BR102019026898A2 - Método para a produção fermentativa de l-lisina usando cepas de c. glutamicum com um transportador kup mutado - Google Patents

Abstract

método para a produção fermentativa de l-lisina usando cepas de c. glutamicum com um transportador kup mutado. a presente invenção se refere a um método para a produção fermentativa de l-lisina usando cepa de c. glutamicum tendo um transportador kup mutado.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE L-LISINA USANDO CEPAS DE C. GLUTAMICUM COM UM TRANSPORTADOR KUP MUTADO

[0001] A L-lisina é produzida por fermentação de cepas da espécie Corynebacterium glutamicum. Trabalha-se continuamente para melhorar os métodos de produção. As melhorias podem estar relacionadas à tecnologia de fermentação, ao processamento do caldo de fermentação para uma forma de produto adequada ou podem estar relacionadas às propriedades intrínsecas de desempenho do próprio microrganismo.

[0002] As sequências de nucleotídeos dos cromossomos de várias cepas de bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum estão disponíveis em bancos de dados acessíveis ao público e podem ser usadas para fins de desenvolvimento da cepa. Um de tais bancos de dados é o banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional de Informações Biotecnológicas [National Center for Biotechnology Information], U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA) .

[0003] Durante o procedimento de anotação para um cromossomo sequenciado de um organismo, estruturas identificadas como, por exemplo, genes ou sequências de codificação, são dotadas de um identificador exclusivo denominado locus_tag pelo fornecedor das informações do banco de dados.

[0004] A sequência de nucleotídeos do cromossomo Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e sua análise foram descritas, por exemplo, por Nakagawa et al. no documento EP1108790 A2. As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_003450. Na sequência de cromossomos revelada sob o número de acesso NC_003450, locus_tag NCgl0682 identifica uma sequência de nucleotídeo anotada como codificando um transportador de K+. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o identificador NP_599944.

[0005] A sequência de nucleotídeos do cromossomo ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e sua análise foram independentemente descritos por Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003)). As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_006958. Locus_tag CGTRNA_RS03565 identifica uma sequência de nucleotídeos anotada como codificando um transportador de potássio Kup. A designação cg0817 de old_locus_tag também é usada na técnica. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o identificador WP_011013837. As sequências de nucleotídeo de locus_tag NCgl0682 e CGTRNA_RS03565 são idênticas. A sequência de aminoácidos do transportador Kup é mostrada na SEQ ID NO:2. A sequência de nucleotídeos correspondente do gene kup é o gene identificado por NCgl0682 e mostrado sob o SEQ ID NO: 1 .

[0006] O documento WO 01/00805 também revela o gene kup de Corynebacterium glutamicum de acordo com SEQ ID NO: 2 assim como outros genes de proteínas de codificação de C. glutamicum envolvidas na síntese da membrana e transporte de membrana e geralmente ensina que a modificação das cepas de C. glutamicum nesses genes aumenta a produção de, por exemplo, L-lisina.

[0007] Follmann et al. (Journal of Bacteriology 191(9), 2944-2952, 2009) investigou o transporte de potássio em Corynebacterium glutamicum. Eles forneceram evidências experimentais de que o potencial canal de potássio CglK é o único sistema funcional de absorção de potássio em Corynebacterium glutamicum. O dito canal de potássio CglK é codificado por uma sequência de nucleotídeos identificada pela antiga designação locus_tag cg0887. Follmann et al. constataram ainda que as células que não possuíam o gene kup identificado pelo antigo locus_tag cg0817 não apresentaram diferença no crescimento em comparação com o tipo selvagem.

[0008] O objetivo da presente invenção consiste em fornecer medidas inovadoras para a produção fermentativa de L-lisina por bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0009] Constatou-se que modificar bactérias excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum ao trocar o aminoácido glicina na posição 344 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 2 por um aminoácido proteinogênico diferente, ou seja, por L-valina, aumentou sua habilidade de excretar L-lisina em um processo fermentativo em comparação com a bactéria de produção de L-lisina não modificada.

[0010] A presente invenção disponibiliza um método inovador para a produção fermentativa de L-lisina, compreendendo as etapas de fornecer uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, com a capacidade de excretar L-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido glicina na posição 344 é substituído por valina, cultivando a bactéria em um meio adequado sob condições adequadas e acumulando a L-lisina no meio para formar um caldo de fermentação contendo L-lisina. Nesse processo fermentativo, a produção de L-lisina é aumentada em comparação com um método que compreende o cultivo de uma bactéria secretora de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum sem essa substituição.

[0011] A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido glicina na posição 344 é substituído por valina, é mostrada na SEQ ID NO:4.

[0012] Verificou-se que as bactérias modificadas, fornecidas no método de acordo com a invenção, excretaram L-lisina em um meio adequado sob condições de fermentação adequadas em um modo aumentado.

[0013] O método de acordo com a invenção contribui, dessa forma, para a melhoria de aspectos técnicos e econômicos da fabricação de L-lisina ou de produtos contendo L-lisina.

[0014] Em uma modalidade preferida, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo das posições 40 a 1923 da SEQ ID NO:1, as nucleobases da posição 1069 a 1071 sendo gtt, gtc, gta ou gtg, de preferência, gtc.

[0015] A sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1923 da SEQ ID NO:1 a nucleobase na posição 1070 sendo timina (t) é particularmente preferida.

[0016] A sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1923 da SEQ ID NO: 1 os nucleotídeos das posições 1069 a 1071 sendo gtc é idêntica à sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1923 da SEQ ID NO:3.

[0017] Em uma outra modalidade preferida, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo das posições 40 a 1926 da SEQ ID NO:1, as nucleobases da posição 1069 a 1071 sendo gtt, gtc, gta ou gtg, de preferência, gtc.

[0018] A sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1926 da SEQ ID NO:1 a nucleobase na posição 1070 sendo timina (t) é particularmente preferida.

[0019] A sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1926 da SEQ ID NO: 1 os nucleotídeos das posições 1069 a 1071 sendo gtc é idêntica à sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1926 da SEQ ID NO:3.

[0020] Em uma outra modalidade preferida, a bactéria fornecida no método de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO:1, as nucleobases da posição 1069 a 1071 sendo gtt, gtc, gta ou gtg, de preferência, gtc.

[0021] A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1 a nucleobase na posição 1070 sendo timina (t) é particularmente preferida.

[0022] A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 os nucleotídeos das posições 1069 a 1071 sendo gtc é idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3.

[0023] O termo L-lisina, quando mencionado no presente documento, em particular, no contexto de formação de produto, também compreende suas formas iônicas e sais, por exemplo, monocloridrato de L-lisina ou sulfato de L-lisina.

[0024] Para a prática da presente invenção, bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum são usadas. Bactérias adequadas para o método desta invenção são cepas excretoras de L-lisina de Corynebacterium glutamicum, por exemplo, cepas excretoras de L-lisina obtidas por uma ou diversas etapas de desenvolvimento de cepa da cepa ATCC13032 e similares e modificadas como descrito nesta invenção.

[0025] A cepa ATCC13032 (também disponível como DSM20300) é a cepa do tipo taxonômico da espécie Corynebacterium glutamicum. Um estudo taxonômico desse grupo de bactérias baseado em hibridização de DNA-DNA foi feito por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260, 1991). Uma análise comparativa de várias cepas da espécie Corynebacterium glutamicum baseada em análise de sequência foi fornecido por Yang e Yang (BMC Genomics 18(1) :940) .

[0026] Uma multitude de cepas que excretam L-lisina do gênero Corynebacterium, em particular da espécie Corynebacterium glutamicum, foi obtida na técnica durante as últimas décadas, tendo início em cepas como ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 e similares. Foram obtidas como resultado de programas de desenvolvimento de cepa com o uso, entre outros, de métodos como mutagênese clássica, seleção para resistência antimetabólito, bem como amplificação e modificação de promotor de genes da via biossintética da L-lisina por métodos de engenharia genética.

[0027] As cepas excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são amplamente conhecidas na técnica e podem ser modificadas como descrito na presente invenção. Por exemplo, o documento US 7.338.790 B2 descreve a cepa DM1797. É depositado em DSMZ (Braunschweig, Alemanha) sob o número de acesso DSM16833. DM1797 é um mutante resistente à aminoetilcisteína da cepa ATCC13032 obtida após a mutagênese da N'-metil-N-nitro-nitrosoguanidina. Por exemplo, Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009) descrevem uma cepa DM1933, a qual está depositada sob número de acesso DSM25442. A cepa DM1933 foi obtida a partir de ATCC13032 por diversas etapas de desenvolvimento de cepa. Além disso, a cepa DM2031 de Corynebacterium glutamicum que excreta de L-lisina, depositada na DSMZ (Braunschweig, Alemanha) sob o número de acesso DSM32514 pode ser usada. A cepa DM2031 é um derivado desenvolvido posteriormente a partir de DM1933 que tem habilidade melhorada de excreção de L-lisina. Outras cepas de Corynebacterium glutamicum que excretam L-lisina são descritas, por exemplo, nos documentos WO2008033001 A1 e EP0841395 A1.

[0028] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum contêm tipicamente um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação. Uma variante de polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação significa uma aspartato quinase que é menos sensível, ou dessensibilizada, à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina, por exemplo, 10 mM cada, ou misturas do análogo de L-lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína e L-treonina, por exemplo, S-(2-aminoetil)-L-cisteína 50 mM e L-treonina 10 mM, em comparação à forma selvagem da enzima, que está contida em cepas selvagens como, por exemplo, ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869. O número EC para aspartato quinase é EC 2.7.2.4. Descrições de polinucleotídeos de Corynebacterium glutamicum que codificam uma variante de polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação são dadas, por exemplo, nos documentos US5688671, US6844176 e US6893848. Uma lista resumida pode ser encontrada, entre outros, na WO2009141330 A1. O símbolo usado na técnica para um gene que codifica um polipeptídeo de aspartato quinase é lysC. A abreviação ask também é encontrada. Caso o gene codifique uma variante de polipeptídeo resistente a realimentação, a técnica usa tipicamente símbolos como lysCfbr com fbr indicando resistência a realimentação. A técnica também usa o termo aspartoquinase para aspartato quinase.

[0029] Consequentemente, as ditas cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum modificadas como descrito na presente invenção, contêm, de preferência, pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação dessensibilizada à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina.

[0030] O dito polinucleotídeo que codifica a dita variante do polipeptídeo de aspartato quinase pode ser expresso pelo seu promotor natural, ou seja, o promotor contido na cepa ATCC13032, ou qualquer outro promotor adequado conhecido na técnica.

[0031] A SEQ ID NO:5 mostra a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação do polipeptídeo de aspartato quinase da cepa ATCC13032 e a SEQ ID NO:6 mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Sabe-se, na técnica (consultar documento US6893848), que a troca do aminoácido Thr na posição 311 da SEQ ID NO :6 por Ile confere à enzima resistência à realimentação para inibição por misturas de L-lisina e L-treonina.

[0032] Consequentemente, é preferido que a sequência de aminoácidos do dito polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação compreenda a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 contendo isoleucina ao invés de treonina na posição 311.

[0033] A dita troca de amino pode ser alcançada ao trocar a nucleobase citosina (c) na posição 932 da SEQ ID NO:5 para produzir timina (t). O códon acc para treonina é, então, alterado para o códon atc para isoleucina.

[0034] Sabe-se ainda na técnica, que a troca do códon de iniciação gtg da sequência de codificação para o polipeptídeo de aspartato quinase por atg amplifica a expressão do polipeptídeo (consultar, por exemplo, documento EP2796555 A2).

[0035] Consequentemente, é preferível que a sequência que codifica um polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação seja iniciada com um códon de iniciação atg.

[0036] O termo DSM denota o depositório Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen localizado em Braunschweig, Alemanha. O termo ATCC denota o depositório American Type Culture Collection localizado em Manasass, Virginia, EUA.

[0037] Corynebacterium glutamicum, em particular, cepa ATCC13032 e cepas excretoras de L-lisina obtidas a partir da mesma durante um programa de desenvolvimento de cepa, contém em seu cromossomo um, em particular um, gene que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. A sequência de codificação pode conter mutações silenciosas que não alteram a sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Esse contexto também é conhecido como degeneração do código genético na técnica.

[0038] Durante o trabalho para a presente invenção, constatou-se que modificar bactérias excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum ao trocar o aminoácido glicina na posição 344 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 2 por um aminoácido proteinogênico diferente, ou seja, pela valina, aumentou sua habilidade de excretar L-lisina em um processo fermentativo em comparação à bactéria não modificada.

[0039] A pessoa versada na técnica está ciente de diversos métodos de mutagênese para alcançar a dita modificação na Corynebacterium glutamicum.

[0040] Uma bactéria mutante de acordo com a invenção pode ser obtida por mutagênese in vivo clássica executada com populações celulares de cepas de Corynebacterium glutamicum com o uso de substâncias mutagênicas, por exemplo, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, ou luz ultravioleta.

[0041] A sequência de nucleotídeos que compreende o sítio de mutagênese no gene pode ser amplificada por PCR com o uso de iniciadores selecionados a partir da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:3. Sequenciando-se o produto de PCR, os mutantes desejados são identificados. Detalhes referentes a essa abordagem podem ser encontrados, entre outros, no documento US7754446. A PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET também pode ser usada para detecção de mutação. O termo FRET é a abreviatura de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Cyril D S Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 6375 (2006) revisa a identificação de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método.

[0042] Outro método comum de realizar mutação de genes de Corynebacterium glutamicum é o método de substituição de gene descrito por Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 8487 (1991)) e adicionalmente elaborado por Schafer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)).

[0043] Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) usaram o método de substituição de gene para inativar o gene pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato carboxilase. No documento US7585650, o método foi aplicado ao gene zwf para realizar uma troca de aminoácido na posição 321 da sequência de aminoácidos da subunidade Zwf da glicose 6-fosfato desidrogenase. No documento US7754446, o método foi aplicado ao gene rel para realizar uma troca de aminoácido na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de GTP-pirofosfato quinase.

[0044] No método de substituição de gene, uma mutação, por exemplo, uma deleção, inserção ou substituição de pelo menos uma nucleobase, é fornecida por um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de nucleotídeos do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação.

[0045] No contexto da presente invenção, a sequência de nucleotídeos do gene em questão é o gene identificado por NCgl0682 também conhecido como gene kup na técnica.

[0046] No contexto da presente invenção, a mutação é uma substituição de pelo menos uma nucleobase localizada no códon que especifica o aminoácido glicina na posição 344 da sequência de aminoácidos codificada (consultar SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) do polipeptídeo.

[0047] Como uma consequência da dita mutação, o códon especifica um aminoácido proteinogênico diferente de glicina, preferencialmente leucina, isoleucina ou valina, de modo particularmente preferencial, valina. Os códons que especificam valina são gtt, gtc, gta e gtg. O códon gTc é preferencial.

[0048] O códon para o aminoácido na posição 344 tem a posição de 1069 a 1071 na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A sequência de nucleotídeos da posição 1069 a 1071, em particular, o nucleotídeo na posição 1070, também pode ser denominada sítio de mutação.

[0049] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação compreende i) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 5' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 5' ou sequência a montante na técnica, ii) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 3' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 3' ou sequência a jusante na técnica, e iii) a sequência de nucleotídeos do sítio de mutação entre i) e ii).

[0050] A dita sequência flanqueadora 5' e a sequência flanqueadora 3' necessárias para recombinação homóloga têm tipicamente um comprimento de pelo menos 200 pb, pelo menos 400 pb, pelo menos 600 pb ou pelo menos 800 pb. O comprimento máximo é tipicamente 1000 pb, 1500 pb ou 2000 pb.

[0051] Um exemplo de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo mutada no contexto da presente invenção é mostrado na SEQ ID NO:7. A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7 das posições 9 a 1724 corresponde à SEQ ID NO:3 das posições 213 a 1928. O polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 7 contém nos seus sítio de reconhecimento de extremidade 5' e 3' para endonuclease de restrição XbaI úteis para fins de clonagem. A SEQ ID NO: 7 contém parte da sequência de codificação da variante do polipeptídeo NCgl0682 descrito nesta invenção. A sequência flanqueadora 5' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 9 a 865 da SEQ ID NO:7. A sequência flanqueadora 3' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 867 a 1724 da SEQ ID NO:7. O sítio de mutação está na posição 866 da SEQ ID NO:7.

[0052] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação fornecida é clonada em um vetor plasmidial, por exemplo, pK18mobsacB descrito por Schäfer et al. (Gene 145, 69-73 (19 94) ) , que não é capaz de replicação autônoma em Corynebacterium glutamicum. O dito vetor de plasmídeo que compreende a dita sequência de nucleotídeos que sofreu mutação é subsequentemente transferido para a cepa desejada de Corynebacterium glutamicum por transformação com o uso de eletroporação ou conjugação. Após dois eventos de recombinação homóloga que compreendem um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 5' fornecido pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum e um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 3' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum, um realizando a integração e o outro realizando a excisão do dito vetor de plasmídeo, a mutação é incorporada no cromossomo de Corynebacterium glutamicum. Desse modo, a sequência de nucleotídeos do gene em questão contida no cromossomo da dita cepa desejada é substituída pela sequência de nucleotídeos que sofreu mutação. A presença da mutação na cepa desejada é então confirmada, por exemplo, por análise da sequência de nucleotídeos ou PCR em tempo real com o uso de FRET como descrito acima.

[0053] Um evento de recombinação homóloga também pode ser denominado permutação.

[0054] É preferencial que as cepas de Corynebacterium glutamicum excretoras de L-lisina fornecidas para o método da presente invenção tenham a habilidade de excretar ≥ 0,25 g/l, preferencialmente ≥ 0,5 g/l, particularmente preferencial ≥ 1,0 g/l, de modo muito particularmente preferencial ≥ 2,0 g/l de L-lisina em um meio adequado sob condições adequadas.

[0055] Em um processo fermentativo de acordo com a invenção, uma Corynebacterium glutamicum modificada de acordo com a presente invenção e que tem a habilidade de excretar L-lisina é cultivada em um meio adequado sob condições adequadas. Devido à sua habilidade de excretar a dita L-lisina, a concentração de L-lisina aumenta e se acumula no meio durante o processo fermentativo e a L-lisina é, então, produzida.

[0056] Um meio adequado usado para a produção de L-lisina por um processo fermentativo contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos e outros compostos orgânicos, conforme necessário.

[0057] As fontes de carbono adequadas incluem glicose, frutose, sacarose, bem como as matérias-primas correspondentes, como hidrolisado de amido, melaços ou xarope de milho com alto teor de frutose.

[0058] Como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de carne, hidrolisados de soja ou ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, gás de amônio ou amônia aquosa, podem ser usados.

[0059] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados.

[0060] Íons inorgânicos, como potássio, sódio, magnésio, cálcio, ferro e demais elementos-traço etc. são fornecidos como sais de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico.

[0061] Outros compostos orgânicos representam fatores de crescimento essenciais, como vitaminas, por exemplo, tiamina ou biotina ou L-aminoácidos, por exemplo, L-homosserina.

[0062] Os componentes de meio podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou podem ser alimentados durante o cultivo de uma maneira adequada.

[0063] Durante o processo fermentativo, o pH da cultura pode ser controlado empregando-se compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. O pH é geralmente ajustado a um valor de 6,0 a 8,5, preferencialmente 6,5 a 8,0. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, como, por exemplo, antibióticos. O processo fermentativo é preferencialmente realizado sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O processo fermentativo é realizado, quando adequado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 40 °C, preferencialmente de 30 °C a 37 °C. Em um processo descontínuo, o cultivo é continuado até que uma quantidade da L-lisina suficiente para ser recuperada tenha sido formada. O cultivo é, então, concluído. Esse objetivo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, períodos mais longos de cultivo são possíveis.

[0064] Exemplos de meios e condições de cultura adequados podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005).

[0065] Então, o processo fermentativo resulta em um caldo de fermentação que contém a L-lisina desejada.

[0066] Um produto contendo a L-lisina é, então, recuperado ou fabricado em líquido ou sólido do caldo de fermentação.

[0067] Um "caldo de fermentação" significa um meio em que um Corynebacterium glutamicum descrito na invenção foi cultivado por um certo tempo e sob certas condições.

[0068] Quando o processo fermentativo é concluído, o caldo de fermentação resultante compreende consequentemente:

• a) a biomassa (massa de células) de Corynebacterium glutamicum da invenção, a dita biomassa tendo sido produzida devido à propagação das ditas células de Corynebacterium glutamicum,
• b) a L-lisina desejada acumulada durante o processo fermentativo,
• c) os subprodutos orgânicos acumulados durante o processo fermentativo e
• d) os componentes do meio empregado que não foram consumidos no processo fermentativo.

[0069] Os subprodutos orgânicos incluem compostos que podem ser formados pela Corynebacterium glutamicum durante o processo fermentativo de acordo com a presente invenção além da produção da L-lisina.

[0070] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou tanque de fermentação, coletado em lugar adequado e usado para fornecer um produto contendo a L-lisina, em forma líquida ou sólida. A expressão "recuperar o produto contendo L-lisina" também é usada para tanto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-lisina, o qual foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[0071] O caldo de fermentação pode subsequentemente ser submetido à extração ou eliminação substancial de água do dito caldo de fermentação. Em particular, pelo menos 40 % (p/p) , de preferência, pelo menos 90 % (p/p) , mais de preferência pelo menos 95 % (p/p) de água são extraídos do caldo de fermentação.

[0072] A remoção da biomassa pode ser alcançada, entre outros, por centrifugação, filtração ou decantação ou uma combinação desses.

[0073] A fabricação de um produto de L-lisina também pode compreender uma etapa de purificação, de preferência, selecionada do grupo que consiste em cromatografia de troca iônica, tratamento com carvão ativado ou cristalização.

[0074] Assim, por exemplo, um produto que contém L-Lisina x HCl, de preferência, contendo ≥ 80 % de L-Lisina x HCl, particularmente de preferência ≥ 90 % de L-Lisina x HCl ou ≥ 95 % de L-Lisina x HCl pode ser obtido.

[0075] A análise de L-lisina para determinar sua concentração em um ou mais períodos durante a fermentação pode ocorrer separando-se a L-lisina por meio de cromatografia de troca iônica, preferencialmente cromatografia de troca catiônica, com derivatização pós-coluna subsequente com o uso de ninidrina, como descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído em vez de ninidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo de visão geral sobre cromatografia de troca iônica pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science 7(6):484-487 (1989)). É possível, do mesmo modo, realizar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, com o uso de orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Um método desse tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)). A detecção é realizada fotometricamente (absorção, fluorescência).

SEÇÃO EXPERIMENTAL A) MATERIAIS e MÉTODOS

[0076] Os kits, iniciadores e produtos químicos de biologia molecular usados e alguns detalhes dos métodos aplicados são brevemente descritos no presente documento.
1. Antibióticos e produtos químicos

• a. Canamicina: Solução de canamicina de Streptomyces kanamyceticus adquirida junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. K0254).
• b. Ácido nalidíxico: Sal de sódio de ácido nalidíxico disponível junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. N4382).
• c. Se não for declarado de outro modo, todos os produtos químicos foram adquiridos analiticamente puros junto à Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2. Cultivo

[0077] Se não for declarado de outro modo, todos os procedimentos de cultivo/incubação foram realizados como a seguir:

• a. Caldo de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110285) foi usado para cultivar cepas de E. coli em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 37 °C e 200 rpm.
• b. Ágar de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha n° de Cat. 110283) foi usado para cultivo de cepas de E. coli em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 37 °C em uma mini-incubadora INCU-Line® da VWR (Radnor, EUA) .
• c. Caldo de infusão cérebro-coração (BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110493) foi usado para cultivar cepas de C. glutamicum em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 33 °C e 200 rpm.
• d. Ágar cérebro-coração (ágar BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 113825) foi usado para cultivo de cepas de C. glutamicum em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 33 °C em uma incubadora da Heraeus Instruments com controlador de temperatura Kelvitron® (Hanau, Alemanha).

3. Determinação de densidade óptica

• a. A densidade óptica de suspensões bacterianas em culturas de frasco de agitação foi determinada a 600 nm (OD600) com o uso do BioPhotometer da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).
• b. A densidade óptica de suspensões bacterianas produzidas no sistema de microfermentação Wouter Duetz (WDS) (Placas de 24 poços) foi determinada a 660 nm (OD660) com o leitor de placa GENios™ da Tecan Group AG (Männedorf, Suíça).

4. Centrifugação

• a. Centrífuga de bancada para tubos de reação com um volume de até 2 ml

[0078] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 2 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de reação de 1 ml ou 2 ml (por exemplo, Eppendorf Tubes® 3810X) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5417 R (5 min a 13.000 rpm).
b. Centrífuga de bancada para tubos com um volume de até 50 ml

[0079] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 50 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de centrífuga de 15 ml ou 50 ml (por exemplo, Tubos de Centrífuga Cônica de 50 ml FalconTM) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5810 R por 10 min a 4.000 rpm.

5. Detecção de mutações com o uso de FRET

[0080] A presença de uma dada mutação, por exemplo, uma troca de nucleobase, foi detectada por PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET. O termo FRET é a abreviatura de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Como o instrumento de PCR em tempo real, um Lightcycler da Roche Diagnostics® foi usado (consultar abaixo).

[0081] Esse método foi, por exemplo, usado por M. J. Lay e C. T. Wittwer (Clinical Chemistry 42 (12), 2262-2267 (1997)) para a genotipagem de fator V de Leiden. Cyril DS Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 63-75 (2006) revisa a genotipagem de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método.

[0082] A sonda doadora de hibridização de FRET foi identificada com o corante fluorescente fluoresceína e a sonda receptora com o corante fluorescente LC-Red640. Em essência, o método de detecção compreendia três etapas: PCR de colônia, hibridização por sonda e análise de curva de fusão subsequente. O método é simplesmente denominado PCR em tempo real no presente documento.

a. Iniciadores e Sondas

[0083] Os oligonucleotídeos usados foram sintetizados por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha).

b. Modelo

[0084] Como modelo de PCR, o DNA total contido em uma colônia foi usado. Foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave & Grill da SEVERIN Elektrogeräte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, os reagentes de PCR foram adicionados ao modelo no tubo de reação de PCR.

b. Mistura de Reação

[0085] O kit de PCR de sonda Fast SNP Type-it® (Kit Type-it) da Qiagen (Hilden, Alemanha, n° de Cat. 206045) foi usado para detecção em tempo real das mutações. Portanto, 2,5 μl do Qiagen Fast SNP Puffer (2x) foram misturados com 0,5 μΐ de cada um dos Iniciadores de LC-PCR [10 μM] e 0,5 μl de cada uma das sondas receptora e doadora diluídas a 1:500 [100 pmol/μl] para obter a mistura principal para a PCR em tempo real.

[0086] Tabela 1: Condições de termociclização para PCR com o LightCycler® (etapas 1-3) e análise de curva de fusão (etapas 4-6).

c. Ciclador PCR

[0087] As reações foram realizadas em um Instrumento LightCycler® 2.0 e analisadas com o Software 4.1 LightCycler® da Roche Diagnostics (Rotkreuz, Suíça).

6. Transformação química de E. coli

[0088] A cepa S17-1 de E. coli K-12 foi usada como doadora para transferência conjugacional de plasmídeos baseados em pk18mobsacB de E. coli para C. glutamicum. A cepa S17-1 é descrita por Simon, R. et al. (Bio/Technology 1, 784-794, 1983). Está disponível junto à Coleção Americana de Culturas Celulares sob o número de acesso ATCC47055.

[0089] As células de E. coli S17-1 quimicamente competentes foram feitas como a seguir: Uma pré-cultura de 10 ml de meio de LB (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foi inoculada com 100 μl suspensão bacteriana da cepa S17-1 e a cultura foi incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 37 °C e 250 rpm. A cultura principal (70 ml de LB contidos em um frasco Erlenmeyer de 250 ml com 3 defletores) foi inoculada com 300 μl da pré-cultura e incubada até um OD600 de 0,5-0,8 a 37 °C. A cultura foi centrifugada por 6 min a 4 °C e 4000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pélete celular foi ressuspenso em 20 ml de solução estéril gelada de CaCl2 50 mM e incubado no gelo por 30 min. Após outra etapa de centrifugação, o pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução gelada de CaCl2 50 mM e a suspensão foi incubada no gelo por 30 min. A suspensão celular foi, então, ajustada a uma concentração final de glicerol a 20 % (v/v) com glicerol estéril gelado a 85 %. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 μl e armazenada a -80 °C.

[0090] Para transformar células S17-1, o protocolo de acordo com Tang et al. (Nucleic Acids Res. 22(14), 28572858, 1994) com um choque térmico de 45 s foi usado.

7. Conjugação de C. glutamicum

[0091] O sistema de plasmídeo pK18mobsacB descrito por Schafer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) foi usado para integrar fragmentos de DNA desejado no cromossomo de C. glutamicum. Um método de conjugação modificada de Schafer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) foi usado para a transferência do respectivo plasmídeo para a cepa recipiente de C. glutamicum desejada.

[0092] As culturas líquidas das cepas de C. glutamicum foram realizadas em meio de BHI a 33 °C. O choque térmico foi realizado a 48,5 °C por 9 min. Transconjugantes foram selecionados plaqueando-se a batelada de conjugação em ágar de EM8 (Tabela 2) , a qual foi suplementada com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar de EM8 foram incubadas por 72 h a 33 °C.

[0093] Palitos estéreis foram usados para a transferência dos transconjugantes para ágar de BHI, o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar foram incubadas por 20 h a 33 °C. As culturas dos respectivos transconjugantes produzidos dessa maneira foram, então, propagadas adicionalmente por 24 h a 33 °C em 10 ml de meio de BHI contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Uma alíquota foi obtida da cultura líquida, adequadamente diluída e plaqueada (tipicamente 100 a 200 μl) em ágar de BHI que foi suplementado com sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 48 h a 33 °C. As colônias em crescimento nas placas de ágar contendo sacarose foram, então, examinadas para o fenótipo de sensibilidade à canamicina. Para fazê-lo, um palito foi usado para remover material celular da colônia e transferi-lo para ágar de BHI contendo 25 mg/l de canamicina e para ágar de BHI contendo sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 60 h a 33 °C. Clones que se provaram sensíveis à canamicina e resistentes à sacarose foram examinados para integração do fragmento de DNA desejado por meio de PCR.

8. Estoques de glicerol de cepas de E.coli e C. glutamicum

[0094] Para um armazenamento de longo período de cepas de E.coli e C. glutamicum, estoque de glicerol foram preparados. Os clones de E. coli selecionados foram cultivados em 10 ml de meio de LB suplementado com 2 g/l de glicose. Os clones de C. glutamicum selecionados foram cultivados em meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 2 g/l de glicose. Culturas de cepas de E. coli contendo plasmídeo foram suplementadas com 50 mg/l de canamicina. Culturas de cepas de C. glutamicum contendo plasmídeo foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com um laço de células obtido a partir de uma colônia e a cultura foi incubada por cerca de 18 h a 37 °C e 200 rpm no caso de E. coli e 33 °C e 200 rpm no caso de C. glutamicum. Após o dito período de incubação, 1,2 ml de glicerol estéril a 85 % (v/v) foram adicionados à cultura. A suspensão celular contendo glicerol obtida foi, então, dividida em alíquotas em porções de 2 ml e armazenada a -80 °C.

9. Sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz (WDS)

[0095] O sistema de cultivo de escala em mililitros de acordo com Duetz (Trends Microbiol. 2007; 15(10):469-75) foi usado para investigar o desempenho das cepas de C. glutamicum construídas. Para esse propósito, microplacas de 24 poços profundas (placas WDS de 24 poços) da EnzyScreen BV (Heemstede, Holanda; n° de Cat. CR1424) preenchidas com 2,5 ml de meio foram usadas.

[0096] Pré-culturas das cepas foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 pl de uma cultura de estoque de glicerol e a cultura foi incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.

[0097] Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas. As culturas principais foram feitas inoculando-se os poços contendo 2,5 ml de meio da Placa de WDS de 24 poços com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,1.

[0098] Como meio para a cultura principal foi usado o meio CGXII. A composição do meio de CGXII é mostrada na tabela 3.

[0099] Essas culturas principais foram incubadas por aproximadamente 45 h a 33 °C e 300 rpm em um agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) até o consumo completo de glicose.

[0100] A concentração de glicose na suspensão foi analisada com o medidor de glicose no sangue OneTouch Vita® da LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Alemanha).

[0101] Após o cultivo, as suspensões de cultura foram transferidas para uma microplaca de poço profundo. Uma parte da suspensão de cultura foi adequadamente diluída para medir o OD600. Outra parte da cultura foi centrifugada e a concentração de L-aminoácidos, em particular, L-lisina, e glicose residual foi analisada no sobrenadante.

10. Analisador de aminoácido

[0102] A concentração de L-lisina e outros L-aminoácidos, por exemplo, L-valina, nos sobrenadantes de cultura foi determinada por cromatografia de troca iônica com o uso de um analisador de aminoácido SYKAM S433 da SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Alemanha). Como fase sólida, uma coluna com trocador de cátion esférico à base de poliestireno (Peek LCA N04/Na, dimensão 150 x 4,6 mm) da SYKAM foi usada. Dependendo do L-aminoácido, a separação ocorre em um ciclo isocrático com o uso de uma mistura de tampões A e B para eluição ou por eluição de gradiente com o uso dos ditos tampões. Como tampão A, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 263 g de citrato de trissódio, 120 g de ácido cítrico, 1100 ml de metanol, 100 ml de HCl a 37 % e 2 ml de ácido octanoico (pH final 3,5) foi usada. Como tampão B, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 392 g de citrato de trissódio, 100 g de ácido bórico e 2 ml de ácido octanoico (pH final 10,2) foi usada. Esses aminoácidos livres foram coloridos com ninidrina através de derivatização pós-coluna e detectados fotometricamente a 570 nm.

11. Determinação de glicose com sistema de fluxo contínuo (CFS)

[0103] Um analisador de fluxo contínuo multicanal SANplus da SKALAR Analytic GmbH (Erkelenz, Alemanha) foi usado para determinar a concentração de glicose no sobrenadante. A glicose foi detectada com um ensaio acoplado de enzima (Hexoquinase/ Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase) por formação de NADH.

B) RESULTADOS EXPERIMENTAIS Exemplo 1

[0104] Sequência do gene kup da cepa C. glutamicum DM1933

[0105] A cepa DM1933 é uma produtora de L-lisina descrita por Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009). Pode ser obtida em DSMZ sob o número de acesso DSM25442.

[0106] A sequência de nucleotídeos do cromossomo da cepa DM1933 foi determinada por tecnologia de sequenciamento de genoma completo Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA). Consultar, por exemplo, Benjak et al. (2015) Whole-Genome Sequencing for Comparative Genomics e De Novo Genome Assembly. Em: Parish T., Roberts D. (eds) Mycobacteria Protocols. Methods in Molecular Biology, Vol 1285. Humana Press, NY, US) e Bennet, S. (Pharmacogenomics 5(4), 433- 438, 2004).

[0107] Constatou-se que a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação de kup (locus_tag NCgl0682) da cepa DM1933, incluindo a sequência de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma, é idêntica àquela de ATCC13032 mostrada na SEQ ID NO:1.

[0108] DM1933 contém em seu cromossomo uma variante do gene de aspartoquinase que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. O dito polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 da listagem de sequências, em que o aminoácido treonina (Thr) na posição 311 da sequência de aminoácidos é substituído por isoleucina (Ile). No documento US 7.338.790, a abreviatura "lysC T311I" é usada para indicar a dita troca. Blombach et al. usam a abreviatura "lysC(T311I)".

Exemplo 2

[0109] Construção do plasmídeo pK18mobsacB_kup_G344V

[0110] O plasmídeo pK18mobsacB_kup_G344V foi construído para possibilitar a incorporação da mutação que causa a troca de aminoácido G344V para a sequência de nucleotídeos da sequência codificadora kup da cepa DM1933. O plasmídeo é baseado no vetor móvel pK18mobsacB descrito por Schäfer et al. (Gene 145, 69-73, 1994) . Para a construção do pK18mobsacB_kup_G344V o polinucleotídeo kup_G344V de acordo com a SEQ ID NO:7 foi sintetizado e sub-clonado em pK18mobsacB por GeneArt (ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA)).

[0111] Para montar o plasmídeo pK18mobsacB_kup_G344V, as seguintes etapas foram realizadas por GeneArt: Os dois polinucleotídeos, isto é, o vetor pK18mobsacB e o polinucleotídeo kup_G344V, foram ambos tratados com XbaI, ligados e a mistura de ligação usada para transformar E. coli .

[0112] O DNA do plasmídeo pK18mobsacB_kup_G344V foi isolado de um transformante.

Exemplo 3

[0113] Construção da cepa DM1933_kup_G344V

[0114] O plasmídeo pK18mobsacB_kup_G344V obtido no exemplo 2 foi utilizado para incorporar a mutação (ver posição nucleotídica 1070 da SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3 e posição nucleotídica 866 da SEQ ID NO:7) levando à troca de aminoácidos G344V (ver posições de nucleotídeo 1069-1071 da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:3, posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4 e posições do nucleotídeo 865-867 da SEQ ID NO:7) no cromossomo do produtor de L-lisina DM1933.

[0115] Células quimicamente competentes da cepa S17-1 de E. coli foram transformadas com DNA plasmidial de pK18mobsacB_kup_G344V. O método de conjugação modificado de Schãfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990), como descrito em materiais e métodos, foi usado para transferência conjugada para a cepa DM1933 e para seleção de clones de transconjugantes em virtude de sua resistência à sacarose e fenótipo de sensibilidade à canamicina.

[0116] Os clones transconjugantes foram analisados por PCR em tempo real com o uso do Kit Type-it e os iniciadores LC-Ncgl0682_1 e LC-Ncgl0682_2 para amplificação de PCR e NCgl0682_344_C como sonda de aceptor e NCgl0682_G344V_A como sonda de doador para análise de curva de fusão (tabela 4) .

[0117] Tabela 4: Lista de iniciadores e sondas usadas para PCR em tempo real.

1 sonda receptora identificada com LC-Red640 na extremidade 5' e fosforilada na extremidade 3'
2 sonda doadora identificada com fluoresceína na extremidade 3'

[0118] Um dos clones de transconjugante então caracterizado foi denominado DM1933_kup_G344V. A cultura de estoque de glicerol do clone de transconjugante foi preparada e usada como material de partida para investigações adicionais.

[0119] Então, o gene kup da cepa DM1933 foi submetido à mutação com o efeito de que o aminoácido glicina na posição 344 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo Kup codificado foi substituído por valina.

Exemplo 4

[0120] Produção de L-lisina pela cepa DM1933_kup_G344V

[0121] As cepas DM1933 (referência) e DM1933_kup_G344V obtidas no exemplo 3 foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir L-lisina de glicose por cultivo de batelada com o uso de sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz.

[0122] Como meio, CGXII contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. As culturas foram incubadas por cerca de 45 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e as concentrações de L-lisina e a densidade óptica OD660 foram determinadas. O resultado do experimento é apresentado na tabela 5.

1 como L-lisina x HCl

[0123] O experimento mostra que a produção de L-lisina foi aumentada na cepa DM1933_kup_G344V em comparação à cepa principal DM1933.

Claims (12)

1. Método para a produção fermentativa de L-lisina caracterizado por compreender as etapas de fornecer uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, com a capacidade de excretar L-lisina, e contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido glicina na posição 344 é substituído por valina, cultivando a bactéria em um meio adequado sob condições adequadas e acumulando a L-lisina no meio para formar um caldo de fermentação contendo L-lisina.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na bactéria, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1923 da SEQ ID NO:1 as nucleobases nas posições 1069 a 1071 sendo gtt, gtc, gta ou gtg.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as nucleases nas posições 1069 a 1071 são gtc.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na bactéria, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 40 a 1926 da SEQ ID NO:1 as nucleobases nas posições 1069 a 1071 sendo gtt, gtc, gta ou gtg.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as nucleases nas posições 1069 a 1071 são gtc.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na bactéria, o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1 as nucleobases nas posições 1069 a 1071 sendo gtt, gtc, gta ou gtg.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as nucleases nas posições 1069 a 1071 são gtc.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender adicionalmente a fabricação de um produto contendo L-Lisina a partir do caldo de fermentação.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a fabricação compreende uma etapa de purificação.
10. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de purificação é selecionada a partir do grupo que consiste em tratamento com carvão ativado, troca iônica e cristalização.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a bactéria contém pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação dessensibilizada à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do dito polipeptídeo de aspartato quinase resistente à realimentação compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 contendo isoleucina ao invés de treonina na posição 311.