KR890003710B1 - 발효법에 의한 l-글루타민산의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

발효법에 의한 L-글루타민산의 제조방법

본 발명은 발효법에 의한 L-글루타민산의 제조방법에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 탄소원으로 사탕수수 당밀(Cane Molasses, 이하 CM이라 칭함), 사탕무우 당밀(Beet Molasses, 이하 BM이라 칭함) 및 원당(Raw Sugar)을 혼합사용하므로써 CM 또는 BM을 단독으로 사용하는 경우보다, 높은 수율로 L-글루타민산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 L-글루타민산의 발효에 있어서, 보다 높은 수율을 얻기 위해서는 배지중의 비오틴(Biotin) 또는 비오틴활성 물질을 증식에 필요한 양이하로 제한하여야 할 필요가 있어, CM(비오틴 함유량 : 0.4-1.2mg/kg), BM(비오틴함유량 : 0.02-0.08mg/kg)과 같이 비오틴을 다량 함유한 물질을 탄소원으로 하여 L-글루타민산 생산균을 이용한 발효법으로 L-글루타민산을 생산하는 경우에 있어서는 항생물질 또는 계면 활성제등의 비오틴활성억제제를 배양중 적당한 시기에 배지에 첨가하여 L-글루타민산 발효를 진행시키는 방법이 널리 행해지고 있다.

본 발명자들은 CM과 BM 및 원당을 1 : 1 : 3 내지 1 : 1 : 6까지의 범위의 비율이 되도록 혼합 사용하는 경우 종전에 비하여 보다 높은 수율로 L-글루타민산을 생산할 수 있다는 사실을 알고, 탄소원 각각의 특징을 적절히 활용하는 방법에 대하여 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 완성하게 되었다.

즉, 본 발명자들은 L-글루타민산 생산균의 유가배양(Fed-Batch Culture)에 있어 증식 초기에는 균을 증식시키기에 용이한 각종의 영양물질이 적당히 함유되도록 일정량의 CM과 원당을 배지에 혼합사용하여 균의 배양을 행하고, Feed당에 사용되는 탄소원은 L-글루타민산의 생성에 유리하도록 일정량의 BM과 원당을 혼합사용하므로서 CM과 BM을 각각 유일의 탄소원으로 사용하는 경우보다 현저히 높은 수율로 L-글루타민산을 얻는 것이 가능함을 밝혀내었다.

좀더 상세히 본 발명을 설명하면, 당일 및 원당을 주탄소원으로 하는 배지에 L-글루타민산 생산능을 가진 세균을 배양하고, 배양초기 내지 대수증식기 말기까지의 적당한 시기에 비오틴활성억제제로서 항생물질 또는 계면활성제를 첨가하여 배양을 계속하여 배지중에 생성 축적된 L-글루타민산을 채취하는 L-글루타민산의 제조법에 있어서, L-글루타민산의 생산에 필요한 균체의 확보를 위한 대수증식기 말기 이전에는 증식력이 왕성한 적정량의 균체를 확보키 위해 균체 증식에 필수적인 비오틴 및 기타 미량 영양원을 상당량 포함하는 배기가 요구되고, 대수증식기 말기 이후의 L-글루타민산 생성기에는 L-글루타민산 생성에 유리하도록 비오틴을 최소량으로 역제해줌과 동시에 균체의 L-글루타민산 생산능력 및 생균체의 활성역가 유지에 필요한 생체유지에너지의 생합성에 요구되는 최소한의 영양분을 공급해줄 필요성이 있다는 사실에 근거하여, 증식초기에 사용되는 배지(본 배지)에는 비오틴의 함유량이 비교적 높고 기타 영양원도 다량 함유하고 있는 CM과 비오틴을 전혀 함유하고 있지 않는 원당을 증식 및 L-글루타민산 생산역가가 우수한 균체 확보에 최적 상태가 되도록 혼합 사용하되, CM : 원당의 사용비가 1 : 1-4 : 1이 되도록 조정하여 주고, L-글루타민산의 주생성시기인대수증식기 말기 이후에 사용되는 Feed 당에는 L-글루타민산 생산능력이 활발하고 균체의 활성역가 유지에 필요한 생체유지에너지의 생합성에 필요한 최소한의 영양분을 공급해줄 수 있도록 비오틴의 함유량이 비교적 낮고, PCA(Pyrrolidone Carboxylic Acid)를 4-5%(w/w)함유하고 있어 고수율로 L-글루타민산의 생성이 가능한 BM과 원당을 L-글루타민산의 생성축적에 최적 상태가 되도록 혼합사용하되, CM : 원당의 사용비가 1 : 4-3 : 7이 되도록 조정하여 줌으로써 높은 수율로 L-글루타민산을 생산해 낼수 있다는 것이다.

이 경우, L-글루타민산 발효에 이용된 탄수원 CM : BM : 원당의 사용비는 1 : 1 : 3 내지 1 : 1 : 6의 비율이 된다.

결론적으로, 본 발명은 발효법에 의한 L-글루타민산의 제조방법에 있어서 탄소원으로서 CM, BM 원당을 1 : 1 : 3 내지 1 : 1 : 6이 되도록 혼합사용하되, 배양초기에 이용되는 배지(본배지)에는 CM과 원당을 1 : 1 내지 4 : 1의 비율이 되도록 조정하여 주고, 대수증식기 말기 이후에 사용되는 Feed 당에는 BM과 원당을 1 : 4-3 : 7의 비율이 되도록 조정하여 주어 고수율로 L-글루타민산을 생성 축적시키는 것을 요지로 한다.

본 발명에 사용된 L-글루타민산 생산균은 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속의 비오틴 요구성주로써, 예를 들면, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020, 브레비박테리움 사카로리티컴 ATCC 14066, 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 및 코리네박테리움 아세토애시도피룸 ATCC 13870 등이다.

본 발명에서 사용된 탄소원은 CM, BM, 원당이나, Hightest 당밀이나 전분 당화액등도 동일한 효과를 갖는 것으로 사용가능하다.

또한 질소원으로는 유안, 암모니아가스, 요스 등에 보조적 질소원으로 사용가능한 유기질소원인 대두박단백가수분해액, CSL(Corn Steep Lipuor)등이 사용가능하다.

탄소원, 질소원 이외의 무기물질로서 인산염, 마그네슘염, 및 철이온, 망간이온을 미량 첨가하였으며, 타아민 등의 미량 영양소를 필요에 따라 적절히 사용하였다.

본 발명에 있어서 사용된 비오틴 활성억제제로는 페니실린 G, F, K, O, V, X 등의 각 페니실린제 및 폴리옥시에칠렌 소르비탄 모노팔미테이트산, 폴리옥시에칠렌 소로비탄 모노스테아레이트산 등 비이온성 계면활성제가 사용되었다.

배양은 호기적 조건하에서 행하였고, 배양온도는 30-40℃ 배양중 pH는 6-8로 조절하였다.

Feed당의 첨가 방법은 배양도중 배양액중의 당농도가 10-20g/l가 되는 싯점에서 연속적 또는 간헐적으로 5-6회 축차 첨가하였다.

본 발명에서 대수증식기 말기라고 하는 의미는 L-글루타민산을 생성하는데 필요한 규체량이 될때까지의 시기를 말하며 균체의 생육이 미증하고 L-글루타민산이 배지중에 축적되기 시작하는 시기는 포함되지 않는다.

[실시예 1]

CM, BM 및 원당이 혼합사용비율을 변화시켜 환원당으로서 100mg/ml, KH₂PO₄10mg/ml, MgSO₄·7H₂O, 0.4mg/ml, FeSO₄·7H₂O 1mg/dl, MnSO₄·4H₂O 1mg/dl, 티아민 염산염 10㎍/dl(pH7.0)의 조성을 갖는 배지를 조제하여, 그 1.5L씩을 5L용 쟈-퍼멘트에 넣고 120℃에서 20분간 가열살균하였다.

이 배지에 브레비박테리룸 풀라붐 ATCC 14067을 접종하고 31.5℃에서 통기 교반 배양을 행하였다. 배양개시후 5시간 후에 페니실린 G를 1.0unit/ml의 농도가 되도록 첨가하였다.

배양중에는 암모니아가스를 쟈-퍼멘터에 적절히 첨가하여, 배양액을 pH 7.8을 유지하였다.

배양액중의 당농도가 1-2%(w/v)가 되면 CM, BM 및 원당의 혼합사용비율을 변화시켜 미리 조제된 Feed당을 축차적으로 첨가하여 30시간 배양후 발효를 종료하였다.

배양액중에 축적된 L-글루타민산을 정량하고 대당 수율을 계산하여, 그 결과를 표1에 표시하였다.

[실시예 2]

CM, BM 및 원당이 혼합사용비율을 변화시켜 환원당으로서 100mg/ml, KH₂PO₄10mg/ml, MgSO₄·7H₂O, 0.5mg/ml, FeSO₄·7H₂O 1mg/dl, MnSO₄·4H₂O 1mg/dl, 티아민 염산염 10㎍/dl(pH 7.0)의 조성을 갖는 배지를 조제하여, 그 13L씩을 30L 쟈-퍼멘트에 넣고 120℃에서 15분간 가열살균하였다.

이 배지에 브레박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869를 접종하여 31.5℃에서 통기 교반 배양을 행하였다. 배양 개시후 6시간후에 폴리옥시에칠렌 모노팔메테이트산을 1mg/ml의 농도가 되도록 첨가하였다.

기타의 방법은 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

배양액중에 축적된 L-글루타민산을 정량하고, 대당수율을 계산하여그 결과를 표2에 표시하였다.

[실시예 3]

실시예2와 동일하게 준비된 배지에 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032를 접종하여 실시예2와 동일하게 배양하였다.

배양액중에 축적된 L-글루타민산을 정량하고, 대당수율을 계산하여 그 결과를 표 3에 표시하였다.

Claims (2)

1. L-글루타민산 생산균을 배양하는 배지의 탄소원으로서 사탕수수 당밀, 사탕무우 당밀 및 원당을 혼합사용하되, 그 사용비율을 1 : 1 : 3 내지 1 : 1 : 6까지의 범위로 하여 글루타민산 생산균을 배양함을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-글루타민산의 제조방법.
2. 1항에 있어서, L-글루타민산의 배지중 배양초기의 배지는 사탕수수 당밀과 원당을 1 : 1 내지 4 : 1의 비율로 혼합 사용하고 균체의 대수증식기 말기 이후에 사용되는 Feed 당은 사탕무우 당밀과 원당을 1 : 4 내지 3 : 7의 비율로 혼합 사용함을 특징으로 하는 방법.