KR0161147B1

KR0161147B1 - 오르니틴의 제조방법

Info

Publication number: KR0161147B1
Application number: KR1019950011643A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 정봉현; 최대건; 류욱상; 장형욱; 장순재; 김남학
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR960041371A

Abstract

본 발명은 아르기닌 영양요구성인 브레비박테리움(Brevibacterium)속의 미생물을 이용한 유가식 발효에 의해 오르니틴을 제조하는 방법에 잇어서, 아르기닌을 요구량 이상 첨가한 성장 배지에서 상기 미생물을 배양하여 오르니틴의 생산을 유도한 후, 아르기닌과 인산염 농도를 상기 균주의 아르기닌 영양요구성의 상실을 억제시키는 범위내로 조절되도록 생산용 배지를 공급하며 더욱 배양하는 단계를 포함하는, 생산성이 향상된 오르니틴의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면 65시간의 발효에서 70g/l 이상의 오르니틴을 얻을 수 있다.

Description

오르니틴의 제조 방법

본 발명은 오르니틴의 제조 방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 브레비박테리움 케토글루타미쿰(Brevibacterium ketoglutamicum) KCTC 0141BP를 이용하여 오르니틴을 발효적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

오르니틴은 시트룰린(citrulline), 프롤린과 같이 암모니아에 대한 해독기능을 갖고 잇어 간장질환의 치료제로서 사용되며, 수용액 아미노산 제제에 포함되기도 한다.

오르니틴 생산에 이용되는 미생물로는 자외선 처리등에 의하여 시트룰린 또는 아르기닌 영양요구성 돌연변이주인 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)(교와하꼬공업(주), 일본, 미국 특허 제2,988,489호), 브레비박테리움 락토페르멘툼(B. lactofermentum), 동속 카와사키(B. kawasaki), 동속 플라붐(B. flavum)(아지노모토, 일본 특허공고 제68-8712, 68-8714 및 69-26,910호), 동속 케토글루타미쿰(B. ketoglutamicum), 아스로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus)(교와하꼬공업(주), 미국 특허 제3,574,061호)등이 알려져 있다. 또한 아르기닌이나 시트룰린의 영양요구성 균주인 아스로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium Lactofermentum), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynevacterium glutamicum)(아지노모토(주), 유럽특허 공개 제0 393 708 A2)을 마이코페놀산(mycophenolic acid) 또는 오르니티놀(ornithinol)에 저항성을 갖는 영양요구성 돌연변이주를 선별하여 오르니틴 생산에 사용한다. 상기와 같은 영양요구성 돌연변이주에 의한 오르니틴의 발효생산은 영양요구성 물질의 제한조건하에서 오르니틴 생산이 가장 좋지만, 발효시간 경과에 따라 돌연변이 성질이 회귀된 영양요구성 상실균주가 점차적으로 증가되어 오르니틴의 생산성을 감소시킨다. 이때 돌연변이 성질이 회귀되어 영양요구성이 상실된 균주를 회귀주(revertant)라 한다.

상기 미국 특허 제3,574,061호에서는 영양요구성 돌연변이주인 브레비박테리움 케토글루타미쿰(ATCC 21092)을 탄화수소, 예를 들어, 파라핀을 주요 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 L-오르니틴을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 이 방법에 의하면 오르니틴의 생산성은 4일간의 배양에서 8.6mg/ml로 그다지 높지 않았다.

이에, 본 발명자들은 브레비박테리움 속의 균주를 이용하여 오르니틴을 발효적으로 생산하는데 있어서, 균주의 영양요구성이 상실되는 것을 방지하면서 오르니틴의 생산성을 높이는 방법을 개발하기 위해 연구를 계속한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 돌연변이된 브레비박테리움 속의 균주를 이용한 오르니틴 발효생산에서 오르니틴 생산균주의 안정성을 증가시켜 높은 효율로 오르니틴을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 아르기닌 영양요구성인 브레비박테리움(Brevibacterium)속의 미생물을 이용한 유가식 발효에 의해 오르니틴을 생산하는 데 있어서, 우선 아르기닌을 충분히 첨가한 성장배지에서 상기 미생물을 배양하여 오르니틴의 생산을 유도한 후, 배지중의 아르기닌과 인산염 농도를 균주의 아르기닌 영양요구성의 상실을 억제시킬 수 있는 범위내로 조절한 생산용 배지를 공급하여 더욱 배양하는 단계를 포함하는 생산성이 향상된 오르니틴의 제조 방법이 제공된다.

본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 오르니틴의 제조에 사용할 수 있는 미생물은 아르기닌 영양요구성을 나타내는 브레비박테리움 속의 균주들이며, 브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP는 브레비박테리움 게토글루타미쿰 KCTC 3186을 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 자외선으로 처리한 후 시트룰린을 함유한 최소배지에서 배양하고, 이어서 아르기닌 히드로자메이트를 처리한 후 아르기닌을 함유한 최소배지에서 배양함으로써 얻을 수 있으며, 시트룰린과 아르기닌에 대한 영양요구성을 나타내는 신규 미생물이다.

아르기닌 영양요구성을 나타내는 브레비박테리움 속의 돌연변이 균주를 이용하여 오르니틴를 생산할 때, 아르기닌이 첨가된 배지에서 균주를 배양하여 오르니틴의 생산을 유도한 후, 유가식으로 배양하면서 배지중의 인산염과 아르기닌 농도를 조절하여 균주의 영양요구성의 상실을 억제시킴으로써 오르니틴의 생산성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 방법은, 예를 들어, 다음과 같이 수행할 수 있다. 브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP를 0.5 내지 1% 농도의 효모 추출물, 또는 0.3 내지 0.6% 농도의 카제인 펩톤을 필수적으로 포함하는 배지에서 배양한 후 균체증식 시기에 0.1 내지 0.3%의 아르기닌 용액을 배양액에 첨가하여 오르니틴의 생산을 유도한다. 이때 배양온도는 28 내지 31℃가 바람직하고 배양시간은 10 내지 15시간으로 한다.

균주의 영양요구성의 상실을 억제시키면서 오르니틴의 생산성을 증가시키기 위해서는 배양액중의 아르기닌 농도를 10 내지 30mg/l로 유지하도록 하고 인산염 농도를 5 내지 40mg/l로 유지하기에 적당한 속도로 생산용 배지를 배양액에 가하면서 28 내지 31℃에서 45 내지 60시간 동안 배양을 계속한다.

상기와 같은 본 발명의 방법에 의하면 3일 이내에 약 70g/l 이상의 오르니틴을 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 참조예 및 실시에에 의해 더욱 상세히 설명하고자 하나, 하기 참조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 그에 한정되는 것은 아니다.

[참조예 1]

브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP의 제조

브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 3186(2×10⁸세포/ml)을 2mg/ml의 니트로구아니딘으로 30분간 처리하고 자외선을 4분간 조사한 후 200μg/ml의 시트룰린을 함유한 최소배지(포도당 2%, 인산수소칼륨 0.075%, 인산이나트륨 0.15%, 황산마그네슘 0.04%, 황산암모늄 0.4%, 황산망간 0.005%, 황산철 0.001%, 황산아연 0.001% 및 한천 2%, pH 7.0)에서 배양하였다. 여기에 8mg/ml의 아르기닌 히드로자메이트(arginine hydroxamate)를 처리한 후 균체를 분리하여 200μg/ml의 아르기닌을 함유하는 최소배지에서 배양하였다.

상기 방법으로 시트룰린과 아르기닌에 대한 영양요구성을 나타내는 신규 미생물을 얻었으며, 이를 브레비박테리움 케토글루타미쿰 52로 명명하여 1994년 12월 23일자로 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0141BP로서 기탁하였다.

[참조예 2]

측정 방법

하기 실시예에서 각종 측정 방법은 다음과 같이 수행하였다.

(1) 세고건조량 측정

배양액을 원심분리하여 세포를 수확한 후 등장액으로 세척하고, 80℃에서 건조하여 항량에 도달하였을 때의 무게를 측정하였다.

(2) 오르니틴의 정량법

오르니틴의 생산량은 닌히드린법(Chinard, J. Biol. Chem., 199, 91(1952))을 사용하여 측정하였다.

(3) 아르기닌의 정량법

아르기닌의 양은 알파-나프타놀-디아세틸법(Rosenbey, J. Biochem., 63, 153-159(1956))을 사용하여 측정하였다.

(4) 인산 정량법

인산의 양은 몰리브크로나바나도 인산법(molybdovanado phosphate method, Taussky, H. H., J. Biol. Chem., 202, 675-678(1953))을 사용하여 측정하였다.

(5) 포도당 정량법

포도당의 양은 포도당 분석기(미국 YSI사 제품, 모델 2700)를 이용하여 분석하였다.

(6) 회귀율의 측정

평판 배지상에서 배양할 때 100개 정도의 집락이 관찰되도록 배양액을 적당히 희석한 후, 포도당 2%, 인산수소칼륨 0.075%, 인산이나트륨 0.15%, 황산마그네슘 0.04%, 황산암모늄 0.4%, 황산망간 0.005%, 황산철 0.001%, 황산아연 0.001%, 및 아가 2%(pH 7.0)로 조정된, 아르기닌이 제거된 배지에서 30℃로 72시간 동안 배양하였을 때 관찰되는 집락의 수를 측정하였다. 초기 균수에 대한 회귀주의 발생빈도를 %비율로 표시하였다.

[실시예 1]

브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP를 플라스크 배지(포도당 6%, 효모 엑기스 1%, 인산수소칼륨 0.075%, 인산이나트륨 0.15%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 1.0%, 황산망간 0.005%, 황산철 0.001%, 황산아연 0.001%, 탄산칼슘 0.5%, pH 7.0)에서 30℃로 72시간 동안 배양했을 때, 8.5g/l의 오르니틴이 생산되었다.

[실시예 2 내지 5]

2ℓ의 회분식 배양용 배지(포도당 10%, 효모 엑기스 0.5%, 아르기닌 0.04%, 염화칼륨 0.08%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 1.0%, 황산망간 0.005%, 황산철 0.001%, 황산아연 0.001%, pH 7.0)에 인산이나트륨을 각각 0.1%, 0.4%, 0.8% 및 1.0%로 첨가하고, 접종용 배지(포도당 2%, 효모 엑기스 1.0%, 카제인 펩톤 1.0%, 인산이칼륨 0.5%, 소금 0.5%, pH 7.0)에서 30℃로 24시간 동안 배양한 브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP를 10% 농도가 되도록 접종하였다. 이를 30℃에서 pH 7.0을 유지하면서 48시간 동안 배양한 후 참조예 2에서와 같이 세포 건조량, 오르니틴 생성량 및 회귀율을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

상기 결과로부터 인산이나트륨의 농도가 증가함에 따라 세포 건조량의 변화는 없으나, 인산이나트륨 농도 0.8%까지는 농도가 증가함에 따라 오르니틴의 생산량이 증가함을 할 수 있다. 이는 회귀주가 차지하는 비율이 낮아졌기 때문이다. 한편, 인산이나트륨 농도 1.0%에서는 아르기닌이 균체성장에 제한 조건이 되기 때문에 회귀주의 비율이 오히려 높아져 오르니틴의 생성량도 감소하였다.

[실시예 6 내지 9]

실시예 2 내지 5의 회분식 배양용 배지에서 염화칼륨을 0.15%로, 인산이나트륨을 0.8%로 고정한 배지에 실시예 2 내지 5와 동일한 접종배지에서 30℃로 24시간 배양한 브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP를 10% 농도가 되도록 접종하였다. 상기 배지에서 균체를 15시간 동안 배양한 후, 0.2%, 0.3%, 0.4% 및 0.5% 아르기닌 용액을 시간당 0.6ml씩 첨가하면서 30℃, pH 7.0에서 33시간 동안 더 배양하였다. 배양종료 후 참조예 2에서와 같이 세포건조량과 오르니틴 생성량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2와 같다.

상기 결과로부터 아르기닌 농도가 증가함에 따라 세포건조량은 증가되지만 0.3%보다 높은 아르기닌 농도에서 오르니틴의 생성량이 감소한 것은 최종산물에 의한 대사적 저해가 일어났기 때문이다.

[실시예 10]

실시예 2 내지 5와 동일한 접종배지에서 30℃로 36시간 동안 배양한 브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP를 20ℓ의 성장 배지(포도당 6.0%, 효모 엑기스 0.4%, 인산수소칼륨 0.08%, 인산이나트륨 0.1%, 황산마그네슘 0.03%, 황산암모늄 0.5%, 황산망간 0.0025%, 황산철 0.0005%, 황산아연 0.0005%, pH 7.0)에 10%의 양으로 접종하고 30℃에서 배양하면서 균체증식시기에 0.2%의 아르기닌을 성장 배지내에 첨가하여 14시간 동안 배양한 후, 생산용 배지(포도당 70%, 효모 엑기스 1.0%, 인산수소칼륨 0.45%, 인산이나트륨 1.2%, 황산마그네슘 0.24%, 황산암모늄 6.6%, 황산망간 0.01%, 황산철 0.002%, 황산아연 0.002%, 아르기닌 0.3%, pH 7.0)를 시간당 200ml씩 첨가하여 유가배양하였다. 그 결과, 총 65시간의 발효에서 46g/ℓ의 세포건조량 및 72g/ℓ의 오르니틴을 얻었다. 회귀율은 1%미만이었다.

상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, 아르기닌 영양요구성인 브레비박테리움 케토글루타미쿰 KCTC 0141BP의 배양배지에 아르기닌을 첨가하여 오르니틴의 생산을 유도한 다음, 유가식으로 발효시키면서 첨가되는 배지중의 아르기닌 및 인산염 농도를 적절히 조절하면 회귀율을 최소화하면서 오르니틴의 생산성을 높일 수 있다.

Claims

아르기닌 영양요구성인 브레비박테리움(Brevibacterium)속의 미생물을 이용한 유가식 발효에 의해 오르니틴을 제조하는 방법에 있어서, 균체증식 시기에 0.1 내지 0.3%의 아르기닌 용액을 첨가한 성장 배지에서 상기 미생물을 배양하여 오르니틴의 생산을 유도한 후, 성장 배지내에 아르기닌 농도가 10 내지 40mg/ℓ 및 인산염 농도가 5 내지 60mg/ℓ로 각각 유지되도록 생산용 배지를 공급하면서 더욱 배양하는 단계를 포함하는, 생산성이 향상된 오르니틴의 제조 방법.
상기 미생물이 브레비박테리움 케토글루타미쿰(Brevibacterium ketoglutamic

um) 52(KCTC 0141BP)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 성장 배지에서 상기 미생물을 14 내지 24시간 동안 배양하여 오르니틴의 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생산용 배지중에서의 배양시간이 40 내지 50시간인 것을 특징으로 하는 방법.