peters−Wendisch et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3(2) :295〜300）中でクローン化した。

クローニングは２工程で実施した。まずポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からの遺伝子を以下の配列番号１に由来するオリゴヌクレオチド−プライマーにより増幅した。オリゴヌクレオチドは、その５’末端に付加的な制限切断箇所を含んでいる（下線：LysE＿1.pに関してはEcoRV、及びLysE＿2.pに関してはAvrII又はSspI）。

ＰＣＲ反応をサーモサイクラー（Mastercycler、エッペンドルフ社、ハンブルク）中で、２００μＭデスオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、相応のオリゴヌクレオチド０．５μＭ、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の、染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、５倍反応バッファーＨＦ１／５体積及び０．０２Ｕ／μｌPhusion（登録商標）Hot Start DNAポリメラーゼ（Biozym Scientific GmbH, D-31840 Hess. Oldendorf）の存在で、以下の条件下に[９８℃で１分間；３０サイクル×（９８℃で２０秒；６３℃で２０秒；７２℃で４０秒）；７２℃で６分]実施した。

７６１bpのサイズのＰＣＲ−lysE断片（配列番号３）を以下に記載するようにpVWEx1中にクローン化した：
ベクターの準備：３７℃で１時間インキュベートすることにより、酵素PstI１０単位を含有する酵素特異的なバッファー系中でpVWEx1のプラスミドDNA１μｇを切断した。この直後に、製造者の指示に従ってQuick Blunting Kit（New England Biolabs GmbH、フランクフルト・アム・マイン）用いて、切断混合物を処理し、かつその後に製造者の指示に従ってQiaExII精製キット（Qiagen AG、ヒルデン、ドイツ）を使用して精製した。次にこのように前処理したベクターを酵素特異的なバッファー系中、１０単位×baIを用いて３７℃で１時間切断し、かつその後に新たにQiaExII精製キットを用いて精製した。

インサートの準備：lysE−ＰＣＲ−断片をそれぞれ酵素AvrIIとEcoRV１０単位で切断し、かつその後に製造者の指示に従ってQiaExII−精製キットの使用により精製した。

ライゲーション：ベクターとインサートを１：５のモル比で混合し、かつT４DNAリガーゼの使用により１６℃で１時間ライゲーションした。ライゲーションミックスのうち３μｌを化学成分E.ColiDH５α細胞（サブクローニング効率、Invitrogen GmbH、カールスルーエ）中に形質転換した。

形質転換体をそのカナマイシン耐性を用いて、５０μｇ／mlカナマイシン−スルフェート含有のLB−アガールプレートにおいて同定した。４つの形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、かつプラスミドをインサートとしての０．７５kb断片の存在に関して制限分析により試験した。このように生じた組み換えプラスミドは、pVWEx1＿LysEと称した。

プラスミドpVWEx1＿LysE中の０．７５kb断片のヌクレオチド配列を、Sangerらによるジデオキシ−チェーン・ターミネーション法により決定した［Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（1977）74：5463〜5467］。このために、Eurofins MWG Operon GmbH社（エベルスブルク、ドイツ）のオリゴヌクレオチド−プライマーpVW＿l.p（５’−TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA C−３’）及びpVW＿2.p（５’−CGA CGG CCA GTG AAT TCG AG−３’）を用いてプラスミドpVWEx1＿LysEの完全なインサートをシーケンシングした。

得られたヌクレオチド配列をプログラム（Clone Manager９）を用いて分析し、かつ配列番号２０と表記した。

例２：コリネバクテリウム・グルタミクムにおけるargFRGＨ−領域を欠失するための、ベクターpK18mobsacB＿DargFRGHの構築
このためにＣ．グルタミクムATCC13032からの染色体DNAをTauchら（1995、プラスミド33：168〜179）による方法により単離した。Ｃ．グルタミクムからの遺伝子argFRGHの配列に基づき、以下に挙げるオリゴヌクレオチドをargFRGH−欠失構造の製造に選択した。欠失構造は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、特に遺伝子SOEing法（Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3：93〜98（1995））により作成された。

記載されているオリゴヌクレオチドプライマーは、Eurofins MWG Operon GmbH社（エベルスベルク、ドイツ）から入手した。

ＰＣＲ反応は、Phusion（登録商標）Hot Start DNAポリメラーゼ（Biozym Scientific GmbH, D−31840 Hess. Oldendorf）の使用下に、サーモサイクラー（Mastercycler、エッペンドルフ社、ハンブルク）中で実施した。

プライマーargFRGH＿d2は、２つの領域から成る。ヌクレオチド配列のうちの一部は、ａｒｇＦ遺伝子の出発コドンの１bp上流から１９bp下流までの範囲に相補的である。ヌクレオチド配列のもう１つの部分は、ａｒｇＨ遺伝子のヌクレオチド１４１９〜ａｒｇＨ遺伝子の５ヌクレオチド下流の範囲に相補的である。

ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、プライマーargFRGH＿１とargFRGH＿２は、５４３bpのサイズのDNA断片の増幅を可能にし、かつプライマーargFRGH＿３とargFRGH＿４は、５１３塩基対のサイズのDNA断片の増幅を可能にする。増幅物をＰＣＲにより製造し、０．８％濃度のアガロースゲル中で電気泳動により試験し、高純度ＰＣＲ製品精製キット（製品番号1732676、Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ）を用いて、アガロースゲルから単離し、かつプライマーargFRGH＿１及びargFRGH＿４と一緒に更なるＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用した。このように、１０３６bpのサイズのDargFRGH欠失誘導体が生じた（配列番号２１も参照）。これには、ａｒｇＤ遺伝子の３’末端の４７７bp、ａｒｇＦ遺伝子の５’末端の１９bp、ａｒｇＨ遺伝子の３’末端の１５bp及びｃｇ１５８９リーディング枠の５’末端の４２０bpが含まれる。このように増幅された生成物を０．８％濃度のアガロースゲル中で電気泳動により試験した。

１．０４ｋｂサイズのDargFRGHPCR産物（配列番号２１）を酵素ＮｄｅＩとＮｓｉＩで完全に切断した。引き続き、断片をＰＣＲ精製キット（Qiagen、ヒルデン）で精製した。このように前処理したDargFRGH−欠失誘導体を移動可能なクローニングベクターpK18mobsacB（Schaefer et al.(1994), Gene 14: 69〜73）と一緒にライゲーションに使用した。これをあらかじめ制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＰｓｔＩで完全に切断しておいた。これによりＮｄｅＩ切断及びＮｓｉＩ切断により生じたインサートの末端に互換性のＤＮＡ末端が作られる。このように準備されたベクターを、DargFRGH断片とモル比１：５で混合し、かつT４−ＤＮＡ−リガーゼ（Amersham−Pharmacia、フライブルク、ドイツ）の使用により１６℃で１時間ライゲーションした。ライゲーション混合物からは、化学的コンピテントE.Coli DH5α細胞（Subcloning efficiency、Invitrogen GmbH、カールスルーエ）中３μｌが形質転換された。形質転換体は、そのカナマイシン耐性を用いてカナマイシン−硫酸含有ＬＢ−アガールプレート５０μｇ／ｍｌにおいて同定された。形質転換体の４つからプラスミドＤＮＡを単離し（Qiagen社、ヒルデンのQIAprep Spin Miniprep Kit）、かつ制限分析によりプラスミドをインサートとしての１．０４kb断片の存在について試験した。このように生じた組換体プラスミドをpK18mobsacB＿DargFRGHと称した。株は、E. Coli＿DH5α／pK18mobsacB＿DargFRGHと称した。Sangerらによるジデオキシ−チェーン・ターミネーション法により、プラスミドpK18mobsacB＿DargFRGH中の１．０４ｋｂ断片のヌクレオチド配列（配列番号２１）の決定を実施した（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74：5463〜5467）。このために、プラスミドpK18mobsacB＿DargFRGHの完全なインサートを、ユーロフィンズMWGオペロン社（エベルスベルク、ドイツ）のオリゴヌクレオチド−プライマーM１３単位（−２１）（５’−TGT AAA ACG ACG GCC AGT−３’）及びM13 rev（−４９）（５’−GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG−３’）を用いてシーケンス化し、かつ精度について試験した。

例３：株コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２＿DargFRGHの製造
例２に挙げられたベクターpK18mobsacB＿DargFRGHをSchaeferら［Journal of Microbiology 172：1663〜1666(1990)］のプロトコールによるコンジュゲーションによりコリネバクテリウム・グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２中に移した。このために、ベクターを予め株E. Coli S17−１中で形質転換しておいた（Simon et al., Biotechnology 1：784〜791）。S17−１中のベクターの同一性は、試験したE. Coli DH5α（例２参照）中での検出に類似した。

ベクターpK18mobsacB又はpK18mobsacB＿DargFRGHは、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中では自己複製できず、かつ組み換えの事象の結果染色体に組み込まれた場合にだけ細胞中に含有されたままであった。組み込まれたpK18mobsacB＿DargFRGHを有するクローンの選択は、カナマイシン１５ｍｇ／ｌとナルディック酸５０ｍｇ／ｍｌで補充しておいたLBアガール上にコンジュゲーション混合物を塗ることにより行った（Sambrook et al., Molecular Cloning：A Labpratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor, New York, 1989）。成長したクローンを２５ｍｇ／ｌカナマイシン含有ＬＢアガールプレート上に塗り、かつ３３℃で１６時間インキュベートした。２番目の組み換え事象によりプラスミドの切除が行われる突然変異体を選択するために、クローンを２０時間非選択的にＬＢ−液体培地中で培養し、引き続き１０％スクロース含有ＬＢアガール上に塗り、かつ２４時間インキュベートした。

プラスミドpK18mobsacB＿DargFRGHは、出発プラスミドpK18mobsacBと同様にカナマイシン耐性遺伝子の他に、バシラスサブチリスからのレバン−スクラーゼをコードするｓａｃ−遺伝子のコピーを含む。スクロースにより誘発可能な発現は、レバン−スクラーゼの形成を生じ、これはＣ．グルタミクムにとって毒性の生成物レバンの合成を触媒する。従って、スクロース含有LBアガール上では組み込まれたpK18mobsacB＿DargFRGHが再び切除されたクローンだけが成長する。切除は、argFRGHの完全な染色体コピーを切除するか、又はargFRGHの内部欠失を有する不完全なコピーを切除するどちらかと一緒のプラスミドであってもよい。

"スクロースの存在で成長"及び"カナマイシンの存在で成長しない"表現型について、約４０〜５０個のコロニーを試験した。欠失したａｒｇＦＲＧＨ対立遺伝子が染色体中に残っていることを証明するために、 "スクロースの存在で成長"及び"カナマイシンの存在で成長しない" 表現型を有する約２０個のコロニーをInnisら（PCRプロトコール、A Guide to Mothods and Applications, 1990, Academic Press）の標準的なＰＣＲ法によりポリメラーゼ連鎖反応を用いて試験した。この場合に、コロニーの染色体ＤＮＡから、欠失argFRGH領域の周辺領域を有するＤＮＡ断片が増幅される。以下のプライマーオリゴヌクレオチドをＰＣＲに選択した。

完全なargFRGH遺伝子座を有するコントロールクローンでは、プライマーは約５．３５kbサイズのＤＮＡ断片の増幅を可能にする。欠失したargFRGH遺伝子座を有するクローンでは、約１．０４kbのサイズを有するDNA断片が増幅される。

増幅したＤＮＡ断片は、電気泳動により、０．８％濃度のアガロースゲル中で同定される。これにより、株が欠失したargFRGH対立遺伝子を染色体上に有することを示すことができた。株は、コリネバクテリウム・グルタミクムDelta＿argFRGHと称する。

例４：コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032＿Delta＿argFRGH中でのlysE遺伝子の発現
電気泳動（Haynes et al., FEMS Microbiology Letters（1989）61：329〜334）により、プラスミドpVWEx1＿LysE及び空のプラスミドpVWEx1をＬ−オルニチン形成株ATCC13032＿Delta＿argFGH中に挿入した。２５μｇ／ｍｌカナマイシン含有Casoアガールプレート上で形質転換体をそれらのカナマイシン耐性を用いて同定した。引き続き、形質転換されたプラスミドの正確さについて５個の単一クローンを試験した。このために、プラスミドDNAを単離し（Plasmid Isolation Kit, Qiagen）、かつ正確な切断パターンに関してこのDNAを制限分析により試験した。このように、Ｃ．グルタミクム株ATCC13032＿Delta＿argFRGH／pVWEx1＿LysEとATCC13032＿Delta＿argFRGH／pVWEx1が生じた。

例５：コリネバクテリウム・グルタミクムを用いるＬ−オルニチンの製造
Ｌ−オルニチンの生産能力を調べるために、それぞれ株ATCC13032＿Delta argFRGH／pVWEx1＿LysEの３つのクローンと、株ATCC13032＿Delta＿argFRGH／pVWEx1の３つのクローンを、試験培地中１０ｍｌ中でそれぞれ３３℃で１６時間予備培養した。生産試験のために、それぞれ試験培地１０ｍｌを、出発時にＯＤ₆₀₀（６００nmでの光学密度）が０．１であるように得られた予備培地と一緒に接種した。それぞれのクローンを３つの振盪フラスコ中で試験し、各株がそれぞれの培養時間について全部で９個の振盪フラスコにより示されるようにした。試験培地は、Keilhauerらにより記載されているCgXII培地と同じであった（Journal of Bacteriology(1993)175：5593〜5603）。但し、前記培地は更に酵母エキス（Difco）７．５ｇ／ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ、１ｍMIPTG（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）及びグルコースの代わりに４０ｇ／ｌサッカロースを含有していた。簡潔にするために、試験培地の組成物は以下の第２表にまとめられている。

第２表

培養を１００ｍｌ振盪フラスコ中３３℃及び２００rpmで行った。振盪の振れは５ｃｍであった。２４時間後と４８時間後にクローンの３つの培養物を回収した。このために、試料を培地から取り出し、かつ光学密度、サッカロース含有量及びＬ−オルニチン含有量を決定した。サッカロース含有量及びＬ−オルニチン含有量を決定するために、細胞を短い遠心分離から外した［テーブルトップ遠心分離機タイプ5415D（エッペンドルフ社）、１３０００rpmで１０分、室温］。

光学密度の決定は６６０nmの波長で、GENiosマイクロタイタークレート光度計（Tecan, Reading UK）を用いて行った。プローブを測定前に脱イオン水で１：１００に希釈しておいた。

R−Biopharm AG社（ダルムシュタット、ドイツ）の試験系（カタログ番号19716251035）を使用して、サッカロースの決定を行った。この場合に、サッカロースを調べ、かつ組み合わされた酵素試験（ヘキソキナーゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を用いて形成されたグルコースをＮＡＤＨ形成により検出した。

培養上澄み液からの細胞外アミノ酸濃度の定量的測定は、逆相ＨＰＬＣ（Lindroth et al., Analytical Chemistry(1979)51：1167〜1174）により実施した。連結した蛍光検出器（G1321A）が備わったSerie HP1100のＨＰＬＣ装置を使用し、システムコントロール及びデータ評価は、HP−Chem−Station（ヒューレットパッカード社）を用いて実施した。分析すべきアミノ酸溶液１μLを、オルトフタルアルデヒド／２−メルカプトエタノール即席試薬（Pierce Europe BV, Oud-Beijerland, Niederlande）２０μｌを用いて自動プレカラム誘導化中で混合した。この場合に生じたチオ置換された蛍光イソインドール（Jones et al., Journal of Chromatography（1983）266：471〜482）を、組み合わされたプレカラム（４０×４mm Hypersil ODS 5）及びメインカラム（Hypersil ODS５）において、非極性相（メタノール）を増やしながら勾配プログラムを使用して分離した。前記カラムは、両方ともＣＳ−クロマトグラフィーサービスGmbH（ランゲルヴェーエ、ドイツ）社のものである。極性溶出液は、酢酸ナトリウム（０．１M；ｐH７．２）であり；流量は０．８ｍL／分であった。誘導化アミノ酸の蛍光検出は、２３０nmの励起波長及び４５０nmの発光波長で行った。Ｌ−オルニチン又はＬ−オルニチンヒドロクロリド濃度は、外部標準と、更なる内部標準であるＬ−アスパラギンと比較することにより計算した。

Ｌ−オルニチンヒドロクロリドのモル質量は、１６８．６ｇ×mol^-1であり、かつＬ−オルニチンは１３２．１×mol^-1である。

収率を計算するために、形成されたＬ−オルニチンの量（Ｌ−オルニチンヒドロクロリドとして測定）を消費されたサッカロースの量で割った。結果は表３に記載されている。

表３：インキュベーション２４時間後（表３Ａ）と４８時間後（表３Ｂ）のＬ−オルニチン形成。略語：＊：ATCC13032＿Delta＿argFRGH；Orn−HCL：Ｌ−オルニチンヒドロクロリド。

例６：プラスミドpEC7LysEのシーケンシングと寄託
プラスミドpEC7LysEは、Dr.Lothar Eggeling（Forschungszentrum Juelich GmbH, D−52425 Juelich）、刊行物Bellmann et al.（Microbiology(2001) 147, 1765〜1774）の相応の著者から水溶液の形で入手可能である。

Invitrogen GmbH社（ペイズリー、UK）の株DH5αの大腸菌コンピテント細胞［サブクローニング効率、遺伝子タイプ：Ｆ−Φ８０lacZΔM15Δ（lacZYA−argF）U169 recA1 endA1 hsdR17（rk−、mK+）phoA supE44 λ−thi−１ gyrA96 relA1）］を製造者の指示に従って形質転換するために、得られたDNA溶液のうち一部を使用した。形質転換体の選択は、５０μｇ／mlカナマイシンで補充しておいたLuria−Bertaniアガール上で行った。

１つの形質転換体はエシェリキア・コリDH5α／pEC7LysE（DM2204）と称され、かつドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）においてブダペスト条約に従って受入番号ＤＳＭ２３２３９として２０１０年１月１５日に寄託してある。

通常のＤＮＡシーケンシング（Walking Service）の範囲内で、MWG Operon GmbH（マルチンスリード、ドイツ）にてＤＳＭ２３２３９株からのｐＥＣ７LysEプラスミドを完全にシーケンス化した。ｐＥＣ７LysEの配列は配列番号２９に挙げられている。

Claims (9)

1. Ｌ−オルニチンを製造する方法において、該方法は以下：
   ａ）Ｌ−オルニチンエクスポーターの活性を有し、かつそのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と≧３５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過剰発現して存在する、コリネバクテリウム属、バシラス属、ストレプトミセス属、アルスロバクター属及び腸内細菌科から成るグループから選択されるＬ−オルニチンを排出する細菌を培地中で発酵し、
   ｂ）Ｌ−オルニチンを前記培地中で蓄積し、その際、発酵ブロスが得られ、かつ
   ｃ）その際、過剰発現については、ＤＳＭ２３２３９に寄託されているプラスミドｐＥＣ７ＬｙｓＥは除外され、
   ｄ）かつ、その際場合により、コードされたポリペプチドの長さは、１４６以上２８６以下のアミノ酸又はアミノ酸残基である
   の工程を行うことを特徴とする、Ｌ−オルニチンを製造する方法。
2. コードされたポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
3. コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）の場合は、過剰発現によってＡＴＣＣ１３０３２又はＡＴＣＣ１４０６７又はＡＴＣＣ１３８６９と比較して、Ｌ−オルニチンの排出活性の高さは少なくとも１０％だけ高まって存在する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 過剰発現は、次のグループ：
   ａ）コピー数を増やすことと、
   ｂ）強力なプロモーターを使用することと、
   ｃ）プロモーターを突然変異させることと、
   ｄ）アクチベータータンパク質を過剰発現させることと、
   から選択される１つ以上の措置によって達成される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
5. 細菌は、コリネバクテリウム、有利にはコリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
6. 次のグループ：
   ａ）α−ケトグルタル酸デドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．４．２）のＥ１サブユニットをコードするｏｄｈＡ遺伝子、
   ｂ）ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．６１）をコードするｓｕｃＡ遺伝子、
   ｃ）ジヒドロジピコリネート−シンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ４．２．１．５２）をコードするｄａｐＡ遺伝子、
   ｄ）ジヒドロジピコリネート−シンターゼ（ＤａｐＢ、ＥＣ１．３．１．２６）をコードするｄａｐＢ遺伝子、
   ｅ）メソ−ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（Ｄｄｈ，ＥＣ１．４．１．１６）をコードするｄｄｈ遺伝子、
   ｆ）ジアミノピメレート−デヒドロカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ，ＥＣ４．１．１．２０）をコードするｌｙｓＡ遺伝子、
   ｇ）Ｌ−アルギニンの生合成のリプレッサー（ＡｒｇＲ）をコードするａｒｇＲ遺伝子、
   ｈ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ，ＥＣ２．１．３．３）をコードするａｒｇＦ遺伝子、
   ｉ）アルギニノコハク酸シンターゼ（ＡｒｇＧ，ＥＣ６．３．４．５）をコードするａｒｇＧ遺伝子、
   ｊ）アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＡＬ）（ＡｒｇＨ，ＥＣ４．３．２．１）をコードするａｒｇＨ遺伝子、
   ｋ）アスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ，ＥＣ２．７．２．４）をコードするｌｙｓＣ遺伝子及び
   ｌ）アスパラギン酸セミアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ，ＥＣ１．２．１．１１）をコードするａｓｄ遺伝子
   から選択される１つ以上の遺伝子を更に弱める、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
7. 更に、次のグループ：
   ａ）ｇｄｈ遺伝子によりコードされるグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．３）、
   ｂ）ａｒｇＪ遺伝子によりコードされるグルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３５及びＥＣ２．３．１．１）、
   ｃ）ａｒｇＢ遺伝子によりコードされるアセチルグルタメートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．８）、
   ｄ）ａｒｇＣ遺伝子によりコードされるＮ−アセチル−γ−グルタミル−ホスフェートリダクターゼ（ＥＣ１．２．１．３８）、
   ｅ）ａｒｇＤ遺伝子によりコードされるアセチル−オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１１）、
   ｆ）ｐｔｓＧ遺伝子によりコードされるグルコース取込み系のグルコース−特異的成分ＥＩＩＢ（ＰｔｓＧ）（ＥＣ２．７．１．６９）、
   ｇ）ｐｔｓＳによりコードされるサッカロース取込み系のサッカロース特異的成分ＥＩＩＢ（ＰｔｓＳ）（ＥＣ２．７．１．６９）、
   ｈ）ｚｗｆ遺伝子によりコードされるグルコース−６−ホスフェート１−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９）、
   ｉ）ｐｇｉ遺伝子によりコードされるグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．９）、
   ｊ）ｐｆｋＡ遺伝子によりコードされるホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１）、
   ｋ）ｆｄａ遺伝子によりコードされるフルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１３）、
   ｌ）ｇａｐ遺伝子によりコードされるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．５９）、
   ｍ）ｐｇｋ遺伝子によりコードされるホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．３）、
   ｎ）ｐｙｋ遺伝子によりコードされるピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、
   ｏ）ａｃｅＥ遺伝子によりコードされるピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニット（ＥＣ１．２．４．１）、
   ｐ）ｐｐｃ遺伝子によりコードされるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３１）、
   ｑ）ｐｙｃ遺伝子によりコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．１）、
   ｒ）ａｃｎ遺伝子によりコードされるアコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）、及び
   ｓ）ｉｃｄ遺伝子によりコードされるイソシトレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４２）
   から選択される１つ以上の遺伝子を更に増強させる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
8. 回分法、流加回分法、繰り返し流加法及び連続的方法のグループから選択される方法である、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
9. Ｌ−オルニチン含有発酵ブロスから、Ｌ−オルニチン又は液体又は固体Ｌ−オルニチン含有生成物を回収する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。

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