CN111334534A

CN111334534A - 使用具有突变的Kup转运蛋白的谷氨酸棒杆菌菌株发酵生产L-赖氨酸的方法

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Publication number: CN111334534A
Application number: CN201911300673.8A
Authority: CN
Inventors: T·贝克尔; K·福斯; G·蒂尔巴赫; F·施耐德
Original assignee: Evonik Operations GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2020-06-26
Also published as: BR102019026898A2; EP3670526A1; RU2019139788A; US20200190546A1; EP3670526B1; EP3670525A1; US10717999B2

Abstract

本发明涉及使用具有突变的Kup转运蛋白的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)菌株发酵生产L‑赖氨酸的方法。

Description

使用具有突变的Kup转运蛋白的谷氨酸棒杆菌菌株发酵生产 L-赖氨酸的方法

L-赖氨酸是通过物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株的发酵产生的。改善生产方法的工作正在不断进行。改善可能涉及发酵技术，涉及将发酵液加工成合适的产品形式，或者可能涉及微生物本身的固有性能特性。

物种谷氨酸棒杆菌的各种细菌菌株的染色体的核苷酸序列可在公共可访问的数据库中获得，并可用于菌株开发目的。一个这样的数据库是NCBI(National Center forBiotechnology Information，U.S.National Library of Medicine 8600RockvillePike，Bethesda MD，20894USA)的GenBank数据库。

在针对生物体测序的染色体注释过程期间，通过向数据库提供信息的提供者，向鉴定的结构例如基因或编码序列提供称为locus_tag的唯一标识符。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析由例如Nakagawa等人在EP1108790A2中描述。该信息可在NCBI以登录号NC_003450获得。在以登录号NC_003450公开的染色体序列中，locus_tag NCgl0682标识了注释为编码K+转运蛋白的核苷酸序列。多肽的氨基酸序列可在标识符NP_599944下获得。

Kalinowski等人独立地描述了谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析(Journal of Biotechnology 104(1-3)，5-25(2003))。该信息可在NCBI以登录号NC_006958获得。Locus_tag CGTRNA_RS03565标识了注释为编码钾转运蛋白Kup的核苷酸序列。old_locus_tag指定cg0817也在本领域中使用。多肽的氨基酸序列可在标识符WP_011013837下获得。locus_tag NCgl0682和CGTRNA_RS03565的核苷酸序列是相同的。Kup转运蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。kup基因的相应核苷酸序列是由NCgl0682标识并示于SEQ ID NO：1下的基因。

WO 01/00805还公开了根据SEQ ID NO：2的谷氨酸棒杆菌的kup基因，以及编码涉及膜合成和膜转运的蛋白的谷氨酸棒杆菌的其他基因，并且通常教导在这些基因中修饰谷氨酸棒杆菌菌株增加例如L-赖氨酸的生产。

Follmann等人(Journal of Bacteriology 191(9),2944-2952,2009)研究了谷氨酸棒杆菌中的钾转运。他们提供了实验证据，表明潜在的钾通道CglK是谷氨酸棒状杆菌中唯一的功能性钾摄取系统。所述钾通道CglK被由old locus_tag指定cg0887标识的核苷酸序列编码。Follmann等人进一步发现，与野生型相比，缺少由old locus_tag cg0817标识的kup基因的细胞在生长中没有显示出差异。

本发明的目标是提供通过物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的细菌发酵生产L-赖氨酸的新措施。

已经发现，与未修饰的L-赖氨酸生产细菌相比，通过将SEQ ID NO：2所示多肽的编码的氨基酸序列的位置344处的氨基酸甘氨酸交换为不同的蛋白原氨基酸(即L-缬氨酸)来修饰物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌，在发酵过程中增加了其分泌L-赖氨酸的能力。

本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的新方法，该方法包括以下步骤：提供具有分泌L-赖氨酸能力的物种谷氨酸棒状杆菌的细菌，该细菌在其染色体中含有编码包含SEQ IDNO：2的氨基酸的多肽的多核苷酸，其中位置344处的氨基酸甘氨酸被缬氨酸取代，在合适的条件下在合适的培养基中培养细菌，并在该培养基中积累L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。在这种发酵过程中，与包含培养没有这种取代的物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌的方法相比，L-赖氨酸的生产增加。

SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中位置344处的氨基酸甘氨酸被缬氨酸取代，示于SEQ ID NO：4。

发现根据本发明的方法提供的修饰的细菌在合适的发酵条件下以增长的方式将L-赖氨酸分泌到合适的培养基中。

因此，根据本发明的方法有助于制备L-赖氨酸或含L-赖氨酸产物的技术和经济方面的改善。

在优选的实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中含有编码多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的位置40至1923的核苷酸序列(位置1069至1071的核碱基是gtt、gtc、gta或gtg，优选gtc)。

特别优选的是SEQ ID NO：1的位置40至1923的核苷酸序列，位置1070处的核碱基是胸腺嘧啶(t)。

SEQ ID NO：1的位置40至1923的核苷酸序列，位置1069至1071的核苷酸是gtc，其与SEQ ID NO：3的位置40至1923的核苷酸序列相同。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中包含编码多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的位置40至1926的核苷酸序列(位置1069至1071的核碱基是gtt、gtc、gta或gtg，优选gtc)。

特别优选的是SEQ ID NO：1的位置40至1926的核苷酸序列，位置1070处的核碱基是胸腺嘧啶(t)。

SEQ ID NO：1的位置40至1926的核苷酸序列，位置1069至1071的核苷酸是gtc，其与SEQ ID NO：3的位置40至1926的核苷酸序列相同。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法提供的细菌在其染色体中包含编码多肽的氨基酸序列的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列(位置1069至1071的核碱基是gtt、gtc、gta或gtg，优选gtc)。

特别优选的是SEQ ID NO：1的核苷酸序列，位置1070处的核碱基是胸腺嘧啶(t)。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列，位置1069至1071的核苷酸是gtc，其与SEQ ID NO：3的核苷酸序列相同。

本文提及的术语L-赖氨酸，特别是在产物形成的情况下，还包含它们的离子形式和盐，例如L-赖氨酸单盐酸盐或L-赖氨酸硫酸盐。

为了实施本发明，使用物种谷氨酸棒杆菌的细菌。对于本发明的方法合适的细菌是谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株，例如从菌株ATCC13032等通过一步或几步菌株开发获得的以及如本发明所述修饰的L-赖氨酸分泌菌株。

菌株ATCC13032(也可以DSM20300获得)是物种谷氨酸棒杆菌的分类类型菌株。基于DNA-DNA杂交的这组细菌的分类学研究由Liebl等人(International Journal ofSystematic Bacteriology 41(2)，255-260,1991)完成。Yang and Yang(BMC Genomics 18(1)：940)提供了基于基因组序列分析的物种谷氨酸棒杆菌的各种菌株的比较分析。

在过去几十年中，从菌株例如ATCC13032、ATCC14067、ATCC13869等开始，在本领域中获得了多种棒状杆菌属(Corynebacterium)(特别是物种谷氨酸棒杆菌)的L-赖氨酸分泌菌株。它们是由于菌株开发程序获得的，所述程序尤其使用方法如经典诱变、抗代谢物抗性的选择以及通过遗传工程方法对L-赖氨酸的生物合成途径的基因进行扩增和启动子修饰。

物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株在本领域中是广泛已知的，并且可以如本发明所述被修饰。例如，US 7,338,790B2描述了菌株DM1797。它以保藏号DSM16833保藏在DSMZ(德国不伦瑞克)。DM1797是在N'-甲基-N-硝基-亚硝基胍诱变后获得的ATCC13032菌株的氨乙基半胱氨酸抗性突变体。例如，Blombach等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology75(2)，419-427,2009)描述了菌株DM1933，其以保藏号DSM25442保藏。通过菌株开发的几个步骤从ATCC13032获得菌株DM1933。此外，可以使用以保藏号DSM32514保藏在DSMZ(德国不伦瑞克)的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株DM2031。菌株DM2031是DM1933进一步开发的衍生物，具有增强的L-赖氨酸分泌能力。其他L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株在例如WO2008033001A1和EP0841395A1中描述。

物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株通常含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶(aspartate kinase)多肽变体的多核苷酸。反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体是指当与野生形式的酶(其包含在野生菌株如ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869中)比较时，对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如各自10mM)或L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如50mM S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和10mM L-苏氨酸)的抑制较不敏感或脱敏的天冬氨酸激酶。天冬氨酸激酶的EC编号为EC 2.7.2.4。编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体的谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的描述例如在US5688671、US6844176和US6893848中给出。总结列表尤其可以在WO2009141330A1中找到。本领域中用于编码天冬氨酸激酶多肽的基因的符号是lysC。也找到缩写ask。在基因编码反馈抗性多肽变体的情况下，本领域通常使用符号如lysC^fbr，其中fbr表示反馈抗性。本领域也使用术语天冬氨酸激酶(aspartokinase)指天冬氨酸激酶。

因此，如本发明所述修饰的物种谷氨酸棒杆菌的所述L-赖氨酸分泌菌株优选含有至少一个拷贝的多核苷酸，其编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制脱敏的反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体。

所述编码所述天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸可以被其天然启动子(即包含在菌株ATCC13032中的启动子)或本领域已知的任何其他合适启动子表达。

SEQ ID NO：5显示了菌株ATCC13032的天冬氨酸激酶多肽的编码序列的核苷酸序列，并且SEQ ID NO：6显示了所编码多肽的氨基酸序列。本领域已知(参见US6893848)，用Ile交换SEQ ID NO：6的位置311处的氨基酸Thr赋予酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制的反馈抗性。

因此，优选所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含在位置311处含有异亮氨酸而不是苏氨酸的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

通过交换SEQ ID NO：5位置932处的核碱基胞嘧啶(c)以得到胸腺嘧啶(t)，可以实现所述氨基酸交换。因此，苏氨酸的acc密码子被改变为异亮氨酸的atc密码子。

本领域进一步已知，用atg交换天冬氨酸激酶多肽的编码序列的gtg起始密码子增强多肽的表达(参见例如EP2796555A2)。

因此，优选编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的序列以atg起始密码子开始。

术语DSM表示位于德国不伦瑞克(Braunschweig,Germany)的保藏单位德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)。术语ATCC表示位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯(Manasass,Virginia,US)的保藏单位美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。

谷氨酸棒杆菌，特别是菌株ATCC13032和在菌株开发程序期间由其获得的L-赖氨酸分泌菌株，在其染色体中含有，尤其含有一个编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的基因。编码序列可含有不改变多肽的氨基酸序列的沉默突变。该情况在本领域也称为遗传密码的简并性。

在本发明的工作期间，发现与未修饰的细菌相比，通过用不同的蛋白原氨基酸(即缬氨酸)交换SEQ ID NO：2所示的多肽的编码氨基酸序列的位置344处的氨基酸甘氨酸来修饰物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌，增加了它们在发酵过程中分泌L-赖氨酸的能力。

本领域技术人员知道如何在谷氨酸棒杆菌中实现所述修饰的许多诱变方法。

根据本发明的突变细菌可以使用诱变物质(例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍或紫外光)通过对谷氨酸棒杆菌菌株的细胞群进行的经典体内诱变来获得。

可以使用选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的引物通过PCR扩增基因内包含诱变位点的核苷酸序列。通过对PCR产物测序，鉴定出所需的突变体。关于该方法的细节尤其可以在US7754446中找到。与FRET杂交探针联用的实时PCR也可用于突变检测。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。Cyril D S Mamotte(The Clinical Biochemist Reviews 27,63-75(2006))综述了使用这种方法鉴定单个核苷酸取代。

另一种突变谷氨酸棒杆菌基因的常用方法是Schwarzer and Pühler描述的基因置换方法(Bio/Technology 9,84-87(1991))，并由

等人进一步阐述(Gene 145,69-73(1994))。

Peters-Wendisch等人(Microbiology 144,915-927(1998))使用基因置换方法失活谷氨酸棒杆菌编码丙酮酸羧化酶的pyc基因。在US7585650中，将该方法应用于zwf基因以实现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基的氨基酸序列位置321处的氨基酸交换。在US7754446中，将该方法应用于rel基因以实现GTP-焦磷酸激酶多肽的氨基酸序列位置38处的氨基酸交换。

在基因置换方法中，通过包含所讨论基因的核苷酸序列或其含有突变的部分的分离的多核苷酸，提供至少一个核碱基的突变，例如缺失、插入或取代。

在本发明的情况中，所讨论基因的核苷酸序列是由NCgl0682标识的基因，其在本领域也称为kup基因。

在本发明的情况中，突变是位于指定多肽的编码氨基酸序列(参见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)的位置344处的氨基酸甘氨酸的密码子中的至少一个核碱基的取代。

作为所述突变的结果，密码子指定了与甘氨酸不同的蛋白原氨基酸，优选亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，特别优选缬氨酸。指定缬氨酸的密码子是gtt、gtc、gta和gtg。密码子gtc是优选的。

位置344处的氨基酸的密码子在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中具有位置1069至1071。位置1069至1071的核苷酸序列，特别是位置1070的核苷酸，也可称为突变位点。

所讨论基因的突变核苷酸序列或其含有突变的部分包含i)突变位点5'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为5'-侧翼序列或上游序列，ii)突变位点3'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为3'-侧翼序列或下游序列，和iii)i)和ii)之间的突变位点的核苷酸序列。

同源重组所需的所述5'-侧翼序列和3'-侧翼序列通常具有至少200bp、至少400bp、至少600bp或至少800bp的长度。最大长度通常为1000bp、1500bp或2000bp。

在本发明的情况中，包含突变的核苷酸序列的多核苷酸的实例示于SEQ ID NO：7。SEQ ID NO：7的核苷酸序列的位置9至1724对应于SEQ ID NO：3的位置213至1928。SEQ IDNO：7所示的多核苷酸在其5'端和3'端含有用于克隆目的的限制性内切酶Xbal的识别位点。SEQ ID NO：7含有本发明所述的NCgl0682多肽的变体的部分编码序列。5'-侧翼序列由SEQID NO：7位置9至865的核苷酸序列组成。3'-侧翼序列由SEQ ID NO：7位置867至1724的核苷酸序列组成。突变位点位于SEQ ID NO：7位置866处。

将提供的突变核苷酸序列克隆到不能在谷氨酸棒杆菌中自主复制的质粒载体中，例如由

等人描述的pK18mobsacB(Gene 145,69-73(1994))。随后通过使用电穿孔的转化或接合将包含所述突变核苷酸序列的所述质粒载体转移到所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。在两个同源重组事件(包含由质粒载体与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列提供的5'-侧翼序列内的重组事件，和由质粒载体与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列提供的3'-侧翼序列内的重组事件，其中一个影响所述质粒载体的整合，一个影响所述质粒载体的切除)之后，该突变掺入谷氨酸棒杆菌染色体中。因此，包含在所述所需菌株的染色体中的所讨论基因的核苷酸序列被突变的核苷酸序列置换。然后，例如如上所述，通过核苷酸序列分析或使用FRET的实时PCR在所需菌株中确认突变的存在。

同源重组事件也可称为交换(crossing over)。

优选为本发明的方法提供的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株在合适的条件下在合适的培养基中具有分泌≥0.25g/l，优选≥0.5g/l，特别优选≥1.0g/l，非常特别优选≥2.0g/l的L-赖氨酸的能力。

在根据本发明的发酵方法中，根据本发明修饰并具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中在合适的条件下培养。由于所述分泌所述L-赖氨酸的能力，L-赖氨酸的浓度在发酵方法过程中在培养基中增加并积累，因此生产L-赖氨酸。

用于通过发酵方法生产L-赖氨酸的合适培养基含有碳源、氮源、磷源、无机离子和其他所需的有机化合物。

合适的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖以及相应的原料如淀粉水解产物、糖蜜或高果糖玉米糖浆。

可以使用有机含氮化合物如蛋白胨、肉提取物、大豆水解产物或尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、氨气或氨水作为氮源。

可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。

无机离子如钾、钠、镁、钙、铁和其它微量元素等，以硫酸、磷酸或盐酸的盐提供。

其他有机化合物是指必需生长因子如维生素，例如硫胺素或生物素或L-氨基酸例如L-高丝氨酸。

培养基组分可以以单批的形式加入培养物中，或在培养过程中以合适的方式补料。

在发酵方法过程中，培养物的pH可以通过以合适的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制。通常将pH的值调节至6.0至8.5，优选6.5至8.0。为了控制发泡，可以使用消泡剂，例如聚乙二醇脂肪酸酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性物质，例如抗生素。发酵方法优选在需氧条件下进行。为了维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物(例如空气)引入培养物中。在适当的情况下，在升高的压力(例如在0.03-0.2MPa的升高的压力)进行发酵方法。培养物温度通常为25℃至40℃，优选30℃至37℃。在不连续方法中，继续培养直至形成足以回收的L-赖氨酸的量。然后完成培养。这个目标通常在10小时到160小时内完成。在连续方法中，更长的培养时间是可能的。

合适的培养基和培养条件的实例尤其可以在L.Egegeling and M.Bott(Handbookof Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)中找到。

因此，发酵方法产生含有所需L-赖氨酸的发酵液。

然后将含有L-赖氨酸的产物从发酵液中以液体或固体形式回收或制备。

“发酵液”是指培养基，在其中培养本发明所述的谷氨酸棒杆菌一定时间并在某些条件下培养。

当发酵方法完成时，所得的发酵液因此包含：

a)本发明的谷氨酸棒杆菌的生物质(细胞质量)，所述生物质是由于所述谷氨酸棒杆菌的细胞的繁殖而产生的，

b)在发酵方法过程中积累的所需L-赖氨酸，

c)在发酵方法过程中积累的有机副产物，和

d)在发酵方法中所使用的培养基未被消耗的组分。

除了产生L-赖氨酸外，有机副产物包括在根据本发明的发酵方法过程中可由谷氨酸棒杆菌形成的化合物。

从培养容器或发酵罐中移出发酵液，在适当时收集，并用于提供液体或固体形式的含有L-赖氨酸的产物。表述“回收含L-赖氨酸产物”也用于此。在最简单的情况下，已从发酵罐中移出的含L-赖氨酸发酵液本身构成回收的产物。

随后可以使发酵液进行从所述发酵液中提取水或基本除去水。从发酵液中提取特别是至少40％(w/w)，优选至少90％(w/w)，更优选至少95％(w/w)的水。

除去生物质尤其可以通过离心、过滤或倾析或其组合来实现。

制备L-赖氨酸产物也可包含纯化的步骤，优选选自离子交换色谱法、用活性炭处理或结晶。

因此可获得例如包含L-赖氨酸x HCl，优选含有≥80％L-赖氨酸x HCl，特别优选≥90％L-赖氨酸x HCl或≥95％L-赖氨酸x HCl的产物。

分析L-赖氨酸以测定其在发酵过程中的一个或多个时间的浓度，可以通过利用离子交换色谱法，优选阳离子交换色谱法分离L-赖氨酸，随后使用茚三酮进行柱后衍生来进行，如Spackman等人所述(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))。也可以使用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生。关于离子交换色谱的概述文章可以在Pickering(LC.GC(Magazine of Chromatographic Science 7(6)：484-487(1989))中找到。同样可以进行柱前衍生，例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯，并可以通过反相色谱法(RP)分馏所得的氨基酸衍生物，优选以高效液相色谱法(HPLC)的形式。这种类型的方法描述于例如Lindroth等人(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))。检测通过光度测定(吸收，荧光)进行。

实验部分

A)材料和方法

本文简要描述了所用的分子生物学试剂盒、引物和化学品以及所应用方法的一些细节。

1.抗生素和化学品

a.卡那霉素：来自Sigma Aldrich的卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)的卡那霉素溶液(St.Louis，USA，目录号K0254)。

b.萘啶酮酸：来自Sigma Aldrich的萘啶酮酸钠盐(St.Louis，USA，目录号N4382)。

c.如果没有另外说明，则所有化学品均是购自Merck(Darmstadt，Germany)，SigmaAldrich(St.Louis，USA)或Carl-Roth(Karlsruhe，Germany)的分析纯。

2.培养

如果没有另外说明，则所有培养/孵育程序如下进行：

a.来自Merck的LB培养液(MILLER)(Darmstadt,Germany；目录号110285)用于在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/含有3个挡板的100mlErlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养箱摇床中以37℃和200rpm孵育。

b.来自Merck的LB琼脂(MILLER)(Darmstadt,Germany目录号110283)用于在琼脂平板上培养大肠杆菌菌株。将琼脂平板于37℃在来自VWR(Radnor，USA)的INCU-

小型培养箱中孵育。

c.来自Merck的脑心浸液培养液(BHI)(Darmstadt,Germany；目录号110493)用于在液体培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Einsbach，Germany)的Infors HT Multitron标准培养箱摇床中以33℃和200rpm孵育。

d.来自Merck的脑心琼脂(BHI-琼脂)(Darmstadt,Germany；目录号113825)用于在琼脂平板上培养谷氨酸棒杆菌菌株。将琼脂平板于33℃在来自Heraeus Instruments的具有

温度控制器(Hanau，Germany)的培养箱中孵育。

3.测定光密度

a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg，Germany)的BioPhotometer在600nm(OD600)测定摇瓶培养物中细菌悬浮液的光密度。

b.使用来自Tecan Group AG(

Switzerland)的GENios^TM读板仪在660nm(OD660)测定Wouter Duetz(WDS)微发酵系统(24孔板)中产生的细菌悬浮液的光密度。

4.离心

a.用于体积达2ml的反应管的台式离心机

使用Eppendorf 5417R离心机，使用1ml或2ml反应管(例如Eppendorf

3810X)使最大体积为2ml的细菌悬浮液沉淀(以13,000rpm离心5分钟)。

b.用于体积达50ml的管的台式离心机

使用Eppendorf 5810R离心机，使用15ml或50ml离心管(例如Falcon^TM50ml锥形离心管)，以4000rpm离心10分钟，使最大体积为50ml的细菌悬浮液沉淀。

5.使用FRET检测突变

给定突变(例如核碱基交换)的存在通过实时PCR联用FRET杂交探针检测。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。使用来自Roche

的Lightcycler作为实时PCR仪器(见下文)。

这种方法被例如M.J.Lay and C.T.Wittwer(Clinical Chemistry 42(12),2262-2267(1997))用于因子V Leiden的基因型分型。Cyril DS Mamotte(The ClinicalBiochemist Reviews 27,63-75(2006)综述了使用这种方法进行单核苷酸取代的基因型分型。FRET杂交供体探针用荧光染料荧光素标记，受体探针用荧光染料LC-Red640标记。实质上，检测方法包括三个步骤：菌落PCR，探针杂交和随后的解链曲线分析。该方法在此简称为实时PCR。

a.引物和探针

使用的寡核苷酸由eurofins genomics GmbH(Ebersberg，Germany)合成。

b.模板

使用菌落中含有的总DNA作为PCR模板。它是通过用牙签从琼脂平板上的菌落挑取细胞材料并将细胞材料直接放入PCR反应管中来制备的。将细胞材料在来自SEVERIN

GmbH(Sundern，Germany)的微波炉型号Mikrowave&Grill中用800W加热10秒，然后将PCR试剂加入到PCR反应管中的模板中。

b.反应混合物

来自Qiagen的

Fast SNP探针PCR试剂盒(Type-it Kit)(Hilden，Germany，目录号206045)用于实时检测突变。因此，将2.5μl的Qiagen Fast SNP Puffer(2x)与0.5μl的每种LC-PCR-引物[10μM]和0.5μl的每种以1：500稀释的受体和供体探针[100pmol/μl]混合获得实时PCR的mastermix。表1：使用Light

(步骤1-3)和解链曲线分析(步骤4-6)进行PCR的热循环条件。

c.PCR循环仪

反应在Light

2.0仪器中进行，并用Roche Diagnostics(Rotkreuz，Switzerland)的Light

软件4.1分析。

6.大肠杆菌的化学转化

大肠杆菌K-12菌株S17-1用作结合转移基于pK18mobsacB的质粒的供体，从大肠杆菌到谷氨酸棒杆菌。Simon,R.等人描述了菌株S17-1(Bio/Technology 1,784-794,1983)。它可从美国典型培养物保藏中心以保藏号ATCC47055获得。

化学感受态大肠杆菌S17-1细胞如下制备：用100μl菌株S17-1的细菌悬浮液接种10ml LB培养基(10ml液体培养基/含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)的预培养物，并将培养物在37℃和250rpm孵育过夜约18小时。用300μl预培养物接种主培养物(含有3个挡板的250ml Erlenmeyer烧瓶中含有的70ml LB)，并在37℃孵育至OD600为0.5-0.8。将培养物以4℃和4000rpm离心6分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于20ml无菌冰冷的50mMCaCl₂溶液中并在冰上孵育30分钟。在另一次离心步骤后，将沉淀重悬于5ml冰冷的50mMCaCl₂溶液中并将悬浮液在冰上孵育30分钟。然后将细胞悬浮液用85％(v/v)无菌冰冷甘油调节至终浓度为20％甘油(v/v)。将悬浮液分成50μl等分试样并储存在-80℃。

为了转化S17-1细胞，使用根据Tang等人的方案(Nucleic Acids Res.22(14),2857-2858,1994)，并热休克45秒。

7.谷氨酸棒杆菌的接合

等人描述的pK18mobsacB质粒系统(Gene 145,69-73,1994)用于将所需的DNA片段整合到谷氨酸棒杆菌的染色体中。

等人的修饰的接合方法(Journal ofBacteriology 172,1663-1666,1990)用于将各个质粒转移到所需的谷氨酸棒杆菌受体菌株中。

谷氨酸棒杆菌菌株的液体培养物在BHI培养基中于33℃进行。热休克在48.5℃进行9分钟。通过将接合批次铺板在EM8琼脂(表2)上来选择转接合子，所述EM8琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将EM8琼脂平板在33℃孵育72小时。

表2：EM8琼脂的成分

使用无菌牙签将转接合子转移到BHI琼脂上，该琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将琼脂平板在33℃孵育20小时。然后将以这种方式产生的各个转接合子的培养物在33℃于含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中含有的10ml BHI培养基中进一步繁殖24小时。从适当稀释的液体培养物中取出等分试样并在补充有10％蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)。将琼脂平板在33℃孵育48小时。然后检查在含蔗糖琼脂平板上生长的菌落的表型卡那霉素敏感性。为此，使用牙签从菌落中移出细胞材料并将其转移到含有25mg/l卡那霉素的BHI琼脂上，以及转移到含有10％蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃孵育60小时。利用实时PCR，检查证明对卡那霉素敏感并对蔗糖具有抗性的克隆中所需DNA片段的整合。

8.大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的甘油原液

为了大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的长时间储存，制备甘油原液。将选择的大肠杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的10ml LB培养基中培养。将选择的谷氨酸棒杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的2倍浓缩BHI培养基中培养。用50mg/l卡那霉素补充含质粒的大肠杆菌菌株的培养物。用25mg/l卡那霉素补充含质粒的谷氨酸棒杆菌菌株的培养物。将培养基装在含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用取自菌落的一环细胞接种，且培养物在大肠杆菌的情况下在37℃和200rpm孵育约18小时，在谷氨酸棒杆菌的情况下在33℃和200rpm孵育约18小时。在所述孵育期后，向培养物中加入1.2ml 85％(v/v)无菌甘油。然后将获得的含甘油的细胞悬浮液等分成2ml部分，并储存在-80℃。

9.根据Wouter Duetz(WDS)的培养系统

根据Duetz(Trends Microbiol.2007；15(10)：469-75)的毫升级培养系统用于研究构建的谷氨酸棒杆菌菌株的性能。为此目的，使用来自EnzyScreen BV的24深孔微孔板(24孔WDS板)(Heemstede,Netherlands；目录号CR1424)，其填充有2.5mL培养基。

菌株的预培养物在10ml的2倍浓缩BHI培养基中进行。将培养基装在含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用100μl甘油原液培养物接种，并将培养物在33℃和200rpm孵育24小时。

在所述孵育期后，测定预培养物的光密度OD600。通过用预培养物的等分式样接种24孔WDS板的含2.5ml培养基的孔使得光密度OD600为0.1来制作主培养物。

使用主培养物CGXII培养基作为培养基。CGXII培养基的成分如表3所示。

表3：CGXII培养基的成分。

将这些主培养物在来自Infors GmbH(Bottmingen，Switzerland)的Infors HTMultitron标准培养箱摇床中于33℃和300rpm孵育约45小时，直至完全消耗葡萄糖。

用来自LifeScan(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，Germany)的血糖仪OneTouch

分析悬浮液中的葡萄糖浓度。培养后，将培养物悬浮液转移到深孔微孔板中。适当稀释一部分培养物悬浮液以测量OD600。将培养物的另一部分离心，并分析上清液中的L-氨基酸，特别是L-赖氨酸和残余葡萄糖的浓度。

10.氨基酸分析仪

使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck，Germany)的SYKAM S433氨基酸分析仪，通过离子交换色谱测定培养物上清液中的L-赖氨酸和其他L-氨基酸(例如L-缬氨酸)的浓度。使用来自SYKAM的具有球形聚苯乙烯基阳离子交换剂(Peek LCA N04/Na，尺寸150×4.6mm)的柱作为固相。取决于L-氨基酸，使用用于洗脱的缓冲剂A和B的混合物进行等度运行以进行分离，或使用所述缓冲剂通过梯度洗脱进行分离。使用20l含有263g柠檬酸三钠、120g柠檬酸、1100ml甲醇，100ml 37％HCl和2ml辛酸的水溶液(最终pH 3.5)作为缓冲剂A。使用20l含有392g柠檬酸三钠、100g硼酸和2ml辛酸的水溶液(最终pH 10.2)作为缓冲剂B。通过柱后衍生用茚三酮将游离氨基酸着色，并在570nm处用光度法检测。

11.用连续流动系统(CFS)测定葡萄糖

使用来自SKALAR analytic GmbH(Erkelenz，Germany)的SANplus多通道连续流动分析仪测定上清液中葡萄糖的浓度。通过NADH形成用偶联酶测定(己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶)检测葡萄糖。

B)实验结果

实施例1

谷氨酸棒杆菌菌株DM1933的kup基因的序列

菌株DM1933是Blombach等人描述的L-赖氨酸生产者(Applied andEnvironmental Microbiology 75(2),419-427,2009)。它在DSMZ以保藏号DSM25442可得。

通过Illumina全基因组测序技术(Illumina Inc.，San Diego，CA，US)测定菌株DM1933的染色体的核苷酸序列。参见例如Benjak等人(2015)Whole-Genome Sequencingfor Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly.In:Parish T.,Roberts D.(eds)Mycobacteria Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol 1285.HumanaPress,NY,US)和Bennet,S.(Pharmacogenomics 5(4),433-438,2004)。

发现菌株DM1933的kup编码序列(locus_tag NCgl0682)的核苷酸序列(包括其上游和下游的核苷酸序列)与SEQ ID NO：1中所示的ATCC13032的核苷酸序列相同。

DM1933在其染色体中含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体。所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中氨基酸序列位置311处的氨基酸苏氨酸(Thr)被异亮氨酸(Ile)置换。在US 7,338,790中，缩写“lysC T311I”用于表示所述交换。Blombach等人使用缩写“lysC(T311I)”。

实施例2

构建质粒pK18mobsacB_kup_G344V

构建质粒pK18mobsacB_kup_G344V以使导致氨基酸交换G344V的突变掺入菌株DM1933的kup编码序列的核苷酸序列中。该质粒基于

等人描述的可移动(mobilizable)载体pK18mobsacB(Gene 145,69-73,1994)。为了构建pK18mobsacB_kup_G344V，合成根据SEQ ID NO：7的kup_G344V多核苷酸并通过GeneArt(Thermo FisherScientific(Waltham，USA))亚克隆到pK18mobsacB中。

为了组装质粒pK18mobsacB_kup_G344V，以下步骤由GeneArt进行：将两种多核苷酸，即载体pK18mobsacB和多核苷酸kup_G344V均用Xbal处理，连接，并将连接混合物用于转化大肠杆菌。

从转化体中分离出质粒pK18mobsacB_kup_G344V的DNA。

实施例3

菌株DM1933_kup_G344V的构建

使用实施例2中获得的质粒pK18mobsacB_kup_G344V，将导致氨基酸交换G344V(参见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的核苷酸位置1069-1071，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸位置344，和SEQ ID NO：7的核苷酸位置865-867)的突变(参见SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3的核苷酸位置1070和SEQ ID NO：7的核苷酸位置866)掺入L-赖氨酸生产者DM1933的染色体中。

用pK18mobsacB_kup_G344V的质粒DNA转化大肠杆菌菌株S17-1的化学感受态细胞。使用

等人(Journal of Bacteriology 172,1663-1666,1990)描述于材料和方法中的修饰的接合方法用于接合转移到菌株DM1933中，并且由于它们的蔗糖抗性和卡那霉素敏感性表型用于选择转接合子克隆。

使用Type-it Kit以及用于PCR扩增的引物LC-Ncgl0682_1和LC-Ncgl0682_2以及用作解链曲线分析的受体探针的NCgl0682_344_C和供体探针的NCgl0682_G344V_A(表4)，通过实时PCR分析转接合子克隆。表4:实时PCR使用的引物和探针列表

名称	序列
		LC-NCgl0682_1	ATCAGATACAGGACGCTGAC
LC-NCgl0682_2	AGGTCTGCGGATTCCGTTGG
		NCgl0682_344_C<sup>1</sup>	TAGATCTGGACTTCCTCTTT
NCgl0682_344_A<sup>2</sup>	CACGGATACAAACAGCAATCCATTAACCAGTGGCA

¹ 用LC-Red640在 5’-端标记并在3’-端磷酸化的受体探针

² 用荧光素在3’-端标记的供体探针

如此表征的转接合子克隆之一称为DM1933_kup_G344V。制备转接合子克隆的甘油原液培养物并用作进一步研究的起始材料。

因此菌株DM1933的kup基因被突变，其效果是编码Kup多肽的氨基酸序列的位置344处的氨基酸甘氨酸被缬氨酸置换。

实施例4

通过菌株DM1933_kup_G344V生产L-赖氨酸。

使用根据Wouter Duetz的培养系统，通过分批培养分析实施例3中获得的菌株DM1933(参考)和DM1933_kup_G344V从葡萄糖生产L-赖氨酸的能力。

使用含有20g/l葡萄糖作为碳源的培养基CGXII。将培养物孵育45小时直至完全消耗葡萄糖，如通过使用血糖仪的葡萄糖分析所确认的，并测定L-赖氨酸的浓度和光密度OD660。实验结果如表5所示。

表5：菌株DM1933_kup_G344V的L-赖氨酸生产。

菌株	L-赖氨酸<sup>1</sup>(g/l)	OD660
			DM1933	3.7	9.5
DM1933_kup_G344V	4.0	9.2

¹以L-赖氨酸×HCl

该实验显示，与亲本菌株DM1933相比，菌株DM1933_kup_G344V中L-赖氨酸的生产增加。

序列表

<110> 赢创运营有限公司

<120> 使用具有突变的Kup转运蛋白的谷氨酸棒杆菌菌株发酵生产L-赖氨酸的方法

<130> file: 201800290

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1963

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(37)

<223> putative ribosome binding site

<220>

<221> CDS

<222> (40)..(1923)

<223> coding sequence of NCgl0682

<220>

<221> misc_feature

<222> (1070)..(1070)

<223> nucleobase guanine

<220>

<221> misc_feature

<222> (1924)..(1926)

<223> taa stop codon

<400> 1

gtcttttctg agcgctagca tttctccact caaaggagc atg ctt aac cgc atg 54

Met Leu Asn Arg Met

1 5

aaa agt gcg cgg cca aaa tca gtc gct cca aaa tcc gga caa gct tta 102

Lys Ser Ala Arg Pro Lys Ser Val Ala Pro Lys Ser Gly Gln Ala Leu

10 15 20

ctc act ctc ggt gcc cta ggt gtt gtg ttc ggc gac atc ggc acc agc 150

Leu Thr Leu Gly Ala Leu Gly Val Val Phe Gly Asp Ile Gly Thr Ser

25 30 35

ccc ctg tac tca ctt cac act gca ttc agc atg cag cac aac aaa gtc 198

Pro Leu Tyr Ser Leu His Thr Ala Phe Ser Met Gln His Asn Lys Val

40 45 50

gaa gtc act cag gaa aat gtg tac ggc atc atc tcc atg gtg ttg tgg 246

Glu Val Thr Gln Glu Asn Val Tyr Gly Ile Ile Ser Met Val Leu Trp

55 60 65

acc atc act ttg atc gtc acc gtc aaa tac gtc atg ctg gtc acc cga 294

Thr Ile Thr Leu Ile Val Thr Val Lys Tyr Val Met Leu Val Thr Arg

70 75 80 85

gct gac aac caa gga caa ggt ggc atc ctg gcg ctc gtt gct ttg ctg 342

Ala Asp Asn Gln Gly Gln Gly Gly Ile Leu Ala Leu Val Ala Leu Leu

90 95 100

aaa aac cgt ggg cac tgg gga aaa ttc gtg gca gta gcc ggc atg ttg 390

Lys Asn Arg Gly His Trp Gly Lys Phe Val Ala Val Ala Gly Met Leu

105 110 115

ggc gcc gca ttg ttt tat ggc gat gtg gtg atc acc ccg gcg atc tct 438

Gly Ala Ala Leu Phe Tyr Gly Asp Val Val Ile Thr Pro Ala Ile Ser

120 125 130

gtt ctc agc gca aca gaa ggc ttg acg gtt atc tcc cca agc ttt gag 486

Val Leu Ser Ala Thr Glu Gly Leu Thr Val Ile Ser Pro Ser Phe Glu

135 140 145

cgc ttc att ctg ccc gta tct ctc gca gtt ctg atc gct att ttt gca 534

Arg Phe Ile Leu Pro Val Ser Leu Ala Val Leu Ile Ala Ile Phe Ala

150 155 160 165

atc caa ccg ctc ggt aca gaa aaa gtc ggc aaa gcc ttc ggc ccc atc 582

Ile Gln Pro Leu Gly Thr Glu Lys Val Gly Lys Ala Phe Gly Pro Ile

170 175 180

atg ttg ctg tgg ttt gtc acc ctt gca gga ttg gga att ccg caa atc 630

Met Leu Leu Trp Phe Val Thr Leu Ala Gly Leu Gly Ile Pro Gln Ile

185 190 195

atc ggg cac cca gaa atc ttg cag agc ttg tct cca cat tgg gcc ctg 678

Ile Gly His Pro Glu Ile Leu Gln Ser Leu Ser Pro His Trp Ala Leu

200 205 210

cgc ttg att gtg gct gag cct ttc caa gca ttt gtg ctg ctt ggt gcc 726

Arg Leu Ile Val Ala Glu Pro Phe Gln Ala Phe Val Leu Leu Gly Ala

215 220 225

gtt gtc ctg aca gta acg ggt gcg gaa gcg ctc tac gct gat atg ggc 774

Val Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Glu Ala Leu Tyr Ala Asp Met Gly

230 235 240 245

cat ttt ggg gcg agg cca atc aga gtg gcg tgg ttt tgc gtc gtc atg 822

His Phe Gly Ala Arg Pro Ile Arg Val Ala Trp Phe Cys Val Val Met

250 255 260

cct gct tta atc ttg acg tat ttg ggg cag ggc gcc ttg gtg atc aac 870

Pro Ala Leu Ile Leu Thr Tyr Leu Gly Gln Gly Ala Leu Val Ile Asn

265 270 275

cag cct gaa gcg gtg cgc aac ccc atg ttt tat ctc gcg ccg gaa ggt 918

Gln Pro Glu Ala Val Arg Asn Pro Met Phe Tyr Leu Ala Pro Glu Gly

280 285 290

ctg cgg att ccg ttg gtt att ttg gcg acc atc gct acg gtg atc gca 966

Leu Arg Ile Pro Leu Val Ile Leu Ala Thr Ile Ala Thr Val Ile Ala

295 300 305

tcg cag gcc gtg att tct ggt gcg tat tca ttg acc aag cag gcc gtg 1014

Ser Gln Ala Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Lys Gln Ala Val

310 315 320 325

aat ttg aaa ctg ctg cca cgc atg gtg atc cgg cat acc tcc cgc aaa 1062

Asn Leu Lys Leu Leu Pro Arg Met Val Ile Arg His Thr Ser Arg Lys

330 335 340

gag gaa ggc cag atc tat atg cca ctg gtt aat gga ttg ctg ttt gta 1110

Glu Glu Gly Gln Ile Tyr Met Pro Leu Val Asn Gly Leu Leu Phe Val

345 350 355

tcc gtg atg gtt gtg gtg ctg gta ttc cga tcc tct gaa agc ctc gcc 1158

Ser Val Met Val Val Val Leu Val Phe Arg Ser Ser Glu Ser Leu Ala

360 365 370

agc gcg tac gga ctt gca gtg acc gga acc ttg gtg ctg gtc agc gtc 1206

Ser Ala Tyr Gly Leu Ala Val Thr Gly Thr Leu Val Leu Val Ser Val

375 380 385

ctg tat ctg atc tat gtt cac acc aca tgg tgg aaa aca gcg ctg ttc 1254

Leu Tyr Leu Ile Tyr Val His Thr Thr Trp Trp Lys Thr Ala Leu Phe

390 395 400 405

att gtg ctc atc ggt att cca gaa gta ctt cta ttc gcc tcg aac acc 1302

Ile Val Leu Ile Gly Ile Pro Glu Val Leu Leu Phe Ala Ser Asn Thr

410 415 420

acg aaa att cac gac ggt ggc tgg ctt cca cta ctt att gcg gcc gtg 1350

Thr Lys Ile His Asp Gly Gly Trp Leu Pro Leu Leu Ile Ala Ala Val

425 430 435

ctc atc gtg gtg atg cgg acc tgg gag tgg gga agt gac cgc gtc aat 1398

Leu Ile Val Val Met Arg Thr Trp Glu Trp Gly Ser Asp Arg Val Asn

440 445 450

cag gaa cgc gca gag ctg gaa ctt ccc atg gat aag ttc ttg gag aaa 1446

Gln Glu Arg Ala Glu Leu Glu Leu Pro Met Asp Lys Phe Leu Glu Lys

455 460 465

ctc gat cag cca cac aat att ggt ctg cgt aaa gtt gcc gaa gtg gca 1494

Leu Asp Gln Pro His Asn Ile Gly Leu Arg Lys Val Ala Glu Val Ala

470 475 480 485

gta ttt cca cat ggc acc agc gat act gtc ccg ttg tca ttg gtt cgc 1542

Val Phe Pro His Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro Leu Ser Leu Val Arg

490 495 500

tgc gtg aaa gac ctc aag ctt tta tac cga gag atc gtg atc gtt cga 1590

Cys Val Lys Asp Leu Lys Leu Leu Tyr Arg Glu Ile Val Ile Val Arg

505 510 515

atc gtc caa gaa cac gtt ccg cac gtg cca cca gag gaa cgc gcg gaa 1638

Ile Val Gln Glu His Val Pro His Val Pro Pro Glu Glu Arg Ala Glu

520 525 530

atg gaa gtg ctc cat cac gcc ccg atc aga gtc gtg cga gtt gat ctg 1686

Met Glu Val Leu His His Ala Pro Ile Arg Val Val Arg Val Asp Leu

535 540 545

cac ctt ggt tat ttt gat gag cag aac ctg cct gag cat ctc cat gcc 1734

His Leu Gly Tyr Phe Asp Glu Gln Asn Leu Pro Glu His Leu His Ala

550 555 560 565

att gac cca aca tgg gat aac gcc acc tac ttc ctg tct gcc ctg act 1782

Ile Asp Pro Thr Trp Asp Asn Ala Thr Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Thr

570 575 580

ctt cgg agc agg ttg cct gga aag att gct ggc tgg cgt gat cgt ttg 1830

Leu Arg Ser Arg Leu Pro Gly Lys Ile Ala Gly Trp Arg Asp Arg Leu

585 590 595

tat ctt tcg atg gaa cgt aat cag gca tct cga act gag tct ttc aaa 1878

Tyr Leu Ser Met Glu Arg Asn Gln Ala Ser Arg Thr Glu Ser Phe Lys

600 605 610

ttg caa cca agc aaa acc atc acg gtt gga aca gag ctg cac ctt 1923

Leu Gln Pro Ser Lys Thr Ile Thr Val Gly Thr Glu Leu His Leu

615 620 625

taatcaggca gttgctggcc aactgagtta gcctaaaacg 1963

<210> 2

<211> 628

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 2

Met Leu Asn Arg Met Lys Ser Ala Arg Pro Lys Ser Val Ala Pro Lys

1 5 10 15

Ser Gly Gln Ala Leu Leu Thr Leu Gly Ala Leu Gly Val Val Phe Gly

20 25 30

Asp Ile Gly Thr Ser Pro Leu Tyr Ser Leu His Thr Ala Phe Ser Met

35 40 45

Gln His Asn Lys Val Glu Val Thr Gln Glu Asn Val Tyr Gly Ile Ile

50 55 60

Ser Met Val Leu Trp Thr Ile Thr Leu Ile Val Thr Val Lys Tyr Val

65 70 75 80

Met Leu Val Thr Arg Ala Asp Asn Gln Gly Gln Gly Gly Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Val Ala Leu Leu Lys Asn Arg Gly His Trp Gly Lys Phe Val Ala

100 105 110

Val Ala Gly Met Leu Gly Ala Ala Leu Phe Tyr Gly Asp Val Val Ile

115 120 125

Thr Pro Ala Ile Ser Val Leu Ser Ala Thr Glu Gly Leu Thr Val Ile

130 135 140

Ser Pro Ser Phe Glu Arg Phe Ile Leu Pro Val Ser Leu Ala Val Leu

145 150 155 160

Ile Ala Ile Phe Ala Ile Gln Pro Leu Gly Thr Glu Lys Val Gly Lys

165 170 175

Ala Phe Gly Pro Ile Met Leu Leu Trp Phe Val Thr Leu Ala Gly Leu

180 185 190

Gly Ile Pro Gln Ile Ile Gly His Pro Glu Ile Leu Gln Ser Leu Ser

195 200 205

Pro His Trp Ala Leu Arg Leu Ile Val Ala Glu Pro Phe Gln Ala Phe

210 215 220

Val Leu Leu Gly Ala Val Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Glu Ala Leu

225 230 235 240

Tyr Ala Asp Met Gly His Phe Gly Ala Arg Pro Ile Arg Val Ala Trp

245 250 255

Phe Cys Val Val Met Pro Ala Leu Ile Leu Thr Tyr Leu Gly Gln Gly

260 265 270

Ala Leu Val Ile Asn Gln Pro Glu Ala Val Arg Asn Pro Met Phe Tyr

275 280 285

Leu Ala Pro Glu Gly Leu Arg Ile Pro Leu Val Ile Leu Ala Thr Ile

290 295 300

Ala Thr Val Ile Ala Ser Gln Ala Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Thr Lys Gln Ala Val Asn Leu Lys Leu Leu Pro Arg Met Val Ile Arg

325 330 335

His Thr Ser Arg Lys Glu Glu Gly Gln Ile Tyr Met Pro Leu Val Asn

340 345 350

Gly Leu Leu Phe Val Ser Val Met Val Val Val Leu Val Phe Arg Ser

355 360 365

Ser Glu Ser Leu Ala Ser Ala Tyr Gly Leu Ala Val Thr Gly Thr Leu

370 375 380

Val Leu Val Ser Val Leu Tyr Leu Ile Tyr Val His Thr Thr Trp Trp

385 390 395 400

Lys Thr Ala Leu Phe Ile Val Leu Ile Gly Ile Pro Glu Val Leu Leu

405 410 415

Phe Ala Ser Asn Thr Thr Lys Ile His Asp Gly Gly Trp Leu Pro Leu

420 425 430

Leu Ile Ala Ala Val Leu Ile Val Val Met Arg Thr Trp Glu Trp Gly

435 440 445

Ser Asp Arg Val Asn Gln Glu Arg Ala Glu Leu Glu Leu Pro Met Asp

450 455 460

Lys Phe Leu Glu Lys Leu Asp Gln Pro His Asn Ile Gly Leu Arg Lys

465 470 475 480

Val Ala Glu Val Ala Val Phe Pro His Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro

485 490 495

Leu Ser Leu Val Arg Cys Val Lys Asp Leu Lys Leu Leu Tyr Arg Glu

500 505 510

Ile Val Ile Val Arg Ile Val Gln Glu His Val Pro His Val Pro Pro

515 520 525

Glu Glu Arg Ala Glu Met Glu Val Leu His His Ala Pro Ile Arg Val

530 535 540

Val Arg Val Asp Leu His Leu Gly Tyr Phe Asp Glu Gln Asn Leu Pro

545 550 555 560

Glu His Leu His Ala Ile Asp Pro Thr Trp Asp Asn Ala Thr Tyr Phe

565 570 575

Leu Ser Ala Leu Thr Leu Arg Ser Arg Leu Pro Gly Lys Ile Ala Gly

580 585 590

Trp Arg Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Met Glu Arg Asn Gln Ala Ser Arg

595 600 605

Thr Glu Ser Phe Lys Leu Gln Pro Ser Lys Thr Ile Thr Val Gly Thr

610 615 620

Glu Leu His Leu

625

<210> 3

<211> 1963

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(37)

<223> putative ribosome binding site

<220>

<221> CDS

<222> (40)..(1923)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1070)..(1070)

<223> nucleobase thymine

<220>

<221> misc_feature

<222> (1924)..(1926)

<223> taa stop codon

<400> 3

gtcttttctg agcgctagca tttctccact caaaggagc atg ctt aac cgc atg 54

Met Leu Asn Arg Met

1 5

aaa agt gcg cgg cca aaa tca gtc gct cca aaa tcc gga caa gct tta 102

Lys Ser Ala Arg Pro Lys Ser Val Ala Pro Lys Ser Gly Gln Ala Leu

10 15 20

ctc act ctc ggt gcc cta ggt gtt gtg ttc ggc gac atc ggc acc agc 150

Leu Thr Leu Gly Ala Leu Gly Val Val Phe Gly Asp Ile Gly Thr Ser

25 30 35

ccc ctg tac tca ctt cac act gca ttc agc atg cag cac aac aaa gtc 198

Pro Leu Tyr Ser Leu His Thr Ala Phe Ser Met Gln His Asn Lys Val

40 45 50

gaa gtc act cag gaa aat gtg tac ggc atc atc tcc atg gtg ttg tgg 246

Glu Val Thr Gln Glu Asn Val Tyr Gly Ile Ile Ser Met Val Leu Trp

55 60 65

acc atc act ttg atc gtc acc gtc aaa tac gtc atg ctg gtc acc cga 294

Thr Ile Thr Leu Ile Val Thr Val Lys Tyr Val Met Leu Val Thr Arg

70 75 80 85

gct gac aac caa gga caa ggt ggc atc ctg gcg ctc gtt gct ttg ctg 342

Ala Asp Asn Gln Gly Gln Gly Gly Ile Leu Ala Leu Val Ala Leu Leu

90 95 100

aaa aac cgt ggg cac tgg gga aaa ttc gtg gca gta gcc ggc atg ttg 390

Lys Asn Arg Gly His Trp Gly Lys Phe Val Ala Val Ala Gly Met Leu

105 110 115

ggc gcc gca ttg ttt tat ggc gat gtg gtg atc acc ccg gcg atc tct 438

Gly Ala Ala Leu Phe Tyr Gly Asp Val Val Ile Thr Pro Ala Ile Ser

120 125 130

gtt ctc agc gca aca gaa ggc ttg acg gtt atc tcc cca agc ttt gag 486

Val Leu Ser Ala Thr Glu Gly Leu Thr Val Ile Ser Pro Ser Phe Glu

135 140 145

cgc ttc att ctg ccc gta tct ctc gca gtt ctg atc gct att ttt gca 534

Arg Phe Ile Leu Pro Val Ser Leu Ala Val Leu Ile Ala Ile Phe Ala

150 155 160 165

atc caa ccg ctc ggt aca gaa aaa gtc ggc aaa gcc ttc ggc ccc atc 582

Ile Gln Pro Leu Gly Thr Glu Lys Val Gly Lys Ala Phe Gly Pro Ile

170 175 180

atg ttg ctg tgg ttt gtc acc ctt gca gga ttg gga att ccg caa atc 630

Met Leu Leu Trp Phe Val Thr Leu Ala Gly Leu Gly Ile Pro Gln Ile

185 190 195

atc ggg cac cca gaa atc ttg cag agc ttg tct cca cat tgg gcc ctg 678

Ile Gly His Pro Glu Ile Leu Gln Ser Leu Ser Pro His Trp Ala Leu

200 205 210

cgc ttg att gtg gct gag cct ttc caa gca ttt gtg ctg ctt ggt gcc 726

Arg Leu Ile Val Ala Glu Pro Phe Gln Ala Phe Val Leu Leu Gly Ala

215 220 225

gtt gtc ctg aca gta acg ggt gcg gaa gcg ctc tac gct gat atg ggc 774

Val Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Glu Ala Leu Tyr Ala Asp Met Gly

230 235 240 245

cat ttt ggg gcg agg cca atc aga gtg gcg tgg ttt tgc gtc gtc atg 822

His Phe Gly Ala Arg Pro Ile Arg Val Ala Trp Phe Cys Val Val Met

250 255 260

cct gct tta atc ttg acg tat ttg ggg cag ggc gcc ttg gtg atc aac 870

Pro Ala Leu Ile Leu Thr Tyr Leu Gly Gln Gly Ala Leu Val Ile Asn

265 270 275

cag cct gaa gcg gtg cgc aac ccc atg ttt tat ctc gcg ccg gaa ggt 918

Gln Pro Glu Ala Val Arg Asn Pro Met Phe Tyr Leu Ala Pro Glu Gly

280 285 290

ctg cgg att ccg ttg gtt att ttg gcg acc atc gct acg gtg atc gca 966

Leu Arg Ile Pro Leu Val Ile Leu Ala Thr Ile Ala Thr Val Ile Ala

295 300 305

tcg cag gcc gtg att tct ggt gcg tat tca ttg acc aag cag gcc gtg 1014

Ser Gln Ala Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Lys Gln Ala Val

310 315 320 325

aat ttg aaa ctg ctg cca cgc atg gtg atc cgg cat acc tcc cgc aaa 1062

Asn Leu Lys Leu Leu Pro Arg Met Val Ile Arg His Thr Ser Arg Lys

330 335 340

gag gaa gtc cag atc tat atg cca ctg gtt aat gga ttg ctg ttt gta 1110

Glu Glu Val Gln Ile Tyr Met Pro Leu Val Asn Gly Leu Leu Phe Val

345 350 355

tcc gtg atg gtt gtg gtg ctg gta ttc cga tcc tct gaa agc ctc gcc 1158

Ser Val Met Val Val Val Leu Val Phe Arg Ser Ser Glu Ser Leu Ala

360 365 370

agc gcg tac gga ctt gca gtg acc gga acc ttg gtg ctg gtc agc gtc 1206

Ser Ala Tyr Gly Leu Ala Val Thr Gly Thr Leu Val Leu Val Ser Val

375 380 385

ctg tat ctg atc tat gtt cac acc aca tgg tgg aaa aca gcg ctg ttc 1254

Leu Tyr Leu Ile Tyr Val His Thr Thr Trp Trp Lys Thr Ala Leu Phe

390 395 400 405

att gtg ctc atc ggt att cca gaa gta ctt cta ttc gcc tcg aac acc 1302

Ile Val Leu Ile Gly Ile Pro Glu Val Leu Leu Phe Ala Ser Asn Thr

410 415 420

acg aaa att cac gac ggt ggc tgg ctt cca cta ctt att gcg gcc gtg 1350

Thr Lys Ile His Asp Gly Gly Trp Leu Pro Leu Leu Ile Ala Ala Val

425 430 435

ctc atc gtg gtg atg cgg acc tgg gag tgg gga agt gac cgc gtc aat 1398

Leu Ile Val Val Met Arg Thr Trp Glu Trp Gly Ser Asp Arg Val Asn

440 445 450

cag gaa cgc gca gag ctg gaa ctt ccc atg gat aag ttc ttg gag aaa 1446

Gln Glu Arg Ala Glu Leu Glu Leu Pro Met Asp Lys Phe Leu Glu Lys

455 460 465

ctc gat cag cca cac aat att ggt ctg cgt aaa gtt gcc gaa gtg gca 1494

Leu Asp Gln Pro His Asn Ile Gly Leu Arg Lys Val Ala Glu Val Ala

470 475 480 485

gta ttt cca cat ggc acc agc gat act gtc ccg ttg tca ttg gtt cgc 1542

Val Phe Pro His Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro Leu Ser Leu Val Arg

490 495 500

tgc gtg aaa gac ctc aag ctt tta tac cga gag atc gtg atc gtt cga 1590

Cys Val Lys Asp Leu Lys Leu Leu Tyr Arg Glu Ile Val Ile Val Arg

505 510 515

atc gtc caa gaa cac gtt ccg cac gtg cca cca gag gaa cgc gcg gaa 1638

Ile Val Gln Glu His Val Pro His Val Pro Pro Glu Glu Arg Ala Glu

520 525 530

atg gaa gtg ctc cat cac gcc ccg atc aga gtc gtg cga gtt gat ctg 1686

Met Glu Val Leu His His Ala Pro Ile Arg Val Val Arg Val Asp Leu

535 540 545

cac ctt ggt tat ttt gat gag cag aac ctg cct gag cat ctc cat gcc 1734

His Leu Gly Tyr Phe Asp Glu Gln Asn Leu Pro Glu His Leu His Ala

550 555 560 565

att gac cca aca tgg gat aac gcc acc tac ttc ctg tct gcc ctg act 1782

Ile Asp Pro Thr Trp Asp Asn Ala Thr Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Thr

570 575 580

ctt cgg agc agg ttg cct gga aag att gct ggc tgg cgt gat cgt ttg 1830

Leu Arg Ser Arg Leu Pro Gly Lys Ile Ala Gly Trp Arg Asp Arg Leu

585 590 595

tat ctt tcg atg gaa cgt aat cag gca tct cga act gag tct ttc aaa 1878

Tyr Leu Ser Met Glu Arg Asn Gln Ala Ser Arg Thr Glu Ser Phe Lys

600 605 610

ttg caa cca agc aaa acc atc acg gtt gga aca gag ctg cac ctt 1923

Leu Gln Pro Ser Lys Thr Ile Thr Val Gly Thr Glu Leu His Leu

615 620 625

taatcaggca gttgctggcc aactgagtta gcctaaaacg 1963

<210> 4

<211> 628

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

Met Leu Asn Arg Met Lys Ser Ala Arg Pro Lys Ser Val Ala Pro Lys

1 5 10 15

Ser Gly Gln Ala Leu Leu Thr Leu Gly Ala Leu Gly Val Val Phe Gly

20 25 30

Asp Ile Gly Thr Ser Pro Leu Tyr Ser Leu His Thr Ala Phe Ser Met

35 40 45

Gln His Asn Lys Val Glu Val Thr Gln Glu Asn Val Tyr Gly Ile Ile

50 55 60

Ser Met Val Leu Trp Thr Ile Thr Leu Ile Val Thr Val Lys Tyr Val

65 70 75 80

Met Leu Val Thr Arg Ala Asp Asn Gln Gly Gln Gly Gly Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Val Ala Leu Leu Lys Asn Arg Gly His Trp Gly Lys Phe Val Ala

100 105 110

Val Ala Gly Met Leu Gly Ala Ala Leu Phe Tyr Gly Asp Val Val Ile

115 120 125

Thr Pro Ala Ile Ser Val Leu Ser Ala Thr Glu Gly Leu Thr Val Ile

130 135 140

Ser Pro Ser Phe Glu Arg Phe Ile Leu Pro Val Ser Leu Ala Val Leu

145 150 155 160

Ile Ala Ile Phe Ala Ile Gln Pro Leu Gly Thr Glu Lys Val Gly Lys

165 170 175

Ala Phe Gly Pro Ile Met Leu Leu Trp Phe Val Thr Leu Ala Gly Leu

180 185 190

Gly Ile Pro Gln Ile Ile Gly His Pro Glu Ile Leu Gln Ser Leu Ser

195 200 205

Pro His Trp Ala Leu Arg Leu Ile Val Ala Glu Pro Phe Gln Ala Phe

210 215 220

Val Leu Leu Gly Ala Val Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Glu Ala Leu

225 230 235 240

Tyr Ala Asp Met Gly His Phe Gly Ala Arg Pro Ile Arg Val Ala Trp

245 250 255

Phe Cys Val Val Met Pro Ala Leu Ile Leu Thr Tyr Leu Gly Gln Gly

260 265 270

Ala Leu Val Ile Asn Gln Pro Glu Ala Val Arg Asn Pro Met Phe Tyr

275 280 285

Leu Ala Pro Glu Gly Leu Arg Ile Pro Leu Val Ile Leu Ala Thr Ile

290 295 300

Ala Thr Val Ile Ala Ser Gln Ala Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Thr Lys Gln Ala Val Asn Leu Lys Leu Leu Pro Arg Met Val Ile Arg

325 330 335

His Thr Ser Arg Lys Glu Glu Val Gln Ile Tyr Met Pro Leu Val Asn

340 345 350

Gly Leu Leu Phe Val Ser Val Met Val Val Val Leu Val Phe Arg Ser

355 360 365

Ser Glu Ser Leu Ala Ser Ala Tyr Gly Leu Ala Val Thr Gly Thr Leu

370 375 380

Val Leu Val Ser Val Leu Tyr Leu Ile Tyr Val His Thr Thr Trp Trp

385 390 395 400

Lys Thr Ala Leu Phe Ile Val Leu Ile Gly Ile Pro Glu Val Leu Leu

405 410 415

Phe Ala Ser Asn Thr Thr Lys Ile His Asp Gly Gly Trp Leu Pro Leu

420 425 430

Leu Ile Ala Ala Val Leu Ile Val Val Met Arg Thr Trp Glu Trp Gly

435 440 445

Ser Asp Arg Val Asn Gln Glu Arg Ala Glu Leu Glu Leu Pro Met Asp

450 455 460

Lys Phe Leu Glu Lys Leu Asp Gln Pro His Asn Ile Gly Leu Arg Lys

465 470 475 480

Val Ala Glu Val Ala Val Phe Pro His Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro

485 490 495

Leu Ser Leu Val Arg Cys Val Lys Asp Leu Lys Leu Leu Tyr Arg Glu

500 505 510

Ile Val Ile Val Arg Ile Val Gln Glu His Val Pro His Val Pro Pro

515 520 525

Glu Glu Arg Ala Glu Met Glu Val Leu His His Ala Pro Ile Arg Val

530 535 540

Val Arg Val Asp Leu His Leu Gly Tyr Phe Asp Glu Gln Asn Leu Pro

545 550 555 560

Glu His Leu His Ala Ile Asp Pro Thr Trp Asp Asn Ala Thr Tyr Phe

565 570 575

Leu Ser Ala Leu Thr Leu Arg Ser Arg Leu Pro Gly Lys Ile Ala Gly

580 585 590

Trp Arg Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Met Glu Arg Asn Gln Ala Ser Arg

595 600 605

Thr Glu Ser Phe Lys Leu Gln Pro Ser Lys Thr Ile Thr Val Gly Thr

610 615 620

Glu Leu His Leu

625

<210> 5

<211> 1266

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1263)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1264)..(1266)

<223> taa stop codon

<400> 5

gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

gca ggc acc gga cgc taa 1266

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 6

<211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 6

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 7

<211> 1731

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Corynebacterium glutamicum DNA equipped with recognition sites

for the restriction endonuclease XbaI (polynucleotide kup_G344V)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(9)

<223> recognition site for restriction endonuclease XbaI

<220>

<221> misc_feature

<222> (866)..(866)

<223> nucleobase thymine

<220>

<221> misc_feature

<222> (1723)..(1728)

<223> recognition site for restriction endonuclease XbaI

<400> 7

gcgtctagaa atgtgtacgg catcatctcc atggtgttgt ggaccatcac tttgatcgtc 60

accgtcaaat acgtcatgct ggtcacccga gctgacaacc aaggacaagg tggcatcctg 120

gcgctcgttg ctttgctgaa aaaccgtggg cactggggaa aattcgtggc agtagccggc 180

atgttgggcg ccgcattgtt ttatggcgat gtggtgatca ccccggcgat ctctgttctc 240

agcgcaacag aaggcttgac ggttatctcc ccaagctttg agcgcttcat tctgcccgta 300

tctctcgcag ttctgatcgc tatttttgca atccaaccgc tcggtacaga aaaagtcggc 360

aaagccttcg gccccatcat gttgctgtgg tttgtcaccc ttgcaggatt gggaattccg 420

caaatcatcg ggcacccaga aatcttgcag agcttgtctc cacattgggc cctgcgcttg 480

attgtggctg agcctttcca agcatttgtg ctgcttggtg ccgttgtcct gacagtaacg 540

ggtgcggaag cgctctacgc tgatatgggc cattttgggg cgaggccaat cagagtggcg 600

tggttttgcg tcgtcatgcc tgctttaatc ttgacgtatt tggggcaggg cgccttggtg 660

atcaaccagc ctgaagcggt gcgcaacccc atgttttatc tcgcgccgga aggtctgcgg 720

attccgttgg ttattttggc gaccatcgct acggtgatcg catcgcaggc cgtgatttct 780

ggtgcgtatt cattgaccaa gcaggccgtg aatttgaaac tgctgccacg catggtgatc 840

cggcatacct cccgcaaaga ggaagtccag atctatatgc cactggttaa tggattgctg 900

tttgtatccg tgatggttgt ggtgctggta ttccgatcct ctgaaagcct cgccagcgcg 960

tacggacttg cagtgaccgg aaccttggtg ctggtcagcg tcctgtatct gatctatgtt 1020

cacaccacat ggtggaaaac agcgctgttc attgtgctca tcggtattcc agaagtactt 1080

ctattcgcct cgaacaccac gaaaattcac gacggtggct ggcttccact acttattgcg 1140

gccgtgctca tcgtggtgat gcggacctgg gagtggggaa gtgaccgcgt caatcaggaa 1200

cgcgcagagc tggaacttcc catggataag ttcttggaga aactcgatca gccacacaat 1260

attggtctgc gtaaagttgc cgaagtggca gtatttccac atggcaccag cgatactgtc 1320

ccgttgtcat tggttcgctg cgtgaaagac ctcaagcttt tataccgaga gatcgtgatc 1380

gttcgaatcg tccaagaaca cgttccgcac gtgccaccag aggaacgcgc ggaaatggaa 1440

gtgctccatc acgccccgat cagagtcgtg cgagttgatc tgcaccttgg ttattttgat 1500

gagcagaacc tgcctgagca tctccatgcc attgacccaa catgggataa cgccacctac 1560

ttcctgtctg ccctgactct tcggagcagg ttgcctggaa agattgctgg ctggcgtgat 1620

cgtttgtatc tttcgatgga acgtaatcag gcatctcgaa ctgagtcttt caaattgcaa 1680

ccaagcaaaa ccatcacggt tggaacagag ctgcaccttt aatctagagc c 1731

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer LC-NCgl0682_1

<400> 8

atcagataca ggacgctgac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer LC-NCgl0682_2

<400> 9

aggtctgcgg attccgttgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> probe NCgl0682_344_C

<400> 10

tagatctgga cttcctcttt 20

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> probe NCgl0682_344_A

<400> 11

cacggataca aacagcaatc cattaaccag tggca 35

201800290A 4

Claims

1.一种发酵生产L-赖氨酸的方法，包含以下步骤：提供具有分泌L-赖氨酸的能力并在其染色体中含有编码如下多肽的多核苷酸的物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的细菌，所述多肽包含其中位置344处的氨基酸甘氨酸被缬氨酸取代的SEQ IDNO：2的氨基酸序列，在合适的条件下在合适的培养基中培养所述细菌，以及在所述培养基中积累L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。

2.权利要求1的方法，其中在所述细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ IDNO：1的位置40至1923的核苷酸序列，位置1069至1071的核碱基是gtt、gtc、gta或gtg。

3.权利要求2的方法，其中位置1069至1071的核碱基是gtc。

4.权利要求1的方法，其中在所述细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ IDNO：1的位置40至1926的核苷酸序列，位置1069至1071的核碱基是gtt、gtc、gta或gtg。

5.权利要求4的方法，其中位置1069至1071的核碱基是gtc。

6.权利要求1的方法，其中在所述细菌中，编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸序列，位置1069至1071的核碱基是gtt、gtc、gta或gtg。

7.权利要求6的方法，其中位置1069至1071的核碱基是gtc。

8.权利要求1-9任一项的方法，还包含从所述发酵液中制备含L-赖氨酸的产物。

9.前述权利要求任一项的方法，其中所述制备包含纯化步骤。

10.权利要求11的方法，其中所述纯化步骤选自用活性炭处理、离子交换和结晶。

11.前述权利要求任一项的方法，其中所述细菌含有至少一个拷贝的多核苷酸，其编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制脱敏的反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体。

12.权利要求11的方法，其中所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含在位置311处含有异亮氨酸而不是苏氨酸的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。