BR102019014297A2 - método para a produção fermentativa de l-lisina - Google Patents

Abstract

método para a produção fermentativa de l-lisina a presente invenção disponibiliza um método inovador para a produção fermentativa de l-lisina com o uso de bactérias da espécie corynebacterium glutamicum, as quais têm a habilidade de excretar l-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional, em que um aminoácido em uma posição particular da sequência de aminoácidos do polipeptídeo foi substituído por um aminoácido proteinogênico diferente.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE L-LISINA [0001] A L-lisina é usada em medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria alimentícia e particularmente em nutrição de animais. A L-lisina é produzida por fermentação de cepas da espécie Corynebacterium glutamicum. Devido à grande importância econômica, tem-se trabalhado continuamente para melhorar os métodos de produção. As melhorias podem estar relacionadas com a tecnologia de fermentação como, por exemplo, agitação e fornecimento de oxigênio, ou a composição do meio de nutriente, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou o processamento do caldo de fermentação para uma forma de produto adequada, por exemplo, por secagem e granulação do caldo de fermentação ou cromatografia de troca iônica ou pode se relacionar com as propriedades de desempenho intrínseco do próprio microrganismo.

[0002] Os métodos usados para melhorar as propriedades de desempenho desses microrganismos são os de mutagênese, seleção e triagem de mutantes. As cepas obtidas desse modo são resistentes a antimetabólitos ou são auxotróficas para metabólitos de importância regulatória e produzem L-lisina. Um antimetabólito bem conhecido é o análogo de L-lisina S(2-aminoetil)-L-cisteína (consultar, por exemplo, Tosaka et al.: Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752, (1978)).

[0003] Métodos de tecnologia de DNA recombinante foram usados de modo similar por diversos anos para melhoramento de cepas produtoras de L-lisina da espécie Corynebacterium

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2/46 glutamicum, modificando-se, isto é, melhorando ou atenuando, genes individuais envolvidos em biossíntese de L-lisina e investigando-se o efeito na produção de Llisina.

[0004] As sequências de nucleotídeo dos cromossomos de várias bactérias ou cepas, respectivamente, da espécie Corynebacterium glutamicum e sua análise foram reveladas. Essas informações estão disponíveis em bancos de dados publicamente acessíveis e podem ser usadas para propósitos de desenvolvimento de cepas. Um de tais bancos de dados é o banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional de Informações Biotecnológicas [National Center for Biotechnology Information], U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA) .

[0005] Durante o procedimento de anotação para um cromossomo sequenciado de um organismo, estruturas identificadas, como, por exemplo, genes ou sequências de codificação são dotadas de um identificador exclusivo denominado locus_tag pelo fornecedor das informações do banco de dados.

[0006] A sequência de nucleotídeos do cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e sua análise foram descritos por Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)) e no documento EP1108790. As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_003450. Na sequência de cromossomos revelada sob o número de acesso NC_003450, locus_tag NCgl0458 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína antiterminação de transcrição NusG. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o

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3/46 identificador NP_599720.1. No documento EP1108790, a sequência de codificação é revelada sob a sequência 532 (consultar número de acesso GenBank AX120616).

[0007] A sequência de nucleotídeos do cromossomo ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e sua análise foram independentemente descritos por Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003)). As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_006958. Locus_tag CGTRNA_RS02440 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de terminação/antiterminação de transcrição NusG. A designação cg0562 de old_locus_tag também é usada na técnica. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o identificador WP_011013678. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo também está disponível sob o número de acesso CAF19189, onde é descrita como proteína antiterminação de transcrição NusG.

[0008] As sequências de nucleotídeo de locus_tag NCgl0458 e CGTRNA_RS02440 são idênticas.

[0009] A antiterminação é um mecanismo para controlar a transcrição por RNA polimerase em bactérias. Durante a antiterminação, a atividade de RNA polimerase é modificada para que leia além de um terminador transcricional em genes que se encontram a jusante do dito terminador.

[0010] The Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics (Springer, Dordrecht, 2008; DOI: https ://doi.org/10.1007/978-1-4020-6754-9_978) declara : Antitermination permits RNA polymerase to ignore transcription termination instructions such as bacterial rho and thus proceed through the termination signal. [A

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antiterminação	permite	que a RNA polimerase	ignore	as
instruções de	terminação de	transcrição,	como	rho
bacteriana, e	então	prossiga	através do	sinal	de
terminação] ”.

[0011] Um antiterminador clássico conhecido em genética bacteriana é a proteína de antiterminador N de fago λ (lambda) de Escherichia coli. A dita proteína de antiterminador N permite a expressão de genes de fago, permitindo que o vírus inicie sua fase lítica. A proteína N do fago λ forma um complexo com proteínas hospedeiras denominadas fatores Nus (substâncias de utilização de N (proteína de fago lambda)) necessárias para modificar a atividade da RNA polimerase de tal modo que não responda mais a terminadores. Um desses fatores Nus é a proteína ou polipeptídeo resp. NusG. O banco de dados EcoCyc (SRI International (Stanford Research Institute), Menlo Park, EUA, CA) para Escherichia coli resume sob o número de acesso EG10667 para o polipeptídeo codificado pelo gene nusG: O fator de terminação de transcrição NusG é necessário para alguns tipos de terminação dependente de Rho, bem como para antiterminação de transcrição.

[0012] Demais leituras referentes à terminação e antiterminação transcricional podem ser encontradas em livros de microbiologia, biologia molecular ou genética, por exemplo, no livro Lewin's Genes XII de Jocelyn E. Krebs, Elliot S. Goldstein e Stephen T. Kilpatrick (Jones & Bartlett Learning, Burlington MA (EUA), 2018) .

[0013] Barreiro et al. (Applied and Environmental Microbiology 67(5), 2183-2190, 2001) relatam a organização e a análise transcricional de um agrupamento de seis genes

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5/46 de Corynebacterium glutamicum que compreendem o gene nusG. Barreiro et al. se referem ao polipeptídeo codificado como proteína de antiterminador NusG.

[0014] O gene que codifica o polipeptídeo NusG é denominado nusG. Informações referentes a sinais de transcrição em Corynebacterium glutamicum, por exemplo, região (ou regiões) -10 de um promotor, ou um sítio de início transcricional (ou sítios de início transcricional) do gene nusG (old_locus_tag cg0562) podem ser encontradas em Pfeifer-Sancar et al. (BMC Genomics 14:888 (2013)) ou Barreiro et al.

[0015] A técnica descreve o polipeptídeo NusG como um antiterminator transcricional. Consequentemente, o polipeptídeo NusG tem a atividade de um polipeptídeo envolvido em transcrição ou a atividade de um fator transcricional resp.

[0016] O objetivo da presente invenção consiste em fornecer medidas inovadoras para a produção fermentativa de L-lisina por bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0017] Para alcançar o objetivo definido acima, a presente invenção disponibiliza um novo método para a produção fermentativa de L-lisina com o uso de bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum, as quais têm a habilidade de excretar L-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional, em que o aminoácido na posição 210 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo contém qualquer aminoácido proteinogênico diferente de asparagina, preferencialmente ácido aspártico ou ácido

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6/46 glutâmico em vez de asparagina.

[0018] A presente invenção disponibiliza adicionalmente métodos para a fabricação de um produto que contém a dita L-lisina do caldo de fermentação.

[0019] Consequentemente, a presente invenção fornece o seguinte:

[0020] Um método para a produção fermentativa de Llisina que compreende as etapas de

a. fornecer uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, a qual tem a habilidade de excretar Llisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional e que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido asparagina na posição 210 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente, preferencialmente por ácido glutâmico ou ácido aspártico, de modo particularmente preferencial por ácido aspártico,

b. cultivar a bactéria em um meio adequado sob condições adequadas, e

c. acumular a L-lisina no meio para formar uma L-lisina contendo caldo de fermentação.

[0021] Constatou-se que as bactérias modificadas fornecidas no método de acordo com a invenção excretaram Llisina, em um meio adequado sob condições de fermentação adequadas de uma maneira aumentada em relação a um ou mais parâmetros selecionados a partir de concentração de produto (isto é, quantidade de L-lisina produzida por volume, ou unidade de massa, respectivamente, de meio/caldo de

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7/46 fermentação (por exemplo, g/l ou g/kg)), rendimento de produto (isto é, quantidade de L-lisina produzida por fonte de carbono consumida (por exemplo, g/g ou kg/kg)), taxa de formação de produto (isto é, quantidade de L-lisina produzida por volume, ou unidade de massa, respectivamente, de meio/caldo de fermentação e unidade de tempo (por exemplo, g/l x h ou g/kg x h)), e taxa de formação de produto específica (isto é, quantidade de L-lisina produzida por unidade de tempo e unidade de massa do produtor (por exemplo, g/h x g de massa seca)) em comparação à bactéria não modificada.

[0022] É evidente que uma maior concentração de produto facilita a fabricação de produto, por exemplo, purificação e isolamento. Um rendimento de produto aumentado reduz a quantidade de matéria-prima necessária. Uma taxa de formação de produto aumentada reduz o tempo necessário para um ciclo de fermentação, aumentando, desse modo, a disponibilidade de um dado fermentador.

[0023] O método de acordo com a invenção contribui, então, para a melhora de aspectos técnicos e econômicos da fabricação de L-lisina ou produtos contendo L-lisina.

[0024] Em um conjunto de modalidades preferenciais, a invenção fornece o seguinte:

[0025] Em uma modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1328 da SEQ ID NO:1, sendo que as nucleobases da posição 1002 a 1004 são gac ou gat,

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8/46 preferencialmente gac.

[0026] Em uma modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1331 da SEQ ID NO:1, sendo que as nucleobases da posição 1002 a 1004 são gac ou gat, preferencialmente gac.

[0027] Em uma modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 114 a 1331 da SEQ ID NO:1, sendo que as nucleobases da posição 1002 a 1004 são gac ou gat, preferencialmente gac.

[0028] Em uma modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 114 a 1402 da SEQ ID NO:1, sendo que as nucleobases da posição 1002 a 1004 são gac ou gat, preferencialmente gac.

[0029] A sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:3 é idêntica àquela da SEQ ID NO:1 além da nucleobase na posição 1002. A nucleobase na posição 1002 da SEQ ID NO:1 é adenina. A nucleobase na posição 1002 da SEQ ID NO:3 é guanina. Consequentemente, as nucleobases das posições 1002

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9/46 a 1004 da SEQ ID NO:3 são gac, um códon para ácido aspártico. Consequentemente, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 contém o aminoácido ácido aspártico na posição 210 .

[0030] Em outro conjunto de modalidades preferenciais, a invenção considera a degeneração do código genético e fornece o seguinte:

[0031] Em outra modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1328 da SEQ ID NO:5.

[0032] Em outra modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1331 da SEQ ID NO:5.

[0033] Em outra modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 114 a 1331 da SEQ ID NO:5.

[0034] Em outra modalidade preferencial, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional que compreende a sequência de

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10/46 nucleotídeos das posições 114 a 1402 da SEQ ID NO:5.

[0035] A sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID

NO:5 é	idêntica àquela	da	SEQ	ID	NO:3	com as	seguintes
exceções	: A nucleobase	na	posição	995	da SEQ	ID NO:5 é
citocina	resultante em	um	códon	de	ttc	para o	aminoácido

fenilalanina na posição 207 da sequência de aminoácidos. A nucleobase na posição 998 da SEQ ID NO:5 é citocina resultante em um códon de gtc para o aminoácido valina na posição 208 da sequência de aminoácidos. A nucleobase na posição 1001 da SEQ ID NO:5 é citocina resultante em um códon de ggc para o aminoácido glicina na posição 209 da sequência de aminoácidos. A nucleobase na posição 1004 da SEQ ID NO:5 é timina resultante em um códon de gat para o aminoácido ácido aspártico na posição 210 da sequência de aminoácidos.

[0036] Consequentemente, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5 posições 375 a 1328 é idêntica àquela da SEQ ID NO:4 codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3 nas posições 375 a 1328. As sequências de aminoácido da SEQ ID NO:4 e da SEQ ID NO:6 contêm o aminoácido ácido aspártico na posição 210.

[0037] O termo L-lisina, quando mencionado no presente documento, em particular no contexto de formação de produto, também compreende suas formas iônicas e sais, por exemplo, monocloridrato de ou sulfato de L-lisina.

[0038] Para a prática da presente invenção, bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum são usadas. Uma descrição do gênero Corynebacterium e da espécie Corynebacterium glutamicum compreendida por esse gênero

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11/46 pode ser encontrada no artigo Corynebacterium de K. A. Bernard e G. Funke em Bergey's Manual of Systematics of Archaea e Bacteria (Bergey's Manual Trust, 2012).

[0039] Bactérias adequadas para o método desta invenção são cepas excretoras de L-lisina de Corynebacterium glutamicum, por exemplo, cepas excretoras de L-lisina obtidas por uma ou diversas etapas de desenvolvimento de cepa da cepa ATCC13032 e similares e modificadas como descrito nesta invenção.

[0040] A cepa ATCC13032 (também disponível como DSM20300) é a cepa do tipo taxonômico da espécie Corynebacterium glutamicum. Um estudo taxonômico desse grupo de bactérias baseado em hibridização de DNA-DNA foi feito por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260, 1991). Uma análise comparativa de várias cepas da espécie Corynebacterium glutamicum baseada em análise de sequência foi fornecido por Yang e Yang (BMC Genomics 18(1) :940) .

[0041] Uma multitude de cepas que excretam L-lisina do gênero Corynebacterium, em particular da espécie Corynebacterium glutamicum, foi obtida na técnica durante as últimas décadas, tendo início em cepas como ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 e similares. Foram obtidas como resultado de programas de desenvolvimento de cepa com o uso, entre outros, de métodos como mutagênese clássica, seleção para resistência antimetabólito, bem como amplificação e modificação de promotor de genes da via biossintética da L-lisina por métodos de engenharia genética. Resumos podem ser encontrados em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press,

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2005) ou H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnology, Springer Verlag, 2013) ou A. Yokota e M. Ikeda (Amino Acid Fermentation, Springer Verlag, 2017).

[0042] As cepas excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são amplamente conhecidas na técnica e podem ser modificadas como descrito na presente invenção. Por exemplo, Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009) descrevem uma cepa DM1933, a qual está depositada sob número de acesso DSM25442 de acordo com o tratado de Budapeste. A cepa DM1933 foi obtida a partir de ATCC13032 por diversas etapas de desenvolvimento de cepa. Além disso, a cepa de Corynebacterium glutamicum excretora de L-lisina DM2031, depositada de acordo com o Tratado de Budapeste como DSM32514 pode ser usada. A cepa DM2031 é um derivado desenvolvido posteriormente a partir de DM1933 que tem habilidade melhorada de excreção de L-lisina. Outras cepas Corynebacterium glutamicum que excretam L-lisina são descritas, por exemplo, nos documentos W02008033001 e EP0841395.

[0043] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum contêm tipicamente um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. Uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação significa uma aspartoquinase que é menos sensível, ou dessensibilizada, respectivamente, à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina, por exemplo, 10 mM cada, ou misturas do análogo de L-lisina S-(2-aminoetil)-LPetição 870190064830, de 10/07/2019, pág. 75/138

13/46 cisteína e L-treonina, por exemplo, S-(2-aminoetil)-Lcisteína 50 mM e L-treonina 10 mM, em comparação à forma selvagem da enzima, que está contida em cepas selvagens como, por exemplo, ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869. O número EC para aspartoquinase é EC 2.7.2.4. Descrições de polinucleotídeos de Corynebacterium glutamicum que codificam uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação são dadas, por exemplo, nos documentos US5688671, US6844176 e US6893848. Uma lista resumida pode ser encontrada, entre outros, no documento WO2009141330. O símbolo usado na técnica para um gene que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase é lysC. Caso o gene codifique uma variante de polipeptídeo resistente a realimentação, a técnica usa tipicamente símbolos como lysC^fbr com fbr indicando resistência a realimentação.

[0044] Consequentemente, as ditas cepas excretoras de Llisina da espécie Corynebacterium glutamicum modificada como descrito na presente invenção contêm preferencialmente pelo menos (>) uma cópia de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo aspartoquinase resistente à realimentação. [0045] A SEQ ID NO:7 mostra a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação do polipeptídeo de aspartoquinase da cepa ATCC13032 e a SEQ ID NO:8 mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Sabese, na técnica (consultar documento US6893848), que a troca do aminoácido Thr na posição 311 da SEQ ID NO:8 por Ile confere à enzima resistência à realimentação para inibição por misturas de L-lisina e L-treonina.

[0046] Consequentemente, é preferencial que a sequência de aminoácidos da dita aspartoquinase resistente à

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14/46 realimentação polipeptídeo compreenda a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 contendo isoleucina na posição 311.

[0047] A dita troca de amino pode ser alcançada ao trocar a nucleobase citosina (c) na posição 932 da SEQ ID NO:7 para produzir timina (t). O códon acc para treonina é, então, alterado para o códon atc para isoleucina.

[0048] Sabe-se, ainda, na técnica que a troca do códon de início gtg da sequência de codificação para o polipeptídeo de aspartoquinase por atg melhora a expressão do polipeptídeo (consultar, por exemplo, documento EP2796555).

[0049] Consequentemente, é preferencial que a sequência que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação seja iniciada com um códon de início atg.

[0050] Resumos referentes ao melhoramento de cepas que excretam L-lisina de Corynebacterium glutamicum podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005), V. F. Wendisch (Amino Acid Biosynthesis - Pathways, Regulation and Metabolic Engineering, Springer Verlag, 2007), H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013), e Eggeling e Bott (Applied Microbiology and Biotechnology 99 (9), 3387-3394, 2015).

[0051] O termo DSM denota o depositório Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen localizado em Braunschweig, Alemanha. O termo ATCC denota o centro depositório American Type Culture Collection [Coleção Americana de Culturas Celulares] localizado em Manasass,

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Virginia, EUA.

[0052] Os detalhes referentes à bioquímica e à estrutura química de polinucleotídeos e polipeptídeos, como presente em seres vivos, como bactérias como Corynebacterium glutamicum ou Escherichia coli, por exemplo, podem ser encontrados, entre outros, no livro Biochemie por Berg et al (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlim, Alemanha, 2003; ISBN 3-8274-1303-6).

[0053] Os polinucleotídeos consistindo em monômeros de ribonucleotídeos contendo as bases nucleotídicas ou as bases, respectivamente, adenina (a), guanina (g), citosina (c) e uracila (u) são chamados de ribopolinucleotídeos ou ácido ribonucleico (DNA). Os polinucleotídeos consistindo em monômeros de ribonucleotídeos contendo as nucleobases ou as bases, respectivamente, adenina (a), guanina (g), citosina (c) e uracila (u) são chamados de ribopolinucleotídeos ou ácido ribonucleico (RNA). Os monômeros nos ditos polinucleotídeos são covalentemente ligados entre si por uma ligação de 3',5'-fosfodiéster. Por convenção, os polinucleotídeos de fita simples são escritos da direção 5'- para 3'-. Consequentemente, um polinucleotídeo tem uma extremidade 5' e uma extremidade 3'. A ordem dos monômeros de nucleotídeo no polinucleotídeo é comumente denominada sequência de nucleotídeos. Consequentemente, um polinucleotídeo é caracterizado pela sua sequência de nucleotídeos. Para o propósito desta invenção, desoxirribopolinucleotídeos são preferenciais. Em bactérias, por exemplo, Corynebacterium glutamicum ou Escherichia coli, o DNA está tipicamente presente em forma de fita dupla. Consequentemente, o comprimento de uma

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16/46 molécula de DNA é tipicamente dado em pares de bases (pb). A sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo específico é denominada sequência de codificação (cds). Um tripleto de nucleotídeos que especifica um aminoácido ou um sinal de parada para a tradução é denominado códon. Os códons que especificam diferentes aminoácidos são bem conhecidos na técnica.

[0054] Um gene de um ponto de vista químico é um polinucleotídeo, de preferência, um desoxirribopolinucleotídeo.

[0055] O DNA pode ser sintetizado de novo pelo método da fosforamidita (McBride e Caruthers: Tetrahedon Letters 24(3) 245- 248 (1983)). Resumos referentes de novo à síntese de DNA podem ser encontrados no artigo de revisão de Kosuri e Church (Nature Methods 11(5), 499 - 507 (2014)) ou no artigo de Graf et al. no livro Systems Biology and Synthetic Biology” de P. Fu e S. Panke (John Wiley, US, 2009, pp 411-438).

[0056] O termo gene se refere a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo específico (sequência de codificação) e o códon de parada adjacente. Em um sentido mais amplo, o termo inclui sequências reguladoras precedentes e subsequentes à sequência de codificação. A sequência precedente é localizada na extremidade 5' da sequência de codificação e também é denominada sequência a montante. Um promotor é um exemplo de uma sequência reguladora localizada em 5' em relação à sequência de codificação. A sequência após a sequência de codificação está localizada em sua extremidade 3' e também é denominada sequência a

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17/46 jusante. Um terminador transcricional é um exemplo de uma sequência reguladora localizada em 3' em relação à sequência de codificação.

[0057] Os polipeptídeos consistem em monômeros de Laminoácido unidos por ligações peptídicas. Para a abreviação de L-aminoácidos, o código de uma letra e o código de três letras da IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) é usado. Devido à natureza da biossíntese de polipeptídeo, os polipeptídeos têm uma extremidade amino terminal e uma extremidade carboxil terminal também denominadas extremidade N-terminal e extremidade C-terminal. A ordem dos L-aminoácidos ou resíduos de L-aminoácido, respectivamente, no polipeptídeo é comumente denominada sequência de aminoácidos. Os polipeptídeos também são denominados proteínas.

[0058] Além disso, é conhecido na técnica que o códon de iniciação ou códon de partida, respectivamente, gtg de uma sequência de codificação, assim como atg, codifica o aminoácido metionina. Sabe-se, na técnica, que o aminoácido N-terminal metionina de um polipeptídeo codificado pode ser removido por uma aminopeptidase durante ou após tradução (Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick: Lewin's Genes X, Jones e Bartlett Publishers, EUA, 2011). O documento WO0202778 descreve o isolamento, a purificação e o sequenciamento de N-terminal da malato desidrogenase de Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

[0059] Os L-aminoácidos proteinogênicos devem ser compreendidos como os L-aminoácidos presentes em proteínas naturais, as quais são as proteínas de microrganismos, plantas, animais e seres humanos. Os L-aminoácidos

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18/46 proteinogênicos compreendem ácido L-aspártico, Lasparagina, L-treonina, L-serina, ácido L-glutâmico, Lglutamina, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, Lmetionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, Lfenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, Larginina, L-prolina e, em alguns casos, L-selenocisteína e L-pirrolisina. É comum na técnica se referir a esses Laminoácidos proteinogênicos sem aludir à configuração L no átomo de carbono α do L-aminoácido; por exemplo, Lasparagina pode ser denominada simplesmente asparagina, Lácido aspártico pode ser denominado simplesmente ácido aspártico, etc.

[0060] Os ensinamentos e as informações quanto ao manuseio e trabalho experimental com polinucleotídeos podem ser encontrados, entre outros, no livro de J. Sambrook et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o livro de C. R. Newton e A. Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, 1994) e o livro de D. Rickwood e B. D. Hames (Gel electrophoresis of nucleic acids, a practical approach, IRL Press, 1982) .

[0061] Para análise de sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos, por exemplo, alinhamentos de sequência, o programa Clustal W (Larkin et al.: Clustal W e Clustal X versão 2.0. Em: Bioinformatics 23, 2947-2948 (2007)) ou o software público, como o CLC Genomics Workbench (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou o programa MUSCLE fornecido pela Instituto Europeu de Bioinformática (EMBL-EBI, Hinxton, Reino Unido) pode ser usado.

[0062] Corynebacterium glutamicum, em particular a cepa ATCC13032 e cepas excretoras de L-lisina obtidas a partir

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19/46 da mesma durante um programa de desenvolvimento de cepa, contém em seu cromossomo, em particular um (1), um gene que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional, também denominado antiterminator transcricional na técnica, e que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. A sequência de codificação é mostrada na SEQ ID NO:1, posições 375 a 1328. A sequência de codificação pode conter mutações silenciosas que não alteram a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NusG. Esse contexto também é conhecido como degeneração do código genético na técnica. O promotor e uma estrutura haste-ealça que indica um terminador descrito na técnica são mostrados na listagem de sequências.

[0063] Durante o trabalho para a presente invenção, constatou-se que modificar bactérias excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum ao trocar o aminoácido asparagina na posição 210 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo NusG mostrado na SEQ ID NO:2 para um aminoácido proteinogênico diferente, preferencialmente, ácido aspártico ou ácido glutâmico, de modo particularmente preferencial, ácido aspártico, aumentou sua habilidade de excretar L-lisina em um processo fermentativo em comparação com a bactéria não modificada.

[0064] A pessoa versada na técnica está ciente de diversos métodos de mutagênese para alcançar a dita modificação na Corynebacterium glutamicum.

[0065] Uma bactéria mutante de acordo com a invenção pode ser obtida por mutagênese in vivo clássica executada com populações celulares de cepas de Corynebacterium glutamicum com o uso de substâncias mutagênicas, por

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20/46 exemplo, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, ou luz ultravioleta.

[0066] A sequência de nucleotídeos que compreende o sítio de mutagênese no gene nusG pode ser amplificada por PCR com o uso de iniciadores selecionados a partir da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. Sequenciando-se o produto de PCR, os mutantes desejados são identificados. Detalhes referentes a essa abordagem podem ser encontrados, entre outros, no documento US7754446. A PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET também pode ser usada para detecção de mutação. O termo FRET é a abreviatura de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Cyril DS Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 63-75 (2006) revisa a identificação de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método. Resumos adicionais referentes a esse método podem ser encontrados no livro Lewin's Genes XII de Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick (Jones and Bartlett Publishers, EUA, 2018) ou em outros documentos da técnica.

[0067] Um método adicional de mutagênese é a edição de genoma assistida por CRISPR-Cpf1 descrita por Jiang et al. (Nature Communications | 8:15179 | DOI:10.1038/ncomms15179) ou a edição de genoma assistida por CRISPR-Cas9 descrita por Cho et al. (Metabolic Engineering, jul de 2017;42:157167. doi: 10.1016/j.ymben.2017.06.010.), Peng et al. (Microbial Cell Factories, 14 de novembro de 2017;16(1):201. doi: 10.1186/s12934-017-0814-6.) e Liu et al. (Microbial Cell Factories, 16 de novembro de 2017;16(1):205. doi: 10.1186/s12934-017-0815-5.)

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21/46 [0068] Outro método comum de realizar mutação de genes de Corynebacterium glutamicum é o método de substituição de gene descrito por Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 8487 (1991)) e adicionalmente elaborado por Schãfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)).

[0069] Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) usaram o método de substituição de gene para inativar o gene pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato carboxilase. No documento US7585650, o método foi aplicado ao gene zwf para realizar uma troca de aminoácido na posição 321 da sequência de aminoácidos da subunidade Zwf da glicose 6-fosfato desidrogenase. No documento US7754446, o método foi aplicado ao gene rel para realizar uma troca de aminoácido na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de GTP-pirofosfato quinase.

[0070] No método de substituição de gene, uma mutação, por exemplo, uma deleção, inserção ou substituição de pelo menos uma nucleobase, é fornecida por um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de nucleotídeos do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação.

[0071] No contexto da presente invenção, a sequência de nucleotídeos do gene em questão é o gene nusG.

[0072] No contexto da presente invenção, a mutação é uma substituição de pelo menos uma nucleobase localizada no códon que especifica o aminoácido asparagina na posição 210 da sequência de aminoácidos codificada (consultar SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) do polipeptídeo NusG.

[0073] Como uma consequência da dita mutação, o códon especifica um aminoácido proteinogênico diferente de asparagina, preferencialmente ácido aspártico ou ácido

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22/46 glutâmico, de modo particularmente preferencial, ácido aspártico. Os códons que especificam ácido aspártico são gac ou gat. O códon gac é preferencial.

[0074] O códon para o aminoácido na posição 210 tem a posição de 1002 a 1004 na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A sequência de nucleotídeos da posição 1002 a 1004, em particular, o nucleotídeo na posição 1002, também pode ser denominada sítio de mutação.

[0075] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação compreende i) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 5' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 5' ou sequência a montante na técnica, ii) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 3' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 3' ou sequência a jusante na técnica, e iii) a sequência de nucleotídeos do sítio de mutação entre i) e ii).

[0076] A dita sequência flanqueadora 5' e a sequência flanqueadora 3' necessárias para recombinação homóloga têm tipicamente um comprimento de pelo menos 200 pb, pelo menos 400 pb, pelo menos 600 pb ou pelo menos 800 pb. O comprimento máximo é tipicamente 1000 pb, 1500 pb ou 2000 pb.

[0077] Um exemplo de uma sequência de nucleotídeos que sofreu mutação no contexto da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:1 das posições 114 a 1402 com guanina na posição 1002 ou compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:3 das posições 114 a 1402.

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23/46 [0078] Outro exemplo de uma sequência de nucleotídeos que sofreu mutação no contexto da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:1 das posições 205 a 1802 com guanina na posição 1002, ou compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:3 das posições 205 a 1802 resp.

[0079] A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:9 das posições 8 a 1605 é idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3 das posições 205 a 1802. A SEQ ID NO: 9 contém um sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição Xbal na extremidade 5' e na extremidade 3' útil para propósitos de clonagem.

[0080] A dita sequência de flanqueamento em 5' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 8 a 804 da SEQ ID NO:9. A sequência flanqueadora 3' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 806 a 1605 da SEQ ID NO:9. O sítio de mutação está na posição 805 da SEQ ID NO:9.

[0081] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação fornecida é clonada em um vetor plasmidial, por exemplo, pK18mobsacB descrito por Schâfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)), que não é capaz de replicação autônoma em Corynebacterium glutamicum. O dito vetor de plasmídeo que compreende a dita sequência de nucleotídeos que sofreu mutação é subsequentemente transferido para a cepa desejada de Corynebacterium glutamicum por transformação com o uso de eletroporação ou conjugação. Após dois eventos de recombinação homóloga que compreendem um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 5' fornecido pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum e um evento de

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24/46 recombinação dentro da sequência flanqueadora 3' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum, um realizando a integração e o outro realizando a excisão do dito vetor de plasmídeo, a mutação é incorporada no cromossomo de Corynebacterium glutamicum. Desse modo, a sequência de nucleotídeos do gene em questão contida no cromossomo da dita cepa desejada é substituída pela sequência de nucleotídeos que sofreu mutação. A presença da mutação na cepa desejada é então confirmada, por exemplo, por análise da sequência de nucleotídeos ou PCR em tempo real com o uso de FRET como descrito acima.

[0082] Um evento de recombinação homóloga também pode ser denominado permutação.

[0083] É preferencial que as cepas de Corynebacterium glutamicum excretoras de L-lisina fornecidas para o método da presente invenção tenham a habilidade de excretar b 0,25 g/l, preferencialmente b 0,5 g/l, particularmente preferencial b 1,0 g/l, de modo muito particularmente preferencial b 2,0 g/l de L-lisina em um meio adequado sob condições adequadas.

[0084] Em um processo fermentativo de acordo com a invenção, uma Corynebacterium glutamicum modificada de acordo com a presente invenção e que tem a habilidade de excretar L-lisina é cultivada em um meio adequado sob condições adequadas. Devido à sua habilidade de excretar o dito L-lisina, a concentração do L-lisina aumenta e se acumula no meio durante o processo fermentativo e o Llisina é, então, produzido.

[0085] O processo fermentativo pode ser um processo

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25/46 descontínuo, como um processo de batelada ou um processo de batelada alimentada, ou um processo contínuo. Um resumo referente à natureza geral de processos de fermentação está disponível no livro por H. Chmiel (Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, 2011), no livro de C. Ratledge e B. Kristiansen (Basic Biotechnology, Cambridge University Press,2006) ou no livro de V.C. Hass e R. Portner (Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag, 2011).

[0086] Um meio adequado usado para a produção de Llisina por um processo fermentativo contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos e outros compostos orgânicos, conforme necessário.

[0087] As fontes de carbono adequadas incluem glicose, frutose, sacarose, bem como as matérias-primas correspondentes, como hidrolisado de amido, melaços ou xarope de milho com alto teor de frutose.

[0088] Como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de carne, hidrolisados de soja ou ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, gás de amônio ou amônia aquosa, podem ser usados.

[0089] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados.

[0090] Íons inorgânicos, como potássio, sódio, magnésio, cálcio, ferro e demais elementos-traço etc. são fornecidos

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26/46 como sais de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico.

[0091] Outros compostos orgânicos representam fatores de crescimento essenciais, como vitaminas, por exemplo, tiamina ou biotina ou L-aminoácidos, por exemplo, Lhomoserina.

[0092] Os componentes de meio podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou podem ser alimentados durante o cultivo de uma maneira adequada.

[0093] Durante o processo fermentativo, o pH da cultura pode ser controlado empregando-se compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. O pH é geralmente ajustado a um valor de 6,0 a 8,5, preferencialmente 6,5 a 8,0. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, como, por exemplo, antibióticos. O processo fermentativo é preferencialmente realizado sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O processo fermentativo é realizado, quando adequado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 40 °C, preferencialmente de 30 °C a 37 °C. Em um processo descontínuo, o cultivo é continuado até que uma quantidade da L-lisina suficiente para ser recuperado tenha sido

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27/46 formada. O cultivo é, então, concluído. Esse objetivo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, períodos mais longos de cultivo são possíveis.

[0094] Exemplos de meios e condições de cultura adequados podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005) e nos documentos de patente US5770409, US5990350, US 5275940, US5763230 e US6025169.

[0095] Então, o processo fermentativo resulta em um caldo de fermentação que contém a L-lisina desejada.

[0096] Um produto contendo a L-lisina é, então, recuperado ou fabricado em líquido ou sólido do caldo de fermentação.

[0097] Um caldo de fermentação significa um meio em que um Corynebacterium glutamicum descrito na invenção foi cultivado por um certo tempo e sob certas condições.

[0098] Quando o processo fermentativo é concluído, o caldo de fermentação resultante compreende consequentemente:

a. a biomassa (massa celular) do Corynebacterium glutamicum da invenção, sendo que a dita biomassa foi produzida devido à propagação das células do dito Corynebacterium glutamicum,

b. a L-lisina desejada acumulada durante o processo fermentativo,

c. os subprodutos orgânicos acumulados durante o processo fermentativo, e

d. os componentes do meio empregado que não foram consumidos no processo fermentativo.

[0099] Os subprodutos orgânicos incluem compostos que

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28/46 podem ser formados pelo Corynebacterium da invenção durante o processo fermentativo além da produção da L-lisina.

[0100] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou tanque de fermentação, coletado quando adequado e usado para fornecer um produto contendo a L-lisina, em forma líquida ou sólida. A expressão recuperar o produto contendo L-lisina também é usada para tanto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-lisina, o qual foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[0101] O caldo de fermentação pode ser subsequentemente submetido a uma ou mais das medições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

a. remoção parcial	(>0 %	a	<80 %)	a	completa	(100 %)	ou
quase completa	( > 80	%	, > 90	o, %,	> 95 %,	> 96 %,	>
97 %, > 98 %, >	99 %)	da	água,
b. remoção parcial	(>0 %	a	<80 %)	a	completa	(100 %)	ou
quase completa	(> 80	O, %,	> 90	o, %,	> 95 %,	> 96 %,	>
97 %, > 98 %, >	99 %)	da	biomassa,	, sendo que a última

é opcionalmente inativada antes da remoção,

c. remoção parcial	(>0 % a	<80 %) a	completa (100 %)	ou
quase completa	(>	80	o, %	, > 90 %,	> 95 %	, > 96 %	> ,
97 %, > 98 %,	>	99	o, %	, > 99,3	%, >	99,7 %)	dos
subprodutos orgânicos		formados	durante	o processo
fermentativo, e
d. remoção parcial	(	>0 a		80 %) a completa	(100 %)	ou
quase completa	(>	80	o, %	, > 90 %,	> 95 %	, > 96 %	> ,
97 %, > 98 %,	>	99	o, %	, > 99,3	%, >	99,7 %)	dos

componentes residuais do meio empregado ou dos materiais de entrada residuais resp., os quais não

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29/46 foram consumidos no processo fermentativo.

[0102] Uma grande quantidade de instruções técnicas para medições a), b), c) e d) está disponível na técnica.

[0103] A remoção de água (medição a) ) pode ser alcançada, entre outros, por evaporação, com o uso, por exemplo, de um evaporador de filme descendente, por osmose reversa ou nanofiltração. Os concentrados então obtidos podem ser adicionalmente finalizados por secagem por aspersão ou granulação por aspersão. Do mesmo modo, é possível secar o caldo de fermentação diretamente com o uso de secagem por aspersão ou granulação por aspersão.

[0104] Consequentemente, um método de acordo com a invenção compreende extrair ou eliminar substancialmente a água do dito caldo de fermentação. Em particular, pelo menos 40 % (p/p) , preferencialmente pelo menos 90 % (p/p) , mais preferencialmente pelo menos 95 % (p/p) de água são extraídos do caldo de fermentação.

[0105] A remoção da biomassa (medição b)) pode ser alcançada, entre outros, por centrifugação, filtração ou decantação ou uma combinação desses.

[0106] A remoção dos subprodutos orgânicos (medição c)) ou remoção de componentes residuais do meio (medição d) pode ser alcançada, entre outros, por cromatografia, por exemplo, cromatografia por troca de íons, tratamento com carbono ativado ou cristalização. Caso os subprodutos orgânicos ou componentes residuais do meio estejam presentes no caldo de fermentação como sólidos, podem ser removidos pela medição b).

[0107] Consequentemente, a fabricação de um produto de L-lisina de acordo com a invenção compreende uma etapa de

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30/46 purificação, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em cromatografia de troca iônica, tratamento com carbono ativado ou cristalização.

[0108] Então, por exemplo, um produto contendo L-lisina x HCl, preferencialmente contendo > 80 % de L-lisina x HCl, de modo particularmente preferencial > 90 % de L-lisina x HCl ou > 95 % de L-lisina x HCl, pode ser obtido.

[0109] Instruções gerais sobre métodos de separação, purificação e granulação podem ser encontradas, entre outros, no livro de R. Ghosh Principles of Bioseperation Engineering” (World Scientific Publishing, 2006), o livro de F. J. Dechow Seperation e Purification Techniques in Biotechnology” (Noyes Publications, 1989), o artigo Bioseparation” de Shaeiwitz et al. (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, 2012) e o livro de P. Serno et al Granulieren” (Editio Cantor Verlag, 2007) .

[0110] Um esquema de processamento a jusante para produtos de L-lisina pode ser encontrado no artigo Llisina Production” de R. Kelle et al. (L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005)) . O documento US5279744 ensina a fabricação de um produto de L-lisina purificado por cromatografia por troca de íons. O documento US5431933 ensina a fabricação de produtos de L-aminoácido secos, por exemplo, um produto de L-lisina, contendo a maioria dos constituintes do caldo de fermentação.

[0111] Então, uma concentração ou purificação da Llisina é alcançada e um produto que tem o teor desejado da dita L-lisina é fornecido.

[0112] A análise de L-lisina para determinar sua

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31/46 concentração em um ou mais períodos durante a fermentação pode ocorrer separando-se a L-lisina por meio de cromatografia por troca de íons, preferencialmente cromatografia por troca de cátions, com derivatização póscoluna subsequente com o uso de ninidrina, como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído em vez de ninidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo de visão geral sobre cromatografia por troca de íons pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science 7(6):484-487 (1989)). É possível, do mesmo modo, realizar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, com o uso de orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Um método desse tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)). A detecção é realizada fotometricamente (absorção, fluorescência). Uma resenha referente à análise de aminoácido pode ser encontrada, entre outros, no livro Bioanalytik por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha 1998).

[0113] SEÇÃO EXPERIMENTAL

A. MATERIAIS e MÉTODOS [0114] Os kits, iniciadores e produtos químicos de biologia molecular usados e alguns detalhes dos métodos aplicados são brevemente descritos no presente documento.

1. Antibióticos e produtos químicos

a. Canamicina: Solução de canamicina de Streptomyces

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32/46 kanamyceticus adquirida junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. K0254).

b. Ácido nalidíxico: Sal de sódio de ácido nalidíxico disponível junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. N4382) .

c. Se não for declarado de outro modo, todos os produtos químicos foram adquiridos analiticamente puros junto à Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2. Cultivo

Se não for declarado de outro modo, todos os procedimentos de cultivo / incubação foram realizados como a seguir:

a. Caldo LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110285) foi usado para cultivar cepas de E. coli em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 37 °C e 200 rpm.

b. Ágar LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha n° de Cat. 110283) foi usado para cultivo de cepas de E. coli em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 37 °C em uma mini-incubadora INCU-Line® da VWR (Radnor, EUA).

c. Caldo infusão de cérebro e coração (BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110493) foi usado para cultivar cepas de C. glutamicum em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 33 °C e 200 rpm.

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33/46

d. Ágar cérebro e coração (BHI-ágar) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 113825) foi usado para cultivo de cepas de C. glutamicum em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 33 °C em uma incubadora da Heraeus Instruments com controlador de temperatura Kelvitron® (Hanau, Alemanha).

3. Determinação de densidade óptica

a. A densidade óptica de suspensões bacterianas em culturas de frasco de agitação foi determinada a 600 nm (OD600) com o uso do BioPhotometer da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).

b. A densidade óptica de suspensões bacterianas produzidas no sistema de microfermentação Wouter Duetz (WDS) (Placas de 24 poços) foi determinada a 660 nm (OD660) com o leitor de placa GENios™ da Tecan Group AG (Mãnnedorf, Suíça).

4. Centrifugação

a. Centrífuga de bancada para tubos de reação com um volume de até 2 ml [0115] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 2 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de reação de 1 ml ou 2 ml (por exemplo, Eppendorf Tubes^® 3810X) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5417 R (5 min a 13.000 rpm).

b. Centrífuga de bancada para tubos com um volume de até 50 ml [0116] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 50 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de centrífuga de 15 ml ou 50 ml (por exemplo, Tubos de Centrífuga Cônica de 50 ml Falcon™) com o uso de uma

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34/46 centrífuga Eppendorf 5810 R por 10 min a 4.000 rpm.

5. Detecção de mutações com o uso de FRET [0117] A presença de uma dada mutação, por exemplo, uma troca de nucleobase, foi detectada por PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET. O termo FRET é a abreviatura de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Como o instrumento de PCR em tempo real, um Lightcycler da Roche Diagnostics^® foi usado (consultar abaixo).

[0118] Esse método foi, por exemplo, usado por M. J. Lay e C. T. Wittwer (Clinical Chemistry 42 (12), 2262-2267 (1997)) para a genotipagem de fator V de Leiden. Cyril DS Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 63-75 (2006) revisa a genotipagem de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método. Resumos referentes a esse método podem ser encontrados nos livros Lewin's Genes XII de Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick (Jones e Bartlett Publishers, EUA, 2018), Molecular Diagnostics, 12 Tests that changed everything de W. Edward Highsmith (Humana Press, Springer, Nova York, 2014) ou em outras publicações da técnica.

[0119] A sonda de doador de hibridização de FRET foi identificada com o corante fluorescente fluoresceína e a sonda de aceptor com o corante fluorescente LC-Red640. Em essência, o método de detecção compreendia três etapas: PCR de colônia, hibridização de sonda e análise de curva de fusão subsequente. O método é simplesmente denominado PCR em tempo real no presente documento.

a. Iniciadores e Sondas [0120] Os oligonucleotídeos usados foram sintetizados

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35/46 por eurofins genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha).

b. Modelo [0121] Como modelo de PCR, o DNA total contido em uma colônia foi usado. Foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave & Grill da SEVERIN Elektrogerãte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, os reagentes de PCR foram adicionados ao modelo no tubo de reação de PCR.

b. Mistura de Reação [0122] O kit de PCR de sonda Type-it® Fast SNP (Kit Type-it) da Qiagen (Hilden, Alemanha, n° de Catálogo 206045) foi usado para detecção em tempo real das mutações. Portanto, 2,5 pl do Qiagen Fast SNP Puffer (2x) foram misturados com 0,5 pl de cada um dos Iniciadores de LC-PCR [10 pM] e 0,5 pl de cada uma das sondas de aceptor e doador diluídas a 1:500 [100 pmol/pl] para obter a mistura principal para a PCR em tempo real.

[0123] Tabela 1: Condições de termociclização para PCR com o LightCycler® (etapas 1-3) e análise de curva de fusão (etapas 4-6).

Programa PCR
Etapa	Tempo [s]	T [°C]	Descrição
1	15	95	Etapa de desnaturação (e Ativação de DNA polimerase HotStarTaqTM)
2	05	55	Etapa de recozimento

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Programa PCR
Etapa	Tempo [s]	T [°C]	Descrição
3	30	72	Etapa de alongamento
			Repetir etapa 1 a 3: 50 x
4	10	95	Etapa de desnaturação
5	30	40	Hibridização por sonda
6		40- 80	Análise de curva de fusão
7		80- 40	Resfriamento

c. Ciclizador de PCR [0124] As reações foram executadas em um Instrumento LightCycler® 2.0 e analisadas com o Software 4.1 LightCycler® da Roche Diagnostics (Rotkreuz, Suíça).

6. Transformação química de E. coli

A cepa S17-1 de E. coli K-12 foi usada como doadora para transferência conjugacional de plasmídeos com base em pK18mobsacB de E. coli para C. glutamicum. A cepa S17-1 é descrita por Simon, R. et al. (Bio/Technology 1, 784-794, 1983). Está disponível junto à Coleção Americana de Culturas Celulares sob o número de acesso ATCC47055.

[0125] As células de E. coli S17-1 quimicamente competentes foram feitas como a seguir: Uma pré-cultura de 10 ml de meio de LB (10 ml de meio líquido por frasco de Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foi inoculada com 100 pl suspensão bacteriana de cepa S17-1 e a cultura foi incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 37 °C e 250 rpm. A cultura principal (70 ml de LB contidos em um frasco de Erlenmeyer de 250 ml com 3 defletores) foi inoculada com 300 pl da pré-cultura e incubada até um OD600

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37/46 de 0,5-0,8 a 37 °C. A cultura foi centrifugada por 6 min a 4 °C e 4000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pélete celular foi ressuspenso em 20 ml de solução estéril gelada de CaCl2 50 mM e incubado no gelo por 30 min. Após outra etapa de centrifugação, o pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução gelada de CaCl2 50 mM e a suspensão foi incubada no gelo por 30 min. A suspensão celular foi, então, ajustada a uma concentração final de glicerol a 20 % (v/v) com glicerol estéril gelado a 85 %. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 pl e armazenada a -80 °C.

[0126] Para transformar células S17-1, o protocolo de acordo com Tang et al. (Nucleic Acids Res. 22(14), 28572858, 1994) com um choque térmico de 45 s foi usado.

7. Conjugação de C. glutamicum

O sistema de plasmídeo pK18mobsacB descrito por Schâfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) foi usado para integrar fragmentos de DNA desejado no cromossomo de C. glutamicum. Um método de conjugação modificada de Schâfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) foi usado para a transferência do respectivo plasmídeo para a cepa recipiente de C. glutamicum desejada.

[0127] As culturas líquidas das cepas de C. glutamicum foram realizadas em meio de BHI a 33 °C. O choque térmico foi realizado a 48,5 °C por 9 min. Transconjugantes foram selecionados plaqueando-se a batelada de conjugação em ágar de EM8 (Tabela 2) , a qual foi suplementada com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar de EM8 foram incubadas por 72 h a 33 °C.

[0128] Tabela 2: Composição do ágar de EM8

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Componentes	Concentração (g/l)
Glicose (estéril-filtrada)	23
CSL (milhocina; Roquette; teor sólido 48±2 % em p/p)	30
Peptona de farinha de soja (Merck, Alemanha)	40
(NHJ2SO4	8
Ureia	3
KH2PO4	4
MgSO4 · 7 H2O	0,5
FeSO4 · 7 H2O	0,01
CuSO4 · 5 H2O	0,001
ZnSO4 · 7 H2O	0,01
Pantotenato de cálcio, D(+)	0,01
Tiamina	0,001
Inositol	0,1
Ácido nicotínico	0,001
Biotina (estéril-filtrada)	0,005
CaCO3 (autoclavada separadamente)	1,6
Ágar-Ágar (Merck, Alemanha)	14

[0129] Palitos estéreis foram usados para a transferência dos transconjugantes para ágar de BHI, o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar foram incubadas por 20 h a 33 °C. As culturas dos respectivos transconjugantes produzidos dessa maneira foram, então, propagadas adicionalmente por 24 h a 33 °C em 10 ml de meio de BHI contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores.

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Uma alíquota foi obtida da cultura líquida, adequadamente diluída e plaqueada (tipicamente 100 a 200 μl) em ágar de BHI que foi suplementado com sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 48 h a 33 °C. As colônias em crescimento nas placas de ágar contendo sacarose foram, então, examinadas para o fenótipo de sensibilidade à canamicina. Para fazê-lo, um palito de dentes foi usado para remover material celular da colônia e transferi-lo para ágar de BHI contendo 25 mg/l de canamicina e para ágar de BHI contendo sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 60 h a 33 °C. Clones que se provaram sensíveis à canamicina e resistentes à sacarose foram examinados para integração do fragmento de DNA desejado por

meio de PCR.
8. Estoques	de	glicerol	de	cepas	de E.coli	e C.
glutamicum
[0130] Para	um	armazenamento	de longo período de	cepas
de E.coli e	C.	glutamicum,	estoque	de glicerol	foram
preparados. Os	clones de	E.	coli	selecionados	foram

cultivados em 10 ml de meio de LB suplementado com 2 g/l de glicose. Os clones de C. glutamicum selecionados foram cultivados em meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 2 g/l de glicose. Culturas de cepas de E. coli contendo plasmídeo foram suplementadas com 50 mg/l de canamicina. Culturas de cepas de C. glutamicum contendo plasmídeo foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com um laço de células obtido a partir de uma colônia e a cultura foi incubada por cerca de 18 h a 37 °C e 200 rpm no caso de E. coli e 33 °C e 200 rpm

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40/46 no caso de C. glutamicum. Após o dito período de incubação, 1,2 ml de glicerol estéril a 85 % (v/v) foram adicionados à cultura. A suspensão celular contendo glicerol obtida foi, então, dividida em alíquotas em porções de 2 ml e armazenada a -80 °C.

9. Sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz (WDS) [0131] O sistema de cultivo de escala em mililitros de acordo com Duetz (Trends Microbiol. 2007; 15(10):469-75) foi usado para investigar o desempenho das cepas de C. glutamicum construídas. Com esse propósito, microplacas de 24 poços profundos (placas WDS de 24 poços) da EnzyScreen BV (Heemstede, Holanda; n° de Cat. CR1424), preenchidas com 2,5 ml de meio foram usadas.

[0132] Pré-culturas das cepas foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 pl de uma cultura de estoque de glicerol e a cultura foi incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.

[0133] Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas.

[0134] As culturas principais foram feitas inoculando-se os poços contendo 2,5 ml de meio da Placa de WDS de 24 poços com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,1.

[0135] Como meio para a cultura principal, o meio de CGXII descrito por Keilhauer et al. (J. Bacteriol. Setembro de 1993; 175(17): 5595-5603) foi usado. Por conveniência, a composição do meio de CGXII é mostrada na tabela 3.

[0136] Tabela 3: Composição do meio de CGXII de Keilhauer.

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Componentes	Concentração (g/l)
MOPS (Ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico)	42
(NHJ2SO4	20
Ureia	5
KH2PO4	1
K2HPO4	1
MgSO4 · 7 H2O	0,25
CaCl2	0,01
FeSO4 · 7 H2O	0,01
MnSO4 H2O	0,01
ZnSO4 · 7 H2O	0,001
CuSO4 · 5 H2O	0,0002
NiCl2 6 H2O	0,00002
Biotina (estéril-filtrada)	0,0002
Ácido protocatecuico (estéril-filtrado)	0,03
Fonte de carbono (estéril-filtrado)	conforme necessário
ajustar o pH a 7 com NaOH

[0137] Essas culturas principais foram incubadas por aproximadamente 45 h a 33 °C e 300 rpm em um agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) até o consumo completo de glicose.

[0138] A concentração de glicose na suspensão foi analisada com o medidor de glicose no sangue OneTouch Vita® da LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Alemanha).

[0139] Após o cultivo, as suspensões de cultura foram

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42/46 transferidas para uma microplaca de poço profundo. Uma parte da suspensão de cultura foi adequadamente diluída para medir o OD600. Outra parte da cultura foi centrifugada e a concentração de L-aminoácidos, em particular L-lisina, e glicose residual foram analisadas no sobrenadante.

10. Analisador de aminoácido [0140] A concentração de L-lisina e outros Laminoácidos, por exemplo, L-valina, nos sobrenadantes de cultura foi determinada por cromatografia por troca de íons com o uso de um analisador de aminoácido SYKAM S433 da SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Alemanha). Como fase sólida, uma coluna com trocador de cátion esférico à base de poliestireno (Peek LCA N04/Na, dimensão 150 x 4,6 mm) da SYKAM foi usada. Dependendo do L-aminoácido, a separação ocorre em um ciclo isocrático com o uso de uma mistura de tampões A e B para eluição ou por eluição de gradiente com o uso dos ditos tampões. Como tampão A, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 263 g de citrato de trissódio, 120 g de ácido cítrico, 1100 ml de metanol, 100 ml de HCl a 37 % e 2 ml de ácido octanoico (pH final 3,5) foi usada. Como tampão B, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 392 g de citrato de trissódio, 100 g de ácido bórico e 2 ml de ácido octanoico (pH final 10,2) foi usada. Esses aminoácidos livres foram coloridos com ninidrina através de derivatização pós-coluna e detectados fotometricamente a 570 nm.

11. Determinação de glicose com sistema de fluxo contínuo (CFS) [0141] Um analisador de fluxo contínuo multicanal SANplus da SKALAR Analytic GmbH (Erkelenz, Alemanha) foi

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43/46 usado para determinar a concentração de glicose no sobrenadante. A glicose foi detectada com um ensaio acoplado de enzima (Hexoquinase/ Glicose-6-FosfatoDesidrogenase) por formação de NADH.

B) RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Exemplo 1 [0142] Sequência do gene nusG da cepa DM1933 de C. glutamicum [0143] A cepa DM1933 é um produtor de L-lisina descrito por Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009). É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM25442.

[0144] A sequência de nucleotídeos do cromossomo da cepa DM1933 foi determinada por tecnologia de sequenciamento de genoma completo Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA). Consultar, por exemplo, Benjak et al. (2015) WholeGenome Sequencing for Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly. Em: Parish T., Roberts D. (eds) Mycobacteria Protocols. Methods in Molecular Biology, Vol 1285. Humana Press, NY, US) e Bennet, S. (Pharmacogenomics 5(4), 433-438, 2004).

[0145] Constatou-se que a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação de nusG da cepa DM1933, incluindo

a sequência de nucleotídeos	a montante	e a jusante	da
mesma, é	idêntica àquela de	ATCC13032	mostrada na SEQ	ID
NO:1.
[0146]	DM1933 contém em seu cromossomo	uma variante	do
gene de	aspartoquinase que	codifica	um	polipeptídeo	de

aspartoquinase resistente à realimentação. O dito polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação

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44/46 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 da listagem de sequências, em que o aminoácido treonina (Thr) na posição 311 da sequência de aminoácidos é substituído por isoleucina (Ile). No documento US 7.338.790, a abreviação lysC T311I” é usada para indicar a dita troca. Blombach et al. usam a abreviação lysC(T311I)”.

Exemplo 2 [0147] Construção do plasmídeo pK18mobsacB_nusG_N210D [0148] O plasmídeo pK18mobsacB_nusG_N210D foi construído para possibilitar a incorporação da mutação que causa a troca de aminoácido N210D para a sequência de nucleotídeos da sequência codificadora nusG da cepa DM1933. O plasmídeo é baseado no vetor móvel pK18mobsacB descrito por Schâfer et al. (Gene 145, 69-73, 1994) . Para a construção de pK18mobsacB_nusG_N210D, a sequência de nusG_N210D mostrada na SEQ ID NO:9 foi sintetizada e subclonada em pK18mobsacB por GeneArt (ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA)).

[0149] Para unir o pK18mobsacB_nusG_N210D plasmidial, os dois polinucleotídeos, isto é, o corte de vetor pK18mobsacB com Xbal e o polinucleotídeo nusG_N210D sintetizado e digerido por Xbal, foram ligados e transformados em E.coli por GeneArt (ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA)).

Exemplo 3 [0150] Construção da cepa DM1933_nusG_N210D [0151] O plasmídeo pK18mobsacB_nusG_N210D obtido no exemplo 2 foi usado para incorporar a mutação (consultar posição 1002 da SEQ ID NO:1) que leva à troca de aminoácido N210D (consultar posições de nucleotídeo 1002-1004 da SEQ ID NO :3 ou posição de nucleotídeo 805-807 da SEQ ID NO:9) no cromossomo do produtor de L-lisina DM1933.

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45/46 [0152] Células quimicamente competentes de E. coli cepa S17-1 foram transformadas com DNA plasmidial de pK18mobsacB_nusG_N210D. O método de conjugação modificado de Schafer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 1666, 1990) como descrito em materiais e métodos foi usado para transferência conjugada para a cepa DM1933 e para seleção de clones de transconjugante em virtude de sua resistência à sacarose e fenótipo de sensibilidade à canamicina.

[0153] Os clones transconjugantes foram analisados por PCR em tempo real com o uso do Kit Type-it e os iniciadores N210D_for e N210D_rev para amplificação de PCR e NCgl0458_N210D_C como sonda de aceptor e NCgl0458_N210D_A como sonda de doador para análise de curva de fusão (tabela

4) . Os ditos iniciadores e sondas também são mostrados nas SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14 da listagem de sequências.

[0154] Tabela 4: Lista de iniciadores e sondas usadas para PCR em tempo real.

nome	sequência
N210D_for	ACCTTGACATGCGTGCTCAG
N210D_rev	CATAGCCACAACCTGCTCAC
NCgl045 8_N210D_C1	TGCCCTCGTCACCCACAAAG
NCgl045 8_N210D_A2	AACTTCGCAACATCGCGGTGCTTCACAGGAGTTGC

¹ sonda de aceptor identificada com LC-Red640 na extremidade 5' e fosforilada na extremidade 3' ² sonda de doador identificada com fluoresceína na extremidade 3' [0155] Um dos clones de transconjugante então caracterizado foi denominado DM1933_nusG_N210D. A cultura

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46/46 de estoque de glicerol do clone de transconjugante foi preparada e usada como material de partida para investigações adicionais.

[0156] Então, o gene nusG da cepa DM1933 foi submetido à mutação com o efeito de que o aminoácido asparagina na posição 210 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo NusG codificado foi substituído por ácido aspártico.

Exemplo 4 [0157] Produção de L-lisina pela cepa DM1933_nusG_N210D [0158] As cepas DM1933 (referência) e DM1933_nusG_N210D obtidas no exemplo 3 foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir L-lisina de glicose por cultivo de batelada com o uso de sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz.

[0159] Como meio, CGXII contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. As culturas foram incubadas por cerca de 45 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e as concentrações de L-lisina e a densidade óptica OD660 foram determinadas. O resultado do experimento é apresentado na tabela 5.

[0160] Tabela 5: Produção de L-lisina pela cepa DM1933_nusG_N210D.

cepa	L-lisina1 (g/l)	OD6 6 0
DM1933	3,7	9,5
DM19 3 3_nusG_N210D	4,1	9,3

¹ como L-lisina x HCl [0161] O experimento mostra que a produção de L-lisina foi aumentada na cepa DM1933_nusG_N210D em comparação à cepa principal DM1933.

Claims (3)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção fermentativa de L-lisina caracterizado por compreender as etapas de

a) fornecer uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum que tem a habilidade de excretar L-lisina contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de um fator transcricional e compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido asparagina na posição 210 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente,

b) cultivar a bactéria em um meio adequado sob condições adequadas, e

c) acumular a dita L-lisina no meio para formar uma Llisina contendo caldo de fermentação.

2/3

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o

polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1331 da SEQ ID NO: 1, sendo que as nucleobases nas posiçõe s 1002 a 1004 são gac ou gat. 6. Método, de acordo com a reivindicação 3,

caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o

polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 114 a 1331 da SEQ ID NO: 1, sendo que as nucleobases nas posições 1002 a 1004 são gac ou gat. 7. Método, de acordo com a reivindicação 3,

caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o

polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 114 a 1402 da SEQ ID NO: 1, sendo que as nucleobases nas posições 1002 a 1004 são gac ou gat. 8. Método, de acordo com a reivindicação 3,

caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1328 da SEQ ID NO:5.

9. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1331 da SEQ ID NO:5.

10. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida,

Petição 870190064830, de 10/07/2019, pág. 111/138

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o dito aminoácido na posição 210 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 é ácido aspártico ou ácido glutâmico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o dito aminoácido na posição 210 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 é ácido aspártico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 375 a 1328 da SEQ ID NO:1, sendo que as nucleobases nas posições 1002 a 1004 são gac ou gat.

Petição 870190064830, de 10/07/2019, pág. 110/138

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polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 114 a 1331 da SEQ ID NO: 5. 11. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, na bactéria fornecida, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das

posições 114 a 1402 da SEQ ID NO:5.