JPH04166092A - 発酵法によるｌ―リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関する。Ｌ
−リジンは、必須アミノ酸の１種、かつ穀類の第１制限
アミノ酸であり、ブロイラーや豚の配合飼料に用いられ
る重要なアミノ酸である。

〈従来の技術〉 従来から知られるリジン発酵法では、自然界から分離・
誘導した微生物人工変異株が用いられる。

これら人工変異株の多くは、ブレビバクテリウム属又は
コリネバクテリウム属に属する微生物由来で、栄養要求
性、感受性及びアナグロ耐性等の性質の組合せ又は順次
付加せしめることによりＬ−リジンの生合成系を強化し
たものであることが知られている「アミノ酸発酵」相田
、滝波、千畑、中白、山田編、学会出版センター、１９
８６年、ｐ２７３）。

〈発明が解決しようとする課題〉 Ｌ−リジン住成能を更に向上できる変異株を取得するこ
とを目的とする。　　− 〈課題を解決する為の手段とその効果〉本発明者らは、
ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属に属す
る微生物の中からＬ−リジン生成能の向上した変異株を
取得する為ムこ種々研究した結果、セレナリジン耐性を
付与した変異株の中にＬ−リジンの生成能が向上してい
る微生物を見い出し、本発明はこの知見に基づいて完成
されたものである。すなわち、本発明は、セレナリジン
に耐性を有し、Ｌ−リジン生成能を有するブレビバクテ
リウム属又はコリネバクテリウム属に属する微生物を培
養し、培養液中に生成蓄積するＬ−リジンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−リジンの製造法に関す
る。以下、本発明について詳細に説明する。

本発明でいうセレナリジン（以下、５ｅｌｙｓと記す）
とはリジンと類似の化学構造式を有し、リジンγ位のメ
チレン基がセレン（Ｓｅ）に置換したものである。

本発明で誘導する変異株の親株（以下、親株と記す）の
属は、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属
に属する微生物であれば種、菌株を問わずどのような微
生物でも良い。

例えば、以下に示すようないわゆるコリネ型のＬ−グル
タミン酸生産菌として知られる微生物にＬ−リジン生成
能を付加したものが好適である。

ブレビバクテリウム・テバリカタム　ＡＴＣＣ１４０２
０ブレビバクテリウム・フラバム　ＡＴＣＣ１４０６７
プレビバクテリム・ラクトファーメンタム　ＡＴＣＣ１
３８６９プレビバクテリム・ｌゼウム　ＡＴＣＣ１３８
２５コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム　ＡＴ
ＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣ
Ｃ１５９９０コリネバクテリウム・グ）トタミクム　へ
ＴＣＣ１３０３２更に上述のＬ−リジン生成能を有する
菌株に、Ｌ−アラニン要求生、フルオロピルビン酸感受
性などの性質を付与することによりＬ−リジン生成能が
向上した菌株を親株として使用することもできる。

本発明で言う５ｅｌｙｓ耐性とは、親株に比して明らか
に５ｅｌｙｓ高濃度含有培地で生育できる微生物の性質
をいう。

また、本発明でいう耐性の付与とは、変異誘導により耐
性を付与することをいい、当該方法としては、例えば紫
外線照射又は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（以下、ＮＧと記す）、亜硝酸などの化学
薬剤処理による通常の方法に従えばよい。

本発明の培養に用いる炭素源としては、グルコース、糖
蜜などの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸、エタノー
ルなどのアルコール類が使用できる。

窒素源としては、硫安、硝安、塩安、リン安、尿素、ア
ンモニア水、アンモニアガスその他の通常の窒素源が使
用できる。

有機微量栄養素としては、大豆蛋白酸加水分解物、酵母
エキスなどが使用できる。

本発酵の培養条件は通気培養がよく、発酵温度は３０〜
３５°Ｃ１発酵時間は４０〜１００時間である。培養開
始時及び培養中のｐＨは６．５〜７．０がよく、ｐＨの
調整には、無機又は有機の酸性又はアルカリ性物質、更
には尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどを使用
することができる。

発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常、イオン交換樹
脂法、その他の公知の方法を組合せることにより実施で
きる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

なお、Ｌ−リジンの蓄積値は塩酸塩換算で示し、Ｌ−リ
ジンの定量は酸性−銅ニンヒドリン比色法による。

実施例１ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ＡＴ
ＣＣ１３８６９をペプトン１％、酵母エキスＩ％、Ｎａ
Ｃ１０，５％及びグルコース０，５％を含み、ｐＨを７
．０に調整した培地で生育させ、集菌後ＮＧ２５０Ｊ！
７　ｇ／Ｊ１１ｊ！を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で３０°Ｃにて３０分間処理した。その後、生
残率１．０％の当該菌体を５ｅｌｙｓ　５００μｇ　／
　ｔｎｌを含む最少培地（第１表）の平板寒天培地に播
種し、３０°Ｃ１７日間培養し、生育したコロニーの中
からブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム＾Ｊ１
２５６４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１７０９）を得た。

第１表　最小培地の組成 硫酸アンモニウム　　　　　　　１０ｇ／ｆ！ＫＨ２Ｐ
Ｏ４１ｇ／ｌ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，４ｇ　／　ｊ２ＦｅＳＯ＜　
　・７Ｌ０　　　　　　　　　１０　ｔｎｇ／　ＥＭｎ
ＳＯ４’　４Ｈｚ０　　　　　　　　　１０■／Ｉ！。

ビオチン　　　　　　　　　　　　５０μｇ／ｌサイア
ミン塩酸塩　　　　　　１００μｇ／ｌ第２表　し−リ
ジン生産培地 成分　　　　　　濃度 グルコース　　　　　　　　　　１０ｇ／ｄｆ硫酸アン
モニウム　　　　　　４．５ｇ／ｄｆｆｉＫｌｌｚＰＯ
４ｏ、　１　ｇ　／　ｄ　ｆｆ１Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０
０，０４ｇ／ｄ　Ｉ！。

Ｐｅ５Ｏａ　　７Ｈｚ０　　　　　　　　１．０■／ｄ
ｆｆｉＭｎＳＯ４・４Ｈ２０１，Ｏｍｇ／　ｄ　Ｉ！。

ビオチン　　　　　　　　　　　５，０μｇ／ｄ　ｆｆ
ｉサイアミン塩酸塩　　　　　　２０μｇ／ｄ　ｆｉ（
ｐＨ７，０） 次に、Ｌ−リジンの発酵生産に際し、第２表に示したＬ
−リジン生産培地を調製し、５００ｍ容の振とうフラス
コに２０＃１１ｉずつ分注した。１１５°Ｃで１０分加
熱殺菌後、あらかじめ乾熱殺菌した炭酸カルシウムＩｇ
を加えた。この培地にＩＩＪＩ２５６４を接種し往復振
とう機により３１．５°Ｃ１７２時間培養した。発酵液
中に蓄積したＬ−リジン（塩酸塩換算）の定量値を第３
表に示す。５ｅｌｙｓ耐性株では親株に比べて顕著なＬ
−リジン蓄積の増大が認められた。

実施例２ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム＾ＴＣＣ１
３８７０を実施例１と同様にＮＧによる変異処理を行い
、５ｅｌｙｓ耐性株としてコリネバクテリウム・アセト
アシドフィラムＡＪ１２５６５（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１７
１０）を得た。ＡＴＣＣ１３８７０とＡＪ１２５６５を
実施例１と同じ方法で培養し、Ｌ−リジンの生成能を調
べ第４表に示す結果を得た。

実施例３ Ｓ−（２−アミノエチル−）Ｌ−システィン耐性のリジ
ン生産菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＪ３４２４（ＦＥｌ？Ｍ　Ｐ−１７１１）を実施例１
と同様の変異処理を行い、５ｅｌｙｓ耐性株としてブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２５６６
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１７１１）を得た。ＡＪ３４２４と
八Ｊ１２５６６を実施例１と同じ方法で培養してＬ−リ
ジンの生成能を調べ第５表に示す結果を得た。ＡＪ１２
５６６はＡＪ３４４５に比較して２０．３％生産量が向
上した。

実施例４ Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システィン耐性のリジ
ン生産菌、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ３４
６３（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９８７）を実施例１と同様の変
異処理を行い５ｅｌｙｓ耐性株としてコリネバクテリウ
ム・グルタミクムΔＪ１２５７９（ＦＥＲＭ　Ｐ−ｔ／
２ｏ７）を得た。ＡＪ３４６３とＡＪ１２５７’ｌを実
施例１と同じ方法で培養し、Ｌ−リジンの生成能を調べ
、第６表に示す結果を得た。

第６表 実施例５ フ゛レビパクテリウム・フラバムＡＪ１１８４１　（Ｆ
ＥＲＭＰ−６４６３）に実施例１と同様の変異処理を行
い、５ｅｌｙｓ耐性株としてブレビバクテリウム・フラ
バムＡＪ１２５６８（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１７４１）を得
た。

ＡＪ１１８４１とＡＪ１２５６８を実施例１と同じ方法
で培養し、Ｌ−リジンの生成能を調べ、第７表に示す結
果を得た。

第７表 実施例６ フ゛レビバクテリウム・フラバムＡＪ１１８４１　とＡ
Ｊ１２５６８を 第８表　種培養培地組成 成分　　　　　濃度 グルコース　　　　　　　　　　　　１．５％酢酸アン
モニウム　　　　　　　　０．３％尿素　　　　　　０
．１％ ＫＨ２ＰＯ４０，１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４％ Ｍｎ”　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｐｐｍＦ
８＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　２　ｐｐｍビ
オチン　　　　　　　　　　　５０μｇ／ｌサイアミン
塩酸塩　　　　　２００μｇ　／　Ｉ１第９表　主培養
培地組成 グルコース　　　　　　　　　　　　１０％硫酸アンモ
ニウム　　　′３．０％ Ｋ）１２Ｐ０４０．１％ ＭｇＳＯ４・７１１２０　　　　　　　　　　　　０．
０４％ｐｃ＋＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２ｐｐｍＭｎ◆÷　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２　ｐｐｍビオチン　　　　　　　　　　
　５０μｇ／／２サイアミン塩酸塩　　　　　　６０μ
ｇ／１（ｐＨ７，５） それぞれスラント上より１白金耳かきとり第８表に示さ
れる種培養培地５０ｄに接種し、１８時間、３１．５°
Ｃにて通気撹拌培養を行なって種培養液を調製した。

一方、１！容小型ガラス製ジャーファーメンタ−に第９
表に示される主培養培地を３００ｄ分注し、これらに上
記の種培養液をそれぞれ１５ｍ！宛、接種し３１．５　
”Ｃにて通気毎分１／１容の撹拌培養を行なった。

培養液中にグルコースと硫安の混合液 （グルコース：硫安の混合液は１０：１、混合液のグル
コース濃度は４０％）を培地のｐ！１を７．０〜８．０
の間に保持しつつ、連続的にあるいは間けつ的に添加し
て３１．５°Ｃで７２時間培養を行なった。その結果を
第１Ｏ表に示した。

〈発明の効果〉 このようにして本発明の５ｅｌｙｓ耐性株を培養すると
、親株に比べてＬ−リジンが培養液中に顕著に増大して
蓄積する。これにより工業生産段階においても大幅なコ
スト・ダウンが期待できるものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. セレナリジンに耐性を有し、Ｌ−リジン生成能を有する
   ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属す
   る微生物を培養し、培養液中に生成蓄積するＬ−リジン
   を採取することを特徴とする発酵法によるＬ−リジンの
   製造法。