SU440848A1 - Способ получения l-лизина - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности.

Известен способ получени  L-лизина путем культивировани  продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и азота ацетатные ионы и необходимые дл  синтеза питательные соли с последующим выделением L-лизина.

Предлагаемый способ увеличи-вает выход аминокислоты.

Достигаетс  это тем, что из рода Brevibacterium используют штамм flavum АТСС 21129.

При этом концентрацию ионов ацетата в среде поддерживают равной 1,5 вес. %, а рН среды 7,0-8,5.

Дл  получени  L-лизина из культуральной среды по предлагаемому способу в качестве источника углерода используют соли уксусной кислоты, такие как ацетат кали , ацетат натри , ацетат аммони  и ацетат кальци , или уксусную кислоту, а в качестве источника азота - мочевину, аммиак или соли аммиака, такие как хлористый аммоний, сульфат аммони  и карбонат аммони .

Ацетат аммони  примен ют в качестве вещества , которое одновременно служит источником углерода и азота.

Кроме источников углерода и азота добавл ют сооответствующее количество минеральных составл ющих, витаминов или витаминосодержащих веществ дл  окончательного формировани  среды. В качестве таких веществ используют витамины HI, биотин, дрожжевые экстракты, жидкость после вымачивани  зерна, белковый гидролизат из соевых бобов , рыбную муку, вываренную рыбную муку, гидролизат казеина.

Микроорганизмы, которые способны к выделению L-лизина в среде, содержащей ацетатные ионы в качестве источника углерода, щироко распространены. Такие микроорганизмы получают в виде мутантов, имеющих определенные биохимические характерные особенности , которые известны в процессах ферментативного получени  L-лизина, использующего карбогидраты в качестве основного источника углерода.

Микроорганизмами, которые могут продуцировать L-лизин, использу  ацетатные ионы в качестве основного источника углерода,  вл етс  например: Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium ammoniagenes, Corynebacterium acetoacidophilum , Micrococcus glutamicus u Arthrobacbtcr atreus. Способ заключаетс  в следующем. На первой стадии микроорганизмы высевают на исходную среду, содержащую вместе с ацетатными ионами в количестве меньше 4% (предпочтительно менее 2%) и провод т аэробное выращивание микробов при перемешивании . Так как прибавленные в начале ацетатные ионы в исходной среде ассимилируютс  -по мере инкубации, iB среду во врем  выращивани  бактерий непрерывно или -периодически ввод т ацетатные ионы вместе с источником азота. Введение ацетатных ионов во врем  культивации ведут так, чтобы концентраци  ацетатных ионов в среде не превышала 1,5%, и чтобы значение рН культивируемой среды было от 7-8,5. Дл  установлени  концентрации ацетатных ионов и рН в среде используют раствор из смеси уксусной кислоты и ацетата аммони  соответственно 1 : 0,5-0,75, предпочтительно 1 :0,1-0,5. Когда раствор из смеси с указанным мол рным соотношением подают в среду, поддержива  в ней значение рН между 7,0-8,5, концентраци  ацетатных ионов в среде не превышает 1,5 вес. %. Если содержание ацетата аммони  в растворе смеси больше этих значений, концентраци  остаточной уксусной кислоты в культуральной среде увеличиваетс  и соответственно продуцирование L-лизина замедл етс . И наоборот, когда это содержание меньше, соотношение между углеродом и азотом в среде становитс  неподход щим дл  продуцировани  L-лизина. В тех случа х, когда источник азота, такой как газообразный аммиак, водный раствор и мочевину подают отдельно, -провер ют рН среды дл  того, чтобы оно имело значение между 7 и 8,5 и концентрацию ацетатных ионов дл  получени  хорошего выхода L-лизина. Дл  увеличени  выхода L-лизина в культуральную среду ввод т карбогидраты вместе с ацетатными ионами в виде их смеси. Обшее количество добавл емых в среду карбогидратов во врем  ферментации находитс  в пределах 20% (предпочтительно 5-il5%), исход  из расчета общего количества адетатных ионов, добавл емых в среду. Извлечение L-лизина из питательной среды ведут известными способами, например при помощи ионообменных смол. Пример 1. Brevibacterium flavum АТСС 21129 высевают на культуру (рН 8) следующего состава: Гидролизат крахмала (рас-1,5% считанный по глюкозе) Ацетат аммони 0,3% КН2РО40,1% MgSO4-7H2O0,04% Fe++2 ррт Мп++2 ррт Белковый гидролизат из сое-3 ррт вых бобов DL-метионин10 мг/дл Биотин50 у1л. Витамин Bi-HCl200 Y/Л. Инкубацию ведут в течение И час при 31,5°С в аэробных услови х. Основную культуральную среду ввод т в стекл нные ферменторы-качалки небольшого размера порци ми по 300 мл. Все порции стерилизуют при 110°С в течение 10 мин. Основна  культуральна  среда (рН 6,5) имеет следующий состав: Ацетат аммони 1,2% КН2Р040,2% MgSO4-7H200,04% Fe++2 ррт Мп++2 ррт Белковый гидролизат из сое- 4 мл/дл вых бобов L-треонин15 мг/дл LL-метионин30 мг/дл Биотин50 Y/л Витамин Bi-HCl40 -у/л Мочевина0,2%. 15 мл обсемененного .питательного бульона добавл ют к основной культуральной среде в ферменторе и ведут инкубацию при 31,5°С, перемешива  среду со скоростью 1350 об/мин при аэрации в том же объеме в 1 мин, что и дл  бульона. После 5 час .культивировани  значение рН культуральной среды становитс  равным приблизительно 8,2. Автоматически подают водный раствор, содержащий уксусную кислоту в количестве 40% и газообразный аммиак, сохран   концентрацию уксусной кислоты в среде ниже 1,5 вес. % и значение рН между 7,5 и 8. Таким образом, в 48 час культуре накапливаетс  4,34 г/дл L-лизина (эквивалентно 25,2 вес. % относительно всего количества используемой уксусной кислоты ). Количество уксусной :кислоты, введенное в среду, составл ет 17% по весу от количества исходной среды. Из 390 мл питательного бульона получают 13,7 г неочищенного кристаллического L-лизина . Пример 2. Основную культуральную среду ввод т в п ть стекл нных ферменторовкачалок небольшого размера порци ми по 300 мл соот1ветственно. Все порции стерилизуют при 110°Св течение 10 мин. Обсемененный культуральный бульон в количестве 15 мл, приготовленный тем же способом, что и в примере 1, добавл ют в основную культуральную среду в каждом стекл нном ферменторе. Инкубацию ведут при перемешивании (1350 об/мин) в услови х аэрации в том же объеме, что и дл  бульона. Основна  культуральна  среда (рН 6,5) имеет следующий состав: Ацетат аммони 1,2% Гидролизат крахмала (рас- 1 % считанный по глюкозе) Сульфат аммони 0,7% КН2Р040,2% MgS04-7H200,04% Fe++2 ppm Mn++2 ppm Белковый гидролизат из сое- 4 мл/дл вых бобов L-треонин15 мг/дл DL-метионин30 мг/дл Биотин50 Y/л Витамин Bi-HCl40 Y/Л Мочевина0,2%. Когда значение рН среды становитс  равным .приблизительно 8,2 после 5 час культивации , растворы смесей из уксусной кислоты и ацетат аммони  (концентраци  уксусной кислоты в растворе 60%), имеющие мол рные соотношени , приведенные в табл. 1, ввод т в каждый ферментор до тех тор, пока значение рН среды не становитс  равным приблизительно 7,6. Раствор добавл ют автоматически , когда значение рН среды возрастает до 7,7. Добавление смешанного раствора прекраш ,ают дл  46 час культуры, и далее ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (48 час в обш,ем). Выход L-лизина в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 1. Таблица 1 DL-метионин30 мг/дл Биотин50 Y/л Витамин Bi-HCl40 Y/Л Мочевина0,2%. Обсемененный культуральный бульон Brevibacterium flavum АТСС 21129 в количестве 15 мл, который готов т так же, как в примере 1, добавл ют к основной культуральной среде в ферменторе-качалке. Инкубацию ведут при 31,5°С при скорости перемешивани  1400 об/мин с посто нной степенью аэрации. После 5 час культивировани  рН культуральной среды становитс  равным приблизительно 8,2. Поэтому в каждой ферментер начинают подачу раствора (концентраци  уксусной кислоты в растворе 60%), состо щего из смеси растворов уксусной кислоты и ацетата аммони  с мол рным соотношением 1 : 0,25 и гидролизата крахмала (рассчитанного по глюкозе ) возрастающей концентрации (см. табл. 2). Раствор подают в каждый ферментор - качалку до рН 7,5. Подачу раствора повтор ют автоматически, если рН среды увеличиваетс  приблизительно до 7,7. Добавление этого раствора прекращают дл  58 час культуры и затем ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (в сумме 60 час). Выход L-лизина в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 2. Таблица 2