BR112012024799B1 - processo para a produção de l-ornitina por fermentação - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-ORNITINA POR FERMENTAÇÃO. A presente invenção refere-se a um método para a produção de L-ornitina através por fermentação usando micro-organismo, que é caracterizado por uma exportação aumentada do aminoácido.

Description

Técnica anterior

[001] A presente invenção refere-se a L-ornitina é conhecida por sua ação estimulatória com relação à função hepática e é frequentemente utilizada como um ingrediente de medicamentos e em nutrição esportiva.

[002] Nos dias de hoje, a L-ornitina é preparada por vários processos. Um método é a preparação fermentativa com o auxílio de micro-organismos. Outro método é a hidrólise alcalina de arginina, por exemplo, com hidróxido de bário (CN 1594282 A). Outro método é a biotransformação de arginina por micro-organismos imobilizados que possuem uma atividade de arginase (KR589121B1). Um método de preparar L-ornitina a partir de L-citrulina também foi descrito na literatura de patentes (JP 42007767 B4).

[003] Micro-organismos que são diferenciados por excretarem L- ornitina no meio de cultura foram descritos na literatura. Exemplos dos ditos micro-organismos são bactérias dos gêneros Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus (JP 43010996 B4, JP 57041912 B), Escherichia (US 3668072 A), Providencia (JP 03195494) ou Arthrobacter (US 3574061).

[004] Os micro-organismos produtores de L-ornitina são frequentemente diferenciados por serem auxotróficos para os aminoácidos L- arginina ou L-citrulina (descritos para Brevibacterium, Bacillus, Corynebacterium em EP 392708 B1 e KR 161147 B1 e para Escherichia em US 366072 A). Além disso, foram descritos micro-organismos que são resistentes à 2-tiazol-alanina, sulfaguanidina ou 2- fluoropiruvato (publicação japonesa aberta à inspeção pública n° 61- 119194). O documento EP 0393708 B1 descreve produtores de L- ornitina que são diferenciados por uma menor resistência ao ornitol e ao ácido micofenólico. As ditas propriedades podem, também, estar em uma forma combinada.

[005] A liberação de aminoácidos básicos como L-lisina, L- arginina e L-ornitina através de difusão passiva a partir da célula é muito fraca (Bellmann et al.(Microbiology 2001; 147: 1765-74)). Isto foi bem descrito para a lisina, a título de exemplo. Vrlijc et al. (Journal of Bacteriology 1995; 177(14): 4021-7) estudaram uma pluralidade de mutantes de Corynebacterium glutamicum deficientes na exportação. Para um mutante, uma concentração intracelular de 174 mM de L- lisina foi medida, enquanto um valor de apenas 0,7 mM foi medido ex- tracelularmente.

[006] Vrlijc et al. (Molecular Microbiology 1996; 22(5): 815-26 e Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 1999; 1: 327-336) e EP 0868527 B1 identificaram e descreveram um novo exportador como exportador de L-lisina (LysE). Um mutante null para LysE definido não era mais capaz de transportar L-lisina para fora da célula. O polipeptídeo codificado pelo gene lysE tem 233 aminoácidos ou resíduos de aminoácido de comprimento e é representado na SEQ ID No. 2. Após a superexpressão do gene lysE em um produtor de lisina, um aumento na excreção de L-lisina foi observada.

[007] Von Bellmann et al.(Microbiology 2001; 147: 1765-74) caracterizaram em mais detalhes o exportador de LysE com relação ao transporte de vários aminoácidos básicos em C. glutamicum. Os autores demonstraram que o transportador exporta especificamente os aminoácidos L-lisina e L-arginina para fora da célula. Os autores ainda investigaram se a LysE também exporta L-ornitina para fora da célula. Para este propósito, primeiramente, uma cepa de C. glutamicum auxo- trófica para L-arginina chamada de ATCC13032::argF foi preparada.

[008] A cepa foi cultivada em 50 ml (cultura em batelada) de um meio mínimo chamado de CGXII, que continha 40 g/L de glicose. Após um período de incubação de 24 horas 60 mM de L-ornitina, correspondendo a 7,9 g/L, foram medidos. Intracelularmente, uma concentração de L-ornitina de aproximadamente 200 mM foi medida nas células da dita cepa ao longo de um período de incubação de aproximadamente 70 minutos. De modo a esclarecer se LysE também transporta L- ornitina para fora da célula, a cepa 13032::argF foi transformada com o plasmídio replicativo pEC7lysE. Esta medida foi destinada a proporcionar à cepa uma atividade de LysE aumentada, permitindo, assim, que a cepa transporte L-ornitina para dentro do meio a uma taxa mais elevada de exportação. Entretanto, a dita medida não aumentou a taxa de exportação de L-ornitina. A mesma taxa de exportação (0,6 nmol min1 (mg de massa seca)’1) foi determinada para a cepa de controle (13032::argF) e no transformante (13032::argF, carregando pEC7lysE). A partir disto, os autores concluíram que a L-ornitina não é exportada pelo exportador de LysE. Eles ainda chegaram à conclusão de que deveria haver outra função de exportação desconhecida (proteína de exportação) para a L-ornitina em Corynebacterium glutamicum (Bellmann et al., 2001, página 1771, figura 5b e página 1772, linhas 21 a 28).

[009] Uma LysE variante (consulte a SEQ ID No. 4) foi identificada em C. glutamicum R, a qual difere da sequência de aminoácidos do exportador de LysE da cepa ATCC 13032, mostrada na SEQ ID No. 2, por uma terminação N prolongada por três resíduos de aminoácido. A sequência dos ditos resíduos de aminoácido é: metionina, valina, iso- leucina (MVI). Este polipeptídeo de LysE da cepa R foi descrito em EP 1266966 B1 como uma variante que difere da proteína selvagem na formação de uma região de alça, ou mais especificamente, não pode mais formar a dita alça e é, portanto, capaz de realizar a exportação aprimorada da L-lisina e da L-arginina.

[0010] Outra variante de LysE foi descrita por Gunji e Yasueda (Journal of Biotechnology 127, 2006, 1-13). Os autores estavam interessados na formação de L-lisina pela bactéria obrigatoriamente meti- lotrófica, Methylophilus methylotrophus. Eles transformaram M. me- thylotrophus com um plasmídio chamado de pSE que continha o gene de lysE ATCC13869 de C. glutamicum de modo a melhorar a formação de lisina por M. methylotrophus. Entretanto, os autores descobriram que eles eram capazes de estabelecer apenas uma forma mutada do gene lysE (lysE24) de uma forma estável em M. methylotrophus. A fase de leitura aberta do gene lysE foi deslocada no alelo de lysE24 devido à inserção de um resíduo de timina, resultando na terminação da fase de leitura após 432 bp. A fase de leitura truncada codifica uma proteína LysE que é mais curta por 92 resíduos de aminoácidos na terminação C do que a proteína LysE selvagem de C. glutamicum ATCC13869. Ela tem 141 resíduos de aminoácido de comprimento. Além disso, os últimos 6 aminoácidos C-terminais da proteína truncada (resíduos 135 a 141) diferem dos aminoácidos da sequência de aminoácidos de LysE selvagem. Uma cepa de M. methylotrophus transportando o alelo de LysE modificado em um plasmídio (pSE24) foi testado para a formação de lisina. Para isto, a cepa foi testada em 0,3 L de um meio mínimo chamado de SEIIc sob a forma de uma cultura em batelada alimentada por 50 horas. Os autores observaram que o trans- formante também formou pequenas quantidades (0,07 mM que correspondem a 11,8 mg/L) de L-ornitina, em adição a 0,55 mM de L- lisina e 0,19 mM de L-arginina. Conforme explicado pelos autores, esta formação observada de L-ornitina é causada por uma especificidade de substrato alterada do transportador mutado ou possivelmente por um conjunto de L-arginina intracelular alterado da cepa. EP 1266966 B1 (inventores: Gunji e Yasueda) descrevem a ação positiva do transportador de LysE24 sobre a excreção de L-lisina e L-arginina.

Objeto da invenção

[0011] É um objeto da invenção fornecer um novo processo para a preparação fermentativa de L-ornitina.

Descrição da Invenção

[0012] A invenção se refere a um processo para a preparação de L-ornitina, caracterizado pelo fato de que as seguintes etapas são executadas: a) fermentação de uma bactéria que excreta L-ornitina selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter e a Enterobacteriaceae que superexpressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um exportador de L-ornitina e cuja sequência de aminoácidos é pelo menos (>) 35%, > 40%, > 50%, > 55%, £ 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85%, > 90%, > 92%, > 94%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99% ou 100%, de preferência, > 70%, particularmente, de preferência, > 90%, muito particularmente, de preferência, £ 96% e, com a máxima preferência, 100%, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2, em um meio, b) acúmulo da dita L-ornitina no dito meio, em que um caldo de fermentação é obtido, c) em que o plasmídio pEC7lysE, depositado em DSM23239, não é usado para superexpressão, d) e em que o comprimento do polipeptídeo codificado, quando adequado, é > 146 a < 286 de aminoácidos ou resíduos de aminoácido.

[0013] Preferência é dada para selecionar faixas de comprimento do grupo consistindo em > 171 a < 286, > 196 a < 261, > 203 a < 258, > 218 a < 243, > 228 a < 236, e £ 228 a < 233 aminoácidos ou resíduos de aminoácido.

[0014] É dada particular preferência às faixas de comprimento > 203 a < 258, > 218 a < 243, > 228 a < 236, e > 228 a £ 233, e é dada preferência muito particular às faixas de comprimento £ 228 a < 236 e > 228 a < 233.

[0015] Quando a L-ornitina é mencionada mais adiante neste documento, o termo compreende, também, seus sais como, por exemplo, monocloridrato de L-ornitina ou sulfato de L-ornitina.

[0016] Um processo de acordo com a invenção faz uso de bactérias selecionadas do grupo que consiste nos gêneros Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter e a família Enterobacteria- ceae.

[0017] Dentro do gênero Corynebacterium, é dada preferência a cepas baseadas nas seguintes espécies: Corynebacterium efficiens, por exemplo, a cepa DSM44549, Corynebacterium glutamicum, por exemplo, a cepa ATCC13032 ou a cepa R, e Corynebacterium ammoniagenes, por exemplo, a cepa ATCC6871, sendo dada preferência muito particular à espécie Corynebacterium glutamicum.

[0018] Alguns representantes da espécie Corynebacterium glutamicum também são conhecidos na técnica anterior sob outros nomes. Eles incluem, por exemplo: a cepa ATCC13870, chamada de Corynebacterium acetoa- cidophilum, a cepa DSM20137, chamada de Corynebacterium lilium, a cepa ATCC17965, chamada de Corynebacterium melas- secola, a cepa ATCC14067, chamada de Brevibacterium flavum, a cepa ATCC13869, chamada de Brevibacterium lactofer- mentum, e a cepa ATCC14020, chamada de Brevibacterium divarica- tum.

[0019] O termo "Micrococcus glutamicus" para Corynebacterium glutamicum também tem sido igualmente usado. Alguns representantes da espécie Corynebacterium efficiens também foram chamados na técnica anterior de Corynebacterium thermoaminogenes, por exemplo, a cepa FERM BP-1539.

[0020] Dentro do gênero Bacillus, é dada preferência à espécie Bacillus subtilis.

[0021] Dentro do gênero Arthrobacter, é dada preferência à espécie Arthrobacter citreus.

[0022] Dentro da família Enterobacteriacae, é dada preferência aos gêneros Escherichia, Erwinia, Providencia, Pantoea e Serratia. É dada particular preferência aos gêneros Escherichia e Serratia. É dada preferência muito particular à espécie Escherichia coli no gênero Escherichia, à espécie Serratia marcescens no gênero Serratia, e à espécie Providencia rettgeri no gênero Providencia.

[0023] As bactérias ou cepas (cepas iniciais) empregadas para as medidas de superexpressão do exportador de L-ornitina já têm, de preferência, a capacidade de excretar L-ornitina no meio nutriente em torno delas e a acumula ali. A expressão "para produzir" também é usada para isto mais adiante neste documento. Mais especificamente, as cepas empregadas para as ditas medidas de superexpressão possuem a capacidade de concentrar ou acumular no meio nutriente >0,1 g/L, > 0,3 g/L, > 1 g/L, > 3 g/L, £ 10 g/L de L-ornitina. As cepas iniciais são, de preferência, cepas que foram preparadas por mutagênese e seleção, tecnologias de DNA recombinante ou por uma combinação de ambos os métodos.

[0024] É óbvio, e não há necessidade de explicações adicionais, que uma bactéria adequada para as medidas da invenção pode, também, ser obtida por superexpressar primeiramente um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um exportador de L-ornitina e cuja sequência de aminoácidos é pelo menos (>) 35% idêntica a da SEQ ID No. 2, com o comprimento dos polipeptídeos co-dificados, quando adequado, estando dentro das faixas de comprimento descritas acima, em uma cepa selvagem como, por exemplo, na cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 ou na cepa ATCC 14067, e subsequentemente, fazer com que a dita bactéria, por meios genéticos adicionais descritos na técnica anterior, produzam L-ornitina. Transformar uma cepa selvagem, como por exemplo, a cepa ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 ou ATCC17965, apenas com o polinucleotídeo mencionado não resulta em um processo de acordo com a invenção.

[0025] Exemplos de cepas da espécie Corynebacterium glutamicum que excretam ou produzem L-ornitina são: Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 2344, e Corynebacterium glutamicum FERM-BP 2345 descritas em US 5188947.

[0026] Um exemplo de uma cepa da espécie Arthrobacter citreus que excreta ou produz L-ornitina é: Arthrobacter citreus FERM-BP 2342 descrita no documento US 5188947.

[0027] Um exemplo de uma cepa da espécie Bacillus subtilis que excreta ou produz L-ornitina é: Bacillus subtilis BOR-32 (FERM-P 3647) descrita em JP 57041912.

[0028] Um exemplo de uma cepa da espécie Providencia rettgeri que excreta ou produz L-ornitina é: Providencia rettgeri ARGA6 (FERM P-11147) descrita em JP 03195494.

[0029] Um exemplo de uma cepa da espécie Escherichia coli que excreta ou produz L-ornitina é: Escherichia coli B-19-19 (ATCC 21104) descrita em US 3668072.

[0030] As bactérias produtoras de L-ornitina são tipicamente auxo- tróficas para os aminoácidos L-citrulina ou L-arginina. Como uma alternativa, bactérias produtoras de L-ornitina que são braditróficas para L-citrulina ou L-arginina podem, também, ser contempladas. As definições dos termos auxotrófico e braditrófico podem ser encontradas, por exemplo, na página 9 de WO 01/09286. Os braditrofos também são chamados de mutantes "leaky"na técnica. As bactérias braditróficas usadas são, em particular, aquelas nas quais a atividade dos produtos gênicos ArgF (ornitina carbamoil transferase), ArgG (argininosuccinato sintase) ou ArgH (argininosuccinato liase) é maior que (>) zero mas igual a ou menor que (<) 10 por cento, de preferência, > zero e < 1%, em comparação à atividade no selvagem.

[0031] A técnica anterior apresentou polinucleotídeos que são chamados de gene lysE e que codificam proteínas ou polipeptídeos que possuem a atividade de um exportador de L-lisina. Estes polipeptídeos também são conhecidos pela abreviação LysE.

[0032] Um exportador é uma proteína que reside na membrana celular de uma célula e que transporta um metabólito, por exemplo, L- lisina ou L-ornitina, do citoplasma da dita célula para fora no meio circundante. Se a energia necessária para isto for fornecida sob a forma de adenosina trifosfato (ATP), isto se chama exportação ou transporte ativo primário. Isto se chama exportação ou transporte ativo secundário se a dita energia for fornecida sob a forma de um gradiente de íons, por exemplo, de íons de sódio (Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and L. Stryer; Biochemie [Bioquímica], 5a edição, páginas 378-384, Spektrum Akademischer Verlag [editor], Heidelberg, Alemanha, 2003). Instruções para determinar a atividade de exportação de L-ornitina podem ser encontradas em Bellmann et al.(Microbiology 2001; 147: 1765-74).

[0033] Durante o curso do trabalho que leva à presente invenção, observou-se que os exportadores de lisina dos gêneros Corynebacte- rium, de preferência, Corynebacterium glutamicum, e Micrococcus, de preferência, Micrococcus luteus, possuem a atividade de um exportador de L-ornitina além da atividade de exportação de L-lisina.

[0034] As medidas da invenção usam genes que codificam poli- peptídeos que têm atividade de exportação para L-ornitina e cuja sequência de aminoácidos é pelo menos (>) 35%, > 40%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85%, > 90%, > 92%, > 94%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99% ou 100%, de preferência > 70%, particularmente, de preferência, > 90%, muito particularmente, de preferência, > 96% e, com a máxima preferência, > 100%, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2, com o comprimento do polipeptídeo codificado, quando adequado, estando dentro das faixas de comprimento descritas acima.

[0035] Exemplos de exportadores de L-ornitina adequados são os exportadores de lisina ou os polipeptídeos de LysE de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID No. 2), Corynebacterium glutamicum R (SEQ ID No. 4), Corynebacterium glutamicum ATCC14067 (SEQ ID No. 5), Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (SEQ ID No. 7), Corynebacterium efficiens YS-314 (SEQ ID No. 9), Corynebacterium diphteriae NCTC 13129 (SEQ ID No. 10), Corynebacterium striatum ATCC6940 (SEQ ID No. 11), Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 (SEQ ID No. 12), Corynebacterium matruchotii ATCC33806 (SEQ ID No. 13), Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 (SEQ ID No. 14), Corynebacterium accolens ATCC49725 (SEQ ID No. 15), Corynebacterium glucuronalyticum ATCC 51867 (SEQ ID No. 16), Micrococcus luteus NCTC2665 (SEQ ID No. 17), Corynebacterium tubuculostearicum SK141 (SEQ ID No. 18) e Corynebacterium matruchotii ATCC14266 (SEQ ID No. 19). SEQ ID No. 18 e SEQ ID No. 19 também são chamados na técnica de polipep- tídeos ArgO.

[0036] A sequência de nucleotídeos dos genes lysE de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 e Corynebacterium glutamicum ATCC13869 foi determinada neste estudo (SEQ ID No. 6 e SEQ ID No. 8). As sequências de aminoácidos do polipeptídeo LysE de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 e Corynebacterium glutamicum ATCC13869 são mostradas nas SEQ ID No. 5 e 7. Elas são idênticas à sequência de aminoácidos de C. glutamicum ATCC13032 Ly-sE, mostrada na SEQ ID No. 2.

[0037] A Tabela 1 mostra os números de acesso dos polipeptídeos LysE de vários representante do gênero Corynebacterium e de Micrococcus luteus, que foram retirados das bases de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EUA). Além disso, a Tabela 1 faz referência às sequências de aminoácidos do polipeptídeo LysE que são mostradas na listagem de sequências. Finalmente, a Tabela 1 indica o comprimento (número de aminoácidos) do polipeptídeo LysE codificado. TABELA 1

[0038] A figura 1 representa um alinhamento de múltiplas sequências das sequências de aminoácidos dos polipeptídeos LysE das bactérias mencionadas na tabela 1. Os alinhamentos das sequências de aminoácidos mostradas na figura 1 foram produzidos pelo programa Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational Software 600 Pinner Weald Way Ste 202 Cary NC 27513 EUA). A molécula de referência usada para o alinhamento foi o polipeptídeo LysE (LysE) de ATCC13032. Para a matriz de classificação, o ajuste "Blosum 62" (consulte: Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko e L. Stryer; Biochemie, 5a edição, páginas 194 a 197, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 2003)) foi escolhido.

[0039] Também é possível, quando adequado, empregar os programas descritos na técnica anterior, como, por exemplo, o programa ClustalX (Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. e Higgins, D.G. (1997). The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25: 4876-4882).

[0040] Os resíduos de aminoácido 4-236 do polipeptídeo LysE de Corynebacterium glutamicum R (consulte SEQ ID No. 4) correspondem à sequência de aminoácidos de LysE de C. glutamicum ATCC13032 mostrada na SEQ ID No. 2. O polipeptídeo de C. glutamicum R tem uma sequência adicional de três resíduos de aminoácido na terminação N (metionina-valina-isoleucina). Estes resíduos adicio nais são produzidos quando o códon de início localizado 9 pares de base mais à montante do gene lysE é usado como uma alternativa ao códon de início do gene lysE em C. glutamicum ATCC13032 (consulte SEQ ID No. 1).

[0041] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo LysE de C. efficiens YS-314 é 71%, e a de C. diphteriae NCTC 13129 é 44%, a de Corynebacterium striatum ATCC6940 é 44%, a de Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 é 42%, a de Corynebacterium matruchotii ATCC33806 é 43%, a de Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 é 43%, a de Corynebacterium accolens ATCC49725 é 43%, a de Corynebacterium glucuronalyticum ATCC 51867 é 36%, a de Micrococcus luteus NCTC2665 é 40% idêntica à sequência de aminoácidos de C. glutamicum ATCC13032 mostrada na SEQ ID No. 2. Além disso, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo ArgO de C. tubuculostearicum SK141 é 43% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2. Além disso, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo ArgO de C. matruchotii ATCC14266 é 44% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2. As porcentagens de identidade foram produzidas por gerar um alinhamento de sequência global com o auxílio do programa Clone Manager 9 com o uso dos ajustes de Blo- sum 62 (vide figura 2).

[0042] Os genes lysE, isto é, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que possuem a atividade de um exportador de L-ornitina, podem ser isolados dos organismos com o auxílio da reação em cadeia de polimerase (PCR) com o uso de iniciadores adequados. Instruções podem ser encontradas, entre outros, no manual de laboratório "PCR" escrito por Newton e Graham (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994), e no documento WO 2006/100211 nas páginas 14 a 17.

[0043] É dada particular preferência ao emprego, em um processo de acordo com a invenção, de genes que codificam polipeptideos que têm atividade de exportação de L-ornitina e cuja sequência de aminoácidos inclui uma ou mais das características selecionadas do grupo que consiste em a) sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 2 ou SEQ ID No. 4, b) sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 2, incluindo uma ou mais, até 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1, deleção(ões) de aminoácidos, c) sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 2, incluindo uma ou mais, até 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1, inser- ção(ões) de aminoácidos, e d) sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 2, incluindo uma ou mais, até 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1, de preferência, até 5, 4, 3, 2, ou 1, troca(s) (substituição(ões)) de aminoácidos. e) sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No. 2, que inclui uma ou mais, até 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1, de preferência, até 5, 4, 3, 2, ou 1, adição(ões) de aminoácidos na terminação N e/ou na terminação C.

[0044] Quando adequado, é dada preferência às substituições de aminoácido conservatives. No caso de aminoácidos aromáticos, as substituições conservatives são aquelas nas quais os aminoácidos fe- nilalanina, triptofano e tirosina são substituídos uns pelos outros. No caso de aminoácidos hidrofóbicos, as substituições conservatives são aquelas nas quais os aminoácidos leucina, isoleucina e valina são substituídos uns pelos outros. No caso de aminoácidos polares, as substituições conservatives são aquelas nas quais os aminoácidos glu- tamina e asparagina são substituídos um pelo outro. No caso de aminoácidos básicos, as substituições conservatives são aquelas nas quais os aminoácidos arginina, lisina e histidina são substituídos uns pelos outros. No caso de aminoácidos ácidos, as substituições conser- vativas são aquelas nas quais os aminoácidos ácido aspártico e ácido glutâmico são substituídos um pelo outro. No caso de aminoácidos contendo grupos hidroxila, as substituições conservativas são aquelas nas quais os aminoácidos serina e treonina são substituídos um pelo outro.

[0045] É ainda possível usar polinucleotídeos que hibridizam sob condições estringentes com a sequência de nucleotídeos complementar à SEQ ID No. 1, de preferência, à região codificante da SEQ ID No. 1, e que codificam um polipeptídeo que tem atividade de exportação de L-ornitina, com a sequência de aminoácidos da proteína codificada sendo > 70% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 e o comprimento do polipeptídeo codificado, quando apropriado, estando dentro dos intervalos de comprimento descritos acima.

[0046] Instruções com relação à hibridização de ácidos nucleicos e polinucleotídeos, respectivamente, podem ser encontradas pelo versado na técnica, entre outros, no manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" da Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl etal. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). A hibridização ocorre sob condições estringentes, isto quer dizer, apenas híbridos nos quais a sonda, isto é, um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeos complementar à SEQ ID No. 1, de preferência, a região codificante da SEQ ID No. 1, e a sequência alvo, isto é, os polinucleotídeos tratados com ou identificados pela dita sonda, são pelo menos 70% idênticas. Sabe-se que a estringência da hibridização, incluindo as etapas de lavagem, são influenciadas ou determinadas mediante a variação da composição do tampão, da temperatura e da concentração de sal. A reação de hibridização é geralmente executada com es- tringência relativamente baixa em comparação às etapas de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).

[0047] Por exemplo, um tampão SSC 5x a uma temperatura de aproximadamente 50°C a 68°C pode ser empregado para a reação de hibridização. Aqui, as sondas também podem hibridizar com polinucle- otídeos que são menos de 70% idênticos à sequência de nucleotídeos da sonda empregada. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos por lavagem sob condições estringentes. Isto pode ser obtido, por exemplo, por reduzir a concentração de sal para SSC 2x ou SSC 1xâ“ e, quando apropriado, subsequentemente para SSC 0,5x (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha, 1995), com uma temperatura de aproximadamente 50°C a 68°C, aproximadamente 52’C a 68°C, aproximadamente 54°C a 68°C, aproximadamente 56°C a 68’C, aproximadamente 58°C a 68°C, aproximadamente 60°C a 68°C, aproximadamente 62°C a 68°C, aproximadamente 64°C a 68°C, aproximadamente 66°C a 68°C sendo ajustada. É dada preferência a faixas de temperatura de aproximadamente 64°C a 68°C ou aproximadamente 66°C a 68°C. É opcionalmente possível baixar a concentração de sal para uma concentração que corresponde a SSC 0,2x ou SSC 0,1x. O tampão SSC contém, opcionalmente, dodecil sulfato de sódio (SDS) a uma concentração de 0,1%. Por aumentar gradualmente a temperatura de hibridização nas etapas de aproximadamente 1 a 2°C de 50°C para 68°C, é possível isolar os fragmentos de polinucleotídeo que são pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, quando apropriado 100%, idênticos à sequência ou sequência complementar da sonda empregada e que codifica um polipeptídeo que tem atividade de exportação de L-ornitina. Instruções adicionais com relação à hibridização podem ser obtidas no mercado sob a forma de "kits"(por exemplo DIG Easy Hyb da Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, n° de catálogo 1603558).

[0048] Para as medidas da invenção, um polinucleotídeo que codifica uma proteína que tem atividade de exportação de L-ornitina é su- perexpressa em uma bactéria ou cepa inicial ou original que produz L- ornitina, com a sequência de aminoácidos da proteína codificada sendo > 35% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 e o comprimento do polipeptídeo codificado, quando apropriado, estando dentro dos intervalos descritos acima.

[0049] Superexpressão significa, geralmente, um aumento na concentração intracelular ou atividade de um ácido ribonucleico, de uma proteína (polipeptídeo) ou de uma enzima em comparação à cepa inicial (cepa original) ou cepa selvagem, se esta último for a cepa inicial. Uma cepa inicial (cepa original) significa uma cepa na qual a medida que leva à superexpressão foi executada.

[0050] Os termos proteína e polipeptídeo são considerados inter- cambiáveis.

[0051] Para superexpressão, é dada preferência aos métodos de superexpressão recombinante. Eles incluem quaisquer métodos nos quais um micro-organismo é preparado usando uma molécula de DNA fornecida in vitro. Exemplos destas moléculas de DNA incluem promotores, cassetes de expressão, genes, alelos, regiões codificantes, etc. Elas são transferidas para o micro-organismo desejado por métodos de transformação, conjugação, transdução ou métodos similares.

[0052] As medidas de superexpressão aumentam a atividade ou concentração do polipeptídeo correspondente geralmente em pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, de preferência, em até 1000%, 2000%, 4000%, 10000% ou 20000%, com base no nível de atividade ou concentração do dito polipeptídeo na cepa antes da medida resultar em superexpressão.

[0053] Quando se usa cepas da espécie Corynebacterium glutamicum, a atividade de exportação de L-ornitina na cepa ATCC13032 ou ATCC14067 ou ATCC13869 ou ATCC17965, quando apropriado, é um ponto de referência adequado para determinar a superexpressão. Quando se usa cepas baseadas ou derivadas da ATCC13032, a dita cepa ATCC13032 é um ponto de referência adequado. Um exemplo disto é a cepa preparada durante o curso do trabalho que leva à presente invenção, ATCC13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE, que se baseia na cepa ATCC13032. Quando se usa cepas baseadas ou derivadas da ATCC14067, a dita cepa ATCC14067 é um ponto de referência adequado. Quando se usa cepas baseadas ou derivadas da ATCC13869, a dita cepa ATCC13869 é um ponto de referência adequado. Pontos de referência adicionais adequados são produzidos de acordo.

[0054] Quando se usa cepas da espécie Escherichia coli, de preferência cepa K12 de Escherichia coli, a atividade de exportação de L- ornitina na cepa MG1655, quando apropriado, é um ponto de referência adequado para determinar a superexpressão.

[0055] A superexpressão é obtida por uma multiplicidade de métodos disponíveis na técnica anterior.

[0056] Elas incluem aumentar o número de cópias e modificar as sequências de nucleotídeos que direcionam ou controlam a expressão do gene. A transcrição de um gene é controlada, entre outros, pelo promotor e, opcionalmente, por proteínas que superexpressam (proteínas repressoras) ou promovem (proteínas ativadoras) a transcrição. A tradução do RNA formado é controlada, entre outros, pelo sítio de liga-ção ao ribossomo e o códon de início. Os polinucleotídeos ou moléculas de DNA que incluem um promotor e um sítio de ligação ao ribossomo e, opcionalmente, um códon de início também são chamados de cassete de expressão.

[0057] Os ditos métodos incluem, também, o uso de variantes de polipeptídeos ou enzimas, que têm uma atividade catalítica aumentada.

[0058] O número de cópias pode ser aumentado através de plas- mídios que replicam no citoplasma bacteriano. Para isto, vários plas- mídios são descritos na técnica anterior para grupos muito diferentes de micro-organismos, cujos plasmídios podem ser usados para estabelecer o aumento desejado no número de cópias do gene. Os plasmídios adequados para o gênero Escherichia são descritos, por exem-plo, no manual Molecular Biology, Labfax (Ed.: T.A. Brown, Bios Scientific, Oxford, UK, 1991). Os plasmídios adequados para o gênero Corynebacterium são descritos, por exemplo, em Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)) ou em Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)).

[0059] O uso do plasmídio pEC7lysE, depositado em DSM 23239, para aumentar o número de cópias em cepas de Corynebacterium glutamicum é excluído das medidas que levam à presente invenção A sequência de nucleotídeos do plasmídio pEC7lysE foi determinada e é mostrada na SEQ ID No. 29.

[0060] O número de cópias pode ser ainda aumentado em pelo menos uma (1) cópia pela introdução de mais cópias no cromossomo da bactéria. Os métodos adequados para o gênero Corynebacterium, de preferência, Corynebacterium glutamicum, são descritos, por exemplo, nos documentos de patente WO 03/014330, WO 03/040373 e WO 04/069996. O documento WO 03/014330 descreve métodos para a duplicação em tandem de genes no lócus do gene nativo. WO 03/040373 descreve métodos para incorporar uma segunda ou terceira cópia de um gene em mais loci gênicos, com o lócus gênico particular não sendo essencial para o crescimento ou produção do aminoácido específico, L-ornitina, no caso da presente invenção Exemplos de loci gênicos adequados para incorporar uma segunda cópia ou cópia adicional do gene lysE em um processo de acordo com a invenção são os genes odh, sucA, dapA, dapB, ddh, lysA, argR, argF, argG e argH. WO 04/069996 (consulte as tabelas 12 e 13) descreve regiões intergênicas de C. glutamicum e genes que codificam fagos ou componentes de fago, que são adequados para incorporar cópias adicionais do gene lysE.

[0061] Exemplos de métodos adequados para o gênero Escherichia são a incorporação de uma cópia de gene no sítio att do fago (Yu e Court, Gene 223, 77-81 (1998)), amplificação cromossômica com o auxílio do fago Mu, conforme descrito em EP 0 332 448, ou os métodos de reposição gênica com o auxílio de plasmídios de replicação condicional, conforme descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteri-ology 174, 4617-4622 (1989)) ou Link et al. (Journal of Bacteriology 179, 6228-6237 (1997)).

[0062] A expressão gênica pode ser ainda aumentada pelo uso de um promotor forte que está funcionalmente ligado ao gene a ser expresso. É dada preferência ao uso de um promotor que é mais forte que o promotor natural, isto é, aquele presente na cepa selvagem ou original. Para isto, a técnica anterior tem vários métodos disponíveis.

[0063] Os promotores e sistemas de expressão adequados para o gênero Corynebacterium podem ser encontrados, entre outros, nas patentes EP 0 629 699 A2, US 2007/0259408 A1 (promotor gap), WO 2006/069711, EP 1 881 076 A1, WO 2008/088158, WO 2009/025470 (promotor butA, promotor pyk), US 6,861,246 (variantes MC20 e MA16 do promotor dapA), e EP 1 918 378 A1 (promotor sod), e em visões gerais como o "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling and Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)), ou o livro "Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)). Exemplos de promotores que permitem a expressão controlada, isto é, induzível ou reprimível, são descritos, por exemplo, em Tsuchiya e Mo- rinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)).

[0064] Os promotores adequados para o gênero Escherichia são conhecidos há algum tempo. Eles incluem, entre outros, os promotores clássicos promotor lac, promotor trp, os promotores híbrido tac e trc, os promotores PL e PR do fago I. De modo similar, é possível usar os promotores do fago T7, os promotores "gear-box", o promotor nar ou os promotores dos genes rrsG, rnpB, csrA, csrB, ompA, fusA, pepQ, rplX ou rpsG. A expressão controlada é permitida, por exemplo, pelo sistema CI857-PR ou CI857-PL do fago I (Gõtting et al.,BioTechniques 24, 362-366 (1998)). Visões gerais podem ser encontradas em Makri- des (Microbiological Reviews 60(3), 512-538 (1996)) ou no manual "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology"(F.C. Neidhardt (Editor chefe), ASM Press, Washington, EUA (1996)).

[0065] Tais promotores ou cassetes de expressão são tipicamente empregados a uma distância de 1 a 1000, de preferência, 1 a 500, nu- cleotídeos à montante do primeiro nucleotídeo do códon de início da região codificante do gene. A uma distância de 1 significa que o promotor ou o cassete de expressão está posicionado imediatamente em frente à primeira base do códon de início da região codificante.

[0066] Para aumentar a expressão do gene lysE em C. glutamicum, é dada preferência à inserção de promotores adequados como, por exemplo, o promotor sod de C. glutamicum (vide SEQ ID No. 1 de EP 1918 378 A1) ou o promotor gap de C. glutamicum (vide SEQ ID No. 3 de US 2007/0259408) entre as posições 930 e 990 da SEQ ID No. 1.

[0067] Quando se usa cassetes de expressão contendo um promotor e um sítio de ligação ao ribossomo (RBS), como a unidade de expressão do gene sod de C. glutamicum (vide SEQ ID No. 2 de EP 1918 378 A1) ou a unidade de expressão do gene gap de C. glutamicum, descrita em US 2007/0259408 e mostrada em SEQ ID No. 28 (e chamada ali de PgapRBS), por exemplo, eles são inseridos, no caso de C. glutamicum, de preferência, entre as posições 930 e 1001, particularmente, de preferência, entre as posições 1000 e 1001, da SEQ ID No. 1. Um exemplo de um sítio de ligação ao ribossomo adequado em tal cassete de expressão é a sequência de nucleotídeos 5'- agaaaggagg-3' especificada por Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)).

[0068] Também é possível colocar uma pluralidade de promotores à montante do gene desejado ou ligá-los funcionalmente ao gene a ser expresso e, desta forma, obter aumento na expressão. Isto é descrito, por exemplo, no WO 2006/069711.

[0069] A estrutura dos promotores de Corynebacterium glutamicum e de Escherichia coli é bem conhecida. Portanto, é possível aumentar a força de um promotor pela modificação de sua sequência através de uma ou mais substituição(ões) e/ou uma ou mais inser- ção(ões) e/ou uma ou mais deleção(ões) de nucleotídeos. Exemplos disto podem ser encontrados, entre outros, em "Herder Lexikon der Biologie" [A Enciclopédia de Biologia de Herder] (Spektrum Akademis- cher Verlag, Heidelberg, Alemanha (1994)).

[0070] Consequentemente, uma medida adequada para superex- pressar o gene lysE é modificar ou mutar o promotor do dito gene lysE.

[0071] A estrutura dos sítios de ligação ao ribossomo de Corynebacterium glutamicum e Escherichia coli também é bem conhecida e é descrita, por exemplo, em Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)), e em manuais e livros-texto de genética, por exemplo, "Gene und Klo- ne" [Genes e Clones] (Winnacker, Verlag Chemie, Weinheim, Alemanha (1990)) ou "Molecular Genetics of Bacteria" (Dale e Park, Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK (2004)). Genes bem expressos, isto é, os genes estruturais mais importantes em um organismo, possuem um bom sítio de ligação ao ribossomo (Amador, Microbiology 145, 915- 924 (1999)), isto é, este último é muito similar a ou corresponde à sequência consenso. Foi demonstrado na literatura que genes altamente expressos possuem um sítio de ligação ao ribossomo forte (Karlin and Mrázek, Journal of Bacteriology 2000; 182(18): 5238-50). Consequentemente, a eficiência da tradução de um gene ou do mRNA pode ser obtida pelo ajuste do sítio de ligação ao ribossomo.

[0072] Também é possível aumentar a eficiência da tradução pelo ajuste do uso de códons nos genes a serem expressos (por exemplo, Najafabiad etal.,Nucleic Acids Research 2009, 37 (21): 7014-7023).

[0073] A superexpressão pode também ser obtida mediante o aumento da expressão de proteínas ativadoras ou mediante a redução ou desligamento da expressão de proteínas repressoras.

[0074] A proteína ativadora LysG para expressar lysE foi descrita por Bellmann et al.(Microbiology 2001; 147: 1765-74) e é chamada aqui de "regulador positivo". A sequência de aminoácidos de LysG de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 é mostrada na SEQ ID No. 30. Em um alinhamento de sequência global, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo LysG de Corynebacterium diphteriae NCTC13129 é 62%, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo LysG de Corynebacterium efficiens YS-314 é 81%, e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo LysG de Corynebacterium glutamicum R é 94%, idêntica a da SEQ ID No. 30.

[0075] Para proteínas ativadoras, preferência é dada a um polipeptídeo que é > (pelo menos) 55%, de preferência, > 80%, particularmente, de preferência, > 90%, > 92% ou > 94%, muito particularmente, de preferência, > 99% e, com a máxima preferência, 100%, idêntico à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID No. 30.

[0076] As medidas de superexpressão mencionadas, seleciona- das, de preferência, do grupo consistindo em aumentar o número de cópias, usar um promotor forte, mutar o promotor, usar um cassete de expressão adequado e superexpressar uma proteína ativadora, podem ser combinadas de uma forma adequada. Desta forma, é possível, por exemplo, combinar o uso de um promotor adequado com o aumento do número de cópias, ou superexpressão de uma proteína ativadora com o uso de um promotor adequado ou um cassete de expressão adequado.

[0077] Também é possível, além das medidas relacionadas ao po- linucleotídeo que codifica uma proteína que tem atividade de exportação de L-ornitina, atenuar os genes de biossíntese individuais.

[0078] Para aperfeiçoar a produção de L-ornitina, é conveniente, quando apropriado, atenuar, adicionalmente, um ou mais dos genes selecionados do grupo que consiste em a) gene odhA que codifica a subunidade E1 de alfa- cetoglutarato desidrogenase (EC 1.2.4.2), b)gene sucA que codifica a diidrolipoamida succinil transferase (EC 2.3.1.61), c)gene dapA que codifica uma diidrodipicolinato sintase (DapA, EC 4.2.1.52), d) gene dapB que codifica uma diidrodipicolinato sintase (DapB, EC 1.3.1.26), e)gene ddh que codifica uma meso-diaminopimelato desidrogenase (Ddh, EC 1.4.1.16), f) gene lysA que codifica uma diaminopimelato descarboxi- lase (LysA, EC 4.1.1.20), g)gene argR que codifica um/o repressor (ArgR) da biossíntese de L-arginina, h) gene argF que codifica uma ornitina carbamoíla transferase (ArgF, EC 2.1.3.3), i) gene argG que codifica uma argininosuccinato sintase (ArgG, EC 6.3.4.5), j) gene argH que codifica uma argininosuccinato liase (ASAL) (ArgH, EC 4.3.2.1), k) gene lysC que codifica uma aspartato quinase (LysC, EC 2.7.2.4), and l) gene asd que codifica uma aspartato semialdeído desití rogenase (Asd, EC 1.2.1.11).

[0079] É dada preferência à atenuação de um ou mais dos genes selecionados do grupo que consiste em lysA, odhA, argR, argF, argG e argH. É dada preferência particular à atenuação de um ou mais dos genes selecionados do grupo que consiste em lysA, odhA e argF. É dada preferência muito particular à atenuação dos genes lysA e/ou argF.

[0080] O termo "atenuação", neste contexto, descreve a redução ou desligamento da atividade intracelular de uma ou mais enzimas (proteínas) em uma bactéria, que são codificadas pelo DNA correspondente, usando, por exemplo, um promotor fraco ou um gene ou alelo que codifica uma enzima correspondente que tem uma baixa atividade, ou pela inativação do gene ou enzima (proteína) correspondente e, opcionalmente, combinação destas medidas.

[0081] Uma visão geral de promotores conhecidos de várias forças em Corynebacterium glutamicum pode ser encontrada em Pátek et al. (Journal of Biotechnology 104, 311-323 (2003)). Outros promotores fracos são descritos na comunicação 512057 na revista Research Disclosure de dezembro de 2006 (páginas 1616 a 1618).

[0082] Mutações que podem ser consideradas para gerar uma atenuação são transições, transversões, inserções e deleções de pelo menos um (1) par de bases ou nucleotídeo na região codificante do gene em questão. Dependendo do efeito da substituição de aminoáci- do causada mutação sobre a atividade da proteína ou enzima, as mutações são chamadas de mutações missense (de troca de sentido) ou mutações nonsense (sem sentido)".

[0083] A mutação missense resulta em uma troca de um dado aminoácido em uma proteína por outro, a dita troca sendo, em particular, uma substituição de aminoácido não conservative. Isto prejudica a funcionalidade ou atividade da proteína e a reduz para um valor de > 0 a 75%, > 0 a 50%, > 0 a 25%, > 0 a 10% ou > 0 a 5%.

[0084] A mutação nonsense resulta em um códon de parada na região codificante do gene e, portanto, na terminação precoce da tradução e, consequentemente, em um desligamento. Inserções ou dele- ções de pelo menos um par de bases em um gene levam a mutações frameshift (deslocamento de fase) resultando em aminoácidos errados sendo incorporados ou na tradução sendo terminada precocemente. Se a mutação resultar em um códon de parada na região codificante, isto também leva a uma terminação precoce da tradução. As medidas de geração de uma mutação nonsense são executadas, de preferência, na parte 5'-terminal da região codificante, que codifica a terminação N do polipeptídeo. Se o comprimento geral de um polipeptídeo (medido através do número de L-aminoácidos ligados quimicamente) for chamado de 100%, então - dentro do escopo da presente invenção - a terminação N do polipeptídeo inclui aquela parte da sequência de aminoácidos que, pelo cálculo a partir do aminoácido de início, L- formil-metionina, em diante, contém 80% dos L-aminoácidos à jusante.

[0085] Métodos de mutagênese in vivo são descritos, por exemplo, no Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, EUA, 1981) ou em Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) ou em Konicek etal. (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)).

[0086] Os métodos adequados de mutagênese in vitro são, entre outros, o tratamento com hidroxilamina de acordo com Miller (Miller, J.H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and OxyRated Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), o uso de oligonu- cleotídeos mutagênicos (T.A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger [Engenharia Genética para Iniciantes], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 e R.M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)), e o uso de uma reação em cadeia de polimerase usando uma DNA polimerase com uma alta taxa de erro. Um exemplo de tai DNA polimerase é a DNA polimerase Mutazyme (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, No. 600550) da Stratagene (LaJolla, CA, EUA).

[0087] Instruções e visões gerais adicionais sobre a geração de mutações in vivo ou in vitro podem ser encontradas na técnica anterior em livros-texto conhecidos de genética e biologia molecular, como o livro-texto de autoria de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), o de Winnacker ("Gene and Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou o de Hagemann ("Allgemeine Genetik"[Genética Geral], Gus-tav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986), por exemplo.

[0088] Com o auxílio do processo conhecido de substituição de gene ou alelo, cujos fundamentos estão descritos em Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), é possível transferir uma mutação preparada in vitro, ou um polinucleotídeo contendo a mutação desejada, para dentro do cromossomo. Von Schãfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)) empregaram este método de modo a incorporar uma deleção no operon hom-thrB de C. glutamicum. Von Nakagawa et al. (EP 1108790) e Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) empregaram este método para incorporar várias mutações, começando a partir dos alelos isolados, no cromosso- mo de C. glutamicum.

[0089] Um método para a redução direcionada da expressão gêni- ca consiste em colocar o gene a ser atenuado sob o controle de um promotor que pode ser induzido pela adição de quantidades medidas de IPTG (isopropil b-D-tiogalactopiranosídeo), como, por exemplo, o promotor trc ou o promotor tac. Vetores são adequados para este propósito, por exemplo, o vetor de expressão de Escherichia coli pXK99E (WO 0226787; depositado de acordo com o Tratado de Budapeste em 31 de julho de 2001 em DH5alpha/pXK99E como DSM14440 junto ao Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha)), pEKEx2 (n° de acesso NCBI AY585307) ou pVWEx2 (Wendisch, tese de doutorado, Berichte des Forschungszen- trums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemanha (1997)), que permite ao gene clonado ser expresso de uma forma dependente de IPTG em Corynebacterium glutamicum.

[0090] Este método foi empregado, por exemplo, no documento de patente WO 02266787 para a expressão regulada do gene deaD através da integração do vetor pXK99EdeaD no genoma de Corynebacterium glutamicum, e por Simic et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) para a expressão regulada do gene glyA através da integração do vetor pK18mobglyA' em Corynebacterium glutamicum.

[0091] Outro método para reduzir especificamente a expressão gênica é a técnica antissenso que envolve a aplicação nas células-alvo de oligodesoxinucleotídeos curtos ou vetores para sintetizar RNA antissenso mais longo. Ali, o RNA antissenso pode se ligar a seções complementares de mRNAs específicos e reduzir sua estabilidade ou bloquear sua capacidade de tradução. Um exemplo disto pode ser encontrado pelo versado na técnica em Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct.; 66 (10): 4366-4371).

[0092] A taxa de alongamento é influenciada pelo uso de códons. A expressão gênica pode ser atenuada pelo uso de códons para t- RNAs que são raros na cepa original. Isto é descrito em detalhes em WO 2008049781 e em WO 2009133063. Por exemplo, a substituição de um códon de início ATG pelos códons menos comuns GTG ou TTG pode prejudicar a tradução, uma vez que o códon AUG é duas a três vezes mais eficaz que os códons GUG e UUG, por exemplo (Khudya- kov et al., FEBS Letters 232(2): 369-71 (1988); Reddy et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17): 5656-60 (1985)).

[0093] Também é possível, além das medidas relacionadas ao polinucleotídeo que codifica uma proteína que tem atividade de exportação de L-ornitina, acentuar os genes de biossíntese individuais.

[0094] Para aperfeiçoar a produção de L-ornitina, é conveniente, quando apropriado, acentuar, adicionalmente, a atividade enzimática de uma ou mais das proteínas selecionadas do grupo que consiste em a)glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.3) codificada pelo gene gdh, b)glutamato N-acetiltransferase (EC 2.3.1.35 e EC 2.3.1.1) codificada pelo gene argJ, c) acetil glutamato quinase (EC 2.7.2.8) codificada pelo gene argB, d) N-acetil-gama-glutamil-fosfato redutase (EC 1.2.1.38) codificada pelo gene argC, e)acetilornitina aminotransferase (EC 2.6.1.11), codificada pelo gene argD, f) componente glicose-específico EIIB (PtsG) (EC 2.7.1.69) do sistema de absorção de glicose, codificado pelo gene ptsG, g) componente sacarose-específico EIIB (PtsS) (EC 2.7.1.69) do sistema de absorção de sacarosa, codificado pelo gene ptsS, h) glicose-6-fosfato 1-desidrogenase (EC 1.1.1.49) codificada pelo gene zwf, i) glicose-6-fosfato isomerase (EC 5.3.1.9) codificada pelo gene pgi, j) fosfofrutoquinase (EC 2.7.1.11) codificada pelo gene pfkA, k) frutose-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13) codificada pelo gene fda, l) gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.59) codificada pelo gene gap, m) fosfoglicerato quinase (EC 2.7.2.3) codificada pelo gene pgk, n) piruvato quinase (EC 2.7.1.40) codificada pelo gene pyk, o)subunidade E1 da piruvato desidrogenase (EC 1.2.4.1), codificada pelo gene aceE, p)fosfoenolpiruvato carboxilase (EC 4.1.1.31) codificada pelo gene ppc, q) piruvato carboxilase (EC 6.4.1.1), codificada pelo gene pyc, r) aconitase (EC 4.2.1.3) codificada pelo gene acn, e s) isocitrato desidrogenase (EC 1.1.1.42) codificada pelo gene icd.

[0095] O termo intensificação compreende as medidas de superexpressão e o uso de variantes que têm atividade catalítica aumentada em comparação à proteína selvagem.

[0096] É dada particular preferência à intensificação de uma ou mais das enzimas selecionadas do grupo que consiste em glutamato desidrogenase, glutamato N-acetiltransferase e acetilglutamato quinase.

[0097] As medidas adicionais de atenuação mencionadas podem ser combinadas com as medidas adicionais de intensificação.

[0098] Instruções para o manuseio de DNA, digestão e ligação de DNA, transformação e seleção de transformantes podem ser encontradas, entre outros, no manual conhecido de Sambrook et al."Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

[0099] A extensão da expressão ou superexpressão pode ser determinada mediante a medição da quantidade ou concentração de mRNA transcrito a partir do gene, pela determinação da quantidade ou concentração do polipeptídeo e pela determinação do nível de atividade enzimática.

[00100] A quantidade de mRNA pode ser determinada, entre outros, pelo uso dos métodos "Northern blotting"e RT-PCR quantitativa. Na RT-PCR quantitativa, a reação em cadeia de polimerase é precedida por uma transcrição reversa. É possível usar para este propósito, o sistema LightCycler™ da Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha), con- forme descrito em Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)), por exemplo. A concentração da proteína pode ser determinada por fracionamento uni ou bidimensional de proteína em gel e subsequente identificação óptica da concentração de proteína no gel usando um programa de avaliação adequado. Um método comum para preparar os géis de proteína para bactérias corineformes e de identificar as proteínas é o procedimento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001)). A concentração de proteína também pode ser determinada por hibridização de Western-blot com o uso de um anticorpo que é específico para a proteína a ser detectada (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2aEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) e avaliação óptica subsequente com o uso de um programa adequado para a determinação da concentração (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630- 2647 (1999)).

[00101] As bactérias produzidas podem ser cultivadas continuamente - conforme descrito, por exemplo, no WO 05/021772 - ou de maneira descontínua em um processo em batelada (cultivo em batelada) ou em um processo de batelada alimentada ou processo em batelada alimentada repetida (descrito em US 6.562.601 por exemplo) com o propósito de produzir L-ornitina. Um sumário de uma natureza geral sobre métodos de cultivo conhecidos está disponível no livro-texto de Chmiel (Bioprozesstecknik [Bioprocess Technology] 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Introdução à Engenharia de Bioprocessos] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)), ou no livro-texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores e Equipamento Periférico] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, Alemanha 1994)).

[00102] O meio de cultura ou meio de fermentação a ser usado deve estar em uma forma adequada para satisfazer as demandas das cepas particulares. O "Manual of Methods for General Bacteriology" da Sociedade Americana para Bacteriologia (American Society for Bacteriology) (Washington D.C., EUA, 1981) contém descrições de meios de cultura para vários micro-organismos. Os termos meio de crescimento, meio de cultura e meio de fermentação ou meio são intercambiáveis.

[00103] É possível usar, como fonte de carbono, açúcares e carboidratos como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melado, soluções contendo sacarose do processamento de beterraba sacarina ou cana-de-açúcar, amido, hidrolisado de amido e celulose, óleos e gorduras como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos graxos como, por exem- plo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois como, por exemplo, glicerol, metanol e etanol, e ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético ou ácido láctico.

[00104] Com açúcares, é dada preferência à glicose, frutose, sacarose, misturas de glicose e frutose, e misturas de glicose, frutose e sacarose. Quando apropriado, é dada particular preferência à sacarose.

[00105] Com álcoois, é dada preferência ao glicerol.

[00106] É possível usar, como fonte de nitrogênio, compostos orgânicos contendo nitrogênio como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de milho, farinha de soja e ureia, ou compostos inorgânicos como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou como uma mistura.

[00107] É possível usar, como fonte de fósforo, ácido fosfórico, dii- drogenofosfato potássico ou hidrogenofosfato dipotássico ou os sais contendo sódio correspondentes.

[00108] O meio de cultura deve ainda compreender sais, por exemplo sob a forma de cloretos ou sulfatos de metais como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e ferro, como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, por exemplo, que são necessário para o crescimento. Finalmente, fatores de crescimento essenciais como aminoácidos, por exemplo, homoserina e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina ou ácido pantotênico, podem ser empregados além das substâncias acima mencionadas.

[00109] Os materiais de partida mencionados podem ser adicionados à cultura sob a forma de um único lote ou ser alimentados de uma forma adequada durante o cultivo.

[00110] O pH da cultura pode ser controlado pelo emprego de compostos básicos como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ammonia ou amónia aquosa, ou compostos ácidos como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, de uma forma adequada. O pH é geralmente ajustado para um valor de 6,0 a 8,5, de preferência, 6,5 a 8. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar anti-espumantes como, por exemplo, ésteres poliglicólicos de ácido graxo. Para manter a estabilidade dos plasmídios, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas como, por exemplo, antibióticos. A fermentação é executada, de preferência, sob condições aeróbicas. De modo a manter estas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio como, por exemplo, ar são introduzidas na cultura. Também é possível usar líquidos enriquecidos com peróxido de hidrogênio. A fermentação é executada, quando apropriado, a pressão elevada, por exemplo a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C e, de preferência, de 25°C a 40°C, particu-larmente, de preferência, de 30°C a 37°C. Em processos em batelada, é dada preferência a continuar a cultura até uma quantidade da L- ornitina desejada suficiente para ser recuperada tiver se formado. Este objetivo é normalmente atingido dentro de 10 horas a 160 horas. Com processos contínuos, tempos de cultivo mais longos são possíveis. A atividade bacteriana resulta em uma concentração ou aumento na concentração (acúmulo) de L-ornitina no meio de fermentação.

[00111] Exemplos de meios de fermentação adequados podem ser encontrados, entre outros, nas patentes JP 43010996 B4 (para B. sub- tilis), US 3668072 A (para E. coli) e JP 57041912 B (para B. flavum).

[00112] Quando apropriado, o volume do meio de fermentação em um processo de acordo com a invenção é > 0,5 I, > 1 I, > 5 I, > 10 I, > 50 I, 100 I, 500 I, £ 1000 I, de preferência >11, particularmente, de preferência, >10 1, muito particularmente, de preferência, > 100 I e com a máxima preferência £ 1000 I.

[00113] Para determinar a concentração em um ou mais ponto(s) de tempo durante o curso da fermentação, a L-ornitina pode ser analisada por separar os L-aminoácidos através de cromatografia de troca iônica, de preferência, cromatografia de troca de cátions, com subsequente derivatização pós-coluna com o uso de ninhidrina, conforme descrito em Spackman et al.(Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalodialdeído ao invés de ninidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo geral sobre cromatografia de troca iônica pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

[00114] Também é possível executar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, usando orto-ftalodialdeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), de preferência, sob a forma de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Um método deste tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)). A detecção é executada fotometricamente (absorbância, fluorescência).

[00115] Uma revisão relacionada à análise de aminoácidos pode ser encontrada, entre outros, no livro-texto "Bioanalytik" por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha 1998).

[00116] O desempenho dos processos ou processos de fermentação de acordo com a invenção, com relação a um ou mais dos parâmetros selecionados do grupo consistindo em concentração de L- ornitina (L-ornitina formada por volume), rendimento de L-ornitina (L- ornitina formada por fonte de carbono consumida), formação de L- ornitina (L-ornitina formada por volume e tempo), e formação específica de L-ornitina (L-ornitina formada por matéria de célula seca ou bio- massa seca e tempo, ou L-ornitina formada por proteína celular e tempo), ou ainda outros parâmetros de processo e combinações dos mesmos, é aumentado em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5% ou pelo menos 2%, com base em processos ou processos de fermentação que usam bactérias que contêm uma proteína não-superexpressa que tem atividade de exportação de L-ornitina ou que não foram submetidas a uma medida de superexpressão.

[00117] As medidas de fermentação resultam em um caldo de fermentação que contém a L-ornitina desejada.

[00118] Um produto contendo L-ornitina é então fornecido ou produzido ou recuperado sob a forma líquida ou sólida.

[00119] Um caldo de fermentação significa um meio de fermentação ou meio de crescimento no qual um micro-organismo foi cultivado por um certo tempo e a uma determinada temperatura. O meio de fermentação ou os meios empregados durante a fermentação compreen- de/compreendem todas as substâncias ou componentes que garantem a produção da dita L-ornitina e, tipicamente, propagação e viabilidade.

[00120] Quando a fermentação está completa, o caldo de fermentação resultante compreende, consequentemente a) a biomassa bacteriana (massa celular) produzida devido à propagação das células bacterianas, b) a L-ornitina formada durante o curso da fermentação, c) os subprodutos orgânicos formados durante o curso da fermentação, e d) os constituintes do meio de fermentação empregado ou dos materiais de partida, por exemplo vitaminas como biotina ou sais como sulfato de magnésio, que não foram consumidos na fermentação.

[00121] Os subprodutos orgânicos incluem substâncias que são produzidas pelas bactérias empregadas na fermentação em adição à L-ornitina e são, opcionalmente, excretados. Eles incluem, também açúcares como trealose, por exemplo.

[00122] O caldo de fermentação é removido do frasco de cultura ou tanque de fermentação, opcionalmente coletado, e usado para fornecer um produto contendo L-ornitina sob a forma líquida ou sólida. A expressão "recuperar o produto contendo L-ornitina" também é usada para isto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-ornitina, que foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[00123] Uma ou mais das medidas selecionadas do grupo que consiste em a) remoção parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) ou virtualmente completa (> 80%, £ 90%, £ 95%, £ 96%, £ 97%, > 98% ou > 99% a < 100%) de água, b) remoção parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) ou virtual mente completa (> 80%, £ 90%, 95%, £ 96%, > 97%, > 98% ou > 99% a < 100%) da biomassa que é opcionalmente inativada antes da remoção, c) remoção parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) ou virtualmente completa (> 80%, 90%, £ 95%, 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3% ou £ 99,7% a < 100%) dos subprodutos orgânicos formados durante o curso da fermentação, e d) remoção parcial (> 0%) a completa (100%) ou virtualmente completa (> 80%, £ 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3% ou > 99,7% a < 100%) dos constituintes do meio de fermentação empregado ou dos materiais de partida, que não foram consumidos na fermentação, a partir do caldo de fermentação atinge concentração ou purificação da L-ornitina. Os produtos que possuem um conteúdo de L-ornitina desejado são isolados desta forma.

[00124] A remoção parcial (> 0% a < 80%) a completa (100%) ou virtualmente completa (> 80% a < 100%) de água (medida a)) também é chamada de secagem.

[00125] Em uma variante do processo, a remoção completa ou virtualmente completa de água, da biomassa, dos subprodutos orgânicos e dos constituintes não consumidos do meio de fermentação empregado resulta em formas de produto de L-ornitina puros (> 80%, em peso ou > 90%, em peso) ou de alta pureza (> 95%, em peso, > 97%, em peso ou £ 99%, em peso). Várias instruções técnicas para as medidas de acordo com a), b), c) ou d) estão disponíveis na técnica anterior.

[00126] No caso do aminoácido L-ornitina ou seus sais, três produtos essencialmente diferentes foram descritos na técnica anterior.

[00127] Um grupo descreve a L-ornitina HCL, a partir da qual a L- ornitina é purificada da solução de fermentação, após remoção das células através de um trocador de íons, e, então, cristalizada através de cristalização como monocloreto de L-ornitina e recristalização como monocloreto de L-ornitina (US 2988489). A L-ornitina HCL obtida nesse caso tem uma pureza de mais de > 90%, de preferência, mais de 95%, particularmente, de preferência, mais de 98%, e muito particularmente, de preferência, mais de 99%.

[00128] Um processo adicional é descrito no pedido de patente EP 1995322. Isto envolve aplicar a solução de fermentação contendo biomassa ao topo de um trocador de íons fracamente ácido com um diâmetro da partícula de > 300 pm e purificar a L-ornitina por esta etapa. A seleção de um diâmetro da partícula adequado evita que a biomassa bloqueie a resina. A eficiência da remoção das células foi de 99%.

[00129] A L-ornitina purificada pode, então, ser empregada para preparar vários sais de L-ornitina como, por exemplo, a-cetoglutarato de mono- ou di-L-ornitina, L-aspartato de L-ornitina, etc.

[00130] O documento EP 0477 991, por exemplo, descreve um processo para preparar L-aspartato de L-ornitina. Isto envolve adicionar a uma solução aquosa de L-ornitina e L-aspartato, um solvente solúvel em água de modo a chegar a uma solução que é pelo menos 90% saturada ou supersaturada. A dita solução é aquecida sob refluxo até a formação de cristais ter terminado. Um solvente miscível em água é então adicionado continuamente sob refluxo até os cristais de sal se formarem. Os cristais podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação e são subsequentemente secos sob vácuo. A pureza do produto é tipicamente maior que 98,5%.

[00131] O documento JP 46003194 descreve um processo para preparar L-cetoglutarato de L-ornitina. Isto envolve, por exemplo, converter ornitina HCL na base livre através de adsorção a um trocador de íons ácido e eluição com amónia aquosa, adicionar a-cetoglutarato e evaporar a solução sob vácuo até o produto cristalizar.

[00132] O plasmídio pEC7lysE foi depositado sob a forma da cepa DH5alpha/pEC7lysE (DM2204) de Escherichia coli de acordo com o Tratado de Budapeste junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorga- nismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha) sob o número de acesso DSM 23239 em 15 de janeiro de 2010.

EXEMPLOS Exemplo 1 Clonagem e sequenciamento do gene lysE de Corynebacterium qlutamicum ATCC 13032

[00133] O gene lysE da cepa ATCC13032 foi clonado no vetor de transporte e de expressão de E. coli/C. glutamicum pVWExl (Peters- Wendisch etal.,J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3(2): 295-300).

[00134] A clonagem foi executada em duas etapas. Primeiro, uma reação em cadeia de polimerase (PCR) amplificou o gene de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 através dos seguintes iniciadores oligonucleotídicos derivados da SEQ ID No. 1. Os ditos oligonucleotí- deos incluíram sítios de clivagem de restrição adicionais na sua extremidade 5' (sublinhado: EcoRV para lysE l.p e Avrll ou Sspl para ly- sE_2.p). lysE_1 .p: 5'-iTCGATATCATGGAAATCTTCATTACAGGl-3' (vide SEQ ID No. 22) lysE_2.p: S'-fTGCCTAGGTCAATATTTGGGCGAAGGCCACC G]-3' (vide SEQ ID No. 23)

[00135] A reação de PCR foi executada na presença de 200 pM de trifosfatos de desoxinucleotideo (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,5 pM de cada um dos oligonucleotídeos correspondentes, 100 ng de DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/5 volume de tampão de reação 5x HF e 0,02 U/pl Phusion® de DNA polimerase "Hot Start" (Biozym Scientific GmbH, D-31840 Hess. Olden- dorf) em urn termociclador (Mastercycler, Eppendorf AG, Hamburg) sob as seguintes condições: 98°C durante 1 minuto; 30 ciclos ' (98°C, 20 s; 63°C, 20 s; 72°C, 40 s); 72°C durante 6 min.

[00136] O fragmento de PCR de lysE de 761 bp (vide SEQ ID No. 3) foi clonado em pVWExI conforme descrito abaixo:

[00137] Preparação do vetor: 1 pg de DNA plasmidial de pVWExI foi clivado no sistema de tampão enzima-específico contendo 10 unidades da enzima Pstl por incubação a 37°C durante 1 h. Imediatamente após, a mistura de clivagem foi tratada com o kit Quick Blunting (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main) de acordo com as instruções do fabricante e, então, purificada com o uso do kit de purificação QiaExll (Qiagen AG, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O vetor pré-tratado desta forma foi, então, clivado com 10 unidades de Xbal no sistema de tampão enzima-específico a 37°C durante 1 h e, então, purificado novamente com o uso do kit de purificação QiaExll.

[00138] Preparação do inserto: o fragmento de PCR de lysE foi clivado com 10 unidades de cada uma das enzimas Avrll e EcoRV e, então, purificado com o uso do kit de purificação QiaExll de acordo com as instruções do fabricante.

[00139] Ligação: o vetor e o inserto foram misturados a uma razão molar de 1:5 e ligados usando DNA ligase T4 a 16°C durante 1 h. Células E. coli DH5alpha quimicamente competentes (Subcloning efficiency, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha) foram transformadas com 3 pl da mistura de ligação.

[00140] Os transformantes foram identificados com base na sua resistência à canamicina sobre placas de ágar LB contendo 50 pg/mL de sulfato de canamicina. O DNA plasmidial foi isolado de 4 dos ditos transformantes, e os plasmídios foram testados por análise de restrição para a presença do fragmento de 0,75 kb como um inserto. O plasmídio recombinante produzido desta forma foi chamado de pVWExIlysE.

[00141] A sequência de nucleotídeos do fragmento de 0,75 kb no plasmídio pVWEx1-lysE foi determinada pelo método de terminação de cadeia dideóxi, de acordo com Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467). Para isto, o inserto completo do plasmídio pVWExI lysE foi sequenciado com o auxílio dos iniciadores oligonu- cleotidicos pVW_1.p (5'-TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA C-3') and pVW_2.p (5'-CGA CGG CCA GTG AAT TCG AG-3') em Eurofins MWG Operon GmbH (Ebersberg, Alemanha).

[00142] A sequência de nucleotídeos obtida foi analisada com o uso do programa Clone Manager 9 e é mostrada através da SEQ ID No. 20.

Exemplo 2 Construção do vetor pK18mobsacB DarqFRGH para deleção da região arqFRGH em Corynebacterium glutamicum

[00143] Para isto, primeiramente, o DNA cromossômico foi isolado de C. glutamicum ATCC13032 pelo método de Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179). Os oligonucleotídeos mencionados abaixo foram selecionados com base na sequência dos genes de argFRGH de C. glutamicum de modo a preparar o construto de deleção de argFRGH. O dito construto de deleção foi gerado com o auxílio da reação em cadeia de polimerase (PCR), mais especificamente, pelo método Gene SOEing (Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)). argFRGH_d1: 5-GGT GGT GCT AGO CCG GCG ATT TCT TTG CAC AT- 3' (vide SEQ ID No. 24) argFRGH_d2: 5'-AAT GCT TAT CGA CGT ACC CCC CTG TGG TTG TGA AGT CAT A-3' (vide SEQ ID No. 25) argFRGH_d3: 5'-GGG GTA CGT CGA TAA GCA TT-3' (vide SEQ ID No. 26) argFRGH_d4: 5'-GGT GGT ATG CAT GGT GAT GGT TCC GAA TGT TG- 3' (vide SEQ ID No. 27)

[00144] Os iniciadores oligonucleotídicos mostrados foram comprados da Eurofins MWG Operon GmbH (Ebersberg, Alemanha). A reação de PCR foi executada com o uso da DNA polimerase Phusion® "Hot Start" (Biozym Scientific GmbH, D-31840 Hess, Oldendorf) em urn termociclador (Mastercycler, EppendorfAG, Hamburg).

[00145] O iniciador argFRGH_d2 é composto de duas regiões. Uma parte da sequência de nucleotídeos é complementar à região de 1 bp à montante até 19 bp à jusante do códon de início do gene argF. A ou- tra parte da sequência de nucleotídeos é complementar à região do nucleotídeo 1419 do gene argH até 5 nucleotídeos à jusante do gene argH.

[00146] Com o auxílio da reação em cadeia de polimerase, os iniciadores argFRGH_1 e argFRGH_2 permitem que um fragmento de DNA de 543 bp seja amplificado e os iniciadores argFRGH_3 e arg- FRGH 4 permitem que um fragmento de DNA de 513 bp seja amplificado. Os amplicons foram produzidos por PCR, testados por eletroforese em um gel de agarose com concentração de 0,8%, isolados do dito gel de agarose usando o kit High Pure PCR Product Purification Kit (n° do produto 1732676, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), e empregados como molde para outra reação de PCR com o uso dos iniciadores argFRGH I e argFRGH_4. Desta forma, o derivado de deleção de DargFRGH de 1036 bp foi gerado (vide também SEQ ID No. 21). Isto inclui 477 bp da extremidade 3' do gene argD, 19 bp da extremidade 5' do gene argF, 15 bp da extremidade 3' do gene argH, e 420 bp da extremidade 5' da fase de leitura de cg1589. O produto amplificado desta forma foi testado por eletroforese em um gel de agarose com concentração de 0,8%.

[00147] O produto de PCR de DargFRGH de 1,04 kb (SEQ ID No. 21) foi clivado completamente pelas enzimas Ndel e Nsil. O fragmento foi subsequentemente purificado com o uso do kit de purificação de PCR (Qiagen, Hilden, Alemanha). O derivado de deleção de DargFRGH pré-tratado desta forma foi empregado junto com o vetor de clonagem mobilizável pK18mobsacB (Schãfer et al. (1994), Gene 14: 69-73) para ligação. O dito vetor de clonagem havia sido anteriormente clivado completamente pelas endonucleases de restrição Xbal e Pstl. Isto produziu extremidades de DNA compatíveis com as extremidades do inserto gerado pela divagem de Ndel e Nsil. O vetor preparado desta forma foi misturado com o fragmento de DargFRGH a uma razão molar de 1:5 e foram ligados usando a DNA ligase T4 (Amersham- Pharmacia, Freiburg, Alemanha) a 16°C durante 1 hora. Células E. coli DH5alpha quimicamente competentes (Subcloning efficiency, Invitro- gen GmbH, Karlsruhe, Alemanha) foram transformadas com 3 pl da mistura de ligação. Os transformantes foram identificados com base na sua resistência à canamicina sobre placas de ágar LB contendo 50 pg/mL de sulfato de canamicina. O DNA plasmidial foi isolado de 4 dos ditos transformantes (QIAprep Spin Miniprep Kit da Qiagen (Hilden)), e os plasmídios foram testados por análise de restrição para a presença do fragmento de 1,04 kb como um inserto. O plasmídio recombinante produzido desta forma foi chamado de pK18mobsacB_DargFRGH. A cepa foi chamada de E.coli_DH5alpha/pK18mobsacB_DargFRGH.

[00148] A sequência de nucleotídeos do fragmento de 1,04 kb (SEQ ID No. 21) no plasmídio pK18mobsacB_DargFRGH foi determinada pelo método de terminação de cadeia dideóxi, de acordo com Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467). Para isto, o inserto completo do plasmídio pK18mobsacB_DargFRGH foi sequenciado e testado, assim para exatidão com o auxílio dos iniciadores oligonucleotidicos M13 uni (-21) (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3') e M13 rev (-49) (5-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3') em Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha).

Exemplo 3 Preparação da cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 DarqFRGH

[00149] O vetor mencionado no exemplo 2, pK18mobsacB_DargFRGH, foi transferido através de conjugação de acordo com um protocolo por Schãfer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) na cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Para este propósito, o vetor havia sido anteriormente transformado na cepa de E. coli S17-1 (Simon et al.,Biotechnology 1: 784-791). A identidade do vetor em S17-1 foi testada de modo similar à detecção em E. coli DHδalpha (vide Exemplo 2).

[00150] Os vetores pK18mobsacB e pK18mobsacB_DargFRGH não podem se auto-replicar em C. glutamicum ATCC13032 e permanecem na célula apenas se eles estiverem integrados no cromossomo após um evento de recombinação. Os clones com pK18mobsacB_DargFRGH integrado são selecionados por plaquea- mento da mistura de conjugação em ágar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2aEd., Cold Spring Harbor, New York, 1989) suplementado com 15 mg/L de canamicina e 50 mg/ml de ácido nalidixico. Os clones estabelecidos são plaqueados por esfriamento sobre placas de ágar LB contendo 25 mg/L de canamicina e incubados a 33°C durante 16 horas. Mutantes nos quais o plasmídio foi cortado devido a um segundo evento de recombinação são selecionados pelo cultivo dos clones em meio LB líquido sem seleção durante 20 horas e, então, esfriamento dos mesmos em ágar LB contendo 10% de sacarose, seguido de incubação durante 24 horas.

[00151] O plasmídio pK18mobsacB_DargFRGH, como o plasmídio inicial pK18mobsacB, contém, em adição ao gene resistência à canamicina, uma cópia do gene sacB que codifica levansucrase de Bacillus subtilis. A expressão induzível por sacarose leva à formação de levansucrase que catalisa a síntese do produto levan que é tóxico para C. glutamicum. Consequentemente, apenas os clones nos quais o pK18mobsacB_DargFRGH integrado foi cortado novamente estabeleceram crescimento em ágar LB contendo sacarose. O corte pode compreender corte do plasmídio junto com a cópia cromossômica completa de argFRGH ou a cópia incompleta que tem a deleção interna de argFRGH.

[00152] Aproximadamente 40 a 50 colônias foram testadas para o fenótipo "crescimento na presença de sacarose"e "nenhum crescimento na presença de canamicina". De modo a provar que o alelo argFRGH deletado havia permanecido no cromossomo, aproximadamente 20 colônias tendo o fenótipo "crescimento na presença de sacarose"e "nenhum crescimento na presença de canamicina" foram estudadas pelo método de PCR padrão de Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) com o au-xílio da reação em cadeia de polimerase. Isto envolveu amplificar, a partir do DNA cromossômico das colônias, um fragmento de DNA que carrega as regiões que circundam a região de argFRGH deletada. Os seguintes oligonucleotídeos iniciadores foram selecionados para a PCR. argFRGH dl (SEQ ID No. 24): 5'-GGT GGT GCT AGC CCG GCG ATT TCT TTG CAC AT- 3' argFRGH_d4 (SEQ ID No. 27): 5'-GGT GGT ATG CATGGT GAT GGT TCC GAA TGT TG- 3'

[00153] Nos clones de controle contendo o lócus de argFRGH completo, os iniciadores permitem que um fragmento de DNA de aproximadamente 5,35 kb seja amplificado. Em clones tendo um lócus de argFRGH deletado, fragmentos de DNA de aproximadamente 1,04 kb de tamanho são amplificados.

[00154] Os fragmentos de DNA amplificados foram identificados através de eletroforese em um gel de agarose com concentração de 0,8% . Através disto, mostrou-se que a cepa transporta um alelo de argFRGH deletado no cromossomo. A cepa foi chamada de Corynebacterium glutamicum Delta argFRGH.

[00155] Exemplo 4:

[00156] Expressão do gene lysE em Corynebacterium glutamicum ATCC 13032_Delta_argFRGH

[00157] O plasmídio pVWExI LysE e o plasmídio vazio pVWExI foram introduzidos na cepa formadora de L-ornitina - ATCC 13032_Delta_argFGH - através de eletroporação (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334). Os transformantes foram identificados com base na sua resistência à canamicina sobre placas de ágar Caso contendo 25 pg/mL de canamicina. 5 clones isolados foram subsequentemente testados para exatidão do plasmídio transformado. Para este propósito, o DNA plasmidial foi isolado (Plasmid Isolation Kit, Qiagen), e este DNA foi testado por análise de restrição para o padrão de divagem correto. Desta forma, as cepas de C. glutamicum ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE e ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1 foram produzidas.

Exemplo 5: Preparação de L-ornitina com o uso de Corynebacterium glutamicum

[00158] De modo a estudo sua capacidade de produzir L-ornitina, em cada caso, três clones da cepa ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE e três clones da cepa ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1 foram pré-cultivados, em cada caso, em 10 ml de meio de teste a 33°C durante 16 h. Para o teste de produção, em cada caso, 10 ml do meio de teste foram inoculados com a pré-cultura obtida de modo que a ODeoo (densidade óptica a 600 nm) no início fosse 0,1. Cada clone foi testado em três frascos agitadores para que cada cepa fosse representada no respectivo tempo de coleta por nove frascos agitadores no total. O meio de teste era idêntico ao meio CgXII descrito em Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), mas continha, adicionalmente, 7,5 g/L de extrato de levedura (Difco), 25 pg/ml de canamicina, 1 mM de IPTG (isopropil be- ta-D-tiogalactopiranosídeo) e 40 g/L de sacarose ao invés de glicose. Por razões de simplicidade, a composição do meio de teste está re- sumida na Tabela 2 abaixo. Tabela 2

[00159] O cultivo foi executado em frascos agitadores de 100 ml a 33°C e 200 rpm. A deflexão do agitador foi 5 cm. Três culturas de um clone foram coletadas após 24 e 48 horas. Para isto, amostras foram retiradas das culturas e a densidade óptica, o teor de sacarose e o teor de L-ornitina foram determinados. Para determinar os teores sacarose e L-ornitina, as células foram removidas por uma rápida centrifugação (centrífuga de bancada tipo 5415D (Eppendorf) a 13000 rpm, 10 min, temperatura ambiente).

[00160] A densidade óptica foi determinada a um comprimento de onda de 660 nm, com o uso de um fotômetro de placa de microtitula- ção GENios (Tecan, Reading, UK). As amostras foram diluídas 1:100 com água desmineralizada antes da medição.

[00161] A sacarose foi determinada com o uso de um sistema de teste (n° de Catálogo 10 716 251 035) da R-Biopharm AG (Darmstadt, Alemanha). Isto envolve a inversão da sacarose e a glicose formada é detectada com o uso de um teste enzimático acoplado (hexoqui- nase/glicose-6-fosfato desidrogenase) através da formação de NADH.

[00162] A determinação quantitativa da concentração de aminoácido extracelular a partir do sobrenadante da cultura foi executada através de HPLC de fase reversa (Lindroth et al.,Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174), com o uso de um instrumento de HPLC série HP1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Alemanha) com detector de fluorescência conectado (G1321A); o controle do sistema e a avaliação dos dados foram executados usando um equipamento HP ChemStation (Hewlett-Packard). 1 pL da solução de aminoácido a ser analisada foi misturado em uma derivatização pré-coluna automática com 20 pl de reagente de orto-ftaladeído/2-mercapto etanol (Pierce Europe BV, Oud-Beijerland, Holanda). Os isoindois tio-substituídos fluorescentes resultantes (Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482) foram fracionados em uma combinação de pré- coluna (40'4 mm Hypersil ODS 5) e coluna principal (Hypersil ODS 5, ambas as colunas da CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Alemanha) com o uso de um programa de gradiente com uma fase progressivamente não polar (metanol). O eluente era acetato de sódio (0,1 M; pH 7,2); a taxa de fluxo foi de 0,8 mL por minuto. A fluorescência dos aminoácidos derivatizados foi detectada a um comprimento de onda de excitação de 230 nm e um comprimento de onda de emissão de 450 nm. As concentrações de L-ornitina e/ou cloridrato de L-ornitina foram calculadas por comparação com um padrão externo e L-asparagina como padrão interno adicional.

[00163] O peso molecular do cloridrato de L-ornitina é 168,6 g x mol’1 e o da L-ornitina é 132,1 g x mol1.

[00164] O rendimento foi calculado por dividir a quantidade de L- ornitina formada (medida como cloridrato de L-ornitina) pela quantidade de sacarose consumida.

[00165] Os resultados são mostrados na tabela 3.

[00166] Tabela 3: Formação L-ornitina após 24 horas (Tabela 3A) e 48 horas (Tabela 3B) de incubação. Abreviações: *: ATCC 13032_Delta_argFRGH; Orn-HCI: cloridrato de L-ornitina. Tabela 3A:

Tabela 3B:

Exemplo 6: Sequenciamento e deposição do plasmídio pEC7lysE

[00167] O plasmídio pEC7lysE foi disponibilizado sob a forma de uma solução aquosa pelo Dr. Lothar Eggeling (Forschungszentrum Jülich GmbH, D-52425 Jülich), o autor correspondente da publicação Bellmann et al.(Microbiology (2001) 147, 1765-1774).

[00168] Uma alíquota da solução de DNA obtida foi empregada para transformar células de Escherichia coli competentes da cepa DH5alpha (eficiência de subclonagem, genótipo: F-ψ80/acZΔM15 Δ(ZacZYA-argF) U169 recM endM hsc/R17 (rK-, mk+) pho/X supE44 I- thi-1 gyrA96 relM) da Invitrogen GmbH (Paisley, UK) de acordo com as instruções do fabricante. Os transformantes foram selecionados em ágar Luria-Bertani suplementado com 50 pg/mL de canamicina.

[00169] Um transformante chamado de Escherichia coli DH5alpha/pEC7lysE(DM2204) foi depositado de acordo com o Tratado de Budapeste junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Brunswick, Alemanha) sob o número de deposição DSM 23239 em 15 de janeiro de 2010.

[00170] O plasmídio pEC7lysE da cepa DSM 23239 foi completamente sequenciado por sequenciamento de DNA customizado (Walking Service) na Eurofins MWG Operon GmbH (Martinsried, Alemanha). A sequência de pEC7lysE está mostrada como SEQ ID No. 29.

Claims (6)

1. Processo para a preparação de L-ornitina, caracterizado pelo fato de que as seguintes etapas são executadas: a) fermentação de uma bactéria que excreta L-ornitina selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter e a Enterobacteriaceae que superexpressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um exportador de L-ornitina e cuja sequência de aminoácidos é idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2, em um meio, b) acúmulo da dita L-ornitina no dito meio, em que um caldo de fermentação é obtido, e c) em que o plasmídio pEC7lysE, depositado em DSM23239, é excluído para superexpressão.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, no caso de Corynebacterium glutamicum, a superexpressão aumenta o nível de atividade de exportação de L-ornitina em pelo menos 10% em comparação a ATCC13032 ou ATCC14067 ou ATCC13869.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a superexpressão é obtida por uma ou mais medidas selecionadas a partir do grupo compreendendo a) aumentar o número de cópias, e b) usar um promotor forte.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Corynebacterium, de preferência, Corynebacterium glutamicum.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo compreendendo um processo em batelada, processo em batelada alimentada, processo em batelada alimentada repetitivo, e processo con- tínuo.

6.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a L-ornitina ou um produto líquido ou sólido contendo L-ornitina é recuperado do caldo de fermentação contendo L-ornitina.

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