SK18912001A3 - Gény corynebacterium glutamicum kódujúce proteíny zapojené do membránovej syntézy a membránového transportu - Google Patents

Description

Táto prihláška si nárokuje prioritu z predošlej americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/141031, podanej 25. júna 1999. Táto prihláška si taktiež nárokuje prioritu z nemeckej patentovej prihlášky č. 19931454.3, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931478.0, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931563.9, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932122.1, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932124.8, podanej 99709, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932125.6, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932128.0, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932180.9, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932182.5, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932190.6, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932191.4, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932209.0, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932212.0, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932227.9, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932228.7, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932229.5, podanej 99070, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932230.9, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932927.3, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19933005.0,	podanej	14. júla 1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19933006.9,	podanej	14. júla 1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
Č. 19940764.9,	podanej	27. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
Č. 19940765.7,	podanej	27. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
Č. 19940766.5,	podanej	27. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940830.0,	podanej	27. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940831.9,	podanej	27. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940832.7,	podanej	27. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940833.5,	podanej	27. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
Č. 19941378.9	podanej	31. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19941379.7,	podanej	31. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19941395.9,	podanej	31. augusta	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky

č. 19942077.7, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942078.5, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942079.3, podanej 3. septembra 1999 a nemeckej patentovej prihlášky

19942088.2, podanej 3. septembra 1999. Celý obsah všetkých vyššie uvedených prihlášok je tu týmto výslovne začlenený formou odkazu.

Oblasť techniky

Vynález sa týka génov Corynebacterium glutamicum kódujúcich proteíny zapojené do membránovej syntézy a membránového transportu

Doterajší stav techniky

Určité produkty a vedľajšie produkty prirodzených metabolických pochodov v bunkách majú široké priemyselné uplatnenie, vrátane potravinárskeho, x

krmovinárskeho, kozmetického a farmaceutického priemyslu. Do tejto skupiny molekúl súhrnne nazývaných ako špeciálne chemikálie („fine chemicals“) patria organické kyseliny, aminokyseliny proteínového, respektíve neproteínového pôvodu, nukleotidy a nukleozidy, lipidy a mastné kyseliny, dioly, sacharidy, aromatické zlúčeniny, vitamíny a kofaktory, a enzýmy. Ich produkcia sa najvhodnejšie uskutočňuje prostredníctvom veľkého počtu kultúr baktérií vyvinutých na výrobu asekréciu veľkého množstva jednej alebo viacerých požadovaných molekúl. Jedným predovšetkým vhodným organizmom na tieto účely je grampozitívna, nepatogénna baktéria Corynebacterium glutamicum. Pomocou kmeňovej selekcie sa vyvinulo mnoho mutantných kmeňov, ktoré produkujú veľké množstvo požadovaných zlúčenín. Avšak selekcia kmeňov so zvýšenou produkciou danej molekuly je časovo náročný a ťažký proces.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu sú nové molekuly bakteriálnych nukleových kyselín, ktoré majú rôznorodé použitia. Tieto zahŕňajú identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa dajú využiť na produkciu špeciálnych chemikálií, na moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií v C. glutamicum alebo v príbuzných baktériách, na klasifikáciu alebo identifikáciu C. glutamicum alebo príbuzných baktérií, ako referenčné body pri mapovaní genómu C. glutamicum a ako markéry transformácie. Tieto nové molekuly nukleových kyselín kódujú proteíny, označované v tomto dokumente ako konštrukčné a transportné membránové (membráne construction and membráne transport, MCT) proteíny.

C. glutamicum je grampozitívna aeróbna baktéria, ktorá sa bežne používa na priemyselnú výrobu rôznych špeciálnych chemikálií vo veľkom rozsahu a tiež na degradáciu uhľovodíkov (ako napríklad v prípadoch ropných únikov) a na oxidáciu terpenoidov. Molekuly MCT nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa preto dajú využiť na identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa môžu použiť na produkciu špeciálnych chemikálií, napríklad pomocou fermentačných procesov. Modulácia expresie MCT nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo modifikácia sekvencie MCT molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na moduláciu produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov (napríklad na zlepšenie výťažku alebo produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z druhov Corynebacterium alebo Brevibacterium).

MCT nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu, sa dajú tiež použiť na identifikáciu takého organizmu akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzného druhu, alebo na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzného druhu v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých génov C. glutamicum. Skúmaním extrahovanej genómovej DNA jednej kultúry alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so zameraním sa na takú oblasť C. glutamicum génu, ktorá je charakteristická pre tento organizmus, sa dá zistiť, či je tento organizmus prítomný. Hoci Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, dáva sa do súvisu s takými humánnymi patogénnymi druhmi ako Corynebacterium diphtheriae (spôsobujúcimi záškrt); detekcia takýchto organizmov má signifikantný klinický význam.

Molekuly MCT nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu sú aj referenčnými bodmi pri mapovaní C. glutamicum genómu alebo genómov príbuzných organizmov. Podobne sú tieto molekuly alebo ich variantné formy alebo ich časti markérmi pri génových manipuláciách s druhmi Corynebacterium alebo Brevibacterium.

MCT proteíny kódované novými molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú funkčné napríklad v metabolizme (napr. pri biosyntéze alebo degradácii) zlúčenín, ktoré sú potrebné na membránovú biosyntézu alebo napomáhajú pri transmembránovom transporte jednej alebo viacerých zlúčenín,a to buď do alebo von z bunky. Tým, že sa v Corynebacterium glutamicum môžu použiť klonovacie vektory, tak ako to opisujú Sinskey a kol. v americkom patentovom spise US 4,649,119, a metódy génovej manipulácie C. glutamicum a príbuzných druhov Brevibacterium (napr. lactofermentum) (Yoshihama a kol., J. Bacteríol. 162: 591597 (1985); Katsumata a kol., J. Bacteríol. 159: 306- 311 (1984); a Santamaria a kol., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), môžu sa molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu využiť pri génových manipuláciách tohto organizmu s cieľom zlepšiť alebo zefektívniť produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Zvýšená produkcia alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie sa dá dosiahnuť priamou manipuláciou s génom podľa tohto vynálezu, alebo sa to dá dosiahnuť nepriamym účinkom takejto manipulácie.

Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa zmenou MCT proteínu podľa tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Množstvo alebo aktivita MCT proteínov, ktoré majú vplyv na export molekúl špeciálnej chemikálie z bunky sa môže zvýšiť tak, že sa do extracelulárneho média, z ktorého sa oveľa ľahšie získavajú, vylučujú väčšie množstvá týchto zlúčenín. Podobne, sa môže zvýšiť množstvo alebo aktivita proteínov, ktoré majú vplyv na import živín potrebných na biosyntézu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií (napr. fosforečnanov, síranov, zlúčenín dusíka a pod.), takže sa vo vnútri bunky zvýši koncentrácia týchto prekurzorov, kofaktorov alebo medziproduktových zlúčenín. Ďalej, mastné kyseliny a lipidy sú samé osebe požadovanými špeciálnymi chemikáliami; pomocou optimalizovania aktivity alebo zvyšovaním množstva jedného alebo viacerých MCT proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré sa môžu podieľať na biosyntéze týchto zlúčenín alebo oslabením aktivity jedného alebo viacerých MCT proteínov je možné zvýšiť výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie molekúl mastných kyselín a molekúl lipidov z C. glutamicum.

Mutagenézou jedného alebo viacerých MCT génov podľa tohto vynálezu môžu tiež vznikať MCT proteíny so zmenenými aktivitami, ktoré nepriamo vplývajú na produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum.

Napríklad sa môže zvýšiť množstvo alebo aktivita MCT proteínov podlá tohto vynálezu, ktoré majú vplyv na export odpadových produktov tak, že normálne metabolické odpady bunky (snáď vo zvýšenej miere v dôsledku nadmernej produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie) sa účinne exportujú skôr ako by boli schopné poškodiť nukleotidy a proteíny vo vnútri bunky (čo by znižovalo životaschopnosť bunky) alebo interferovať s biosyntetickými dráhami (čo by znižovalo výťažok, produkciu alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie). Ďalej, samotné relatívne veľké intracelulárne množstvá požadovanej špeciálnej chemikálie môžu byť toxické pre bunku, a tak zvyšovaním aktivity alebo množstva transportérov schopných exportovať túto zlúčeninu z bunky, môže odborník zvýšiť životaschopnosť bunky v kultúre, čo zase vedie k väčšiemu počtu buniek v kultúre produkujúcich požadovanú špeciálnu chemikáliu. MCT proteíny podľa tohto vynálezu sa môžu tiež manipulovať tak, aby sa produkovali zodpovedajúce množstvá rôznych molekúl lipidov a molekúl mastných kyselín. Tieto môžu mať nesmierny význam na lipidovú skladbu membrány bunky. Pretože každý druh lipidu má rôzne fyzikálne vlastnosti, menením lipidového zloženia membrány sa môže signifikantne meniť membránová fluidita. Zmeny v membránovej fluidite môžu vplývať na transport molekúl cez membránu, ako aj na integritu bunky, ktoré oboje majú nesmierny vplyv na produkciu požadovaných špeciálnych chemikálií z C. glutamicum pri fermentácii kultúry vo veľkom rozsahu.

Vynález poskytuje nové molekuly nukleových kyselín kódujúce proteíny, ktoré sa v tomto dokumente označujú ako MCT proteíny; ktoré sú napríklad schopné podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo sa podieľajú na transporte molekúl cez tieto membrány. Molekuly nukleových kyselín kódujúce MCT proteín sa v tomto dokumente označujú ako MCT molekuly nukleových kyselín. Vo výhodnom uskutočnení sa MCT proteín zúčastňuje na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. Príkladmi takýchto proteínov sú tie, ktoré sú kódované génmi uvedenými v tabuľke 1.

Vynález sa ďalej týka molekúl izolovaných nukleových kyselín (napr. cDNA, DNA alebo RNA) s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou MCT proteín alebo jeho biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín, ktoré sú vhodnými primérmi alebo hybridizačnými sondami na určenie alebo amplifikáciu MCT kódujúcich nukleových kyselín (napr. DNA alebo mRNA). V predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z nukleotidových sekvencii, ktorá je uvedená s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (Sequence Listing) (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ....) alebo kódujúcu oblasť alebo komplementárny úsek jednej z týchto nukleotidových sekvencii. V ďalších predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje na alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % alebo dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou uvedenou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7) alebo jej časťou. V iných výhodných uskutočneniach kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z aminokyselinových sekvencii uvedených s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname napr. (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8). Výhodne majú MCT proteíny podľa tohto vynálezu aspoň jednu z MCT aktivít opísaných v tomto dokumente.

V ďalšom uskutočnení kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny proteín alebo jeho časť, pričom proteín alebo jeho časť obsahuje takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. takou, ktorá má párne očíslovanú sekvenciu SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ktorá je napr. dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu tak, že proteín alebo jeho časť si udržuje MCT aktivitu. Proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny alebo jeho časť si výhodne zachováva schopnosť podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. V jednom uskutočnení je proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny najmenej asi na 50 %, výhodne asi na 60 %, predovšetkým výhodne asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie asi najmenej na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s celou sekvenciou aminokyselín vybratou zo sekvencii s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení má proteín úplnú dĺžku proteínu C. glutamicum, ktorá je v podstate homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (kódovanou systémom otvoreného čítania súboru uvedeného v príslušnom Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...).

V ďalšom výhodnom uskutočnení je molekula izolovanej nukleovej kyseliny odvodená z C. glutamicum a kóduje proteín (napr. MCT fúzny proteín), ktorý obsahuje biologicky aktívnu doménu, ktorá je najmenej asi na 50 % alebo viac homológna s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. s jednou z aminokyselinových párne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) a má schopnosť podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, a ktoré tiež obsahujú heterológne sekvencie nukleových kyselín kódujúcich heterológne polypeptidové alebo regulačné oblasti.

V ďalšom uskutočnení má izolovaná molekula nukleovej kyseliny dĺžku aspoň 15 nukleotidov ahybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu podlá tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s nepárne očíslovanou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname). Výhodne sa izolovaná molekula nukleovej kyseliny zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ešte výhodnejšie usporiadanie je také, v ktorom izolovaná nukleová kyselina kóduje prirodzene sa vyskytujúci MCT proteín C. glutamicum alebo jeho biologicky aktívnu časť.

Vynález sa dálej týka vektorov, napr. rekombinantných expresných vektorov obsahujúcich molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, a hostiteľských buniek, do ktorých sa tieto vektory zaviedli. V jednom uskutočnení sa takáto hostiteľská bunka použila na produkciu MCT proteínu, a to kultiváciou hostiteľskej bunky vo vhodnom médiu. MCT proteín sa potom môže izolovať z média alebo z hostiteľskej bunky.

Vynález sa dálej ešte týka geneticky zmeneného mikroorganizmu, do ktorého sa zaviedol MCT gén alebo ktorý sa modifikoval. V jednom uskutočnení sa zmenil genóm mikroorganizmu zavedením molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, kódujúcej „divý“ (wild) typ sekvencie alebo zmutovanej MCT sekvencie ako transgénu. V ďalšom uskutočnení bol endogénny MCT gén v rámci genómu mikroorganizmu zmenený, napr. funkčne narušený homológnou rekombináciou so zmeneným MCT génom. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený MCT gén v mikroorganizme menil mutáciami, deléciami alebo inverziami v jednom alebo viacerých bodoch, ale stále kódoval funkčný MCT proteín. V ešte ďalšom uskutočnení sa jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) MCT génu v mikroorganizme menila (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia MCT génu sa modulovala. Vo výhodnom uskutočnení patrili mikroorganizmy do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, pričom Corynebacterium glutamicum bol predovšetkým výhodný.

x

Vo výhodnom uskutočnení sa mikroorganizmus tiež použil na produkciu požadovanej zlúčeniny, napríklad aminokyseliny, predovšetkým výhodne lyzínu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphteriae v subjekte. Tento spôsob sa týka detekcie jednej alebo viacerých sekvencií nukleových kyselín alebo aminokyselín podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname ako SEQ ID NO: 1 až 676) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphteriae v subjekte.

Vynález sa ešte ďalej týka izolovaného MCT proteínu alebo jeho časti, napr. jeho biologicky aktívnej časti. Vo výhodnom uskutočnení sa izolovaný MCT proteín alebo jeho časť sa môže podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. V inom výhodnom uskutočnení je izolovaný MCT proteín alebo jeho časť dostatočne homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány.

Vynález tiež poskytuje izolovaný preparát MCT proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má MCT proteín aminokyselinovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciu s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname).

V inom výhodnom uskutočnení sa vynález týka celej dĺžky izolovaného proteínu, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname A). V ešte inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 95%, 96%, 98% alebo 99% alebo viac homológny s úplnou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V iných uskutočneniach má izolovaný MCT proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna najmenej na 50 % alebo viac s aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a je schopný podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1.

Alternatívne môže izolovaný MCT proteín obsahovať takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach alebo je najmenej asi na 50%, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológne s jednou nukleotidovou sekvenciou z párne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO uvedených v Sekvenčnom zázname. Je tiež výhodné, že výhodné formy MCT proteínov majú tiež jednu alebo viac MCT bioaktivít, ktoré sa uvádzajú v tomto dokumente.

MCT polypeptid alebo jeho biologicky aktívna časť sa môže účinne spojiť s polypeptidom, ktorý nemá MCT aktivitu za vzniku fúzneho proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má tento fúzny proteín odlišné aktivity v porovnaní so samotným MCT proteínom. V ďalších výhodných uskutočneniach sa tento fúzny proteín podieľa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. V predovšetkým výhodných uskutočneniach sa integrovaním tohto fúzneho proteínu do hostiteľskej bunky moduluje produkcia požadovanej zlúčeniny bunkou.

Vynález sa ďalej týka spôsobu skríningu molekúl, ktoré modulujú aktivitu MCT proteínu buď pomocou interakcie so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom MCT proteínu alebo pomocou modulácie transkripcie alebo translácie molekuly MCT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu produkcie špeciálnej chemikálie. Tento spôsob spočíva v kultivácii bunky obsahujúcej vektor, ktorý riadi expresiu molekuly MCT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu tak, aby sa produkovala špeciálna chemikália. Vo výhodnom uskutočnení tento spôsob v ďalšom zahŕňa krok získavania bunky obsahujúcej takýto vektor, pričom pri tomto spôsobe sa bunka transfekuje s vektorom riadiacim expresiu MCT nukleovej kyseliny. V inom výhodnom uskutočnení zahŕňa okrem toho tento spôsob krok získavania špeciálnej chemikálie z kultúry. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sa použila bunka rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, alebo sa vybrala z kmeňov, ktoré sú uvedené v Tab. 3.

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania produkcie molekuly z mikroorganizmu. Takéto spôsoby zahŕňajú spôsoby kontaktovania bunky s agensom, ktorý moduluje aktivitu MCT proteínu alebo expresiu MCT nukleovej kyseliny tak, že bunková aktivita sa mení v porovnaní s rovnakou aktivitou v neprítomnosti agensa. Vo výhodnom uskutočnení sa bunka moduluje pre jednu alebo viacero metabolických dráh v C. glutamicum pre zložky bunkovej membrány alebo sa moduluje na transport zložiek cez takéto membrány tak, že výťažky alebo rýchlosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie týmto mikroorganizmom sa zvýšia. Agensom, ktorý moduluje aktivitu MCT proteínu môže byť agens, ktorý stimuluje aktivitu MCT proteínu alebo expresiu MCT nukleovej kyseliny. Príkladmi agensov, ktoré stimulujú aktivitu MCT proteínu alebo expresiu MCT nukleovej kyseliny sú malé molekuly, aktívne MCT proteíny a nukleové kyseliny kódujúce MCT proteíny, ktoré boli zavedené do bunky. Príkladmi agensov, ktoré inhibujú MCT aktivitu alebo expresiu sú malé molekuly a nezmyselné (antisense) molekuly MCT nukleovej kyseliny.

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania výťažkov požadovanej zlúčeniny z bunky, medzi ktoré patrí zavádzanie „divého“ alebo mutovaného typu MCT génu do bunky, buď udržiavaného na separátnom plazmide alebo integrovaného do genómu hostiteľskej bunky. Pri integrácii do genómu môže nastať náhodná integrácia alebo homológna rekombinácia, takže natívny gén sa nahradí zavedenou kópiou a spôsobí produkciu požadovanej zlúčeniny bunkou, ktorá sa má modulovať. Vo výhodnom uskutočnení sa uvedené výťažky zvyšujú. V inom výhodnom uskutočnení je vyššie uvedenou chemikáliou špeciálna chemikália. V predovšetkým výhodnom uskutočnení je vyššie uvedenou špeciálnou chemikáliou aminokyselina. V obzvlášť výhodných uskutočneniach je uvedenou aminokyselinou L-lyzín.

Podrobný opis vynálezu

Predložený vynález poskytuje MCT nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré sú zapojené do metabolizmu zložiek bunkových membrán v C. glutamicum alebo do transportu molekúl cez tieto membrány. Molekuly podľa tohto vynálezu, sa môžu využiť na moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov, ako napríklad C. glutamicum, a to buď priamo (napr. tam, kde nadmerná expresia alebo optimalizácia proteínu na biosyntézu mastných kyselín má priamy vplyv na výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie mastnej kyseliny z modifikovanej C. glutamicum) alebo môžu mať nepriamy vplyv, ktorý však predsa spôsobuje zvýšený výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny (napr. tam, kde moduláciou metabolizmu zložiek bunkových membrán sa menia výťažky, produkcia a/alebo účinnosť produkcie alebo skladba bunkovej membrány, ktorá samotná môže mať vplyv na produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií). Aspekty vynálezu sú vysvetlené v ďalšom texte.

I. Špeciálne chemikálie

Pojem „špeciálne chemikálie“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa molekuly produkované organizmom, ktoré majú rôznorodé priemyselné použitia, v takých priemyselných odvetviach, ale nielen v nich, akými sú farmaceutický, poľnohospodársky a kozmetický priemysel. Tieto zlúčeniny zahŕňajú také organické kyseliny, ako kyselinu vínnu, kyselinu itakonovú a kyselinu diaminopimelovú, aminokyseliny proteínového aj neproteínového pôvodu, purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy (ako sa to opisuje napr. v Kuninaka, A. (1966), Nucleotides and related compounds, str. 561 -612, v Biotechnology vol. 6, Rehm a kol., eds. VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených), lipidy, nasýtené aj nenasýtené mastné kyseliny (napr. kyselinu arachidonovú), dioly (napr. propándiol abutándiol), sacharidy (napr. kyselinu hyalurónovú atrehalózu), aromatické zlúčeniny (napr. aromatické amíny, vanilín a indigo), vitamíny a kofaktory (podľa opisu v Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, „Vitamins“, str.. 443-613 (1996) VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených avOng, A.S., Niki, E.& Packer, Ľ. (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1.-3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, (1995)), enzýmy, polyketidy (Čane a kol., (1998) Science 282, 63-68) a všetky ďalšie chemikálie opísané v Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 a v tam uvedených odkazoch. Metabolizmus a použitie určitých špeciálnych chemikálií sa vysvetľuje v ďalšom texte.

x

A. Metabolizmus aminokyselín a použitia

Základnými štruktúrnymi jednotkami všetkých proteínov sú aminokyseliny a ako také sú esenciálne pre normálnu bunkovú činnosť vo všetkých organizmoch. Pojem „aminokyselina“ je zaužívaný technický pojem. Aminokyseliny proteínového pôvodu, ktorých je 20 druhov, sú štrukturálnymi jednotkami proteínov, v ktorých sú viazané peptidovými väzbami, kým aminokyseliny neproteínového pôvodu (ktorých sú známe stovky) sa spravidla nevyskytujú v proteínoch (pozri Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 57-97 VCH, Weinheim (1985)). Aminokyseliny môžu byť v D- alebo L-optickej konfigurácii, i keď L- aminokyseliny sú vo všeobecnosti jediný druh, ktorý sa zistil v prirodzene sa vyskytujúcich proteínoch. Biosyntetické a degradačné dráhy každej z 20 aminokyselín proteínového pôvodu sú dobre známe v prokaryotických, ako aj v eukaryotických bunkách (pozri napr. Stryer, L. Biochemistry, 3. vydanie, strany 578-590 (1988)). „Esenciálne“ aminokyseliny (histidín, izoleucín, leucín, lyzín, metionín, fenylalanín, treonín, tryptofán avalín), ktoré sa takto nazývajú, pretože sú obvykle nutritívnou požiadavkou z dôvodu zložitosti ich biosyntéz, sa ľahko jednoduchými biosyntetickými dráhami menia na ostatných 11 „neesenciálnych“ aminokyselín (alanín, arginín, asparagín, aspartát (kyselina asparágová), cysteín, glutamát (kyselina glutámová), glutamín, glycín, prolín, serín atyrozín). Vyššie živočíchy si udržiavajú schopnosť syntetizovať niektoré z týchto aminokyselín, ale esenciálne aminokyseliny sa musia dodať výživou, aby mohla prebiehať normálna biosyntéza. proteínov.

Bez ohľadu na ich funkciu v biosyntéze proteínov, sú tieto aminokyseliny zaujímavé chemikálie so sebe vlastnými schopnosťami a mnohé našli uplatnenie v rôznych aplikáciách v potravinárskom, krmovinárskom, kozmetickom, poľnohospodárskom a farmaceutickom priemysle. Lyzín je dôležitá aminokyselina nielen vo výžive ľudí, ale aj monogastrických živočíchov ako hydiny a ošípaných. Glutamát sa najčastejšie používa ako chuťová prísada (glutamát sodný), (monosodium glutamate, MSG) a používa sa vo veľkom rozsahu v rámci potravinárskeho priemyslu, tak ako aj aspartát, fenylalanín, glycín a cysteín. Glycín, L-metionín a ajtryptofán sa využívajú vo farmaceutickom priemysle. Glutamín, valín, leucín, izoleucín, histidín, arginín, prolín, serín a alanín sa používajú aj vo farmaceutickom aj v kozmetickom priemysle. Treonín, tryptofán a D/L-metionín sú bežnými kŕmnymi aditívami (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, str. 466-502 v Rehm a kol. (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH, Weinheim), Okrem toho sa zistilo, že tieto aminokyseliny sú vhodnými prekurzormi na syntézu syntetických aminokyselín a proteínov, ako N-acetylcysteínu, Skarboxymetyl-L-cysteínu, (S)-5-hydroxytryptofánu a ďalších, ktoré sa opisujú vUlmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str.. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.

Biosyntéza týchto prírodných aminokyselín takými organizmami schopnými ich produkcie ako sú baktérie, je dobre známa (pozri prehľad o bakteriálnej biosyntéze aminokyselín a jej regulácii Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47, 533-606). Glutamát sa syntetizuje redukčnou amináciou a-ketoglutarátu, medziproduktu v cykle kyseliny citrónovej. Glutamín, aj prolín a arginín vznikajú potom z glutamátu. Biosyntéza serínu je trojkrokový proces, ktorý sa začína od 3fosfoglycerátu (medziproduktu pri glykolýze) a končí touto aminokyselinou po kroku oxidácie, transaminácie a hydrolýzy. Aj cysteín aj glycín vznikajú zo serínu; cysteín kondenzáciou homocysteínu so serínom a glycín prenosom bočného reťazca βuhlíkového atómu na tetrahydrofolát reakciou, ktorú katalyzuje seríntranshydroxymetyláza. Fenylalanín a tyrozín sa syntetizujú z glykolytických a pentózofosfátových prekurzorov erytrózo-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu 9-krokovou biosyntetickou cestou, ktorá sa líši len v konečných dvoch krokoch po syntéze prefenátu. Tryptofán vzniká tiež z týchto dvoch počiatočných molekúl, ale jeho syntéza je 11- kroková dráha. Tyrozín sa môže tiež syntetizovať zfenylalanínu reakciou, ktorú katalyzuje fenylalanínhydroxyláza. Alanín, valín a aj leucín sú biosyntetické produkty pyruvátu, konečného produktu glykolýzy. Aspartát vzniká z oxalacetátu, medziproduktu cyklu kyseliny citrónovej. Asparagín, metionín, treonín a aj lyzín vznikajú konverziou aspartátu. Izoleucín vzniká ztreonínu. Zložitá 9-kroková cesta končí vznikom histidínu z 5-fosforibozyl-1-pyrofosfátu, aktivovaného sacharidu.

Viac aminokyselín ako je potrebných na syntézu proteínov sa nemôže uchovávať v bunke a namiesto toho sa degradujú, pričom poskytujú medziprodukty pre hlavné metabolické dráhy bunky (pozri prehľad Stryer, L. Biochemistry 3. ed., Ch. 21 „Amino Acid Degradation and Urea Cycle“str. 495-516 (1988)). Hoci bunka je schopná premieňať nežiaduce aminokyseliny na užitočné metabolické medziprodukty, je produkcia aminokyselín z energetického hľadiska náročná, vyžaduje prekurzorové molekuly a enzýmy na ich syntézu. Tak nie je prekvapujúce, že biosyntéza aminokyselín je regulovaná inhibíciou spätnou väzbou, pri ktorej prítomnosť určitej aminokyseliny spôsobí spomalenie alebo celkom zastavenie jej produkcie (pozri súhrn o mechanizmoch spätnej väzby v aminokyselinových biosyntetických dráhach v Stryer, L. Biochemistry, 3. ed. Ch. 24: Biosynthesis of Amino Acids and Heme“str. 575-600 (1988)). Takto je produkcia každej jednotlivej aminokyseliny limitovaná množstvom tej aminokyseliny, ktorá je prítomná v bunke.

B. Metabolizmus vítamímov, kofaktorov a „nutraceutík“ a použitia

Vitamíny, kofaktory a nutraceutiká predstavujú ďalšiu skupinu molekúl, ktorých schopnosť syntézy vyššie živočíchy stratili, atak sa musia prijímať potravou, i keď iné organizmy, napríklad baktérie, ich ľahko syntetizujú. Tieto molekuly sú buď bioaktívnymi látkami, alebo sú prekurzormi biologicky aktívnych látok, ktoré sú prenášačmi elektrónov alebo sú to medziprodukty v rozmanitých metabolických dráhach. Okrem ich nutritívnej hodnoty majú tieto zlúčeniny tiež signifikantnú priemyselnú hodnotu ako farbivá, antioxidanty a katalyzátory alebo iné technologické pomocné látky. (Pozri napr. súhrn o štruktúre, aktivite a priemyselných aplikáciách týchto zlúčenín vUllman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27, str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966). Pojem „vitamín“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa živiny, ktoré organizmus potrebuje na normálne fungovanie, ale ktoré si organizmus nevie sám syntetizovať. Do skupiny vitamínov možno zahrnúť kofaktory a nutraceutické zlúčeniny. Pojem „kofaktor“ predstavuje zlúčeniny neproteínového pôvodu, ktoré sú potrebné na normálnu enzymatickú aktivitu. Tieto zlúčeniny môžu byť organické alebo anorganické; kofaktorové molekuly v predloženom vynáleze sú výhodne organické. Pojem „nutraceutikum“ zahŕňa potravinové doplnky, ktoré majú užitočný vplyv na zdravotný stav rastlín, zvierat a hlavne ľudí. Príkladmi takýchto molekúl sú vitamíny, antioxidanty a tiež niektoré lipidy (napr. polynenasýtené mastné kyseliny).

Biosyntéza týchto molekúl v organizmoch, ktoré sú schopné ich produkcie, napríklad v baktériách, je zoširoka opísaná (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27,str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E & Packer, L (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1- 3. septembra 1994 vPenang, Malajzia, AOCS Press, Champaign, ILX, 374 S).

Tiamín (vitamín Bi) sa tvorí chemickým viazaním podielov pyrimidínu atiazolu. Riboflavín (vitamín B2) sa syntetizuje z guanozín-5'-trifosfátu (GTP) a ribózo-5'-fosfátu. Samotný riboflavín sa využíva na syntézu flavínmononukleotidu (FMN) aflavínadeníndinukleotidu (FAD). Rodina zlúčenín so spoločným názvom „vitamín B₆“ (napr. pyridoxín, pyridoxamín, pyridoxal-5'-fosfát a komerčne používaný pyridoxín hydrochlorid) sú všetko deriváty spoločnej štruktúrnej jednotky, 5-hydroxy-6-metylpyridínu. Pantotenát (kyselina pantoténová, (R)-(+)-N-(2,4dihydroxy-3,3-dimetyl-1-oxobutyl)-p-alanín) sa môže vyrábať buď chemickou syntézou alebo fermentačne. Konečné kroky pri biosyntéze kyseliny pantoténovej pozostávajú z ATP-riadenej kondenzácie β-alanínu a kyseliny pantoovej. Enzýmy zodpovedné za biosyntetické kroky konverzie na kyselinu pantoovú, β-alanín a za kondenzáciu na kyselinu pantoténovú sú známe. Metabolický aktívna forma pantotenátu je koenzým A, ktorého biosyntéza je 5 krokový enzymatický postup. Pantotenát, pyridoxal-5'-fosfát, cysteín a ATP sú prekurzory koenzýmu A. Tieto enzýmy, nielenže katalyzujú tvorbu kyseliny pantoténovej, ale tiež produkujú (R)pantoovú kyselinu, (R)-pantolaktón, (R)-pantenol (provitamín B5.), panteteín (a jeho deriváty) a koenzým A.

Biosyntéza biotínu z prekurzorovej molekuly pimeloyl-CoA v mikroorganizmoch sa detailne študovala a identifikovali sa niektoré gény zapojené do tohto procesu. Zistilo sa, že mnohé príslušné proteíny sú zapojené do syntézy Fe-clasteru a sú členmi nifS triedy proteinov. Kyselina lipoová je odvodená z kyseliny oktánovej a je koenzýmom v energetickom metabolizme, ktorý je súčasťou pyruvátdehydrogenázového komplexu a a-ketoglutarátdehydrogenázového komplexu. Foláty sú skupinou látok, ktoré sú všetky derivátmi kyseliny listovej, ktorá je samotná odvodená z kyseliny L- glutámovej, p-aminobenzoovej kyseliny a 6-metylpterínu. Biosyntéza kyseliny listovej a jej derivátov, začínajúca sa od metabolických medziproduktov guanozín-5'-trifosfátu (GTP), L- glutámovej kyseliny a kyseliny p-aminobenzoovej, sa podrobne skúmala v určitých mikroorganizmoch.

x

Korinoidy (ako kobalamíny a predovšetkým vitamín B12) a porfyríny patria do skupiny chemikálií vyznačujúcich sa tetrapyrolovým kruhovým systémom. Biosyntéza vitamínu B₁₂ je tak zložitá, že nie je úplne charakterizovaná, ale mnohé enzýmy a substráty zapojené do biosyntézy sú už známe. Kyselina nikotínová (nikotinát) a nikotínamid sú pyridínové deriváty, ktoré sa tiež označujú ako „niacín“. Niacín je prekurzorom dôležitých koenzýmov NAD (nikotínamidadeníndinukleotidu) a NADP (nikotínamidadeníndinukleotidfosfátu) a ich redukovaných foriem.

Výroba týchto chemikálií vo veľkom rozsahu je väčšinou odkázaná na bezbunkové chemické syntézy, i keď niektoré tieto chemikálie, ako riboflavín, vitamín B₆, pantotenát abiotín, sa tiež vyrobili kultiváciou mikroorganizmov vo veľkom rozsahu. Len vitamín B₁₂ sa vyrába výhradne fermentačne, a to kvôli zložitosti jeho syntézy. In vitro metodológie vyžadujú značné materiálové vstupy a čas, často pri vysokých nákladoch.

C. Metabolizmus purínov, pyrimidínov, nukleozidov a nukleotidov a použitia

Gény metabolizmu purínov a pyrimidínov a im prislúchajúce proteíny sú významými cieľmi terapie nádorových ochorení a vírusových infekcií. Pojem „purín alebo pyrimidín“ označuje dusíkaté bázy, ktoré sú zložkami nukleových kyselín, koenzýmov a nukleotidov. Názov „nukleotid“ zahrňuje základné štruktúrne jednotky molekúl nukleových kyselín, ktoré pozostávajú z dusíkatej bázy, pentózového sacharidu (v prípade RNA je sacharidom ribóza; v prípade DNA je sacharidom D- deoxyribóza) a kyseliny fosforečnej. Pojem „nukleozid“ zahŕňa molekuly, ktoré sú prekurzormi nukleotidov, ale ktoré neobsahujú ako zložku kyselinu fosforečnú, túto obsahujú nukleotidy. Inhibovaním biosyntézy týchto molekúl, alebo ich aktivovaním na tvorbu molekúl nukleových kyselín, sa dá inhibovať syntéza RNA a DNA; inhibovaním tejto aktivity spôsobom cieleným na karcinogénne bunky sa môže inhibovať schopnosť nádorových buniek deliť sa a replikovať sa. Navyše sú to nukleotidy, ktoré nevytvárajú molekuly nukleových kyselín, ale skôr fungujú ako energetické zásoby (t.j. AMP) alebo ako koenzýmy (t.j. FAD a NAD)..

Niekoľko publikácií opisuje použitie týchto chemikálií na lekárske indikácie pomocou ovplyvňovania purínového a/alebo pyrimidínového metabolizmu (napr. Christopherson, R. I. and Lyons, S. D. (1990) „Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents“ Med. Res. Reviews, 10, 505-548). Výskumy enzýmov zapojených do purínového a pyrimidínového metabolizmu sa zamerali na vývoj nových liečiv, ktoré by sa mohli použiť napríklad ako imunosupresíva alebo antiproliferatiká (Smith, J. L., (1995) „Enzymes in nucleotide synthesis“ Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23, 877-902). Avšak purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy majú ďalšie využitia: ako medziprodukty pri biosyntéze viacerých špeciálnych chemikálií (napr. tiamínu, S-adenozyl-metionínu, folátov alebo riboflavínu), ako bunkové energetické prenášače (napr. ATP alebo GTP) a ako samotné chemikálie sa bežne používajú ako prostriedky na zvýraznenie chuti a vône (napr. IMP alebo GMP) alebo vo viacerých lekárskych aplikáciách (pozri napr. Kunianaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology, vol.6, Rehm a kol., VCH, Weiheim, str. 561-612). Taktiež enzýmy, podieľajúce sa na metabolizme purínov, pyrimidínov, nukleozidov alebo nukleotidov čoraz viac slúžia ako ciele, proti ktorým boli vyvinuté chemikálie na ochranu poľnohospodárskych plodín ako fungicídy, herbicídy a insekticídy.

Metabolizmus týchto zlúčenín sa charakterizoval v baktériách (pozri napr.

prehľad Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) „de novo purine nucleotide biosynthesis“, v Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic

Press, str. 259-287; a Michal, G. (1999) „Nucleotides and Nucleosides“, Chapter8 v Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley,

New York). Purínový metabolizmus bol predmetom intenzívneho výskumu a je esenciálny pre normálne fungovanie bunky. Oslabený purínový metabolizmus môže u vyšších živočíchov spôsobovať závažné choroby ako napríklad dnu. Purínové nukleotidy sa syntetizujú z ribózo-5-fosfátu sériovými krokmi cez medziproduktovú zlúčeninu inozín-5'-fosfát (IMP), končiacimi vznikom guanozín-5'-monofosfátu (GMP) alebo adenozín-5'-monofosfátu (AMP), z ktorých sa ľahko vytvárajú trifosfátové formy využiteľné ako nukleotidy. Tieto zlúčeniny sa tiež využívajú ako energetické zásoby, pretože ich degradácia poskytuje energiu pre mnoho rôznych biochemických procesov v bunke. Biosyntéza pyrimidínov pokračuje tvorbou uridín5'-monofosfátu (UMP) z ribózo-5'-fosfátu. UMP sa zase konvertuje na cytidín-5'trifosfát (CTP). Deoxyformy všetkých týchto nukleotidov vznikajú jednokrokovou redukčnou reakciou z difosfátribózovej formy nukleotidu na difosfátdeoxyribózovú formu nukleotidu. Na základe fosforylácie sú tieto molekuly schopné podieľať sa na syntéze DNA.

D. Metabolizmus trehalózy a použitia

Trehalóza pozostáva z dvoch glukózových molekúl spojených α,α-1,1 väzbou. Zvyčajne sa používa v potravinárskom priemysle ako sladidlo, aditívum pre sušené alebo mrazené potraviny a v nápojoch. Ale uplatňuje sa tiež vo farmaceutickom, kozmetickom a biotechnologickom priemysle (pozri napr. Nishimoto a kol., (1998) americký patentový spis č. US 5,759,610; Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech., 16, 460-467; Paiva, C.L.A. a Panek, A:D. (1996) Biotech. Ann. Rev.,_2, 293 - 314; a Shiosaka, M. (1977) J. Japan 172, 97 102). Trehalózu produkujú pomocou enzýmov mnohé mikroorganizmy a prirodzene sa vylučuje do okolitého média, z ktorého sa môže zachytávať metódami známymi v danej oblasti techniky.

II. Biosyntéza membrán a transmembránový transport

Bunkové membrány majú v bunke rôznorodé funkcie. Prvou a najdôležitejšou je membránové diferencovanie obsahu bunky od obklopujúceho prostredia, čo poskytuje bunke integritu. Membrány vytvárajú tiež bariéry pre vstup rizikových alebo nežiaducich zlúčenín a tiež pre vylučovanie požadovaných zlúčenín. Bunkové membrány samé osebe neumožňujú neuľahčenú difúziu hydrofilných zlúčenín ako napríklad proteínov, molekúl vody alebo iónov, čo vyplýva z ich štruktúry: dvojvrstvy lipidových molekúl, v ktorej sú hlavičky polárnych skupín orientované smerom von (tak proti vonkajšku ako aj vnútrajšku bunky) a nepoláme chvosty sú orientované smerom do centra dvojvrstvy, čím sa vytvárajú hydrofóbny základ (všeobecný prehľad o štruktúre a funkcii membrán pozri Gennis, R.B. (1989) Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg). Táto bariéra umožňuje bunkám, aby si udržali relatívne vyššiu koncentráciu požadovaných zlúčenín a relatívne nižšiu koncentráciu nežiaducich zlúčenín než aká sa nachádza v obklopujúcom médiu, pretože membrána účinne blokuje difúziu týchto zlúčenín. Avšak membrána tiež predstavuje účinnú bariéru pre import požadovaných zlúčenín a export odpadových molekúl. Na prekonanie tejto prekážky sú do bunkových membrán inkorporované mnohé druhy transportných proteínov, ktoré uľahčujú transmembránový transport rôznych druhov zlúčenín. Existujú dve základné skupiny týchto transportných proteínov: pórové alebo kanálové a transportné. Pórové alebo kanálové transportné proteíny sú integrálnymi membránovými proteínmi, sú to niekedy komplexné proteíny, ktoré vytvárajú regulovaný priechod cez membránu. Táto regulácia alebo „bránový transport“ („gating“) je väčšinou špecifický pre molekuly, ktoré sa majú transportovať cez pór alebo kanál, čím sa tieto membránové konštrukty stávajú selektívne permeabilné pre špecifickú triedu substrátov, napríklad draslíkový kanál je skonštruovaný tak, že môžu cez ne prejsť len tie ióny, ktoré majú náboj a veľkosť podobné draslíku. Kanálové alebo pórové proteíny majú tendenciu vytvárať diskrétne hydrofóbne a hydrofilné domény, takže hydrofóbne orientovaný proteín sa môže asociovať s vnútrajškom membrány, kým hydrofilné orientovaný sa spája s vnútrajškom kanála, a takto poskytujú chránené hydrofilné prostredie, cez ktoré môže prechádzať vybraná hydrofilné molekula. V danej oblasti techniky je známych mnoho takýchto pórov/kanálov, ako napríklad pre draslíkové, vápnikové, sodíkové a chloridové ióny.

Tento systém pórovo alebo kanálovo-sprostredkovanej uľahčenej difúzie je obmedzený na veľmi malé molekuly, ako sú ióny, pretože póry alebo kanály dostatočne veľké na to, aby umožnili prechod celých proteínov uľahčenou difúziou by neboli schopné zabrániť aj prechodu menších hydrofilných molekúl. Transport molekúl týmto spôsobom sa niekedy nazýva aj „uľahčená difúzia“, pretože na to, aby nastal transport sa vyžaduje hnacia sila koncentračného gradientu. Permeázy tiež umožňujú uľahčenú difúziu väčších molekúl, ako napríklad glukózy alebo iných sacharidov, do bunky, ak je koncentrácia týchto molekúl na jednej strane membrány väčšia ako na druhej (tzv. „uniport“). Na rozdiel od pórov alebo kanálov nevytvárajú tieto integrálne membránové proteíny (ktoré majú často 6 až 14 membránu prekleňujúcich α-helixov) otvorené kanály cez membránu, ale skôr sa viažu na cieľovú molekulu na povrchu membrány a potom podliehajú takému konformačnému posunu, že cieľová molekula sa uvoľní na opačnej strane membrány.

Bunky však často vyžadujú import alebo export molekúl proti existujúcemu koncentračnému gradientu („aktívny transport“), a to vtedy, keď sa uľahčená difúzia nemôže vyskytnúť. Existujú dva základné mechanizmy, ktoré bunka využíva na takýto membránový transport: symport alebo antiport a energeticky spriahnutý transport, ako napríklad transport pomocou ABC transportérov. Systémy symportu a antiportu spájajú presun dvoch molekúl cez membránu (prostredníctvom permeáz, ktoré majú dve samostatné väzbové miesta pre dve rozdielne molekuly); pri symporte sa obidve molekuly transportujú v rovnakom smere, zatiaľ čo pri antiporte sa jedna molekula importuje, kým druhá sa exportuje. Je to energeticky možné, pretože jedna z dvoch molekúl sa presunie v súlade s koncentračným gradientom a tento energeticky výhodný dej je umožnený len na základe súčasného presunu požadovanej zlúčeniny proti prevládajúcemu koncentračnému gradientu. Jednotlivé molekuly sa môžu transportovať cez membránu proti koncentračnému gradientu energeticky spriahnutým procesom, ktorý využívajú ABC transportéry. Pri tomto systéme transportný proteín umiestenený v membráne má ATP-viažucu kazetu; na základe viazania cieľovej molekuly konvertuje ATP na ADP + P, a výsledná uvoľnená energia sa použije na pohon presunu cieľovej molekuly na opačnú stranu membrány, a to pomocou transportéra. Detailnejšie opisy všetkých týchto transportných systémov - pozri v: Bamberg, E. et al., (1993) “Chargé transport of ion pumps on lipid bilayer membranes”, Q. Rev. Biophys. 26, 1-25; Findlay, J.B.C. (1991) “Structure and function in membráne transport systems”, Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 804-810; Higgins, C.F. (1992) “ABC transportéra from microorganisms to man”, Ann. Rev. Celí Biol. 8, 67-113; Gennis, R.B. (1989) “Pores, Channels and Transportéra”, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, str. 270-322; a Nikaido, H. and Saier, H. (1992) “Transport proteins in bacteria: common themes in their design, Science 258. 936942, a literárne odkazy, ktoré sa v každej z týchto citácií nachádzajú.

Syntéza membrán je dobre známy proces, ktorý zahrňuje mnoho zložiek, z ktorých najdôležitejšie sú molekuly lipidov. Syntéza lipidov sa dá rozdeliť na dve časti: syntézu mastných kyselín a ich pripojenie na sn-glycerol-3-fosfát a pripojenie alebo modifikácia hlavičky polárnej skupiny. V bakteriálnych membránach sa charakteristicky využívajú lipidy, ako napríklad fosfolipidy, glykolipidy, sfingolipidy a fosfoglyceridy. Syntéza mastných kyselín sa začína konverziou acetyl-CoA buď na malonyl-CoA pomocou acetyl-CoA-karboxylázy alebo na acetyl-ACP pomocou acetyltransacylázy. Tieto dve výsledné molekuly vytvoria spolu nasledovnou kondenzačnou reakciou acetoacetyl-ACP, ktorý sa konvertuje sériou kondenzačných, redukčných a dehydratačných reakcií na molekulu nasýtenej mastnej kyseliny s požadovanou dĺžkou reťazca. Produkciu nenasýtených mastných kyselín z takýchto molekúl katalyzujú špecifické desaturázy, a to buď aeróbne pomocou molekulového kyslíka alebo anaeróbne (o syntéze mastných kyselín na porovnanie pozri: F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella, ASM Press: Washington, D.C., str. 612-636 a odkazy tam uvedené; Lengeler etal. (eds) (1999) Biology of Procaryotes, Thieme: Stuttgart, New York, a odkazy tam uvedené a Magnuson, K. et al., (1993) Microbiological Reviews 57, 522-542, a odkazy tam uvedené). Cyklopropánové mastné kyseliny (cyclopropane fatty acids, CFA) sa syntetizujú špecifickou CFA-syntázou využitím SAM ako kosubstrátu. Rozvetvený reťazec mastných kyselín sa syntetizuje z rozvetveného reťazca aminokyselín, ktoré sa deaminujú za vzniku rozvetveného reťazca 2-oxokyselín (pozri: Lengeler et al., eds. (1999) Biology of Procaryotes, Thieme: Stuttgart, New York, a odkazy tam uvedené) Ďalším esenciálnym krokom pri syntéze lipidov je transfer mastných kyselín na hlavičky polárnych skupín pomocou napríklad glycerolfosfátacyltransferáz. Kombinácia rôznych prekurzorových molekúl a biosyntetických enzýmov vedie k produkcii rôznych molekúl mastných kyselín, ktoré majú veľký vplyv na zloženie membrány.

III. Pojmy a spôsoby vynálezu

Predložený vynález je založený, aspoň sčasti, na objave nových molekúl, uvádzaných v tomto dokumente ako MCT nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré regulujú produkciu bunkových membrán v C. glutamicum a riadia pohyb molekúl cez takéto membrány. V jednom uskutočnení sa MCT molekuly podieľajú na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. Vo výhodnom uskutočnení sa aktivitou MCT molekúl podľa predloženého vynálezu reguluje produkcia membránových zložiek a membránový transport, čo má vplyv na produkciu požadovanej špeciálnej chemikálie týmto organizmom. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sú MCT molekuly podľa tohto vynálezu modulované na aktivitu tak, že metabolické dráhy C. glutamicum, ktoré MCT proteíny podľa tohto vynálezu regulujú, sú modulované na výťažok, produkciu, a/alebo účinnosť produkcie a transport zlúčenín cez membrány sa tak účinne mení, že sa buď priamo alebo nepriamo moduluje výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie z C. glutamicum.

Pojem „MCT¹ proteín“ alebo „MCT polypeptid zahrňuje proteíny, ktoré sa podieľajú na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. Príklady MCT proteínov zahrňujú tie, ktoré sú kódované MCT génmi, uvedenými v tabuľke 1 a tie, ktoré sú kódované nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO. Pojmy „MCT gén“ alebo „MCT sekvencia nukleovej kyseliny“ zahŕňajú sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce MCT proteín, ktoré sa skladajú z kódujúcej oblasti a tiež príslušných netranslatovaných 5'-a 3'-sekvenčných oblastí. Príklady MCT génov sú uvedené v tabuľke 1. Pojmy „produkcia“ alebo „produktivita“ sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú koncentráciu fermentačného produktu (napríklad požadovanej špeciálnej chemikálie), ktorý sa vytvoril za stanovený čas a v stanovenom fermentačnom objeme (napr. kg produktu za hodinu na liter). Pojem „účinnosť produkcie“ znamená čas, ktorý je potrebný na to, aby sa dosiahla príslušná produkcia (napríklad, ako dlho trvá bunke dosiahnutie príslušnej rýchlosti produkovania špeciálnej chemikálie). Pojem „výťažok“ alebo „produkt/výťažok uhlíka“ je známy v danej oblasti techniky a znamená účinnosť konverzie zdroja uhlíka na produkt (t.j. špeciálnu chemikáliu). Toto sa bežne uvádza napríklad ako kg produktu na kg zdroja uhlíka. Zvyšovaním výťažku alebo produkcie zlúčeniny sa množstvo získaných molekúl alebo úspešne získaných molekúl tejto zlúčeniny v stanovenom množstve kultúry v stanovenom čase zvyšuje. Pojem „biosyntéza“ alebo „biosyntetická dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú syntézu zlúčeniny, výhodne organickej zlúčeniny, bunkou z medziproduktových zlúčenín, čo môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojmy „degradácia“ alebo „degradačná dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú rozklad zlúčeniny, výhodne organickej zlúčeniny, bunkou na degradačné produkty (všeobecne povedané, menšie alebo menej zložité molekuly), ktorý môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojem „metabolizmus“ je známy v danej oblasti techniky a znamená súhrn biochemických reakcií, ktoré sa uskutočňujú v organizme. Metabolizmus príslušnej zlúčeniny (napr. metabolizmus aminokyseliny glycínu) zahrňuje potom celkové biosyntetické, modifikačné a degradačné dráhy v bunke týkajúce sa tejto zlúčeniny.

V ďalšom uskutočnení sú MCT molekuly podľa tohto vynálezu schopné modulovať produkciu takej požadovanej molekuly, ako je špeciálna chemikália, v mikroorganizme, ako je C. glutamicum. Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa zmenou MCT proteínu podľa tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Množstvo a aktivita tých MCT proteínov, ktoré sú zapojené do exportu molekúl špeciálnej chemikálie z bunky sa môže zvýšiť tak, že sa do extracelulárneho média, z ktorého sa ľahšie získavajú, vylučujú väčšie množstvá týchto zlúčenín. Podobne sa môže zvýšiť množstvo alebo aktivita tých MCT proteínov, ktoré majú vplyv na import živín potrebných na biosyntézu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií (napr. fosforečnanov, síranov, zlúčenín dusíka a pod.), takže sa vo vnútri bunky zvýši koncentrácia týchto prekurzorov, kofaktorov alebo medziproduktových zlúčenín. Ďalej, mastné kyseliny alipidy sú samé osebe požadovanými špeciálnymi chemikáliami; pomocou optimalizovania aktivity alebo zvyšovaním množstva jedného alebo viacerých MCT proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré sa podieľajú na biosyntéze týchto zlúčenín alebo oslabením aktivity jedného alebo viacerých MCT proteínov, ktoré sú zapojené do degradácie týchto zlúčenín, je možné zvýšiť výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie molekúl mastných kyselín a molekúl lipidov z C. glutamicum.

Mutagenézou jedného alebo viacerých MCT génov podľa tohto vynálezu môžu tiež vznikať MCT proteíny so zmenenými aktivitami, ktoré nepriamo vplývajú na produkciu jednej alebo viacerých požadovaných špeciálnych chemikálií z C.

glutamicum. Napríklad sa môže zvýšiť množstvo alebo aktivita MCT proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré majú vplyv na export odpadových produktov tak, že normálne metabolické odpady bunky (snáď vo zvýšenej miere v dôsledku nadmernej produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie) sa účinne exportujú skôr ako by boli schopné poškodiť nukleotidy a proteíny vo vnútri bunky (čo by znižovalo životaschopnosť bunky) alebo interferovať s biosyntetickými dráhami špeciálnej chemikálie (čo by znižovalo výťažok, produkciu alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie). Ďalej, samotné relatívne veľké intraceluláme množstvá požadovanej špeciálnej chemikálie môžu byť toxické pre bunku, a tak zvyšovaním aktivity alebo množstva transportétov schopných exportovať túto zlúčeninu z bunky, môže odborník zvýšiť životaschopnosť bunky v kultúre, čo zase vedie k väčšiemu počtu buniek v kultúre produkujúcich požadovanú špeciálnu chemikáliu. MCT proteíny podľa tohto vynálezu sa môžu tiež manipulovať tak, aby sa produkovali zodpovedajúce množstvá rôznych molekúl lipidov a molekúl mastných kyselín. Tieto môžu mať nesmierny význam na lipidovú skladbu membrány bunky. Pretože každý druh lipidu má rôzne fyzikálne vlastnosti, menením lipidového zloženia membrány sa môže signifikantne meniť membránová fluidita. Zmeny v membránovej fluidite môžu vplývať na transport molekúl cez membránu, ako aj na integritu bunky, ktoré oboje majú nesmierny vplyv na produkciu požadovaných špeciálnych chemikálií z C. glutamicum pri fermentácii kultúry vo veľkom rozsahu.

Sekvencie izolovaných nukleových kyselín, ktoré sú predmetom tohto vynálezu sú zahrnuté v genóme kmeňa Corynebacterium glutamicum dostupného prostredníctvom americkej zbierky kultúr .Američan Type Culture Collection pod označením ATCC 13032. Nukleotidové sekvencie izolovaných C. glutamicum MCT DNA sú uvedené v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO a predpokladané aminokyselinové sekvencie C. glutamicum MCT proteínov sú uvedené v Sekvenčnom zázname s párne očíslovanými SEQ ID NO. Uskutočnili sa komputerové analýzy, ktoré klasifikujú a/alebo identifikujú tieto nukleotidové sekvencie ako sekvencie, ktoré kódujú proteíny zapojené do metabolizmu zložiek bunkovej membrány alebo proteíny zapojené do transportu zlúčenín cez membrány.

Predložený vynález sa tiež týka proteínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname). Tak ako sa v tomto dokumente uvádza, proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu v podstate homológnu s vybranou sekvenciou aminokyselín je najmenej asi na 50 % homológny s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, napr. celou vybranou aminokyselinovou sekvenciou. Proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, môže byť tiež najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70 % a výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 % alebo 90-95% a najvýhodnejšie najmenej asi na 96%, 97%, 98%, 99% alebo viac homológny s vybranou sekvenciou aminokyselín.

MCT proteín alebo jeho biologicky aktívna časť alebo jeho fragment podľa tohto vynálezu sa môže podieľať na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány alebo mať jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.

Rôzne aspekty vynálezu sa detailnejšie opisujú v nasledujúcich odstavcoch.

A. Molekuly izolovaných nukleových kyselín

Vynález sa týka molekúl izolovaných nukleových kyselín, ktoré kódujú MCT polypeptidy alebo ich biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín vhodných na použitie ako hybridizačné sondy alebo priméry na identifikáciu alebo amplifikáciu MCT-kódujúcej nukleovej kyseliny (napr. MCT DNA). Pojem „molekula nukleovej kyseliny“, tak ako sa v tomto dokumente používa, označuje molekuly DNA (napr. cDNA alebo genómovú DNA) a molekuly RNA (napr. mRNA) a analógy DNA alebo RNA vytvorené použitím nukleotidových analógov. Tento pojem zahrňuje tiež netranslatovanú sekvenciu lokalizovanú na oboch 3'- a 5'- koncoch kódujúcej oblasti génu: najmenej asi 100 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 5'- konci kódujúcej oblasti génu proti smeru (upstream) transkripcie a najmenej asi 20 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 3'- konci kódujúcej oblasti génu v smere (downstream) transkripcie. Molekula nukleovej kyseliny môže byť jednovláknová alebo dvojvláknová, ale prednostne je dvojvláknová DNA. „Izolovanou“ molekulou nukleovej kyseliny je práve tá, ktorá je separovaná od iných molekúl nukleových kyselín, ktoré sú prítomné v prirodzenom zdroji nukleovej kyseliny. Výhodne, „izolovaná“ nukleová kyselina neobsahuje sekvencie, ktoré prirodzene lemujú nukleovú kyselinu (t.j. sekvencie lokalizované na 5-'a 3'-koncoch nukleovej kyseliny) v genómovej DNA organizmu, z ktorého je nukleová kyselina odvodená. Napríklad, v rôznych uskutočneniach, izolovaná MCT molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať menej ako asi 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb alebo 0,1 kb nukleotidových sekvencii, ktoré prirodzene lemujú molekulu nukleovej kyseliny v genómovej DNA bunky, z ktorej je nukleová kyselina odvodená (napr. bunka C. glutamicum). Navyše, „izolovaná“ molekula nukleovej kyseliny, ako DNA molekula, môže byť v podstate bez iného bunkového materiálu alebo kultivačného média, ak sa vytvorila pomocou rekombinantných techník, alebo chemických prekurzorov alebo iných chemikálií, ak sa syntetizovala chemicky.

Molekula nukleovej kyseliny, podľa predloženého vynálezu, napr. molekula nukleovej kyseliny, ktorá má nepárne očíslovanú nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, sa môže izolovať s použitím štandardných techník molekulárnej biológie a informácií o sekvencii poskytnutých v tomto dokumente. Napríklad, C. glutamicum MCT DNA sa môže izolovať z knižnice C. glutamicum použitím celej sekvencie alebo časti jednej zo sekvencii s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname ako hybridizačná sonda a štandardnými hybridizačnými technikami (napr. ako sa opisuje vSambrook, J., Fritsh, E. F., aManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencii nukleových kyselín podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO:) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto sekvencie (napr. molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencii nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto istej sekvencie). Napríklad, mRNA sa môže izolovať z normálnych endotelových buniek (napr. pomocou guanidíniumtiokyanátovej extrakčnej metódy podľa Chirgwim a kol. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299) a DNA sa môže pripraviť použitím reverznej transkriptázy (napr. Moloney MLV reverznej transkriptázy, dostupnej od Gibco/GRL, Bethesda, MD; alebo AMV reverznej transkriptázy dostupnej od Seikagaku America, Inc., St.

Petersburg, FL). Syntetické oligonukleotidové priméry pre amplifikáciu polymerázovou reťazovou reakciou sa môžu skonštruovať na základe jednej z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže amplifikovať použitím cDNA, alebo alternatívne, genómovej DNA, ako templátu a vhodných oligonukleotidových primérov podľa štandardných PCR amplifikačných techník. Nukleová kyselina takto amplifikovaná sa môže klonovať do vhodného vektora a charakterizovať pomocou vhodnej sekvenčnej analýzy DNA. Okrem toho, oligonukleotidy zodpovedajúce MCT nukleotidovej sekvencií sa môžu pripraviť pomocou štandardných syntetických techník napr. použitím automatického syntetizéra DNA.

Vo výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu obsahuje jednu z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Sekvencie nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, tak ako sa uvádzajú v Sekvenčnom zázname, zodpovedajú Corynebacterium glutamicum MCT DNA podľa tohto vynálezu. Táto DNA pozostáva zo sekvencií kódujúcich MCT proteíny (t.j. „kódujúcej oblasti“ zaznamenanej v každej nepárne očíslovanej sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ako aj z 5'netranslatovaných sekvencií a 3'-netranslatovaných sekvencií, ktoré sa tiež zaznamenali v každej nepárne očíslovanej sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. Alternatívne, molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať len kódujúcu oblasť ktorejkoľvek zo sekvencií nukleových kyselín v Sekvenčnom zázname.

Pre účely tejto prihlášky treba rozumieť, že každá zo sekvencií nukleovej kyseliny a aminokyselinových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname je identifikovaná RXA, RXN, RXS alebo RXC číslovaním, ktoré má označenie „RXA,“ „RXN,“ „RXS“ alebo „RXC“ s následnými 5 číslami (t.j. RXA02099, RXN03097, RXS00148 alebo RXC01748). Každá zo sekvencií nukleovej kyseliny sa skladá až z troch častí: 5'- protismernej oblasti, kódujúcej oblasti a oblasti v smere transkripcie. Každá z týchto troch oblastí je identifikovaná rovnakým RXA, RXN, RXS alebo RXC označeniami, aby sa zabránilo zámene. Slovné spojenie „jedna zo sekvencií s nepárnym číslovaním v Sekvenčnom zázname“ teda odkazuje na ktorúkoľvek zo sekvencií nukleovej kyseliny v Sekvenčnom zázname, ktorá môže byť rozlíšiteľná pomocou ich rozdielnych RXA, RXN, RXS alebo RXC označení. Kódujúca oblasť každej z týchto sekvencií je translatovaná na príslušnú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je tiež uvedená v Sekvenčnom zázname ako párne očíslovaná sekvencia SEQ ID NO: priamo nasledujúca po príslušnej sekvencii nukleovej kyseliny. Napríklad, kódujúca oblasť pre RXA03097 je uvedená v SEQ ID NO:1, zatiaľ čo aminokyselinová sekvencia, ktorú kóduje, je uvedená ako SEQ ID NO:2. Sekvencie molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú určené rovnakými RXA, RXN RXS alebo RXC označeniami ako molekuly aminokyselín, ktoré kódujú, takže sa môžu ľahko korelovať. Napríklad, aminokyselinová sekvencia označená RXA02099 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXA02099, aminokyselinová sekvencia označená RXN03097 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXN03097, aminokyselinová sekvencia označená RXS00148 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXS00148 a aminokyselinová sekvencia označená RXC01748 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXC01748; zhoda medzi RXA, RXN, RXS a RXC nukleotidovými sekvenciami a aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu a im pridelené SEQ ID NO čísla sú uvedené v tabuľke 1. Napríklad, ako sa uvádza v tabuľke 1, nukleotidové sekvencia RXA00104 je SEQ ID NO:5 a aminokyselinová sekvencia RXA00104 je SEQ ID NO:6.

Niektoré z génov podľa tohto vynálezu sú „F-označené gény“. F-označené gény zahŕňajú tie gény uvedené v tabuľke 1, ktoré majú „F“ pred RXA, RXN, RXS alebo RXC označením. Napríklad, SEQ ID NO: 11 označuje, ako je ukázané v tabuľke 1, taký F-gén, ktorý má označenie „F RXA02581 “,(SEQ ID NO 31 taký Fgén, ktorý má označenie „F-RXA02487 SEQ ID NO 33 taký gén, ktorý má označenie „F-RXA02490 “ a SEQ ID NO 43 taký gén, ktorý má označenie „F RXA02809).

V jednom uskutočnení, molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu sa nedajú zahrnúť do tých, ktoré sú zostavené do tabuľky 2, a to v prípade dapD génu, ktorého sekvenciu publikoval Wehrmann, A. a kol. (1998) v J. Bacteríoi.

180 (12), 3159-3165. Avšak, sekvencia získaná vynálezcami predloženej prihlášky je významne dlhšia, ako je publikovaná verzia. Predpokladá sa, že publikovaná verzia vychádzala z nesprávneho štartovacieho kodónu, a tak predstavuje len fragment skutočnej kódujúcej oblasti.

V inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, zahrňuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou zo sekvencií nukleotidov podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním sekvencie SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo s jej časťou. Molekulou nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, je práve tá, ktorá je dostatočne komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií v Sekvenčnom zázname (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:), takže sa môže hybridizovať s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, v dôsledku toho sa vytvára stabilný duplex.

V ešte inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% alebo 60%, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, a výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % alebo dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95%, 96%, 97%, 98% alebo 99% alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) alebo jej časťou. Intervaly alebo identita medziľahlých hodnôt s vyššie uvedenými intervalmi (napr.na 70-90% identické alebo na 80-95% identické) patria tiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, intervaly hodnôt identity využívajúce kombináciu akýchkoľvek vyššie uvedených hodnôt ako horné a/alebo dolné hranice taktiež patria do rozsahu vynálezu. V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje, napr. sa hybridizuje v stringentných podmienkach, s jednou nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, alebo jej časťou.

Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže obsahovať len časť kódujúcej oblasti sekvencie jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, napríklad fragment, ktorý sa môže použiť ako sonda alebo primér, alebo fragment kódujúci biologicky aktívnu časť

MCT proteínu. Nukleotidové sekvencie určené z klonovania MCT génov z C.

glutamicum umožňujú vytváranie sond a primárov určených na použitie pri identifikácii a/alebo klonovaní MCT homológov v iných typoch buniek a organizmoch, a tiež MCT homológov z iných Corynebacteria alebo príbuzných druhov. Sonda/primér typicky obsahuje podstatne purifikovaný oligonukleotid. Oligonukleotid typicky obsahuje oblasť nukleotidovej sekvencie, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach najmenej asi s 12, výhodne asi s 25, výhodnejšie asi so 40, 50, alebo 75 po sebe idúcimi nukleotidmi zmysluplného (sense) vlákna jednej z nukleotidových sekvencii podlá tohto vynálezu (napr. jednej zo sekvencii s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), nezmyselnú sekvenciu jednej z týchto sekvencii, alebo ich prirodzene sa vyskytujúce mutanty. Priméry založené na nukleotidovej sekvencii podľa tohto vynálezu sa môžu použiť pri PCR reakciách na klonovanie MCT homológov. Sondy založené na MCT nukleotidových sekvenciách sa môžu použiť na detekciu transkriptov alebo genómových sekvencii kódujúcich tie isté alebo homológne proteíny. Vo výhodných uskutočneniach, sonda dálej obsahuje k nej pripojenú značkovú skupinu, napr. značkovou skupinou môže byť rádioizotop, fluorescenčná zlúčenina, enzým alebo enzýmový kofaktor. Takéto sondy môžu byť súčasťou diagnostického testovacieho kitu na identifikáciu buniek, ktoré chybne exprimovali MCT proteín, napríklad meraním hladiny MCT-kódujúcej nukleovej kyseliny vo vzorke buniek, napr. detegovaním MCT mRNA hladín alebo stanovením, či genómový MCT gén mutoval alebo deletoval.

V jednom uskutočnení molekula nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, kóduje proteín, alebo jeho časť, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr.sekvenciou s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. Tak ako sa používa v tomto dokumente, spojenie „dostatočne homológny“ odkazuje na proteíny alebo ich časti, ktoré majú aminokyselinové sekvencie, ktoré obsahujú minimálny počet identických alebo ekvivalentných (napr. aminokyselinový zvyšok, ktorý má podobný bočný reťazec s aminokyselinovým zvyškom v sekvencii jednej z párne očíslovaných SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) aminokyselinových zvyškov k aminokyselinovej sekvencii podľa tohto vynálezu, takže proteín alebo jeho časť je schopný podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. Proteínové členy takýchto metabolických dráh pre membránové zložky alebo membránové transportné systémy, ako sa opisuje v tomto dokumente, môžu mať svoju funkciu pri produkcii alebo sekrécii jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Príklady takýchto aktivít sa tiež opisujú v tomto dokumente. Takto „funkcia MCT proteínu“ prispieva buď priamo alebo nepriamo k výťažku, produkcii a/alebo účinnosti produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Príklady MCT proteínových aktivít sú uvedené v tabuľke 1.

V inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70% a výhodnejšie najmenej asi na 70-80%, 80-90%, 90-95% a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname).

Časťami proteínov kódovaných molekulami MCT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú predovšetkým biologicky aktívne časti jedného z MCT proteínov. Ako sa používa v tomto dokumente, slovné spojenie „biologicky aktívna časť MCT proteínu“, mieni sa tým časť, napr.doména/motív MCT proteínu, ktorá sa podieľa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Aby sa stanovilo, či sa MCT proteín alebo jeho biologicky aktívna časť môže podieľať na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány, je možné skúšku enzýmovej aktivity. Takéto skúšobné metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky, ako sa to podrobne opisuje v príklade 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Ďalšie fragmenty nukleovej kyseliny kódujúce biologicky aktívne časti MCT proteínu sa môžu pripraviť izoláciou časti jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO:

v Sekvenčnom zázname), expresiou kódovanej časti MCT proteínu alebo peptidu (napr. pomocou rekombinantnej expresie in vitro) a stanovením aktivity kódovanej časti MCT proteínu alebo peptidu.

Vynález ďalej zahrňuje molekuly nukleových kyselín, ktoré sa odlišujú od jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname) (a jej častí) v dôsledku degenerácie genetického kódu, atak kódujú rovnaký MCT proteín ako ten, ktorý kódujú nukleotidové sekvencie opísané vo vynáleze. V inom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, má nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorého aminokyselinová sekvencia sa uvádza v Sekvenčnom zázname (napr. s párne očíslovanou SEQ ID NO:). V ešte ďalšom uskutočnení, kóduje molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu celú dĺžku C. glutamicum proteínu, ktorý je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname).

Odborník, ktorý je skúsený v danej oblasti, si bude vedomý toho, že v jednom uskutočnení, sekvencie podľa tohto vynálezu nie sú mienené tak, aby zahrňovali sekvencie známe z doterajšieho stavu techniky, t.j. sekvencie z Genbanky uvedené v tabuľkách 2 a 4. V jednom uskutočnení vynález zahrňuje nukleotidové a aminokyselinové sekvencie, ktoré majú percento identity s nukleotidovou alebo aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu väčšie, v porovnaní s doteraz známou sekvencou v danej oblasti techniky (napr. Genbanková sekvencia (alebo proteín kódovaný takouto sekvenciou) uvedenou v tabuľkách 2 alebo 4). Napríklad v jednom uskutočnení vynález zahrňuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia ako a/alebo najmenej na 38 % identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA01420 (SEQ ID NO: 7), nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia a/alebo najmenej na 43% identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00104 (SEQ ID NO: 5) a nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia a/alebo najmenej na 45 % identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA02173 (SEQ ID NO: 25). Odborník v danej oblasti techniky by bol schopný vypočítať dolný prah percenta identity pre akúkoľvek danú sekvenciu podľa vynálezu pomocou skúšania skóre GAP-vypočítaného percenta identity uvedeného v tabuľke 4 pre každý z troch najlepších aktívnych záznamov pre danú sekvenciu a to pomocou odpočítania najvyššieho GAP-vypočítaného percenta identity od 100 %. Odborník v danej oblasti techniky si bude tiež vedomý, že sekvencie nukleových kyselín a aminokyselín, ktoré majú percento identity väčšie ako takto vypočítaný dolný prah (napr. sú najmenej na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89% alebo 90% alebo 91 %, 92%, 93%, 94% a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac identické) sú tiež zahrnuté do vynálezu

Okrem C. glutamicum MCT nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO, môžu odborníci skúsení v danej oblasti techniky usúdiť, že DNA sekvenčné polymorfizmy, ktoré vedú k zmenám v aminokyselinových sekvenciách MCT proteínov sa môžu vyskytovať v rámci populácie (napr. C. glutamicum populácie). Takýto genetický polymorfizmus v MCT géne môže existovať medzi jedincami v rámci populácie v dôsledku prirodzenej variácie. Ak sa používajú v tomto dokumente pojmy „gén“ a „rekombinantný gén“, vzťahujú sa tieto na molekuly nukleovej kyseliny, ktoré otvoreným systémom čítania kódujú MCT proteín, výhodne C. glutamicum MCT proteín. Takéto prirodzené variácie môžu typicky spôsobovať 1-5% variáciu nukleotidovej sekvencie MCT génu. Ktorékoľvek a všetky takéto nukleotidové variácie a následné aminokyselinové polymorfizmy v MCT, ktoré vyplývajú z prirodzenej variácie a také, ktoré nemenia funkčnú aktivitu MCT proteínov, sú zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu.

Molekuly nukleovej kyseliny zodpovedajúce prirodzeným variantom a ne-C. glutamicum homológom C. glutamicum MCT DNA podlá vynálezu sa môžu izolovať na základe ich homológie s C. glutamicum MCT nukleovou kyselinou opísanou v tomto dokumente použitím C. glutamicum DNA, alebo jej časti, ako hybridizačnej sondy podľa štandardných hybridizačných metodík v stringentných hybridizačných podmienkach. V súlade s uvedeným, v dálšom uskutočnení má molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu najmenej 15 nukleotidovú dĺžku a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu s nepárne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. V dálších uskutočneniach má nukleová kyselina dĺžku najmenej 30, 50, 100, 250 alebo viac nukleotidov. Tak ako sa používa v tomto dokumente pojem „hybridizuje sa v stringentných podmienkach“, opisujú sa tým podmienky na hybridizáciu a premytie, pri ktorých sú nukleotidové sekvencie najmenej na 60% navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Výhodné podmienky sú také, že sekvencie sú najmenej asi na 65 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 75 % alebo viac navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Takéto stringentné podmienky sú známe skúseným odborníkom v danej oblasti techniky a dajú sa zistiť v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Výhodným, nelimitujúcim príkladom stringentných hybridizačných podmienok sú hybridizácie v 6X chloride sodnom/citráte sodnom (SSC) pri približne 45 °C s následným jedným alebo viacerými premytiami v 0,2 X SSC, 0,1 % SDS pri 50-65 °C. Výhodne sa molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ak sa v tomto dokumente používa pojem „prirodzene sa vyskytujúca“ molekula nukleovej kyseliny, odkazuje sa tým na molekulu RNA alebo DNA, ktoré majú nukleotidovú sekvenciu vyskytujúcu sa v prírode (napr. kódujúcu prirodzene sa vyskytujúci proteín). V jednom uskutočnení, nukleová kyselina kóduje prirodzene sa vyskytujúci C. glutamicum MCT proteín.

Okrem prirodzene sa vyskytujúcich variantných MCT sekvencií, ktoré sa môžu vyskytovať v populácii, si odborník v danej oblasti techniky bude v ďalšom vedomý, že zmeny, ktoré sa môžu zaviesť do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu mutáciou, vedú aj k zmenám v aminokyselinovej sekvencií kódovaného MCT proteínu, bez zmeny funkčnej schopnosti MCT proteínu. Napríklad, nukleotidové substitúcie, ktoré vedú k aminokyselinovým substitúciám na „neesenciálnych“ aminokyselinových zvyškoch, sa môžu uskutočniť v nukleotidovej sekvencii podľa tohto vynálezu. „Neesenciálny“ aminokyselinový zvyšok je zvyšok, ktorý sa môže zmeneniť z „divého“-typu (wild-type) sekvencie jedného z MCT proteínov (napr. s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) bez zmenenia aktivity spomínaného MCT proteínu, kým „esenciálny“ aminokyselinový zvyšok sa vyžaduje na aktivitu MCT proteínu. Ďalšie aminokyselinové zvyšky, však (napr. tie, ktoré nie sú zachované alebo len polozachované v doméne s MCT aktivitou) nemôžu byť esenciálne pre aktivitu, a teda pravdepodobne podliehajú zmene bez zmenenia MCT aktivity.

Podľa toho sa vynález ďalej týka molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich MCT proteíny, ktoré obsahujú zmeny v aminokyselinových zvyškoch, ktoré nie sú esenciálne pre MCT aktivitu. Takéto MCT proteíny sa líšia aminokyselinovou sekvenciou od sekvencie s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname, pričom si ešte udržali najmenej jednu z MCT aktivít opísaných v tomto dokumente. V jednom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu najmenej asi na 50 % homológnu s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu a je schopný podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Výhodne, proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny je najmenej asi na 50-60% homológny s aminokyselinovou sekvenciou jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, výhodnejšie najmenej asi na 6070 % homológny s jednou z týchto sekvencií, dokonca ešte výhodnejšie najmenej asi na 70-80%, 80-90%, 90-95% homológny s jednou z týchto sekvencií a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % homológny s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu.

Aby sa stanovilo percento homológie dvoch aminokyselinových sekvencií (napr. jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu a jej mutantnej formy) alebo dvoch nukleových kyselín, sekvencie sa zoradili za účelom optimálnych porovnaní (napr. medzery (gaps) sa môžu zavádzať do sekvencie jedného proteínu alebo nukleovej kyseliny na optimálne zoradenie s ďalším proteínom alebo nukleovou kyselinou). Aminokyselinové zvyšky alebo nukleotidy v prislúchajúcich aminokyselinových pozíciách alebo nukleotidových pozíciách sa potom porovnajú. Keď je pozícia v jednej sekvencií (napr. jednej aminokyselinovej sekvencií podľa tohto vynálezu) obsadená tým istým aminokyselinovým zvyškom alebo nukleotidom ako prislúchajúca pozícia v inej sekvencií (napr. mutantnou formou aminokyselinovej sekvencie), tak molekuly sú homológne na túto pozíciu (t.j. ak sa v tomto dokumente používa spojenie aminokyselinová alebo nukleovokyselinová „homológia“, je to ekvivalentné aminokyselinovej alebo nukleovokyselinovej „identite“). Percento homológie medzi dvoma sekvenciami je funkciou počtu identických pozícií podieľajúcich sa na sekvenciách (t.j. % homológie= # identických pozícií / celkových # pozícií x 100).

Molekula izolovanej nukleovej kyseliny kódujúca MCT proteín homológny k proteínovej sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencia s párne očíslovanou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) sa môže vytvárať zavedením jednej alebo viacerých nukleotidových substitúcií, adícií alebo delécii do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu tak, že jedna alebo viac aminokyselinových substitúcií, adícií alebo delécii sa zavedú do kódovaného proteínu. Mutácie sa môžu zaviesť do jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu pomocou takých štandardných metód, ako polohou usmernených mutagenéz a PCR sprostredkovaných mutagenéz. Výhodne sa uskutočnili konzervatívne aminokyselinové substitúcie na jednom alebo viacerých predikovaných neesenciálnych aminokyselinových zvyškoch. „Konzervatívna aminokyselinová substitúcia“ je taká, pri ktorej sa aminokyselinový zvyšok nahradí aminokyselinovým zvyškom, ktorý má podobný bočný reťazec. Rodiny aminokyselinových zvyškov, ktoré majú podobné bočné reťazce, sú definované v danej oblasti techniky. Do týchto rodín patria aminokyseliny so zásaditými bočnými reťazcami (napr. lyzín, arginín, histidín), s kyslými bočnými reťazcami (napr. kyselina asparágová, kyselina glutámová), polárnymi bočnými reťazcami bez náboja (napr. glycín, asparagín, glutamín, serín, treonín, tyrozín, cysteín), nepolárnymi bočnými reťazcami (napr. alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán), betarozvetvenými bočnými reťazcami (napr. treonín, valín, izoleucín) a aromatickými bočnými reťazcami (napr. tyrozín, fenylalanín, tryptofán, histidín). Takto predikovaný neesenciálny aminokyselinový zvyšok v MCT proteíne je výhodne nahradený s iným aminokyselinovým zvyškom z tej istej rodiny bočných reťazcov. Alternatívne, v inom uskutočnení, sa mutácie môžu zavádzať náhodne, pozdĺž celej alebo pozdĺž časti MCT kódujúcej sekvencie, napríklad saturačnou mutagenézou a vytvorené mutanty sa môžu podrobiť skríningu na MCT aktivitu opísanú v tomto dokumente, aby sa identifikovali mutanty, ktoré si udržali MCT aktivitu. Následnou mutagenézou jednej z nepárne očíslovaných nukleotidových sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname sa môže rekombinantné exprimovať kódovaný proteín a aktivita proteínu sa môže stanoviť, napríklad pomocou skúšok uvedených v tomto dokumente (pozri príklad 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu).

Okrem molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich MCT proteíny, ktoré sú opísané vyššie, sa vynález ďalej týka molekúl izolovanej nukleovej kyseliny, ktoré sú navyše nezmyselné. „Nezmyselná“ nukleová kyselina obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k „zmysluplnej “nukleovej kyseline kódujúcej proteín, napr. komplementárna ku kódujúcemu vláknu dvojvláknovej cDNA molekuly alebo komplementárna k mRNA sekvencií. Podlá toho sa nezmyselná nukleová kyselina môže viazať vodíkovou väzbou so zmysluplnou nukleovou kyselinou. Nezmyselná nukleová kyselina môže byť komplementárna k celému MCT kódujúcemu vláknu alebo len k jeho časti. V jednom uskutočnení je nezmyselná molekula nukleovej kyseliny nezmyselná ku „kódujúcej oblasti“ na kódujúcom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej MCT proteín. Pojem „kódujúca oblasť“ sa vzťahuje na oblasť nukleotidovej sekvencie obsahujúcej kodóny, ktoré sa translatujú na aminokyselinové zvyšky (napr. celá kódujúca oblasť SEQ ID NO 5 (RXA00104) zahrňuje nukleotidy 1 až 756). V inom uskutočnení, nezmyselná molekula nukleovej kyseliny je nezmyselná ku „nekódujúcej oblasti“ na kódovacom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej MCT. Pojem „nekódujúca oblasť“ sa vzťahuje na 5'- a 3'-sekvencie, ktoré lemujú kódujúcu oblasť, takže nie sú translatované na aminokyseliny (t.j. označované tiež ako 5'- a 3'· netranslatované oblasti).

Z uvedených sekvencií kódujúceho vlákna, ktoré kódujú MCT, opísaných v tomto dokumente (napr. sekvencie uvedené s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), sa môžu navrhnúť nezmyselné nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu podľa pravidiel Watsonovho a Crickovho párovania báz. Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže byť komplementárna k celej kódujúcej oblasti MCT mRNA, ale výhodnejšie je to oligonukleotid, ktorý je nezmyselný len k časti kódujúcej alebo nekódujúcej oblasti MCT mRNA. Napríklad, nezmyselný oligonukleotid môže byť komplementárny k oblasti obklopujúcej miesto štartu translácie MCT mRNA. Nezmyselný oligonukleotid môže mať napríklad dĺžku 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 alebo 50 nukleotidov. Nezmyselná nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže vytvoriť chemickou syntézou a enzýmovými ligačnými reakciami, pričom sa používajú postupy, ktoré sú známe v danej oblasti techniky. Napríklad, nezmyselná nukleová kyselina (napr. nezmyselný oligonukleotid) sa môže chemicky syntetizovať použitím prirodzene sa vyskytujúcich nukleotidov alebo rôzne modifikovaných nukleotidov určených na zvýšenie biologickej stability molekúl alebo na zvýšenie fyzikálnej stability duplexu vytvoreného medzi nezmyselnými a zmysluplnými nukleovými kyselinami, napr. sa môžu použiť fosforotionátové deriváty a akridínom substituované nukleotidy. Príklady modifikovaných nukleotidov, ktoré sa môžu použiť na vytváranie nezmyselných nukleových kyselín zahŕňajú 5-fluóruracil, 5-brómuracil, 5-chlóruracil, 5-jóduracil, hypoxantín, xantín, 4-acetylcytozín, 5-(karboxyhydroxymetyl)uracil, 5karboxymetylaminometyl-2-tiouridín, 5-karboxymetylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktozylcheozín, inozín, N6-izopentenyladenín, 1-metylguanín, 1metylinozín, 2,2-dimetylguanín, 2-metyladenín, 2-metylguanín, 3-metylcytozín, 5metylcytozín, N6-adenín, 7-metylguanín, 5-metylaminometyluracil, 5metoxyaminometyl-2-tiouracil, beta-D-manozylcheozín^ 5 '-metoxykarboxymetyluracil, 5-metoxyuracil, 2-metyltio-N6-izopentenyladenín, kyselinu uracil-5-oxyoctovú (v), wybutoxozín, pseudouracil, cheozín, 2-tiocytozín, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, metylester kyseliny uracil-5-oxyoctovej, uracil-5-oxyoctovú kyselinu (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxypropyl)uracil, (acp3 )w a 2,6-diaminopurín. Alternatívne sa nezmyselná nukleová kyselina môže vytvoriť biologicky použitím expresného vektora, do ktorého sa nukleová kyselina subklonovala v nezmyselnej orientácii (t.j. RNA transkribovaná z vloženej nukleovej kyseliny bude mať nezmyselnú orientáciu k danej cieľovej nukleovej kyseline, podrobnejšie opísanej v nasledujúcom odstavci).

Molekuly nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú typicky aplikované do bunky alebo sa vytvárajú in situ tak, že sa hybridizujú s alebo viažu na bunkovú mRNA a/alebo genómovú DNA kódujúcu MCT proteín, aby týmto spôsobom inhibovali expresiu proteínu, napr. inhibovaním transkripcie a/alebo translácie. Hybridizáciou sa môže bežnou nukleotidovou komplementaritou vytvoriť stabilný duplex, alebo napríklad v prípade nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny, ktorá sa viaže na DNA, duplexy, a to prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnej ryhe dvojitej skrutkovnice. Nezmyselná molekula sa môže modifikovať tak, že sa špecificky viaže na receptor alebo antigén exprimovaný na zvolenom povrchu bunky, napr. pripájaním nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny k peptidu alebo protilátke, ktorá sa viaže na povrchový receptor bunky alebo antigén. Molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny sa môže tiež doručiť k bunkám použitím vektorov opísaných v tomto dokumente. Aby sa dosiahli postačujúce intracelulárne koncentrácie nezmyselných molekúl, uprednostňujú sa také konštrukty vektora, v ktorých je molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny regulovaná silným prokaryotickým, vírusovým alebo eukaryotickým promótorom.

V ešte inom uskutočnení, molekulou nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu je α-anomérna molekula nukleovej kyseliny. α-Anomérna molekula nukleovej kyseliny vytvára špecifické dvojvláknové hybridy s komplementárnou RNA, v ktorých na rozdiel od obvyklých β-jednotiek, sú vlákna navzájom paralelné (Gaultier a kol.(1987) Nucleic Acids. Res.Vä, 6625-6641). Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže tiež obsahovať 2'-o-metylribonukleotid (Inoue a kol. (1987) Nucleic Acid Res. 15, 6131-6148) alebo chimérový RNA-DNA analóg (Inoue a kol. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

V ešte ďalšom uskutočnení, nezmyselnou nukleovou kyselinou podľa tohto vynálezu je ribozým. Ribozýmy sú katalytické molekuly RNA s ribonukleázovou aktivitou, ktoré sú schopné štiepiť jednovláknovú nukleovú kyselinu ako mRNA, ku ktorej majú komplementárnu oblasť. Takto ribozým (napr. „kladivkovité“ ribozýmy (opísané v Haselhoff a Gerlach (1988) Náture 334, 585-591)) sa môžu použiť na katalytické štiepenie MCT mRNA transkriptov, v dôsledku čoho sa inhibuje translácia MCT mRNA. Ribozým, ktorý má špecificitu pre MCT-kódujúcu nukleovú kyselinu sa môžu navrhnúť na základe nukleotidovej sekvencie MCT DNA molekuly uvedenej v tomto dokumente (t.j. SEQ ID NO: 5 (RXN00104)). Napríklad, derivát Tetrahymena L-19 IVS RNA sa môže skonštruovať tak, že irná nukleotidovú sekvenciu aktívneho miesta komplementárnu s nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa má rozštiepiť v MCT-kódujúcej mRNA. Pozri, napr. Cech a kol., americký patentový spis US č. 4,987,071 a Cech a kol., americký patentový spis US č. 5,116,742. Alternatívne sa MCT mRNA môže použiť na selekciu katalytickej RNA, ktorá má špecifickú ribonukleázovú aktivitu zo zásoby, RNA molekúl. Pozri, napr. Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261.1411-1418.

Alternatívne sa expresia MCT génu môže inhibovať cieľovou nukleotidovou sekvenciou komplementárnou k regulačnej oblasti MCT nukleotidovej sekvencie (napr. MCT promótora a/alebo zosilňovačov), aby sa vytvorili trojité skrutkovnicové štruktúry, ktoré zamedzujú transkripciu MCT génu v cieľových bunkách. Pozri všeobecne, Helene C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6), 569-84; Helene, C. a kol. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; a Maher, L. J. (1992) Bioassays 14 (12). 807-15.

B. Rekombinantné expresné vektory a hostiteľské bunky

Vynález sa ďalej týka vektorov, výhodne expresných vektorov, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu kódujúcu MCT proteín (alebo jeho časť). Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „vektor“ označuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná transportovať inú nukleovú kyselinu, ku ktorej bol pripojený. Jedným typom vektorov je „plazmid“, ktorý označuje kruhovú dvojvláknovú DNA slučku, do ktorej sa môžu ligovať ďalšie segmenty DNA. Iným typom vektora je vírusový vektor, ktorým sa ďalšie DNA segmenty môžu ligovať do vírusového genómu. Určité vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napr. bakteriálne vektory, ktoré majú bakteriálny pôvod replikácie aepizomálne vektory cicavcov). Ďalšie vektory (napr. ne-epizomálne vektory cicavcov) sú integrované do genómu hostiteľskej bunky tak, že sa zavedú do hostiteľskej bunky a týmto spôsobom sa replikujú súčasne s hostiteľským genómom. Okrem toho, určité vektory sú schopné riadiť expresiu génov, ku ktorým boli funkčne pripojené. Tieto vektory sa v tomto dokumente označujú ako „expresné vektory“. Vo všeobecnosti, expresné vektory využívané v rekombinantných DNA metódach sú často vo forme plazmidov. V uvedenej prihláške sa pojmy „plazmid“ a „vektor“ môžu zameniteľné používať, pretože plazmid je najbežnejšie používanou formou vektora. Ale vo vynáleze je snaha zahrnúť také formy expresných vektorov, ako vírusové vektory (napr. replikačné detektívne retrovírusy aadenovírusy a adenoasociované vírusy), ktoré majú ekvivalentné funkcie.

Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu obsahujú nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu vo forme vhodnej na expresiu nukleovej kyseliny v hostiteľskej bunke, čo znamená, že rekombinantné expresné vektory obsahujú jednu alebo viac regulačných sekvencii, zvolených podľa hostiteľských buniek, ktoré sa použijú na expresiu, ktoré sú funkčne pripojené k sekvencii nukleovej kyseliny, ktorá sa má exprimovať. V rámci rekombinantného expresného vektora, „funkčne pripojiť“ znamená, že nukleotidová sekvencia, ktorá je predmetom záujmu, sa pripojí k regulačnej sekvencii(iám) takým spôsobom, ktorý umožní expresiu nukleotidovej sekvencie (napr. v in vitro transkripčnom /translačnom systéme alebo v hostiteľskej bunke, ak je vektor zavedený do hostiteľskej bunky). Pojem „regulačná sekvencia“ zahrňuje promótory, zosilňovače a iné expresné riadiace prvky (napr. polyadenylačné signály). Tieto regulačné sekvencie sú opísané, napríklad vGoeddel; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulačné sekvencie zahŕňajú tie, ktoré riadia konštitutívnu expresiu nukleotidovej sekvencie v mnohých typoch hostiteľských buniek a tie, ktoré riadia expresiu nukleotidovej sekvencie len v určitých hostiteľských bunkách. Výhodné regulačné sekvencie sú, napríklad také promótory, ako cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ιρρ-lac-, lacl^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, X-P_R' alebo λ-Ρι_, ktoré sa používajú predovšetkým v baktériách. Ďalšími regulačnými sekvenciami sú, napríklad, promótory z kvasiniek a húb ako ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promótory z rastlín, ako CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos alebo ubikvitínové alebo fazeolínové promótory. Tiež je možné použiť syntetické promótory. Odborník skúsený v danej oblasti techniky si bude vedomý toho, že konštrukcia expresného vektora môže závisieť na takých faktoroch, akými je výber hostiteľskej bunky, ktorá sa má transformovať, na úrovni expresie požadovaného proteínu, a pod. Expresné vektory podľa tohto vynálezu sa môžu zavádzať do hostiteľských buniek, v dôsledku čoho sa produkujú proteíny alebo peptidy, vrátane fúznych proteínov alebo peptidov kódovaných nukleovými kyselinami, ako sa opisuje v tomto dokumente (napr. MCT proteíny, mutantné formy MCT proteínov, fúzne proteíny a pod.).

Rekombinantné expresné vektory podlá tohto vynálezu sa môžu skonštruovať na expresiu MCT proteínov v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Napríklad, MCT gény sa môžu exprimovať v bakteriálnych bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu (použitím baculovírusových expresných vektorov), kvasinkových a iných bunkách húb (pozri Romanos, a kol., (1992) „Foreign gene expression in yeast: a review“, Yeast 8, 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. a kol. (1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi“ v: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., str. 396-428: Academic Press: San Diego; a van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied

Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge), v riasach a v bunkách mnohobunkových rastlín (pozri Schmidt, R and Willmitzer, L. (1988) „High efficiency Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants“ Plánt Celí Rep, 583-586) alebo v bunkách cicavcov. O vhodných hostiteľských bunkách sa diskutuje ďalej v Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatívne, rekombinantný expresný vektor sa môže transkribovať a translatovať in vitro, napríklad použitím T7 promótorových regulačných sekvencií a T7 polymerázy.

Expresia proteínov v prokaryotoch sa najčastejšie uskutočňuje s vektormi obsahujúcimi konštitutívne alebo indukovateľné promótory, ktoré riadia expresiu buď fúznych alebo ne-fúznych proteínov. Fúzne vektory pridávajú mnoho aminokyselín ku kódovanému proteínu, obvykle k amino-koncu rekombinantného proteínu, ale tiež k C-koncu alebo sa fúzujú s vhodnými oblasťami v proteínoch. Takéto fúzne vektory majú typicky tri funkcie: 1) zvyšujú expresiu rekombinantného proteínu; 2) zvyšujú rozpustnosť rekombinantného proteínu; a 3) pomáhajú purifikovať rekombinantný proteín tým, že majú funkciu ligandov pri afinitnej purifikácii. Často sa fúznymi expresnými vektormi zavádza proteolytické štiepne miesto na spojenie fúznej časti a rekombinantného proteínu, aby sa umožnila separácia rekombinantného proteínu z fúznej časti s následnou purifikáciou fúzneho proteínu. Takéto enzýmy, a ich príbuzné rozpoznávacie sekvencie obsahujú Faktor Xa, trombín a enterokinázu.

Charakteristickými fúznymi expresnými vektormi sú pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Jihnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), ktoré fúzujú glutatión-S-transferázu (GST) k cieľovému rekombinantnému proteínu, pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), ktoré fúzujú maltózu E-viažuci proteín k cieľovému rekombinantnému proteínu a pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), ktoré fúzujú proteín A k cieľovému rekombinantnému proteínu. V jednom uskutočnení, kódujúca sekvencia MCT proteínu je klonovaná do pGEX expresného vektora, aby sa vytvoril vektor kódujúci fúzny proteín začlenením, od N-konca k C-koncu, GSTtrombínového štiepneho miesta-X proteínu. Fúzny proteín sa môže purifikovať pomocou afinitnej chromatografie za použitia glutatiónagarózovej živice.

Rekombinantný MCT proteín. ktorý nebol fúziou pripojený na GST sa môže získať štiepením fúzneho proteínu s trombínom.

Príkladmi vhodných induktívnych ne-fúznych E. coli expresných vektorov sú: pTrc (Amann a kol., (1988) Gene 69, 301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN 111113-B1, λ gt11, pBdC1 a pET 11d (Studier a kol., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; a Pouwels a kol., (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018). Cieľová génová expresia zpTrc vektora sa zakladá na RNA polymerázovej transkripcii z hybridného trp-lac fúzneho promótora. Cieľová génová expresia z pET 11 d vektora sa zakladá na transkripcii z T7 gn 10-lac fúzneho promótora sprostredkovanej pomocou koexpresie s vírusovou RNA polymerázou (T7 gn 1). Táto vírusová polymeráza je poskytovaná hostiteľskými kmeňmi BL21 (DE3) alebo HMS174(DE3) z rezidentného Xprofágu prechovávajúceho T7 gn1 gén pod transkripčnou reguláciou laclIV 5 promótora. Na transformáciu ďalších druhov baktérií sa môžu vybrať vhodné vektory. Napríklad plazmidy plJ101, plJ364, plL702 a plJ361 sa úspešne používajú na transformovanie Streptomyces, zatiaľ čo plazmidy pUB110, pC194 alebo pBD214 sú vhodné na transformáciu Bacillus druhov. Niekoľko plazmidov sa používa pri prenose genetickej informácie do Corynebacterium, a to pHM1519, pBĽI, pSA77 alebo pAJ667 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

Jednou stratégiou na maximalizáciu rekombinantnej proteínovej expresie je expresia proteínu v hostiteľskej baktérii s oslabenou schopnosťou proteolytického štiepenia rekombinantného proteínu (Gotteman.S., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119128). Ďalšou stratégiou je meniť nukleovokyselinovú sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá sa má vložiť do expresného vektora, takže individuálne kodóny pre každú aminokyselinu sú tie, ktoré sa prednostne využívajú v baktérii vybratej na expresiu, napríklad ako C. glutamicum (Wada a kol. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 21112118). Takáto zmena nukleovokyselinových sekvencii podľa tohto vynálezu sa môže uskutočniť pomocou štandardných metód syntézy DNA.

V ďalšom uskutočnení je MCT proteínovým expresným vektorom kvasinkový expresný vektor. Príkladmi vektorov na expresiu v kvasinkách S. cerevisiae sú:

pYepSed (Baldari a kol., (1987) Embo J. 6, 229-234), 2 μ, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Celí 30, 933-943), pJRY88 (Schultz a kol., (1987) Gene 54, 113-123) apYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektory a metódy na konštrukciu vektorov vhodných na použitie v ďalších hubách, takých ako vláknitých hubách, sú detailne zhrnuté vo: van den Hondel, C.A.M.J.J & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge, a Pouwels a kol., eds.(1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York (IBSN 0 444 904018).

Alternatívne sa MCT proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách hmyzu použitím baculovírusových expresných vektorov. Baculovírusové vektory dostupné na expresiu proteínov pri kultivovácii buniek hmyzu (napr. buniek Sf9) zahrňujú pAc série (Smith a kol., (1983) Mol. Celí Biol. 3, 2156-2165) apVL série (Lucklow and Summers (1989) Virologv 170.31-39).

V inom uskutočnení sa MCT proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách jednobunkových rastlín (napríklad v riasach) alebo v rastlinných bunkách vyšších rastlín (napr. spermatofytoch ako napríklad poľnohospodárskych plodín). Príklady rastlinných expresných vektorov sú detailne zhrnuté v: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) „New plánt binary vectors with selectable markers located proximal to the left border“ Plánt Mol. Biol. 20, 1195-1197; a Bevan, M.W. (1984) „Binary Agrobacterium vectors for plánt transformation“, Nucl. Acid. Res. 12, 8711-8721 a zahŕňajú pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 a pDH51 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

V ešte inom uskutočnení sa nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu exprimujú v bunkách cicavcov použitím expresného vektora cicavcov. Príkladmi expresných vektorov cicavcov sú pCDM8 (Seed, B.(1987) Náture 329-840) apMT2PC (Kaufman a kol. (1987) EMBO J. 6, 187-195). Ak sa použijú bunky cicavcov, tak regulačné funkcie expresných vektorov často plnia vírusové regulačné elementy. Napríklad, bežne používané promótory sa často odvodzujú od polyoma, Adenovirusu 2, cytomegalovirusu aSimian Virusu 40. Ďalšie vhodné expresné systémy, tak pre prokaryotické ako aj eukaryotické bunky, sa uvádzajú v kapitole 16 a 17 v Sambrook, J., Fritsh. E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory

Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

V ďalšom uskutočnení je rekombinantný expresný vektor cicavcov schopný riadiť expresiu nukleovej kyseliny prednostne vo zvláštnom type bunky (napr. na expresiu nukleovej kyseliny sa používajú tkanivovo-špecifické regulačné elementy). Tkanivovo-špecifické regulačné elementy sú známe v danej oblasti techniky. Nelimitujúcimi príkladmi vhodných tkanivovo-špecifických promótorov sú: albumínový promótor (pečeňovo-špecifický; Pinkert a kol., (1987) Genes Dev. 1, 268-277), lymfoid-špecifické promótory (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43, 235-275), predovšetkým promótory v receptoroch T buniek (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8, 729-733) a imunoglobulíny (Banerji a kol., (1983) Celí 33, 729-740; Queen and Baltimore (1983) Celí 33, 741-748), neurón-špecifické promótory (napr. neurofilament-promótor; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86, 5473-5477), pankreas-špecifické promótory; (Edlund a kol. Science 230, 912-916) a špecifické promótory mliečnej žľazy cicavcov (napr. promótor mliečnej srvátky; americký patentový spis č. US 4,873,316 a publikovaná európska prihláška č. 264 166). Vývojovo-regulované promótory sú tiež zahrnuté, napríklad myšacie hox promótory (Kessel aGruss, (1990) Science 249, 374-379) a a-fetoproteínový promótor (Campes a Tilghman, (1989) Genes Dev. 3, 537-546).

Vynález v ďalšom poskytuje rekombinantný expresný vektor obsahujúci molekulu DNA podľa tohto vynálezu klonovanú do expresného vektora v nezmyselnej orientácii. Znamená to, že molekula DNA je funkčne pripojená k regulačnej sekvencií takým spôsobom, ktorý umožňuje expresiu (pomocou transkripcie molekuly DNA) molekuly RNA, ktorá je nezmyselná k MCT mRNA. Regulačné sekvencie funkčne spojené s nukleovou kyselinou klonovanou v nezmyselnej orientácii sa môžu vybrať také, aby riadili kontinuálnu expresiu nezmyselnej molekuly RNA v rôznych typoch buniek, napríklad vírusové promótory a/alebo zosilňovače, alebo regulačné sekvencie sa môžu zvoliť tak, aby riadili konštitutívnu, tkanivovo-špecifickú alebo podľa typu bunky špecifickú expresiu nezmyselnej RNA. Nezmyselný expresný vektor môže mať formu rekombinantného plazmidu, fágomidu alebo zoslabeného vírusu, v ktorom sa nezmyselná nukleová kyselina produkuje pod kontrolou vysoko účinnej regulačnej oblasti, aktivita ktorej sa môže stanoviť pomocou typu bunky, do ktorej je vektor zavedený. Podrobnejšie informácie o regulácii génovej expresie použitím nezmyselných génov, pozri Weintraub, H. a kol., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Fleviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1), (1986).

Vynález sa ďalej týka hostiteľských buniek, do ktorých sa zaviedol rekombinantný expresný vektor podľa tohto vynálezu. Pojem „hostiteľská bunka“ a „rekombinantná hostiteľská bunka“ sa používa navzájom zameniteľné v tomto dokumente. Rozumie sa, že takéto pojmy označujú nielen príslušný subjekt bunky, ale aj progén alebo potenciálny progén takejto bunky. Pretože určité modifikácie sa môžu vyskytnúť v nasledujúcich generáciách v dôsledku buď mutácie alebo vplyvov prostredia, takýto progén nemôže byť v skutočnosti identický s rodičovskou bunkou, ale ešte stále je zahrnutý do rozsahu pojmu ako sa používa v tomto dokumente.

Hostiteľskou bunkou môže byť akákoľvek prokaryotická alebo eukaryotická bunka. Napríklad, MCT proteín sa môže exprimovať v baktériových bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu, kvasinkách alebo bunkách cicavcov (takých ako ovariálnych bunkách čínskeho škrečka (CHO) alebo COS bunkách). Ďalšie vhodné hostiteľské bunky sú známe odborníkom v danej oblasti techniky. Mikroorganizmy príbuzné ku Corynebacterium glutamicum, ktoré sa môžu obyčajne používať ako hostiteľské bunky pre nukleovú kyselinu a molekuly proteínov podľa tohto vynálezu, sú uvedené v tabuľke 3.

Vektor DNA sa môže zaviesť do prokaryotických a eukaryotických buniek prostredníctvom bežných transformačných a transfekčných metodík. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojmy „transformácia“ a „transfekcia“, „konjugácia“ a „transdukcia“ sú mienené tak, že odkazujú na rôzne, v danej oblasti techniky známe, metódy na zavádzanie cudzej nukleovej kyseliny (napr. lineárnej DNA alebo RNA (napr. linearizovaný vektor alebo samotný génový konštrukt bez vektora) alebo nukleovej kyseliny vo forme vektora (napr. plazmidu, fágu, „fazmidu“, „fagemidu“, transpozónu alebo inej DNA) do hostiteľskej bunky, vrátane koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým alebo chloridom vápenatým, DEAEdextránovo sprostredkovanej transfekcie, lipofekcie, prirodzenej spôsobilosti, chemicky sprostredkovaného transferu alebo elektroporácie. Vhodné metódy na transformovanie alebo transfekovanie hostiteľských buniek sa dajú nájsť v Sambrook, a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory manual. 2nd, ed., Cold Spring

Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a ďalších laboratórnych príručkách.

Pri stabilnej transfekcii buniek cicavcov, ako je známe, v závislosti na expresnom vektore a použitej transfekčnej metodike, len malá frakcia buniek môže integrovať cudziu DNA do svojho genómu. Za účelom identifikácie a selekcie týchto integrácií sa gén, ktorý kóduje selekčný markér (napr. rezistenciu na antibiotiká) bežne zavádza do hostiteľských buniek spolu s génom, ktorý je predmetom záujmu. Výhodné markéry selekcie sú tie, ktoré prepožičiavajú rezistenciu na liečivo, také ako G418, hygromycín a metotrexát. Nukleová kyselina kódujúca selekčný markér sa môže zaviesť do hostiteľskej bunky na tom istom vektore, ktorý kóduje MCT proteín alebo sa môže zaviesť na separátnom vektore. Bunky stabilne transfekované so zavedenou nukleovou kyselinou sa dajú identifikovať napríklad selekciou liečiva (napr. bunky, ktoré inkorporovali selekčný markérový gén prežijú, kým ostatné bunky odumrú).

Za účelom vytvorenia homológneho rekombinantného mikroorganizmu sa pripraví vektor, ktorý obsahuje aspoň časť MCT génu, do ktorého sa zaviedla delécia, adícia alebo substitúcia, aby sa týmto spôsobom zmenil, napr. funkčne rozrušil, MCT gén. Výhodne, týmto MCT génom je Corynebacterium glutamicum MCT gén, ale týmto môže byť homológ z príbuznej baktérie alebo dokonca zo zdrojov z cicavcov, kvasiniek alebo hmyzu. Vo výhodnom uskutočnení, je vektor skonštruovaný tak, že homológnou rekombináciou je endogénny MCT gén funkčne narušený (t.j. už ďalej nekóduje funkčný proteín; tiež označený ako „knock ouť‘ vektor). Alternatívne, vektor môže byť skonštruovaný tiež tak, že na základe homológnej rekombinácie sa endogénny MCT gén zmutuje alebo sa ináč zmení, ale ešte stále kóduje funkčný proteín (napr. protismerná regulačná oblasť sa môže zmeniť tak, že sa zmení expresia endogénneho MCT proteínu). V homológnom rekombinantnom vektore, zmenená časť MCT génu lemuje jeho 5 - a 3'- konce pomocou dodatkovej nukleovej kyseliny MCT génu, čo umožní homológnu rekombináciu medzi exogénnym MCT génom prenášaným prostredníctvom vektora a endogénnym MCT génom v mikroorganizme. Dodatková lemujúca MCT nukleová kyselina má dostatočnú dĺžku na úspešnú homológnu rekombináciu s endogénnym génom. Charakteristicky, niekoľko kilobáz lemujúcej DNA (na oboch 5'- a 3'koncoch) je zahrnutých do vektora (pozri opis homológnych rekombinantných vektorov napr. Thomas, K. R., a Capecchi, M.R. (1987) Celí 51, 503 ). Vektor sa zavádza do mikroorganizmu (napr. pomocou elektroporácie) a bunky, v ktorých sa zavedený MCT gén homológne rekombinoval s endogénnym MCT génom sa rozdeľujú pomocou metód známych v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení sa môžu produkovať rekombinantné mikroorganizmy, ktoré obsahujú zvolené systémy, ktoré umožňujú regulovanú expresiu zavedeného génu. Napríklad, inklúzia MCT génu na vektor, umiestnený tak, že je regulovaný lac operónom, umožňuje expresiu MCT génu len v prítomnosti IPTG. Takéto regulačné systémy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení je endogénny MCT gén v hostiteľskej bunke narušený (napr. homológnou rekombináciou alebo ďalšími genetickými spôsobmi známymi v danej oblasti techniky) tak, že expresia jeho proteínového produktu nenastane. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený MCT gén v hostiteľskej bunke zmenil jednou alebo viacerými bodovými mutáciami, deléciami alebo inverziami, ale stále ešte kóduje funkčný MCT proteín. V ešte ďalšom uskutočnení, jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) MCT génu v mikroorganizme sa zmenili (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia MCT génu je modulovaná. Odborník v danej oblasti techniky si bude vedomý, že hostiteľské bunky, obsahujúce viac ako jednu z opísaných MCT génových a proteínových modifikácií sa dajú ľahko produkovať s použitím spôsobov podľa tohto vynálezu a sú zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu.

Hostiteľská bunka podľa tohto vynálezu, taká ako prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka, sa môže použiť na kultiváciu, aby sa produkoval (t.j. exprimoval) MCT proteín. V súlade s uvedeným, vynález v ďalšom poskytuje spôsoby produkcie MCT proteínov s použitím hostiteľských buniek podľa tohto vynálezu. V jednom uskutočnení, spôsob pozostáva z pestovania hostiteľskej bunky podľa tohto vynálezu, (do ktorej sa zaviedol rekombinantný expresný vektor kódujúci MCT proteín, alebo do genómu ktorej sa zaviedol gén, kódujúci „divý“-typ alebo zmenený MCT proteín) vo vhodnom médiu, až kým sa produkuje MCT proteín. V ďalšom uskutočnení sa spôsob ďalej týka izolácie MCT proteínov z média alebo z hostiteľskej bunky.

C. Izolované MCT proteíny

Vynález sa ďalej týka izolovaných MCT proteinov a ich biologicky aktívnych častí. „Izolovaný alebo „purifikovaný“ proteín, alebo jeho biologicky aktívna časť, je v podstate bez bunkového materiálu vtedy, ak bol produkovaný rekombinantnými DNA metódami, alebo bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok vtedy, ak bol syntetizovaný chemicky. Pojem „v podstate bez bunkového materiálu“ označuje preparáty MCT proteínu, v ktorých sa proteín oddelil od celulárnych zložiek buniek, v ktorých sa prirodzene alebo pomocou rekombinácie produkuje. V jednom uskutočnení, pojem „v podstate bez celulárneho materiálu“ označuje preparáty MCT proteínu, ktoré majú menej ako asi 30% (v sušine) ne-MCT proteínu (tiež označené v tomto dokumente ako „kontaminujúci proteín“), výhodnejšie menej ako asi 20 % ne-MCT proteínu, ešte výhodnejšie menej ako asi 10 % ne-MCT proteínu a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % ne-MCT proteínu. Ak sa MCT proteín alebo jeho biologicky aktívna časť produkuje rekombinantne, tiež je výhodne v podstate bez kultivačného média, t.j. kultivačné médium predstavuje menej ako asi 20 %, výhodnejšie menej ako asi 10 % a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % objemu proteínového preparátu. Slovné spojenie, „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok“ označuje preparáty MCT proteínu, v ktorých je proteín oddelený od chemických prekurzorov alebo iných chemických látok, ktoré sú zapojené do syntézy proteínu. V jednom uskutočnení, slovné spojenie „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok” označuje preparáty MCT proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) chemických prekurzorov alebo ne-MCT chemických látok, výhodnejšie menej ako asi 20 % chemických prekurzorov alebo ne-MCT chemických látok, ešte výhodnejšie menej ako asi 10% chemických prekurzorov alebo ne-MCT chemických látok a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % chemických prekurzorov alebo ne-MCT chemických látok. Vo výhodných uskutočneniach izolované proteíny alebo ich biologicky aktívne časti neobsahujú kontaminujúce proteíny z toho istého organizmu, z ktorého bol MCT proteín odvodený. Charakteristicky sa takéto proteíny produkujú rekombinantnou expresiou, napríklad C. glutamicum MCT proteín v takom mikroorganizme, ako je C. glutamicum.

Izolovaný MCT proteín alebo jeho časť, podľa tohto vynálezu sa môže podieľať metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Vo výhodných uskutočneniach, proteín alebo jeho časť obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán v C. glutamicum alebo na transporte molekúl cez tieto membrány. Časť proteínu je výhodne biologicky aktívna časť, ako sa to uvádza v tomto dokumente. V ďalšom výhodnom uskutočnení má MCT proteín podľa tohto vynálezu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení má MCT proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárne očíslovanou SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname). Veste inom výhodnom uskutočnení, má MCT proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %, 72 %, 73 %,74 %,75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovými sekvenciami podľa tohto vynálezu alebo s ich časťou. Rozsahy a medzilählé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70 až 90% identické alebo na 80 až 95% identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu z ktorýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze sú taktiež zahrnuté. Výhodné MCT proteíny podľa predloženého vynálezu majú tiež výhodne najmenej jednu z MCT aktivít, ktoré sa opisujú v tomto dokumente. Napríklad, výhodný MCT proteín podľa predloženého vynálezu má aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá sa môže podieľať sa na metabolizme zlúčenín potrebných na konštrukciu bunkových membrán vC. glutamicum alebo podieľať na transporte molekúl cez tieto membrány alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.

V iných uskutočneniach, MCT proteín je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a uchováva si funkčnú aktivitu proteínu jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu, ale odlišuje sa od aminokyselinovej sekvencie, v dôsledku prirodzenej variácie alebo mutagenézy, ako sa to opisuje detailne v I. odstavci vyššie. Podľa toho, v inom uskutočnení, MCT proteínom je proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá má najmenej jednu z MCT aktivít opísaných v tomto dokumente. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70-90% identitické alebo na 80-95% identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu ktorýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. V ďalšom uskutočnení sa vynález sa týka celej dĺžky proteínu C. glutamicum, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu.

Biologicky aktívne časti MCT proteínu obsahujú peptidy, ktoré majú z aminokyselinové sekvencie odvodené z aminokyselinovej sekvencie MCT proteínu, napr. aminokyselinovej sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname alebo aminokyselinovej sekvencie proteínu homológneho s MCT proteínom, ktorý obsahuje menej aminokyselín, než je celá dĺžka MCT proteínu, alebo celú dĺžku proteínu, ktorý je homológny s MCT proteínom, a vykazujú najmenej jednu aktivitu MCT proteínu. Typicky, biologicky aktívne časti (peptidy, napr. peptidy, ktoré sú napríklad 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 alebo viac aminokyselín dlhé) obsahujú doménu alebo motív s najmenej jednou aktivitou MCT proteínu. Okrem toho, ďalšie biologicky aktívne časti, v ktorých sú ďalšie oblasti proteínu deletované, sa môžu pripraviť pomocou rekombinantných metód a ohodnotiť na jednu alebo viac aktivít opísaných v tomto dokumente. Výhodne, biologicky aktívne časti MCT proteínu obsahujú jednu alebo viac vybraných domén/motívov alebo ich častí, ktoré majú biologickú aktivitu.

MCT proteíny sú výhodne produkované pomocou DNA rekombinantných metodík. Napríklad, molekula nukleovej kyseliny kódujúca proteín sa klonuje do expresného vektora (ako je opísané vyššie), expresný vektor sa zavedie do hostiteľskej bunky (ako je opísané vyššie) a MCT proteín sa exprimuje v hostiteľskej bunke. MCT proteín sa môže potom izolovať z buniek pomocou vhodných purifikačných postupov, a to použitím štandardných metód na purifikáciu proteínov. Alternatívne k rekombinantnej expresii sa MCT proteín, polypeptid, alebo peptid môžu syntetizovať chemicky použitím štandardných metód syntézy peptidov. Okrem toho, natívny MCT proteín sa môže izolovať z buniek (napr. endotelových buniek), napríklad použitím anti-MCT protilátky, ktorá sa môže produkovať pomocou štandardných metód využívajúcich MCT proteín alebo jeho fragment, podľa tohto vynálezu.

Vynález tiež poskytuje chimérové alebo fúzne proteíny. Tak ako sa používa v tomto dokumente, MCT „chimérový proteín“ alebo „fúzny proteín“ zahrňuje MCT polypeptid, ktorý je účinne spojený sne-MCT polypeptidom. „MCT polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia sa zhoduje s MCT proteínom, zatiaľ čo „ne-MCT polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zodpovedá proteínu, ktorý v podstate nie je homológny s MCT proteínom, napr. proteínu, ktorý sa odlišuje od MCT proteínu, a ktorý je odvodený z toho istého organizmu alebo odlišného organizmu. V rámci fúzneho proteínu sa chce pojmom „účinne spojený“ vyjadriť, že MCT polypeptid a ne-MCT polypeptid sa vzájomne fúziou „in frame“ spoja. Ne-MCT-polypeptid sa môže spojiť fúziou s N-koncom a C-koncom MCT polypeptidu. Napríklad v jednom uskutočnení fúznym proteínom je GST-MCT fúzny proteín, v ktorom MCT sekvencie sa fúziou spojili sC-koncovými GST sekvenciami. Takéto fúzne proteíny môžu uľahčiť purifikáciu rekombinantných MCT proteínov. V ďalšom uskutočnení, fúznym proteínom je MCT proteín obsahujúci heterológnu signálnu sekvenciu na svojom Nkonci. V určitých hostiteľských bunkách (napr. hostiteľských bunkách cicavcov) sa expresia a/alebo sekrécia MCT proteínu môže zvýšiť prostredníctvom použitia heterológnej signálnej sekvencie.

Výhodne sa MCT chimérový alebo fúzny proteín podľa tohto vynálezu produkuje pomocou štandardných DNA rekombinantných metód. Napríklad, fragmenty DNA kódujúce rôzne polypeptidové sekvencie sa spolu ligujú „in frame“ podľa bežných metód, napríklad sa používa tupý (zarovnaný) (blunt-ended) alebo posunutý (neprekrývajúci sa) (stagger-ended) koniec na ligáciu, digescia s reštrikčným enzýmom na poskytnutie vhodného konca, ak treba, doplnenie kohéznych koncov, spracovanie alkalickou fosfatázou na zamedzenie nežalateľného pripojenia, a enzýmová ligácia. V inom uskutočnení sa fúzny gén môže syntetizovať pomocou bežných metód, vrátane automatických DNA syntetizátorov. Alternatívne sa PCR amplifikácia génových fragmentov môže uskutočniť použitím zakotvených primérov, ktoré spôsobujú komplementárne prečnievania medzi dvoma za sebou nasledujúcimi génovými fragmentárni, ktoré môžu byť potom tepelne hybridizované a reamplifikované, aby sa generovala chimérová génová sekvencia (pozri, napríklad Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel a kol., John Wiley & Sons, 1992). Okrem toho, mnohé expresné vektory, ktoré kódujú fúzny podiel sú komerčne dostupné (napr. GST polypeptid). MCT-kódujúca nukleová kyselina sa môže klonovať do takéhoto expresného vektora, takže fúzny podiel je „in-frame“ spojený spolu s MCT proteínom.

Homológy MCT proteínu sa môžu vytvárať mutagenézou, napr. diskrétnou bodovou mutáciou alebo trunkáciou MCT proteínu. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „homológ označuje rôzne formy MCT proteínu, ktoré pôsobia agonisticky alebo antagonistický na aktivity MCT proteínu. Agonista MCT proteínu môže udržiavať v podstate rovnaké, alebo podprahové biologické aktivity MCT proteínu. Antagonista MCT proteínu môže inhibovať jednu alebo viac aktivít prirodzene sa vyskytujúcej formy MCT proteínu, napríklad prostredníctvom, kompetetívneho viazania sa so smerovým alebo protismerovým členom bunkovej membránovej zložky metabolickej kaskády, ktorá obsahuje MCT proteín alebo pomocou naviazania sa na MCT proteín, ktorý sprostredkúva transport zlúčenín cez takéto membrány, čím sa zabráni translokácii na mieste príjmu.

V alternatívnom uskutočnení sa homológy MCT proteínu môžu identifikovať skríningom kombinatorických knižníc mutantov, napr. trunkačných mutantov, MCT proteínu na MCT proteínovú agonistickú alebo antagonistickú aktivitu. V jednom uskutočnení, variegátna knižnica (variegated library) MCT variantov sa vytvára pomocou kombinatorickej mutagenézy na úrovni nukleovej kyseliny a je kódovaná variegátnou génovou knižnicou. Variegátna knižnica MCT variantov sa môže získať pomocou napríklad enzýmovej ligácie zmesi syntetických oligonukleotidov do génových sekvencií tak, že degenerovaný súbor potenciálnych MCT sekvencií je exprimovateľný ako individuálne polypeptidy, alebo alternatívne, ako súbor väčších fúznych proteínov (napr. na fágový displej) obsahujúcich súbor MCT sekvencií tam uvedených. Existujú rôzne metódy, ktoré sa môžu použiť na vytváranie knižníc potenciálnych homológov MCT zdegenerovanej oligonukleotidovej sekvencie. Chemická syntéza degenerovanej génovej sekvencie sa môže uskutočniť v automatickom DNA syntetizátore, a syntetický gén sa potom liguje do vhodného expresného vektora. Použitie degenerovaného súboru génov umožňuje zabezpečiť v jednej zmesi všetky sekvencie kódujúce požadovaný súbor potenciálnych MCT sekvencií. Metódy na syntetizovanie degenerovaných oligonukleotidov sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura a kol., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53, 323; Itakura a kol., (1984) Science 198.1056; Ike a kol., (1983) Nucleic Acid Res. H, 477).

Okrem toho, knižnice fragmentov kódujúcich MCT proteín sa môžu použiť na vytváranie variegátnej populácie MCT fragmentov na skríning a následnú selekciu homológov MCT proteínu. V jednom uskutočnení sa knižnica kódujúcich sekvenčných fragmentov môže vytvárať pomocou spracovania dvojvláknového PCR fragmentu MCT kódujúcej sekvencie s nukleázou v podmienkach, v ktorých medzera (nick) sa vyskytuje len raz na molekulu, denaturáciou dvojvláknovej DNA, renaturáciou DNA aby sa vytvorila dvojvláknová DNA, ktorá môže obsahovať zmysluplné/ nezmyselné páry produktov s rôznym počtom medzier, odstránením jednovláknových častí z novovytvorených duplexov pomocou spracovania s S1 nukleázou a ligovaním knižnice výsledného fragmentu do expresného vektora.

Pomocou tejto metódy sa môže odvodiť taká expresná knižnica, ktorá kóduje Nkoncové, C-koncové a vnútorné fragmenty rôznych veľkostí MCT proteínu.

Viacero metodík je známych v danej oblasti techniky na skíning génových produktov kombinatorických knižníc vytvorených bodovými mutáciami alebo trunkáciou a na skríning cDNA knižníc na génové produkty, ktoré majú zvolené vlastnosti. Takéto metódy sú prispôsobiteľné na rýchly skríning génových knižníc vytvorených kombinatoriálnou mutagenézou MCT homológov. Najviac používané metódy, ktoré sú vhodné na vysokoúčinnú „through-puť* analýzu na skríning veľkých génových knižníc, typicky zahrňujú klonovanie génovej knižnice do replikovateľných expresných vektorov, transformovanie vhodných buniek s výslednou knižnicou vektorov a exprimovanie kombinatorických génov v podmienkach, v ktorých detekcia požadovanej aktivity uľahčuje izoláciu vektora kódujúceho gén, ktorého produkt sa detegoval. Rekurzívna množina mutagenézy (REM, recursive ensemble mutagenesis), nová metóda, ktorá zlepšuje frekvenciu funkčných mutantov v knižniciach, sa môže použiť v kombinácii so skríningovými skúškami na identifikáciu MCT homológov (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89,7811-7815; Delgrave a kol., (1993) Protein Engineeríng 6.(3), 327-331).

V inom uskutočnení sa skúšky na báze bunky môžu využiť na analýzu variegátnej MCT knižnice, ak sa použijú metódy, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky.

D. Použitie a spôsoby vynálezu

Molekuly nukleovej kyseliny, proteíny, proteínové homológy, fúzne proteíny, priméry, vektory a hostiteľské bunky opísané v tomto dokumente sa môžu použiť v jednom alebo vo viacerých nasledovných spôsoboch: identifikácia C. glutamicum a príbuzných organizmov; mapovanie genómov organizmov príbuzných C. glutamicum; identifikácia a lokalizácia C. glutamicum sekvencii, ktoré sú predmetom záujmu; evolučné výskumy; stanovenie oblastí MCT proteínu potrebných na funkčnosť; modulácia MCT proteínovej aktivity; modulácia metabolizmu jednej alebo viacerých bunkových membránových zložiek; modulácia transmembránového transportu jednej alebo viacerých zlúčenín; a modulácia bunkovej produkcie požadovanej zlúčeniny ako napríklad špeciálnej chemikálie.

Molekuly MCT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu majú rozmanité použitia. Po prvé, môžu sa použiť na identifikáciu organizmu, akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzných organizmov. Taktiež sa môžu použiť na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzných organizmov v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých C. glutamicum génov; pomocou sondovania extrahovanej genómovej DNA kultúry jednotnej alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so sondou prekleňujúcou oblasť C. glutamicum génu, ktorá je osobitá pre tento organizmus, možno určiť, či je tento organizmus prítomný.

I keď Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, je príbuzná s patogénnymi druhmi, takými ako Corynebacterium diphtheriae. Corynebacterium diphtheriae je kauzatívny agens diftérie, rýchle sa vyvíjajúcej, akútnej horúčkovitej infekcie s následkami tak lokálnej ako aj systémovej patológie. Pri tejto chorobe, sa vyvíja lokálne poškodenie horného respiračného traktu s nekrotickým poškodením epitelových buniek; bacily vylučujú toxín, ktorý sa rozšíri cez toto poškodenie do distálnych vnímavých telesných tkanív. Degeneratívne zmeny spôsobené inhibíciou proteosyntézy v takých tkanivách, ako v srdci, svale, periférnych nervoch, nadobličkách, obličkách, pečeni a slezine, majú za následok systémovú patológiu choroby. Diftéria pretrváva s vysokým výskytom v mnohých častiach sveta, vrátane Afriky, Ázie, východnej Európy a v nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu. Pokračujúca epidémia diftérie vo východnej Európe a nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu si vyžiadala najmenej 5000 úmrtí od roku 1990.

V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsob na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte. Týmto spôsobom sa deteguje jedna alebo viacej nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo aminokyselinových sekvencií (napr. sekvencie uvedené s párnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte. C. glutamicum a C. diphtheriae sú príbuzné baktérie a mnohé z molekúl nukleových kyselín a proteínových molekúl v C. glutamicum je homológnych s C. diphtheriae molekulami nukleovej kyseliny a proteínovými molekulami, a preto sa môžu použiť na detekciu C. diphtheriae v subjekte.

Molekuly nukleových kyselín a proteínov podľa tohto vynálezu môžu byť tiež markérmi špecifických oblastí genómu. Je to využiteľné nielen pri mapovaní genómu, ale tiež pri funkčných výskumoch proteínov C. glutamicum. Napríklad, na to, aby sa identifikovala oblasť genómu, ku ktorej sa viaže určitý C. glutamicum DNA-väzbový proteín, by sa mal genóm C. glutamicum podrobiť digescii a fragmenty inkubovať s DNA-väzbovým proteínom. Tie, ktoré viažu proteín môžu byť dodatočne sondované s molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, výhodne s ľahko detegovateľnými značkami; viazanie takejto molekuly nukleovej kyseliny s genómovým fragmentom umožňuje lokalizáciu fragmentu na genómovej mape C. glutamicum, a keď sa to uskutoční viacnásobne s rôznymi enzýmami, uľahčí to rýchle stanovenie sekvencie nukleovej kyseliny, ku ktorej sa viaže proteín. Ďalej, molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu byť dostatočne homológne so sekvenciami príbuzných druhov, takže molekuly nukleových kyselín môžu fungovať ako markéry pri konštrukcii genómovej mapy v príbuzných baktériách, takých ako Brevibacterium lactofermentum.

Molekuly MCT nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú tiež využiteľné pri evolučných výskumoch a výskumoch proteínovej štruktúry. Metabolické a transportné procesy, na ktorých sa molekuly podľa tohto vynálezu podieľajú, využíva veľa rozmanitých druhov prokaryotických a eukaryotických buniek, porovnaním sekvencií molekúl nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu s tými, ktoré kódujú podobné enzýmy u iných organizmov sa môže určiť evolučná príbuznosť organizmov. Podobne, takéto porovnanie umožňuje určiť, ktoré oblasti sekvencie sú zachované, a ktoré nie, čo môže pomôcť pri stanovení takých oblastí proteínu, ktoré sú esenciálne pre fungovanie enzýmu. Tento druh stanovenia je hodnotný pre výskumy proteínového manipulovania a môže byť indikáciou, čo proteín môže tolerovať pri mutagenéze bez straty funkcie.

Manipulácia molekúl MCT nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže viesť k produkcii MCT proteínov, ktoré sa funkčne odlišujú od „divého“- typu MCT proteínov. Tieto proteíny môžu mať zvýšenú účinnosť alebo aktivitu, môžu sa nachádzať vo väčších množstvách v bunke ako obyčajne alebo môžu mať zníženú účinnosť alebo aktivitu.

Vynález poskytuje spôsoby na skríning molekúl, ktoré modulujú aktivitu MCT proteínu, buď interakciou so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom MCT proteínu alebo modulovaním transkripcie alebo translácie molekuly MCT nukleovej kyseliny podlá tohto vynálezu. Pri týchto spôsoboch sa mikroorganizmus, ktorý exprimuje jeden alebo viac MCT proteínov, podľa tohto vynálezu, kontaktuje s jednou alebo viacerými testovanými zlúčeninami, a takto sa dá stanoviť vplyv každej testovanej zlúčeniny na aktivitu alebo úroveň expresie MCT proteínu.

Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa zmenou MCT proteínu podľa tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Získanie špeciálnych chemických zlúčenín z kultivácií C. glutamicum vo veľkom rozsahu sa signifikantne zvýši, ak C. glutamicum vylučuje požadované zlúčeniny, pretože také zlúčeniny sa dajú ľahko purifikovať z kultivačného média (v protiklade k ich extrakcii z hmoty buniek C. glutamicum). Zvyšovaním počtu alebo aktivity transportných molekúl, ktoré exportujú špeciálne chemikálie z bunky sa dá zvýšiť množstvo produkovanej špeciálnej chemikálie, ktorá sa nachádza v extracelulárnom médiu a takto umožňovať ich ľahšiu izoláciu a purifikáciu. Naproti tomu na účinnú nadmernú produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií sa vyžadujú zvýšené množstvá kofaktorov, prekurzorových molekúl a medziproduktových zlúčenín na vhodné biosyntetické dráhy. Preto pomocou zvyšovania počtu a/alebo aktivity transportných proteínov zapojených do importu živín, ako napríklad zdrojov uhlíka (t.j. sacharidov), zdrojov dusíka (t.j. aminokyselín, amónnych solí), fosfátu a síry je možné zvýšiť produkciu špeciálnej chemikálie, a to zásluhou odstránenia všetkých obmedzení v prívode živín pre biosyntetický proces. Ďalej, mastné kyseliny a lipidy sú samé osebe požadovanými špeciálnymi chemikáliami; pomocou optimalizovania aktivity alebo zvyšovaním množstva jedného alebo viacerých MCT proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré sa môžu podieľať na biosyntéze týchto zlúčenín alebo oslabením aktivity jedného alebo viacerých MCT proteínov, ktoré sú zapojené do degradácie týchto zlúčenín, jé možné zvýšiť výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie molekúl mastných kyselín a molekúl lipidov z C. glutamicum.

Genetickou manipuláciou jedného alebo viacerých génov podľa tohto vynálezu sa dá dosiahnuť to, že tieto MCT proteíny so zmenenými aktivitami nepriamo ovplyvňujú produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C.

glutamicum. Napríklad, normálne biochemické metabolické procesy vedú k produkcii rôznorodých odpadových produktov (napr. peroxidu vodíka a iných reaktívnych foriem kyslíka), ktoré môžu aktívne interferovať stými istými metabolickými procesmi (napríklad je známe, že peroxodusičnan nitruje bočné reťazce tyrozínu, čím sa inaktivujú niektoré enzýmy, ktoré majú tyrozín v aktívnej polohe (Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3_(2): 226-235). Zatiaľ čo tieto odpadové produkty sa typicky vylučujú, kmene C. glutamicum, ktoré sa využívajú na fermentačnú produkciu vo veľkom rozsahu sa optimalizujú na nadmernú produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií, atak môžu produkovať viac odpadových produktov než ako je typické pre „divý“-typ C. glutamicum. Optimalizáciou aktivity jedného alebo viacerých MCT proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré sú zapojené do exportu odpadových molekúl sa dá zvýšiť životaschopnosť bunky a udržať vhodná metabolická aktivita. Navyše, prítomnosť vysokých intracelulárnych hladín požadovanej špeciálnej chemikálie môže byť v skutočnosti toxická pre bunku, takže zvyšovaním schopnosti bunky vylučovať tieto zlúčeniny sa dá zvýšiť životaschopnosť bunky.

Ďalej, MCT proteíny podľa tohto vynálezu sa môžu tiež manipulovať tak, že relatívne množstvá rozličných molekúl lipidov a molekúl mastných kyselín sa menia. Toto môže mať veľký vplyv na lipidovú skladbu bunkovej membrány. Pretože každý druh lipidu má rôzne fyzikálne vlastnosti, menením lipidového zloženia membrány sa môže signifikantne meniť membránová fluidita. Zmeny v membránovej fluidite môžu vplývať na transport molekúl cez membránu, ktorý, ako sa predtým vysvetlilo, môže modifikovať export odpadových produktov alebo produkovať špeciálnu chemikáliu alebo importovať potrebné živiny. Takéto zmeny v membránovej fluidite môžu mať veľký vplyv na integritu bunky; bunky s relatívne slabšími membránami viacej podliehajú mechanickým stresom v podmienkach vo veľkorozmernom fermentore, ktoré môžu poškodiť alebo usmrtiť bunku. Takýmto manipulovaním MCT proteínov zapojených do produkcie mastných kyselín a lipidov potrebných na konštrukciu membrán, že výsledná membrána má zloženie, ktoré je viac prispôsobiteľné podmienkam okolitého prostredia existujúcim v kultúrach používaných na produkciu špeciálnych chemikálií, by malo väčšie množstvo buniek C. glutamicum v kultúre prežiť a množiť sa. Väčšie množstvá buniek C. glutamicum v kultúre by mali transláciou poskytovať väčšie výťažky, produkciu alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kultúry.

Vyššie spomenuté stratégie mutagenézy MCT proteínov, ktoré poskytujú zvýšené výťažky požadovanej zlúčeniny z C. glutamicum, nie sú mienené ako limitujúce; variácie týchto stratégií mutagenézy sú očividne ľahké pre odborníkov, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Pomocou takýchto stratégií a inkorporáciou tu uvedených mechanizmov sa molekuly nukleovej kyseliny a proteínové molekuly podľa tohto vynálezu môžu využiť na vytváranie C. glutamicum alebo príbuzných kmeňov baktérií, v ktorých expresia mutovaných MCT molekúl nukleovej kyseliny a proteínových molekúl je taká, že výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny sa zvýši. Požadovanou zlúčeninou môže byť akýkoľvek prirodzený produkt produkovaný C. glutamicum, vrátane konečných produktov biosyntetických dráh a medziproduktov prirodzene sa vyskytujúcich metabolických dráh, ako aj molekúl, ktoré sa prirodzene nevyskytujú v metabolizme C. glutamicum, ale ktoré sú produkované kmeňom C. glutamicum podľa tohto vynálezu.

Tento vynález je v ďalšom ilustrovaný pomocou nasledovných príkladov, ktoré by sa nemali chápať ako limitujúce. Obsahy všetkých literárnych odkazov, patentových prihlášok, patentov, publikovaných patentových prihlášok, tabuliek a sekvenčných záznamov, ktoré sú uvedené v tejto prihláške, sú týmto zahrnuté ako odkaz.

φ

ΧΛ ΧΟ £

Έ

Ο.

>

G

Ο

ο χ c

CM Ο ω

« C Ό < < « Z Z c ΌΌ φ 5 S 6 < < α.

•UJ-UJ £ Η Η k

C > > ω co ϊϊ * I- I- C X CC φ ρρ ο

Q. ž ž σ

I- Η Ο '>» r^- r^- g «ω 8.

C0 c

Λ

ο. α. ω ω

Γιο m m co Ο) σ> co v- ιο

CO C0 τS ο

ο		CD ιο CXJ Q	OJ	CD	o	Γ-	Ν'
OJ	C0	CO	CO	CD	o	CO
Ν'	ΙΟ	LO		0)	o	r-
	OJ		οι				o
ο	ο		o	o	o	o	o

ina	ID NO
Φ	O
<0 >	w
	CO

b-O)7-cou>r^0)7-CQtf) bOJOJCOCOCOCOCON-N-N· Ν'

I

CO

Q

UJ

CO

O

I I

		CM
ČO* CM	CO*	CD
CO ŕ Γ có	T CM	O ω
q O	CD	<
CM UJ	N

O UJ o UJ lij z I

ID CO

CÓ CM O UJ >

Ô

CO ϋ Ľl

CM M· 0 UJ

O

CM

CO in m K

CO CD Lz

CQ

CO

CM CM f OO? UJ UJ >

> > Q

UJ Z <

0<2 s

“5 UJ z H <

S

UJ tn £

UJ

	Φ
CM	C
	n
	> o	<D O
	XJ	JC
	<0	C D
	k- o	llI
	o	g
		ω
	(Q	g
	5	t <0
	xa co	*0
	H	S

UJ UJ x ,, cn cn > uj uj uj< ΗΞΞζ ” ω ω n <0 > O JJ x □ Z.

UJ u. ω z ž r o CM UJ

B á ' i > ω

I

Q

Q.

in cô cm

O

UJ ιη iq

V“

CO CM Q

UJ

CQ CM O

UJ z > cn

Q Q.

rj w CM CM OO UJ UJ í 0 o LL CÔ Š o <->lL « Λ CO b*

CM O UJ

I t < < o o o o š š o o o o š

&S9

J

-JO o

-o D (D^ o UJ o u. tn o LL >O ti ti

H X X

UJ o >

<

UJ ω w £ >·>

Q UJ X h~ tn o tn <

UJ tn £ “5 UJ

Z πω

UJ

Ul ω

x > ω co >- > X CM 0 0 0Z o UJ x H tn o tn <

z efí o

LL tn o LL > Z

UJ ω £

UJ z H tn <

UJ Ul

U. LL 0 0

Z z 3 č ?!ľľí~ • > >- CO ľľ; Q O l<

pst ŽQQ t 9® £:>> _j ľ] tn

LL Q

0UJ

Ž>

<

Ž ·<

x o >·«: x =-£ w ω tn x r x S < < > T- > OSSOcmO

Ohuhij i *

> r o r z CM UJ tn ω oo m m ω <o yiw,-i i^m9o !*<<'< , H LL U. i < tn tn feOO ;ο4·4· LL CO CO j O —> —> XOO I UJ X X O UJ UJ I >O O 'd'?'? I Q Z Z = m tf\

CO q co > o <

r? ^M uJ 9 ωό |o ξ£

O x UJ o s O o x UJ o i g δ < Q

I x Q O ' O O Ο ο o uj ’O’O’Oluuj.^ z š •>*>>0»0K0 < 53^4 Q Q UJ UJ UJ □

Q Q cn cn < < z z

UJ UJ UJ x c x Q. Q. Q.

tn tn < < 2 2 §0022

Jl ώ δδ < < oo XX oo i i CO “

CO i B é o

I Q

X CÓ ítn tn oo u. u.

O O UJ_UJ z z t ti T T

□ □ UJ UJ OC CC

S. | t | | | r z z z z z O'O'O'O'O'O CD »— I— I— I— »— fcčččiíč

X I- I- I- I- ŕ o =□=>=>=□ 5 E

-J -J _1 -J -J

0 0 0 G > > > > >

<0^'00000 >WltúŠ<$<?<§<X >

CD M f) v Ύ “ Λ Λ λ z\ i< < <'i= -ú £2.® O O O O O cm o O < >>>gococxg otti^dd

0. <Λ CL (L

XXXIX

ľ*

N

CO

CO

CO

ω

co

CD

CO Φ

CM

CM

Ifí

CO

CO

O)

CO

CO

CD

in

co

IÍ5

CD

05

Q OJ

Y“

CO

£

b*

O

o

Y-

CM

r*

m

o

CM

Φ

Ώ

CD

O)

b*

CO

IO

CO

CD

co m

CO

CD O

irj

CM

''t

CO

X“

CD

CM

CD

CM

o

xŕ

CD

CM

in

05

CO

CO

CO Y

B“

T“

co

CO

CO 05

CM x-

CO

irj

CD b-

CM

CO

T

CM

Y-

in

CMM'CDCOOCM'eiDCD LDiniDlDCOCDCDCDCD o r*·

CM M- CD CD O CM M- CD b-Nb-NCDCOCOCO

CO O CM 5 CD CO CD 05 05 O) O) O)

M- CD CO O O O

CM CO CO O CM * r- τ- ▼- t- CM CM CM

Ycomsojr-níns IDlDiniDlOCDCDCDCD

CD

	r_	co in b*	05	j-coinr-OJT-coinb-O)*“
τ- COLDb*OJT“COlDb*Q5Y’CO	tf) h- 05 O	o o o	O	T-T-Y-T-T-CMCMCMCMCMCO
b<.b»b<*b»b»CDC0C0CD<DO5a>	OJ O 05 y“	x- τ- τ-	1“	x— x— -T— Y-^— Υ-Ύ— T— -^T“

o

N

«5

Y—

CO

CD

rx

xt

O

b*

ro

rx

CD

CM

τ-

CD

CM

CD

CD

ro

CO

CM

ro

o

CO

o

o

CO

Ο

ro

o

CD

ro

o

o

O

CD

CO

CM

03

CD

ro

O

CO

CD

CD

ro

CO

T- CO

ro

CO

γ—

<0

CO

y—

y-

T-

Y“

T“

		03
03	ro			CD	τ-	o	CO
5	CD	CD		CM	Ο	CD	ro
co	CD	CM	CO	CO	O	CO	CD
03	rx	CM	0)	V“	CO	CO	CO

O	CM	CD	ro	co	03	CD	CD	rx		<	03
(D	CD		03			O	Xt			ro	•e
O	O		ro	Y“			IX	rx	|x	CO	|X
	CM	CM	CM	O	O	CM				o	τ-
O	O	O	o	O	O	O	o	o	o	o	Ο

(3 C

xt CD CD O CM CO CO CO xt

CD

CO O xt ro

CM xt CD €0 ro ro ro ro

CM xt CD CD O CO CO CD CD b*

xt CD CO O CM SS N CO CD xt CO

CD CO

CO CO

O

CD CD mco

Tabuľka 1 (pokračovanie) Degradácia mastných kyselín

Nucleic Acid Amino Acid Identification Contig. NT Štart NT Stop Functlon

SEQ ID NO SEQ ID NO Code

197 198 RXA02268 GR00655 2182 3081 LlPÁŽA (EC 3.1.1.3)

UJ CO w F s š -J 0. 2 O X

Uj V x UJ _>

?< S <

._· ._· ._· —’ ._· -_·._()« ii Γ5 y_

U <

COCOCOOCTCOCOrt .<=5 c u .3 o n UJ x

CD M;

CO

M-M-TÍ -M M -M -M ' _ ·, -*S — (0<Ó<O(DC0(OCÔCO^g^]g OOOOOOOO— UJUJUJUJUJUJUJlUrf <<<<000 o-< N N N N UJ UJ IUIUZ „ £ X X gtttiti o | ooooxxxx£-g xxxx<2£Č>'Š ^: ÔÔOôáSiSSo ϋϋθϋ<<<5^ > LL-JLuVyVII

I = 9cooocDtpS

I Q.XCLCLXXXXS ! OOOOágJSÍ ifÄ-ccoccctr^^{000 1} · Q. Q. 0- Q. ľloooo i r uj uj tu uj ’SW j ϋΓιΰΙΰΐϊ tj 'tfXXXX -«íjíčČOOOOH

O-UjUjujUJXXXXUJ ijfflmmmo-a.o.Q.S rf O _ J *x yiSséiá ui UJ ui z in

UJ z o -- Q. 92 o UJ, q N í «8 ωω o

I I I I 1 <<<<(o o o o-< o u o u z Jj J J_jQ > > > > J z z z z s OOOOfj O. Q- CL O. > O O O O r8Č0C

UJ c h a (D O X o UJ ó??.

OC UJ

UJ D

I o -j > x UJ.

992« __ _ cn Q £ cc uj uj o uj sxx ®O h Q Q 9 > sr, u> u. — —i N Q. O. O 0 y— LXJ UJ

Sccgc

>0

K

CO

Q

CD

0

O

0

b*

CD

CU

b.

CO CO

Q O S

b-

CO

CD

8

3

cu

cu CD

5

CD

0)

m

CO

b·

CO

0)

CU

0

co

tn

N

CO

in

CO

Ch

0)

10

CD

CO

CO

tn

CM

tn

O

0

CD

CO

CD

0)

cu

CO

CU

xŕ

10

CO

CD

H

00

CO

CD

CO

0)

0)

«2

CO

b·

v—

’U’

N

co

CD

CD

CD

T-

0)

co

cu

I“

CM

CD

CD

CD

CO

T—

Zl

T-

CM

CM

CM

CM

tn

CD

cu

ΧΓ

CO

CU

tart

0)

S

co

ID

0)

O)

0)

0

CO

Q

N

CD

0)

K/J

CO

O

CM

*9

CO

CO

<2

0)

O

CD

ch

v-

to

CO

Tŕ

g>

CD

O

xŕ

0)

CO

O

to

CD

CO

b-

.

CM

O

b-

CO

tn

tn

CO

in

CO

0)

0

CM

10

CO

0)

CU

cu

CO

ΧΓ

b-

0

CO

CD

CD

IO

O

V“

CD

r~

Tt

CU

CO

co

Tŕ

0

CO

0

CO

b-

CO

CO

CO

CD

CO

m

to

CO

CU

CD

CO

cu

CU

CD

b-

w

b-

CO

z

CU

cu

CU

CO

cu

0)

CO

in o co in b-	b- tm CD ID CO	b m ot <0 b- tn xŕ	0) CO	bCD	bCD	CD CO	σ> 0 -e xŕ tn k.	*-COCOtn®CDb-CD M- b- b* CD ID 0) CD Tŕ	CD	tn tn *5 cd	0>
co m	{Z cd co rZ	CD CD 00 K	CM	CO	CO	CO 0	t- Tŕ b. ?	-U CUCOCOCDK.CUCOCO		cu CD	τ-
000	0 o 0 0	0000	O	O	0	0 Τ-	0 0 0 Τ-	.S! OOOOOOOO		0 0 0	Ο
000	0 0 0 0	0000	O	O	0	Ο o	Ο 0 O n	*P OOOOOOOO	O	0 2 0	O
OCCCCC	> x x >	cc ac oc cc	CC	CC	CC		CC CC K >	ä xxxxxxxx	CC	> x >	CĽ
000	S00S	00000	0	0	0>	000>	^1 0000(3000	0	>0>	0

OCU*CDCOOCU^<DCOOCM ΟΟΟΟΟτ-ι-τ-ν-τ-ςχιςυ CUCUCUCUCUCMCUCUCUCUCUCU

7- o

CD O) co tn

7- in b- CD b- CD CD τo o

Ο o εΜ Τ-

CD CO O CU Tŕ CD CO CM CU CM CO CO CO CO CO CM CU CU CM CM CM CM CM

TrcinsoTCOinľ'O)’OOOOOt-t-t-t-t-CM CMCMCMCUCUCMCUCMCMCMCM

CO	in	b· o	t n ms
cu	cu	cu cu	co co co CO
cu	cu	CU cu	cu cu cu cu

CC LL

CD CO O CU IO in CD CD CD CU CU CM CU CU

0 z .19
Φ	σ
<0 ž	UJ ω

tn r*- o co m m m cd cd cu cu cu cu cu š

«Φ tr _ a^c c c φ 'φ Έ) pop t Q o >

SfĽ>

CS ω jŕ c □ ,<n 8 o y <υ o £ E 3 C £ u I φ Γϊ tr^ o o»N (0 <

f L__ Ml? Ml) Ml?

φ φ φ tr tr tr

2 2 a a a _

o. Q. Q. cn cn co <0 e c c c e * _i < 5

Z ‘uj

O X X > Z x o x ω Z š

C < < < < > Siííá-z O o o o o cE m c c c c Ä “ΒϊΈίX «Ν Q. Q. Q. Q-< jg mb (p *δδδδ!5¾¾¾¾½__________„ .._ <Q.CLCLQ-?SQ_a.CLQ-CLii.a-a.SQ-n

Ί I— r n .φ «Φ «φ «φ δδδδδδδδ NNNNNNNN ‘©'fljMS'CB'w'ťO'COOj

E

CO c Ό E

Q 13 É Ý

O x

<

E £ S £ φ > φ > > > > 2 2 2 2 MD MD Ό *Φ tr tr tr t: - _Ä S. q. S. S. 2 ás 2 <0 to co co 0.·= c c c c ,. Θ· ® ® S ® | -s o o o u e “ CD CD CD m g£ Φ o u.

Q.

·>»£ £ g o o

X'XO>'>'X č c c ς C E CO £ o Q. CO i o m — n 7x q.

-s-a-aÉ X ~ ~

CL X <<<

XXX ϊ> aaa (O O CO CO CO f?f f| o 9.0 o o co 2 m cd co < S < < <

o o u u = O □ = □ ^¾¾¾ > < 5 > > n. .ž* Ô. Ô. Ol , · HM ^{1 1 1} < — ».N £ > S N h-HI-l-l-l-l<<<<<<<

<X JÉ <X «X Á Í .y θ q .y q o o

G) Φ Φ Φ Φ φ φ o o o o o o o

Q_ Q. O. CL Q. Q. Q. X X X X X X X X------

Q1 o ω ta e *55 co b CN

UJ b N N b UJ CD 0> CN cn

CO [β CM cm 2 ω CM 2 CM o 2 o

Ν'

CO CO CN

CD

CO CN CO m

CO uj

CO

UJ uj n

CN o b N b* b o CO

CD CO uj tn

CN

CN CO 3

0) ď) CO CO b

0) Ν' CN

CO b nUJ b CN CN

CO s in CN 0J

CN CO UJ

CO

CN

Ν'

CO b CO r* co o CN

UJ CO

CN CD b

0) CN N CO CO b CN T“ r-

UJ

CO

CO

UJ

,—

UJ

0

0)

CD

0

b

CN

UJ

CO

0)

b

CD

b

CO

00

0)

O

CO

0)

0)

CO

CD

CO

b

O

CO

CD

b

0)

O

in

Ν’

CO

CO

Ν’

CN

b

CN

τ-

b*

CN

CN

N

CN

b

N

O

CN

0)

CO

UJ

00

CD

CO

V“

α?

CN CN

CM

T“

UJ

T“

<o

CM

in <n m

o ⁰

0) CO o o o in

CN

0) Q CO s

CO

0)

N

CD

CO CO b co

CO b Ν’ o b CO O O o _ _

X X 5 X 00>0

CO CO O o

CN 05 O O O

CD b* o o ž in

O

O — X X 00

b. CO o š

CO o o x 0 b UJ O O ž

CD

CN b O

O X 0

CO CO b o o x 0 co

CO o

0) CN CO o o

CN <8

O O

CD CN CO O

O--X X X X > 0000>

8g o

b co UJ o o x

0

CO CO

T“ o o x

CM

CO

O š

0)

T“ o o

CN Ν’ CN O O

N

0)

O

O__

XXX 0 0 0

0) CO i

Ν' CO O o X 0

(G

b.

σ>

co

(O

CD

CO

CO

CD

b.

K

to

b-

b.

CD

CD

CD

to

to

00

b*

CM

CO

CO

τ-

CM

o

o

ch

b.

b*

O

O

O

o

o

o

O

CO

CO

CM

o

o

w

o

o

r

O

o

O

o

O

o

o

o

o

O

o

o

OOO

o

O

O

O

O

o

X

O x

ω o T 411

Ul

Š δ O x z Ul v F C MO ra > o >o

CO « O X c

X

O x x £ s <

1i ít x z z ςΛ rr^-. ri n v>

> z f tr O CL

CD Z č 'í $ o m tr

4N Q tr •E δ S <0 <Q £ □ -O CO H

A <B KD

Iz|

O¹ c o £1 '>♦ c XJ

CO x £ φ

o ä* o c E <1 g m o

D ti < m o

Ο

I •UJ z UJ £

F3 o cc oZ m o <?

o I •UJ z UJ š ň o tr □ ; x ω

fi Q Q

Po o

F UJ UJ □ Q O Q “· U. U. O O O O 5 5 s uj uj ui ujJ545.j5 LL LL LL U-pJpí £ z Z Z Z CD CD (D y H ľ'ľ ω ω ω ujujujuiuiujujqoo ο->-·>-·>OOOOOOOCCCCCCĽ>>> UJUJUJUJUJUJUJcLctcLtLOOO LL LL LL LL LL LL Z Z Z

ZZZZZZZ £ > > > ΰωω UJUJUIUJUJUJUJOOOOFFF |_ H I- F F H F-------OOOOCľľ tr tr x tr tr tr tr tL CL 0. CL Q- CL Q.

'>·»·>»·> ZZZZZZZ F F F F F F F X X X X X X X OOOOOOO____

0-Q-CLCLCLCLCLHI-FF

ZZZZZZZF >>>-<< <*W

-------CD CD CD CD X X XF tí“ _______izzz z>>> Žd-UJ-UJ-UJ £ £ 0000000^^55 5->- cč X X X X g g g s s oo o o x x

X O X ω z í o o CD CD m tn tr tr _

0-0 CC Q °m m f n-> tr tr uj 5 z zz£yfe uj uj tr o f fZ o qσοσ_ασ z z z 5 z _l -I _l 5 -I OOOjjO □ □□□□ Z Z Z z z

S 2 22 2 < < < < < F F F H F D O D D D —I _l _l _l _l O O O O O

F-hl-NNNNOOO o o o-<·<·<·< tr tr tr trtrtruJuFujujQ.a.0. S 5 S 2.· cc tr tr x UJ UJ UJ tu o. x CL c_ Í 2Σ22 *LLJ4U4JJ4iJ I

LU x_ o-TĽ¹ ZtEZ uj_o ' ·>·>-> z z z F I— H oc x tr ooo Q. 0. CL cd cd ω _ Z Z Z S * * <n cd z z oco X CD X OCO D D D

UJ t^b-ujo

Q O UJ T © o_ n. cr cc ι-ώ Z LlJllJLXJUJUJ|-hXX O > < ΗΙ-Ι-Ι-|-ωΙ1ΙΓ:Γτ£ΓΓ_;υ.ΓΛυ__ι

H H H oc OOO O O CD □_ 2 i— 2^v_ m m m h f £ £ £ E “55 ·—·—·— S2XX X tr x o_ CL _{z 2} >q>X 2 q2<C < < < < < < cl o. ľl □_ t*. 7¾ < jr cdOOO^4cdcdcdcdcd<<hf<2 <-ώ o. ² cl-íti xxxxxxx<<<<xxxS; Z X X x^^i Z Z Z Z Z X X.s. <,s_ ôôôôoŕfgjg™g § CD CD CD'P'P 5 § S Y ¥ ¥ W ň

o x

> x t! x > -”ϊ Λ Λ ”i

5° rr

Q.

>

0- O x ľľi

X-O F •WO^Ľ feioô F> X X o⁰-“Z'» □ ZZ

UJ ω Ž o r~ to © φ o o X σ

b. CM b

O x

HftHnŇFFFFFFF

UJ UJ

F tr_______________

0ľjujuj>>00000ww

a.tfcFwwQ-Q.Q.a.r-OOOOO

CL CL cd cd cd z z Z Z Z F— ΙZZZccc

Xxfxxx2Í

O O ω £ ' <, ĎŽO — f r p o ω š

Ul « £ O

Z S <

XI ä o x x

é o ω £

ňjtrtrxtrcctrtrtrtrtÉtrtrtrtrLfiŕiFFF (DbĽFtFtFttFFFtF'^EtCoCCC feQyyyyoyyQgggogofQEQSPP gOQ O QQQQQQDOO O Q Z Z Z Z gj gj oooo<< tr tr tr tr ž cc o. o. - -

Q) X

Φ Ll_ <D

Φ Φ x ··

U.

φ φ Φ XXX <D

Π- Q- I— L—

CM © © b © CM © © ©

to 5 © CM r* © © v© © ©

CM h* © © to ©

©

CM

O CD S CO

CM s © © Tf b © CM ’t

O CM

					CM
© *“ ©	©	CM	CM	©	’t © T-	b*	«e to b.
b* © CM	b- ©		©	O	(O	©	T- CM Φ
© © T“	©	©	o		© © b· Y“	©	© © b*
© CM CM	to © © CM	©	r	CM	© CM T-		y- b- ©

CM Φ © to © γ- c» b m· o CM t- b* CM to to © T- cm b· ω to m

CM

CM © O

CM © b b

CM © CM to CM to b b* in

CM © to ©

©

CM s © CM to © © b © Sto

CM

CM © O to ©

	b*		©		CM
	©	©	CM		tF
Φ	Φ	©	©	©
©	©		O	Φ	o
©	©		Y“	©

CM © © © © to ©

CO äs o>

CM CM Y F CM O CM CD tb to o © o φ .x

Z

	Q z
C	o
Φ	o
tn >	LU
.x	©1

CO CM '’t ©

Y“ o o x x x x x x x 0000000

O t O o b* O o o x x x x x x ©

o jn <405 $5 P5 o £ ίο s o ISŠ

Φ © © o o x σ •φ © © o o ©

© o o ©

CM

O

O o ______X 0000000 co í? 05 o2 x > x > x x 0>0><D0 © © Φ © © in t- cm t- -«t © o o o o o o o o o

Φ © o T- o

O co b. o O O o o o o O TCM © O O

O — X X φ 0 ©

o o — x X O0

Φ o o x O

N t O O

CM © O o o © CM CM O o

O x x x x x x 0 o 0 o 0 0

-ď ©

CM o o o o « CM O O

CM ©

CM to

CWCMObr-O£NgO CM©©OCM0CMRtoo£ ©©©©©©CMqOäO Q_T-QQť~»ŕ-»ŕYi'-^_t—_sV-^_rri O O O O äS ©O Yr- O _Λ| O © ο ™ © © to o o š © © o o

X ω © © o o x o

O o o © © o o © ä o š © CM O O o to

UJ 12 Φ ô o o o Sj 33⁸3s >< >< CD i Z t^ iľ x tr >< LL LL tr LL OC o CM O O s x

CM CM τΟ í x

Si CM v O to CM o x

o CM CM

T“ O to o o o x

m CM CM o o ©

© o o x

CM © O o © b- CM CM © to Φ b b t- CM CM OOO 333 XXX © o cm cm 2 to to S b. CM S CM o S o Z P Z to

T- to •Φ b V- CM o o x x LL LL to b* o © o Z g © © © CM O ©

o o $

x

T- 05 05 CM m co O το o

O © O CM O © b © © v— υΟ O o o σ

x ω

©

Φ

O

CM

©

CO

o

CM

©

©

O

CM

CM

CM

CM

©

©

©

©

©

©

©

’fr

Cf

(D © © 'M^- © b to CM CM CM Tf- Tf © © ’í

O Φ ’tj·

CM © o r*

CM b o to

CM to © to © to

CM

O ©

S O Y

©

b

to

Y-

©

©

b.

to

Y“

©

©

b

to

T—

©

©

b

to

T—

©

©

b

to

Y”

©

©

’j-

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

b

b

b

N

b

©

Φ

©

©

©

O

to

to

Tj-

*4·

xl*

Tf-

M-

bto to to ^r

C vo (0 > O >Q

CO k M.

ω z

o © o o

©©©©ÔN’ÄY'b— CNT-OCNb*CNT-b*cg ©

©b* © b* T- o © © b- CM CQ ® © b* y- ® b»O © © ^ 05 © ©

CM®CMCMy-t-©©® © b· <0 i~r* O © b* o o © h*

O o b* o o b* o o © CO

O b* © O o © CN b* © y- O O o o

no

Ν’ © CM O

I

O

CM

Ν’

©

©

O

CM

©

©

o

CM Ν’

©

cp

o

CM

Ν’

©

»

O

CM

©

©

O

CM

Ν’

©

o

CN

Ν’

Φ

®

O

CM

CM

CM

CM

CM

©

CO

©

©

Ν’

Ν’ Ν’

Ν’

¥

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

b*

b*

b*

b*

®

®

®

®

Φ

0)

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

© ©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

	Ql z
cq c	Q
ω	σ
w 1	ω ω

Os C so ra > o >o ra

1X _a u

c >o α

z □i O S

T“

N

r>

CO

CO

Y“

O

10

CM

h-

CD

CO

CD

co

o

10

h*

Yt

O

10

yJ-

CO

O

CM

O

CM

T

CO

T

r—

CO

CO

«r

o

T

CD

10

CO

co

0)

10 CO

r*

Yt

h-

CO

CD

10

T

00

	CO
T	CO CD
t- CO	CO CM t- F
co N	γ-O) CM CO
CO 0)	CO CO CM Yt CD CM

CO CO YT CO	CO
CM F Yl- CD	O)
T- Yt Yf T-	CM
co O O O
o o o o	O
z z z z	Z
x x x x	x
x x x x	£

£ c φ Ό

Tabuľka 1 (pokračovanie)

UJ	UJ
ί-	H
ο	O
CC	oc
CL	CL
o	O
CL	cl
□	_l
o	O
CL	tL
<	<
—	—.
«	n
cq	cq
T~	v4
tí	Tí
04	04
Q	Q
UJ	UJ

Tabuľka 2 Vylúčené gény

Literárny odkaz

Bachmann, B. et al. DNA fragment coding for phosphoenolpyruvat corboxylase, recombinant DNA carrying said fragment, strains carrying the recombinant DNA and method for producing L-aminino acids uslng said strains, Patent: EP 0358940-A 3 03/21/90

Moeckel, B. et al. Production of L-isoleucine by means of recombinant micro-organisms with deregulated threonine dehydratase, Patent: WO 95 19442-A 5 07/20/95

Kobayashi, M. etal. Cloning, sequencing, and characterization of theftsZ gene from coryneform bacteria, Biochem. Biophys. Res. Commun., 236(2):383-388(1997)

Wachi, M. et al. A murC gene from Coryneform bacteria, Appl. Microbiol. BiotechnoL, 5 1 (2):223-228 (1 999)

Kimura, E. et al. Molecular cloning of a novel gene, dtsR, which rescues the detergent sensitivity of a mutant derived from Brevibacterium lactofermentum Biosci. BiotechnoL Biochem., 60(10): 1565-1570 (1996)

Funkcia génu

Fosfoenolpyruvátkarboxyláza

T reon índehydratáza

| D-glutamátracemáza

transketoláza |

Glutamín: 2-oxoglutarát-aminotransferáza velVé a malé podjednotky

akonitáza |

Replikačný proteín |

Replikačný proteín; aminoglykozidadenyftransferáza

N-acetylglutamát-5semialdehyddehydrogenáza

Glutamínsyntetáza I

(M íl A >» C)

Argininosukcinosyntetáza I

Ornitínkarbamolytransferáza I

3-dehydrochinátdehydratáza I

Pyruvátkarboxyláza |

Názov génu

□> x x

murC; ftsQ; ftsZ

murC; ftsQ

dtsR

CN CC ω 4-4 PΪ ω Ϊ5

□ E

S 4-4

O D) CQ 4-^ cn

C o CO

Q. d) k

rep; aad

argC

< c □)

U. W x:

argG I

argF I

Q o CO

O >» Q.

GenBank™ AKCESNÉ Č.

A09073

σΓ co“ in h· b* CD CO 00 CQ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ LO LO ΙΌ xt xŕ xt < < < < <

AB003132

ABO 15023

O 2 CO O m <

|ABO 18531 |

'’T CN CD O CN O m <

|AB023377 |

AB024708

|AB025424 |

|AB027714 |

AB027715

AF005242

LO CO CD m o o LL <

in o m* o CO o u. <

IAF030520 I

|AF031518 |

CM CO 0) CD CO O LL <

AF038548

CM ľ'.

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Wehmeier, L. et al. “The role of the Corynebacterium glutamicum rel gene in (p)ppGpp metabolism, Microbiology, 144:1853-1862 (1998)

Park, S. et al. Isolation and analysis of met A, a methionine biosynthetic gene encoding homoserine acetyltransferase in Corynebacterium glutamicum, Mol. Cells., 8(3):286-294(1998)

Dusch, N. et al. Expression of the Corynebacterium glutamicum panD gene encoding L-aspartate-alpha-decarboxylase leads to pantothenate overproduction in Escherichia coli, Appl Environ. Microbioi., 65(4)1530- 1539(1999)

Proteín viažuci dipeptid; adenínfosforibozyltransferáza; GTPpyrofosfoklnáza

Arginínový represor

Inozitolmonofosfátfosfatáza

Arginínsukcinátlyáza

N-acetylglutamylfosfátreduktáza; ornitínacetyttransferáza; Nacetylglutamátkináza; acetylomitíntransamináza; omitínkarbamoyltransferáza; arginínový represor; arginínsukcinátsyntáza; arginínsukcinátlyáza

| Enoylacylreduktáza (prenášačový proteín)

| ATP-fosforibozyltransferáza

Fosforibozylformimino-5-amino-1 - fosforibozyl-4-imidazolkarboxyamidizomeráza

Homoserín-O-acetyltransferáza

Dehydrochinátsyntetáza |

Glutam ínamidotransferáza

Fosforibozyl-ATP-pyrofosfohydroláza

5-enolpyruvátšikimát-3-fosfátsyntáza

Ľ-aspartát-alfa-dekarboxylázový prekurzor

3-dehydrochináza; šikimátdehydrogenáza

Chorizmátsyntáza; šikimátkináza; 3dehydrochinátsyntáza; putatívna cytoplazmatická peptidáza

dciAE; apt; rel i

cr σ> (Q

< Q. E

T O) t. CO

argC; argj; argB; argD; argF; argR; argG; argH

< £ c

O CO íc

his A I

á Φ E

CD O CO

X ω x:

LU (0 jz

< o CO

O c CO Q.

aroD; aroE

aroC; aroK; aroB; pepQ

inhA

inhA

AF038651

CO CO o <

AF045998

|AF048764 |

AF049897

|AF050109 |

|AF050166 |

AF051846

AF052652

[ÄF053071 |

[ÄF060558 |

AF086704

AF1 14233

API 16184

AF124518

AF 124600

AF 145897

AF145898

ω r^·

(Ο	•*r	CM
cn	co	CO
	O)	N
	^·	h-
o	o	O
o	o	O
“J		“0
<	<	<

't ľ»

rbω O UJ m b-

Tabuľka 2 (pokračovanie)

CO N S E	C x	CO
> ω	•co	3o
<0	§	ä o
<0 S	Pyi	Iso

(N r-

Tabuľka 2 (pokračovanie)	O'Regan, M. et al. Cloning and nucleotide sequence of the Phosphoenolpyruvate carboxylase-coding gene of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Gene, 77(2):237-25 1 (1989)	Roller, C. et al. Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23 S rRNA genes,“ J. Gen. Microbioi, 138:1167-1175(1992)	Roller, C. et al. Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23S rRNA genes, J. Gen. Microbioi., 1 38: 1 1 67- 1 1 75 (1 992)	Rossol, I. et al. The Corynebacterium glutamicum aecD gene encodes a C-S lyase with alpha, beta-elimination activity that degrades aminoethylcysteine, J. Bacterial, 1 74(9):2968-2977 (1992); Tauch, A. et al. Isoleucine uptake in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is directed by the brnQ gene product,“ Árch. Microbioi, 169(4):303-312(1998)	Herry, D. M. et al. Cloning of the trp gene cluster from a tryptophanhyperproducing strain of Corynebacterium glutamicum: identification of a mutation in the trp leader sequence, Appl. Environ. Microbioi, 59(3):79 1-799 (1993)	O'Gara, J.P. and Dunican, L.K. (1994) Complete nucleotide sequence of the Corynebacterium glutamicum ATCC 21850 tpD gene. Thesis, Microbiology Department, Universŕty College Galway, Ireland.	Schafer, A. et al. “Cloning and characterization of a DNA región encoding a stress-sensitive restriction systém from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and analysis of rts role in intergenerlc conjugation with Escherichia coli, J. Bacterial, 1 76(23):7309-73 1 9 (1994); Schafer, A. et al. The Corynebacterium glutamicum cglIM gene encoding a 5-cytosine in an McrBCdeficient Escherichia coli strain, Gene, 203(2):95-101 (1997)		Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacterium glutamicumproline biosynthetic pathway: A natural bypass of the proA step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)	Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacterium glutamicumproline biosynthetic pathway: A natural bypass of the proA step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)	Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacterium glutamicumproline biosynthetic pathway: A natural bypass of the pro A step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)
Fosfoenolpyruvátkarboxyláza	Gén 23S rRNA Inzerčnej sekvencie	Gén 23S rRNA inzerčnej sekvencie	Beta C-S lyáza; transportný prenášač rozvetveného aminokyselinového reťazca; hypotetický proteín yhbw	Vedúci gén (promótor)	Antranilátfosforibozyltransferáza	Putatívny typ II 5-cytozínmetyltransferázy; putatívny typ II reštrikčnej endonukleázyclease; putatívny typ I alebo typ III reštrikčnej endonukleázy			L-prolín: NADP+ 5-oxidoreduktáza	?;gama- glutamylkináza; podobná Dizomérnym špecifickým 2-hydroxyacid dehydrogenázam
			aecD; brnQ; yhbw	Q. 4-«	trpD	cglIM; cglIR; clgUR	< o Φ	ppx	proC	obg; proB; unkdh
M258I9	M85106	M85107, M85108	M89931	S59299	UI1545	U 13922	U 14965	4 CM CM T“ CO Z3	U31225	U31230

CO

CO	CO	o
o>	CN
cn	CN	b
CO
m	ΙΟ	iO
x	x	x

Ο)

C 'Φ **

O a.

TJ Φ ♦-» Φ

Φ

’o.

O)

CL

CL (0

CT

CQ CL CO o

CN Q.

’5)

ο CO

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Patek, M. et al. Leucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme activities, structure of leuA, and effect of leuA inactivation on lysine synthesis,/tyy?/. Environ. Microbioi, 60(1): 133-140 (1994)

Eikmanns, B.J. et al. Cloning sequence analysis, expression, and inactivation of the Corynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitrate dehydrogenase and biochemical characterization of the enzýme, J. Bacterial., 177(3):774-782(1995)

Heery, D.M. et al. A sequence from a tryptophan-hyperproducing strain of Corynebacterium giutamicum encoding resistance to S-methyltryptophan,” Biochem. Biophys. Res. Commun., 20 1(3): 1255-1262 (1994)

Fitzpatrick, R. et al. Construction and characterization of recA mutant strains of Corynebacterium glutamicum and Brevibacterium lactofermentum, Appl. Microbioi Biotechnoi, 42(4):575-580 (1994)

Reinscheid, D.J. et al. Characterization of the isocitrate lyase gene from Corynebacterium glutamicum and biochemical analysis of the enzýme, J. Bacterioi, 176(12):3474-3483 (1994)

Ludwig, W. et al. Phylogenetic relationships of bacteria based on comparative sequence analysis of elongation factor Tu and ATP-synthase beta-subunit genes, Antónie Van Leeuwenhoek, 64:285-305 (1 993)

Ludwig, W. et al. Phylogenetic relationships of bacteria based on comparative sequence analysis of elongation factor Tu and ATP-synthase beta-subunit genes, Antónie Van Leeuwenhoek, 64:285-305 (1993)

Billman-Jacobe, H. Nucleotide sequence of a recA gene from Corynebacterium glutamicum,“ DNA Seq., 4(6):403-404 (1994)

Reinscheid, D.J. et al. Malate synthase from Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase: sequence analysis, Microbiology, 1 40:3099-3 1 08 (1 994)

Rainey, F.A. etal. Phylogenetic analysis of the genera Rhodococcus and Norcardia and evidence for the evolutionary origin of the genus Norcardia from within the radiation of Rhodococcus species, Microbioi., 141:523-528 (1995)

Kronemeyer, W. et al. Structure of the gluABCD cluster encoding the glutamate uptake systém of Corynebacterium glutamicum, J. Bacterioi., 177(5):1 152-1 158(1995)

Wehrmann, A. et al. Analysis of different DNA fragments of Corynebacterium glutamicum complementing dapE of Escherichia coli, Microbiology, 40:3349-56 (1994)

Izopropylmalátsyntáza

Izocitrátdehydrogenáza (NADP+)

Glutamátdehydrogenáza (NADP+)

5-metyftryptofánová rezistencia

Čiastková izocitrátlyáza ?

ATP-ázová-beta-podjednotka

Elongačný faktor Tu

Malátsyntáza

16S ribozómová RNA

Glutamátový transportný systém

Sukcinyldiaminopimelátdesukcinyláza

leuA

icd

< x a 0

mtrA

recA

ace A; thiX

**- **

recA

aceB

< z O ώ <o

gluA; gluB; gluC; gluD

dapE i

X70959

Χ71489

|X72855 |

Χ75083, X70584

X75085

X75504

X76875

X77034

X77384

X78491

X80629

X81191

X81379 I

CO

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Ruimy, R. et al. Phylogeny of the genus Corynebacterium deduced from analyses of small-subunit ribosomal DNA sequences, Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):740-746(1995)

Serebrijski, I. et al. Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants,“ J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Serebrijski, I. et al. Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants,” J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Pascual, C. et al. Phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium based on 16S rRNA gene sequences, Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):724-728 (1995)

Wehrmann et al. Functional analysis of sequences adjacent to dapE of C. glutamicum proline reveals the presence of aroP, which encodes the aromatic amino acid transportér, J. Bacterial., 177(20):599 1-5993 (1995)

Sakanyan, V. et al. “Genes and enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme evolution in the early steps of the arginine pathway, Microbiology, 142:99-108 (1996)

Reinscheid, D.J. et al. “Cloning, sequence analysis, expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase, Microbiology, 145:503-513 (1999)

Le Marrec, C. et al. Genetic characterization of site-specific integration functions of phi AAU2 infectlng Arthrobacter aureus C70, J. Bacterial., 178(7): 1996-2004 (1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

16S ribozómová RNA

Aspartátsemialdehyddehydrogenáza; ?

Gama-glutamylfosfátreduktáza

16S ribozómová RNA

Permeáza aromatickej aminokyseliny, ?

Acetylglutamátkináza; N-acetyl-gamaglutamylfosfátreduktáza; acetyl: ornitín-aminotransferáza; ornitín : karbamoyl-transferáza; glutamát-Nacetyl-transferáza

Fosfátacetyltransferáza; acetátkináza

Miesto pripojenia

Promótorový fragment Fl

Promótorový fragment F2

Promótorový fragment F10

Promótorovýr fragment F13

< z Q b. ω CD t·

asd; lysC

proA

< z Q CO CD

aroP; dapE

argB; argC; argD; argF; argJ

p ta; ack A

attB

X8206I

X82928

X82929

X84257

X85965

X86157

X89084

O ID CO O) CO x

X90356

X90357

X90358

X90359

OJ CO

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Patek, M. et al. Promoters trom Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif/1 Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,” Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from C. glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142: 1297-1309 (1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Siewe, R.M. et al. Functional and genetic characterization of the (methyl) ammonium uptake carrier of Corynebacterium glutamicum, J. Biol. Chem., 271 (10):5398-5403(1996)

Peter, H. et al. “Isolation, characterization, and expression of the Corynebacterium glutamicum betP gene, encoding the transport systém for the compatlble solute glycine betaine, J. Bacteriol., 178(17):5229-5234 (1996)

Patek, M. et al. Identification and transcriptional analysis of the dapB-ORF2dapA-ORF4 operon of Corynebacterium glutamicum, encoding two enzymes involved in L-lysine synthesis, Biotechnol. Lett., 19:1 1 13-1 1 17 (1997)

Vrljic, M. et al. A new type of transportér with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum, Mol. Microbiol., 22(5):8 1 5-826 (1 996)

Promótorový fragment F22

Promótorový fragment F34

Promótorový fragment F37

Promótorový fragment F45

Promótorový fragment F64

Promótorový fragment F75

Promótorový fragment PF101

Promótorový fragment PF 104

Promótorový fragment PF 109

Amónium-transportný systém

Glycín-betaínový transportný systém

Proteín pre export lyzínu; Regulačný proteín pre export lyzínu

amt

betP

o

lysE; lysG

X90360

X9036I

Χ90362

X90363

X90364

X90365

X90366

X90367

X90368

X93513

X935I4

X95649

X96471

CO CO

o	CM	CD
CO	CD	CO
in	CD	CM
<0	CD	G)
CD	CD	CD
x	x	x

^J· CO

Tabuľka 3 Kmene Corynebacterium a Brevibacterium, ktoré sa môžu uplatniť pri využití tohto vynálezu v praxi

	IÄíOfKBW			NRRĽ	CECT.	ncimb	'CBS	NCTC	DSMŽ
Brevibacterium	ammoniagenes	21054
Brevibacterium	ammoniagenes	19350
Brevibacterium	ammoniagenes	19351
Brevibacterium	ammoniagenes	19352
Brevibacterium	ammoniagenes	19353
Brevibacterium	ammoniagenes	19354
Brevibacterium	ammoniagenes	19355
Brevibacterium	ammoniagenes	19356
Brevibacterium	ammoniagenes	21055
Brevibacterium	ammoniagenes	21077
Brevibacterium	ammoniagenes	21553
Brevibacterium	ammoniagenes	21580
Brevibacterium	ammoniagenes	39101
Brevibacterium	butanicum	21196
Brevibacterium	divaricatum	21792	P928
Brevibacterium	flavum	21474
Brevibacterium	flavum	21129
Brevibacterium	flavum	21518
Brevibacterium	flavum			BI1474
Brevibacterium	flavum			BI1472
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum	21128
Brevibacterium	flavum	21427
Brevibacterium	flavum	21475
Brevibacterium	flavum	21517
Brevibacterium	flavum	21528
Brevibacterium	flavum	21529
Brevibacterium	flavum			B11477
Brevibacterium	flavum			BI1478
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum			BI1474
Brevibacterium	healii	15527
Brevibacterium	ketoglutamicum	21004
Brevibacterium	ketoglutamicum	21089
Brevibacterium	ketosoreductum	21914
Brevibacterium	lactofermentum				70
Brevibacterium	lactofermentum				74
Brevibacterium	lactofermentum				77
Brevibacterium	lactofermentum	21798
Brevibacterium	lactofermentum	21799
Brevibacterium	lactofermentum	21800
Brevibacterium	lactofermentum	21801
Brevibacterium	lactofermentum			B11470

				ŇRRL	CECT	nqmb:
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	21420
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	31269
Brevibacterium	linens	9174
Brevibacterium	linens	19391
Brevibacterium	linens	8377
Brevibacterium	paraffinolyticum					11160
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.	14604
Brevibacterium	spec.	21860
Brevibacterium	spec.	21864
Brevibacterium	spec.	21865
Brevibacterium	spec.	21866
Brevibacterium	spec.	19240
Corynebacterium	acetoacidophilum	21476
Corynebacterium	acetoacidophilum	13870
Corynebacterium	acetoglutamicum			BI1473
Corynebacterium	acetoglutamicum			BI1475
Corynebacterium	acetoglutamicum	15806
Corynebacterium	acetoglutamicum	21491
Corynebacterium	acetoglutamicum	31270
Corynebacterium	acetophilum			B3671
Corynebacterium	ammoniagenes	6872						2399
Corynebacterium	ammoniagenes	15511
Corynebacterium	fujiokense	21496
Corynebacterium	glutamicum	14067
Corynebacterium	glutamicum	39137
Corynebacterium	glutamicum	21254
Corynebacterium	glutamicum	21255
Corynebacterium	glutamicum	31830
Corynebacterium	glutamicum	13032
Corynebacterium	glutamicum	14305
Corynebacterium	glutamicum	15455
Corynebacterium	glutamicum	13058
Corynebacterium	glutamicum	13059
Corynebacterium	glutamicum	13060
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum	21513
Corynebacterium	glutamicum	21526
Corynebacterium	glutamicum	21543
Corynebacterium	glutamicum	13287
Corynebacterium	glutamicum	21851
Corynebacterium	glutamicum	21253
Corynebacterium	glutamicum	21514
Corynebacterium	glutamicum	21516
Corynebacterium	glutamicum	21299

		WCO	äerm	ňrrľ		ncimb	í-cbši	Νέι?	psi®
Corynebacterium	glutamicum	21300
Corynebacterium	glutamicum	39684
Corynebacterium	glutamicum	21488
Corynebacterium	glutamicum	21649
Corynebacterium	glutamicum	21650
Corynebacterium	glutamicum	19223
Corynebacterium	glutamicum	13869
Corynebacterium	glutamicum	21157
Corynebacterium	glutamicum	21158
Corynebacterium	glutamicum	21159
Corynebacterium	glutamicum	21355
Corynebacterium	glutamicum	31808
Corynebacterium	glutamicum	21674
Corynebacterium	glutamicum	21562
Corynebacterium	glutamicum	21563
Corynebacterium	glutamicum	21564
Corynebacterium	glutamicum	21565
Corynebacterium	glutamicum	21566
Corynebacterium	glutamicum	21567
Corynebacterium	glutamicum	21568
Corynebacterium	glutamicum	21569
Corynebacterium	glutamicum	21570
Corynebacterium	glutamicum	21571
Corynebacterium	glutamicum	21572
Corynebacterium	glutamicum	21573
Corynebacterium	glutamicum	21579
Corynebacterium	glutamicum	19049
Corynebacterium	glutamicum	19050
Corynebacterium	glutamicum	19051
Corynebacterium	glutamicum	19052
Corynebacterium	glutamicum	19053
Corynebacterium	glutamicum	19054
Corynebacterium	glutamicum	19055
Corynebacterium	glutamicum	19056
Corynebacterium	glutamicum	19057
Corynebacterium	glutamicum	19058
Corynebacterium	glutamicum	19059
Corynebacterium	glutamicum	19060
Corynebacterium	glutamicum	19185
Corynebacterium	glutamicum	13286
Corynebacterium	glutamicum	21515
Corynebacterium	glutamicum	21527
Corynebacterium	glutamicum	21544
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum			B8183
Corynebacterium	glutamicum			B8182
Corynebacterium	glutamicum			B12416
Corynebacterium	glutamicum			B12417

		Í'ÄTCC|·	FEŔM	NRRL CECT	NCIMB	CBS
Corynebacterium	glutamicum			B12418
Corynebacterium	glutamicum			BI1476
Corynebacterium	glutamicum	21608
Corynebacterium	lilium		P973
Corynebacterium	nitrilophilus	21419				11594
Corynebacterium	spec.		P4445
Corynebacterium	spec.		P4446
Corynebacterium	spec.	31088
Corynebacterium	spec.	31089
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	15954							20145
Corynebacterium	spec.	21857
Corynebacterium	spec.	21862
Corynebacterium	spec.	21863

ATCC: Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, USA

FERM: Fermentation Research Inštitúte, Chiba, Japan

NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA

CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain

NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK

CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL

NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany

Na porovnanie pozri Sugawara, H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of microorganisms: Bacteria, fungi and yeasts (4* edn), World federation for culture collections world data center on microorganisms Saimata, Japan

> o x.	ŽI
		L· to
	Φ	n
	ω	c φ
	i	G
		5
	_φ	E
	E	CO
	Φ TJ	c N OJ
	Φ	N
	L. O	O £
	N	Φ
CA		C
00	re	> £ <0
	č	>
	3 J3	o N
	(Q	Z
	H

VÝVOJI ***, v neusporiadaných úsekoch.

w Q Ώ O	z VJ O o < 3 m o	C o o	C o O)
u. Φ J3	CO <5 e ja	ω <	CO <
3	B	LL m	LL W
E	” 1 ** 3	c Φ	c 0)
’u· Φ O	W *}e ω 2 o. u	D) CO ’c	O) (0 c
CO	O S	O	o
£)	Ό Λ	E	E
O o	8 °	E	E
>	s >>	(0	co
s	< S	CD	CD

a	tn	1D	T—
		CD	CD
09		CO	CO	m	8
φ		O)	0)	CD
u		O	O	o
Jí		o	O	o	o
<		O	O	O	in
		<	<	<	Q
CO			T—	CO	Τ-
je		CO	CO	0)	Ο)
>Ν		o	o	CD	T“
		o	o		<0
□		V“	Y—	b-
		CN	CN	CN
		LO	in
E		CD	co
CO		CO	CO	in
E N N	3	S	CD o	O) o	co m M* o
E CO	o o	o O	o O
>	g	<	<	<	tn
C	E Al	čo	có		a
>	W o	O	0	0	t—
g	1—	1—	♦-	<
<		I I	X	X	CO i
		1 CD	1 m	1 m	CD
		0	(D	0	0
CO
je >N		£5			CO
Q	'—J	in			b-
					CD
		v-
*1		in o			0) O
Q		o			o
		o			o
		co			CO
		£			č

00	Q	CO	CO
			0)	CD
00	CO	CO			00
CD	o	00			00
o	o	b-	Τ-		CO
		o	Ο	O	m
Zj	r-		Q	O	CD
<	D	<	<	<	N
			co	CO
m	CO	CO		*φ	co
m·	m	CD	CO	CO	00
N	00	CO	CN	CN	in
o	co	m			r-
	CO	M-	S	cô	co
			°|	°|
			OO	OO
	CO		CD	CD
	0)		τφ	Tf	o
	>			V	b-
	>	in			CN
	2)	co	O	O	X
in	O	T	O	O	O
O	O	O	<	<	k-
ω	Ul	CO	có	cÓ
	r—		0	0
<	<	<	1—	1-	<
cn 1	tn 1	CD I	I	I	CD
1 m	1 cn	CD	1 tn	1 tn	1 CD
0	0	0	0	0	0
		CD			CD
		CO			b-
		b-			00
		CN
		CD			O
		O
		O			o
		O			o
		CO			CO
		s			s

CD	CO
O				O
*Φ CD	CN	in	CO	00
> 00	CN	CD	CO	CD
X CO	oo	b-	00	O
p in	Γ-		CO	Y“
LL CD	ΟΟ	CO	CD	_!
< N	X	x	N	<
T- co	o	CD	00	O CO
m oo	CN	X		CO
cn m	in	00	CD
00 K	o	o	CO
co co		T-	CO
				CD
	Z			O
o b-	LLI 0	š	CD m	CO m
CN s> Bo	co <	CD <	X	^5
u_	LL	O	CD
	<	<	H	X
s	m	S	CN
ši<				0
<	<	<	H
o. tn i 1	tn I	m 1	tn I	X I
1 1 tn tn	1 m	1 m	m	1 tn
0 0	0	0	0	0
	in			CM
	’Φ			Y“
	b-			ω
	ΙΟ
	CO
				CO
	o			o
	o			o
	CO			CO
	s			č

c

0)

0)

N

00

b*

CO 03

03

co

0)

00

03

CD

03

00 00

0)

03

03

0)

o

0) 0)

0)

q

03

q

q

q

0)

0) 03

CM

CM

03

ro

O)

ŕ oi

OJ

CD

fx

cd cd

v.

O

o

o

r- Υ-

y—

γ-

O

T—

y—

o

Q

o o

CO

CO

cd

oi

oo

ΙΟ cd

cd

τ-

cd

cd

CD

CD CO

O

O

o

OJ

o

o o

o

ο

o

o

OI

o

o

o o

o

xt

o

fx

ro σ>

03

rx

o

m

o

CO

03

O CD

T“

CO

o

ro

T- OI

OI

0)

OI

ro

OI

CD

00

O Χ-

rx

co

o

CO

Xt

CO

OJ

T“

CD

ID

00

ΙΟ 00

LO

ro“

o

CO

rx’

fx’ co’

CO

N

4

03

4

co’

co’

n oo’

CO

CO

CO

CO

CO CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO CO

CM οο

£	ώ -g
u
o	D- O
Jť	oc
Φ	‘z Φ
ω	c (0
*□	o *□
£	r:
o	o °
'>	CM K>
c	™ c
CO	E «
Ό	£ *2
.s	N «
’C	o *-
o	c o t O*
Q.
CO	O v)
2	r= □
Φ	o ω
c	M c
>	c >

ο ο

CD				2 w	CM	CM
O				St CO	CO	00
00 03	2	Xt	2	2 10 S co	ID CO	o
O		£		2 n	CO	CO
T“	0)	OI	0)	Ό O	o	Τ-
U	o	CO	O	Q -i	—1	Ο
<		ZD	>	< <	<	<

ο

ro	M·
OI		o
co		0)
o		CM
ro		CM
o	03	t—
	00	>
<	X	<

CO

co

T—

03

Τ-

CD CO

CO

CO

t

ω

co

tJ)

CO

Ο!

CD CO

CO

CD

ο

CD

03

CM

CM

ro ro

O

r.

CO CO

CO

o

Ο

CO

N

xt

T—

co

CO

Y— T~

ro

ιη

CM

CM

ro ro

o Q

o> O

Tt

CM 00

Η

CM ω

CD

xt O

CM CM

co ro T— “5 ω

2 -s ω

□. H ΖΏ O.

xt 00 CM

Q. H D CL

CO T- — £ 2 * J O r·*· o ω

iň xt fx co

o Xt 00 o <

C0 ο ο ω ζ

ο s σ <

Z xt CM OO “5

< O UJ ω

0) CM CM ξ

o o CD CD CO 00 xt

x

x

0

CO

0

QX

x

0

f«

CO

Q

ôi

ái

O

Z>

O

<ôi

ôi

θ

^-·

γ—

x

CC

4 co

ro ro t— y—

0

0

ôi

co 0

0

co

ω

ω

cd

h—

H· H

H

H

<

<

<

CC H

1—

ω

ω

ω

X

<

cn

cn cn

X,

X I

m I

CD 1

m I

XX

x,

°ι

°ι

°ι

x

m I

UJ I

UJ UJ I I

1 CQ

1 m

m

1 m

1 0

1 1 m m

CO

m

m

m

1 m

m

CD

1 1 m m

0

0

O

O

0

O Φ

0

O

0

0

0

0

0

0 0

ro
03	o	xt	CM	xt
CD	rx	rx	03
	co	M*	CM	rx
Y“	(D	rx	Τ-	00
00	00	co	Ο	CM
Y“			CM	CM
o	o	o	O	O
o	o	o	O	o
(0	CO	(0	CO	CO
č	č	č	£	c

ω σ>

03

ω

Ο)

00

0)

03

α σ>

Φ

0)

00

00

σ>

00

03

Φ

0) Φ

0)

α

03

φ

σ>

0)

ο σ>

Φ

0)

q

q

q

q

q

0)

σί ό

ό

d

03

có

ο

ό

F C0

d

ó

F

F

F

F

F

03

Ο γ-

7—

ο

q

ο

7—

Τ-

q q

q

τη

t—

q

o

o

O

Ο) Φ

φ

Φ

φ

ιη

σ>

Ο)

F γ-

F

F

ó

ó

F

00

F

F

CN ο

ο

ο

ο

ο

CN

CN

T“

T“

CN

CN

03

CN

CN

CN

y- O

O

Φ

Φ

O

00

OO

CN 00

0)

00

O

O

CN

O F

F

K

r^

Φ

in

in

CN CN

CO

in

O

o

in

O O

O

N

CN

q

co

Φ CO

O

Φ

o

ID

N CO

co’

φ

φ’

CD

N

F Φ*

03

oo

O

o

φ

03 03

03

03

03

03

co

03

F 03

CO

03

T“

F

UJ	Q. CO
z	(0
š	a
O z	<0 tr
UJ	<n 2
í	co
UJ ω	O ω
*	o
í	c
	(D
CO*	m
α Q. <0 E	<o*.« c 2 « |
o>
	Q. φ

	10	U3			03						T“
00	Φ	Φ	O o		CN				O	O	h·
00	1X3	in	in o	Φ		cn	m		LO	O
Φ	03	03	O b-	▼-	N			CN	00	00	CO
T—		Y“	CN F	CN	00	r-	£	CO	o	F	CN
F	CN	CN	03 CN	03	r	CM	CM	F	CN	CN
s	F	F			CN			Φ
o	h-	h*	00	CN	CN			O			F
tr x o	0) Φ O O	03 03 O O	g C oo	03 03 LO	t· Y— o	Q. Ι- Ο	Οι— O	O F CO CN	03 UJ	Y— G	Y“ CN O N
o	O	o	o UJ	23	o	UJ	Ul	<	CN	03	Z)
tn	<	<	m o	O	<	0	0		O	O	O
>	F	F	< w	ω	F	q	q	F CN	ω	ω	UJ
ČM	0	0	Ť— r—	F	0			F	F	F
—J	F	F	< <	<	F	<	<	ω	<	<	<
Q. t	T t	T,	m tn t 1	m t	I	CO t	tn I	UJ t	cú	m	CO
1 m	tn	1 m	1 1 m m	tn	1 tn	1 tn	1 tn	tn	co1	1 CO	1 CO
(D	0	(D	O 0	0	0	0	0	0	0	0	0

o	m	00
F	CN	CN	Φ	Φ	03
v—	03	T“	C0	0>	T“
T“	CN	03	r*-		CO
03	0)	03		oo	Φ
F	Φ	Φ	oo	Φ	F
CN	CN	CN	CN	CN	03
O	O	O	O	O	O
O	O	O	o	O	O
CQ	(0	(0	CO	CQ	CO
£	S	e		S	č

(N σ\

σ>

b-

co

CD

o

co

O

b*

o

O)

CD

b*

O ▼“ CO

ο

N

O)

o

co

Q)

S

0)

CXJ

0)

O

7— 4* CO

xt

q

q

CO

q

b-

χζ

q

N^

o

CD

q

q

ó*

co“

7“

in

Ν'

LO

CO

in

CD

b-’

b<“

OJ

oj“ in a>

CO

Ν'

co

in

N-

Ν'

*M·

Ν'

in

€0

co

Ν' CO CO

CXJ	CO Ν'	O T“	O	Γ-	CM	10	OJ	Y“	b-	co m co
m	CO t-	7“ O	CO	ΟΟ	CO	CO	CD		co	t- CM b-
CO	CO CO	t- in		CO	O)	4		Ν'		CM Ν' CO
0)	t CO x 2 Ogj O <0	CM Ν' CD *”	cô o	O		“3 0. S σ	5	in Ναι	CD CO O	CO γ· to co
10 m co o	V CM §5 °σ	in o o Q	O O —1 Q_	5) iD b-	o o o	CO CO N* Z)	co m <	o Y— O O	O < m o in co CD co < D o 5
u.	UJ o	£L <	<	it	CD	CL	0	co CM	<	ωδί
<	< 4	> ώ	ČM	D	1—	5	χί-
ôj	y— J—	r ω	0		ČM		čm	H	Ο	7- f“ H
<	< ω	< ω	1—	<	<	<	<	ω	h-	< _ι ω
m	cd ω t 1	mo	X I	CD	CD I	CO I	CD	UJ t		CD Q. 111 1 1 1
1 CD	co m	CQ CD	1 CD	CD1	CO	1 CO	1 CD	CD	CD	1 1 1 CD CD CO
O	o o	0 0	0	0	0	0	0	0	0	0 0 0

cn

©

CO CD

cn

G)

b

CD ©

©

cn cn

©

G)

00

0)

G)

G) N CO O

cn

©

© ©

G)

G)

cn

q q

cn

σ> cn

©

©

G>

cn

©

© © © ©

cd

00

d

00

in

CN

τ- N

00

oo CD

Y—

CN

có

Ó

N τ S C\i

q

O

q q

q

q

Y“

o o

o

o o

t-

t—

o

τ-

o^-oo

CN

CN

b ©

có

V-’

G)

n- b

có

có có

©

có

yJ

CD

Ο

© © t- b

o

O

CN CN

o

T—

O

CN CN

o

o o

CN

CN

o

t-

CN

t- CN O O

CN

CN

CD b

CD

T“

Y-

CN b

G)

G) b

00

00

CN

Ν’

Ν’

©

©

b O

O

©

©

CO T-

©

© G)

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CD Ν’

Ν’

0)

b

T- Ν-

b

b b

τγ

Y~

b.

CN

©

CÓ

CO

O b-’

cd

©

•Y^

αό' ©

co

CO ©

CO

CO

©

O

©

CO

CO

N* Ν'

CO

CO

Ν’

CO co

co

CO CO

CO

CO

CO

N*

©

co Ä “ 0	CO S ľ= 0	Q.
x: cn	•c S?	0
Cl o	Q. 0	0
O G	o c
CO 0	0 0	2
S ©	S ®	0
O E	a E	X

CO	CO	CO CO	CO	(0 (0	CO	CO
C	c	c c	c	c c	c	c
Φ	Φ	φ Φ	Φ	Φ <0	Φ	Φ
q.	Q	’o. q.	o.	CL Q-	‘cl	a
0	0	CQ (Q	©	0 0	CB	0
(0	CO	CO CO	CO	CO 0	CO	CO
O	o	O O	o	o o	o	o
E	E	E E	E	E E	E	E
o	o	o o	o	o o	o	o
I	Z	x x	x	X I	x	X

co	.52
S	5
3	3
(0	CO
CO	€0
Ώ
’ô	ΰ
CQ	CQ

©	©	©	b
G)	©	©	©
		b Q)	©
S	©	CO (0	©
o	O	© Sí	©
o	O	CN g	b
o	O	S 3	O
<	<		<
o © o Ν’	o © o Ν’	b ©	CD
CN	CN	K b	©
		T- Ν’	©
©	©	b ©	b
©	G)	CN *0	©
		n O	©
CO	co	& CO	©
o	o	=5 O	©
o	o	Z O	b
O	O	d cc	O
<	<	t	<
Čj	ČM		©
0	0	s w	CD
l·-	t-	O ω	CD
I	X	CC0	°|
CD1	CQ1	BO BO	CD
0	0	0 0	0

©		©	© ©
©	b*	o	o o
N-	b. 52	b	b b
O	© SP	©	© ©
	© fc	o	o o
©	© 52	o	o o
<	o S2	o	oo
<	X <	<	<<
		CN	CN CN
	©	©	© co
b	T- G)	σ>	O 03
O	O b	©	© CO
Ν’	t- ©	©	© ©
G) ©	b	©	© ©
		o	o o
q	Tí CO	b	b b
	0 b	©	© ©
©	© co	o	o o
<r	CO ©	o	o o
	x 5	o	o o
**.	CD 5	<	< <
b	T o ΤΊ ©	©	© čô
h“	Z fr“	0	00
to	X CD	H	H H
Ul I	X UJ 1 1	X I
BO	1 1 tn m	1 m	CD tí)
0	00	0	00

y-		O	©	©	b	©
Ν’	Ν’	©	Ν’	b		©
©	©	©	©	©	©	T- CN	©
©	©	©	©	CM	CM	t- CM	CN
©	©	O	O	©	©	y— T-	b
O	O	o		O	T“	© o	O
_l	-J	O	Ľ	U_	Ό	© x	©
<	<	<	<	<	<	N <	O
		N1				O
©	©		©			© Ν’	©
	T	N*	N-	Ν’	CN	CN ©	©
b	b	©	b	©	©	© ©	b
N-	N*	©	O	Ν’	y—	O ©	©
a	©	T—	Ν’	W	©	CN Ν’

to rm to T	© b © 3 CD X	o © © © o o	Y“ © o	© b © CN © O LL	sgg r- “ t- k Q. ZJ o o to to ľl cn
		Q	to	<	m m	< Q
0	0	<1		éu	v-	äi
1—	1—	Ô	<	<	< <	< <
x,	x,	x I	BO t	© I	cn m 1 1	CD BO 1 i 1
BO	©	1 ©	©	1 m	1 . 1 i 1 co bo tn m
0	0	0	0	0	0 0 0 0

Ν’	o	b	©
o	o	©	N	©	©	©
b	©	b	©	CN	©	T-
Y“			©	*“	N-	©
©	©	b	©	O	N-	©
N-	©	b	b	©	CN	CN
Ν’	N	Ν’	N*	N-	©	©
O	O	O	O	O	O	O
O	O	O	O	O	O	O
CO	m	(Q	(0	CQ	CO	CO
č	č	S	č	2	C	č

Tt σ\

CO	0	b* 0	0	b*	CO	0 0 0	0	CO 0 0	0	CO CO 0 0	0
0	0	0 0	σ>	0	0	0 q q	q	0 0 0	0	0 0 0 0	0
		CM CO	có	CM	CD	ób	T-	CD 0	CM	0 0 CM CD	CD
o	O	i- O	q		O	*- o ί-	Τ-	O O O	O	OOOO	O
	CM	iri có	v·!		l<	ο ó ó	Ο	0 CM 0		CM CM CD CÓ	CÓ
Q	O	i- CM		CM		o co co	CO	i-OO	O	O O O CM	CM

	« u>	CO
	l.s	□ D
Q. <0	Š5» s m	O CO □
<0	<0 o	E
«J c	O E	<0
(0	E o	□
CC	< X	5

’co	Q.	Q.	’o.	α	m 0 JS (H	Q.	Q.	Q. Q.
o	C0	CO	CQ	Φ	o 0	CO	CO	CO co
□	CO	CO	(0	ω	CQ t	(0	CO	CO €0
ω	O	O	o	o	0 O o r-	o	o	O O
Φ	E	E	E	E	O Q)	E	E	E E
0	o	o	o	o	>» (0	o	o	o o

	0 0 CM 0 CO CO	CM 0
0	b* 0 0	0	0	CM
0	LO 0 O	O		O
b-	O O ΙΟ O O	O	0 0	Φ 0
b.	oo o	O	r^.	F5
N	<< <	<
	0	0
0	Ý I- b	b-	o	0
	CM CM	CM		0
CO	CM 0 O	0	O	O
CO	0^0	O	b*	O
CO	0 CO CM	CM	0	0

CM	0	O) O)	0	0
O	0	m m	0	0
0	CM	<g <2 *		t—
0	Ό-	S 2	ys	▼“
0	O	o o	CM	CM
		o o m	o	O
LL	LL	O O co	-J	—1
<	<	< < Q ££	<	<
0	0	0 0 b-	O	o
O	0	0 0 Tf	O	O
0	§	CM CM O
M-	i- i- CM	0	0

o

	0	y—
CM 0 0	s s gg O O	Ό* b- O 0
0	o <	<
X	LUčsi	0
•íŕ	Ύ-	CM
H	Ój M	H
CD	<	CD
UJ I	“l°l	ωι
1 CD	mm	m
0	0 0	0

LO

LO

O O

CQ

CM

LO

CD

O N LO O

O CO

O	0	0
0	0	b-	0
CM	CM		b-	o
	τ-		0	0
	Ο		0	b-
b-	0	0	0	o
0	0	0	0	0
O	O	O	o	o
O	O	O	O	o
CO	(0	CO	CO	CO
č	č	c	č	č

CO

co r*

0)

G)

03

03

03

00

0) 03 03

03

CO

b* CO

O)

O) O)

q

03

03

q

q

03

03 03 03

0)

03

03

03 03

CD

CÓ CM*

Ó

Ó

xŕ

Xt

CÓ

CM CM 0)

to

O

CD

03 CD

O

O

r·

o

o

o

O O O

O

T-

O

O O

b*

CÓ CM

to

03

03

có

có

N

N N N

Ó

to

N

03 N

T~

O x-

x—

X“

CM

CM

x—

O O CM

CO

T-

T“

O x-

CM

CM CM

γ—

Xt

xt

LD

in

03

ď) 03 CO

xt

Y—

o

CO CM

to

03 03

xt

CO

CO

CD

CD

CO 03 to

X“

CO

in

03 xt

q

03 q

CO

03

0)

CM

°í

CO

q q r-_

O

r*

co

Q ®

o

x—

in

K

N

CO

có

co“

cm’ 03* b·’

co’

cm’

03’

03’ CD’

CD

in in

ω

CO

CO

Xf

xŕ

CO

LD CO CO

CO

to

CO CO

to

CM

CM

xt xt

Y—

oo

o b-

co

o

O

o

03 03

o

to

xt to

x- to

CO

to

in

CO

00 00

r*

CM

O CM

03

O O

CD

o

o

to

in

o

O O x-

O

O

O O

CD

xt O

CO

r*

b*

xt

CD

to to to

r*

00

CO

to co

CM

CO X“

T“

CM

CM

CO

x- x- CO

t—

to

Y- T“

CO

00

CD

CD

CD CO

co CO

00 CO

(D

ω CM Xt > O

£5 z5 18

CO CO 00 o o o

CO rx 03 O o O

(D r* 03 o o □

o xt to o □

o to o D

O to > O

00 03 LO O O ri CD O) y o o

m CM CD bO O

to b. CM 3

CM CM O >

03 O CM x- CM CM O 2 >

H

w uj

<

<

<

1—

03 03

Q

k

o f-

S

oc <

to

xŕ

xŕ

ô CO

ó CO

Σ

O Q Z

<

xŕ

S

<2

X“

ôj

0

0

0

H

H

x“ x— CD

xŕ

h“

μ

ΤΪ

<

< <

H

H

1—

ω

ω

<

< < ω

CC

ω

<

ó <

m I

m m I I

T,

I I

I I

ωι

LU I

CQ I

CQ CD 0 1 1 1

0-,

LU I

00 1

cc m

CD

1 1 m cq

1 CD

CQ

CO

m

CQ

m

1 1 1 CO m CD

CD

1 CO

1 CO

1 1 CD CO

0

00

0

0

0

0

0

0

000

0

0

0

0 0

o>

00

CD

CO

o

CM

CD

to

Xt

(M

o

03

0)

to

*“

τ-

CD

CM

|x

CO

Y-

Ο

CO

to

CD

Y“

CM

co

O)

CO

co

03

O

CO

CO

CO

r*

b-

Γχ

00

O

o

o

o

o

O

o

O

o

o

o

o

o

o

CO

CO

(0

co

CO

CO

CO

E

2<

s

2$

c

£

č

Ό σχ

0)

CO

b*

0)

0)

0)

0)

0)

00 co

σ> k

b- b- 00 b* 0)

0)

00

00

q

q

q

q

q

0)

q

q

G) 0)

0) 0)

0)

0)

q

0)

q

0)

0)

q

0

0

00

od

0) od

0) CN

b^

b^

ó

Ó

b^

b*

ο

o

v—

o

o

o

v—

T—

o o

O T-

o

O

O

T“

O

o

oj

CD

V“

CO

cd

cd

CD

cd

0Í CN

od

cd

cd

cd

Ó

T—

r—

σ>

0>

CN

CM

CN

o

o

o

CN

CN

v— T“

CM CM

CN

CM

CN

CO

CM

CM

o

o

0)

o

CO

o

o

b-

in

tn

co o

CO CN

v—

M*

CD

CN

CM

CD

CO

N

b-

co

co

M* O

O CO

CM

CO

CO

*r

CO

CO

CO

0)

q

CM

0)

q

in

CO C>

q q

0

CN

T“

o

b-

N

00

q

b*

Τ-Γ

co

00*

oo*

oo

co

co

o

in v-“

co

n

oo“

co“

co’

oo“

0)

0)

CO

CO

CO

CO

CO

co

co

CO ’t

co

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

«	<0	CO
C	c	c
<0	Φ	Φ
CL	CL	CL
CO	CO	cg
<0	CO	<0
o	o	o
E	E	E
o	o	o
x	x	I o >
UJ	UJ	UJ
z	z	2
<	<
>	>	>
O	o	o
z	z
UJ	tu	Ul >
x UJ	x UJ	Ž UJ CO
CO	CO

(0	«	<0
c	c	c
Φ	Φ	Φ
'o.	*Q.	’CL
CO	<0	(Q
ω	CO	(0
o	o	o
E	E	E
o	o	o
x	x	I

>	CO >
o	X o
Φ	® w
(0
o	□5°
x:	t— -c
u	X O
'>	Q ·>
c	_ c
CO
Ό	o Ό
CO	JÉ CO
’C o	« o
□.	E o-
CO 3	•o □ g Φ
Φ
C CO	E c
m	2 *n
CN	JZ CM
f	g r

o ° * C OJ í Φ c 2 £ Q.0O		ž 00	O > UJ
© '2 O <0 -CM	>	o CM 1 Ξ >	Z g
o E °	o	o 5	z
3 = Q.	Φ	Q. Φ

CO co	'i 0> (O 00	J σ> co co	CM Si	T“ m	i— m	cn m Ύ- U> O CO	m σ> b- o v- t—	0) 0) b* b- m co co r\
LO	o	o	o	CM	CM	τ m	00 b-	CN CN H
	o	o	o	CO	CO	o «o	O <f	o o
CO	o	Q	O	co	co	o o	o 5	o o P
m	<	<	<	x	x	O $	o s	O Q
čô	cd	m	m	T—		<ώ	< 2	<<o
co	0	0	0	0	0	CO h-	s h	CM CM -
co	H	H	l—	1—	f—	X ω	x ω	CC CC X
0	X,	I,	x,	X,	x,	Q.UJ	Q. UJ I 1	CL CL 1 1 1
m1	1 m	m	m	m	1 m	mm	mm	m m m
o	0	0	0	0	0	0 0	0 0	000

	0	CM
CD	0	CN	b-	CN
0	b-	O	0	CO
0)	to			b-
	b-	CN	b-
CN	CN			0
00	00	0	to	0
O	O	O	o	O
o	O	O	o	O
CO	CO	CO	CO	CO
č	2	č	č	S

G)	cn	G)	0)	CO	00 00 G) OO LD G)	0)	0)	LD	0)	G) CO CO
q	O)	G)	G)	σ>	G) G) 05 G> 0) Ô>	0)	cn	0)	o	G) G) G)
	σ>	G)	CM	id	CM ’t r-’ CM 00	CÓ	CM	N	cd	CM cd cd
r-	q	O	O	o	r q q r r 9	q	q	O	q	O O O
cd	mj-	’M’		cn	v- cd CM c\i CO CM	04	in	cd		cd 6 6
CN	CM	CM	CM	o	O O CM 1- O O	o	CM	o	CM	T- CM CM

m	00
id	CD
CD	r*
co’	co“
co	CO
	CO
	c
	CD
	D)
	Φ
	Φ
	«
φ	** T3
ts 01	ΧΪ
= CO	CO
x: σ>	£
o. o o £ m <0 2 ®	h. o c Q CD
O E	Q

CM	G)	G)	N	G)	co co
0)	G)	r^		G)	CM CD
LD	CD	▼·	4	N	CD G)
<0	CD	N	cd	id’	o co’
CO	CO	CO	CO	co	Tt CO

CN

to 2	to $2
= (D	= co
x: cn	JZ O)
Q. O	Q. O
O c	O c
CO (Q	(0 <0
2®	2®
Q E	O E

O CM CO co co id	CM CO LD
cn Τ-
Ο CM	04
H
(O O	O
í- CM	CM
1!
V °	O
m o	T“ O
9	O
V> <	<
X či	cd
ω 0	O
CC 1-	H
Q-X,
tn tn	m
0 0	0

N M* N O O

CO o

O K

O	CO			G) O>
M-	N.	CO	CO	CO O ·»-
	O	CO	T	CM Ν' r-
	CM	M-	LD	CD CM CO

CO

04	G0	LD
N h·	G) r*. CD	CO CO 00 CN CN	CO CO 04	SSo S|š Q 5 Q.
O	o
O O	o O	□ <
<	<	x		co 0 _j
CN	CN			< z o.
0	0		0	T~ V*
1-	I-	ω	ω	CC < <
r,	x,	ωι	0	n. m m
m	CD	tn	CD*	m oo m
0	0	0	0	0 0 0

	tn	CD	00	G)
CO	co	O	00	CD	00
v—	co	G)	G)	G5	CO
00		CO
CN	CD O	LD	00	O	G)
LD	LD h*	h*	K	00	O>
00	00 00	00	oo	oo	OD
O	O O	O	o	o	O
O	O O	O	o	o	O
CD	CO CO	CO	CO	CO	(0
2<	S S	č	£	č	£

Tabuľka 4 (pokračovanie)

GB_BA1:PDGINT0RF 6747 L06418 Integron In7 (z Plazmidu pDGOlOO z Escherichia coli) integráza (int), Plazmid pDGOlOO 38,966 20.03.96 aminoglykozid-adenylyltransferáza (aad), proteín rezistencie na kvartérnu amóniovú zlúčeninu, reduktáza dihydrofolátu (dhfrX), a dihydropteroát-syntáza c

MD σι

cn	CD	0 b- b· 0	CO	CO	0)	cn	CO	cn	h- 0)	CO	T“
Q	0	0) O) O) O)	0)	0)	0)	0)	0	0)	0) 0)	0)	0)
CD	0	N CM CM CD	0	0	00	CM	oo	CM	CM	0	0
o	O	O r- O	O	O	O	y·	o	T-	T“ T“	o	q
6	CM	0 Ó Ó CD	N		0	CO	LO	00	T* 0	CD
Y“	T“	O ’T- 1- T-	•f—		CM	O	CM	o	O O	1“	o

o o 0 b* CO

in	CD LO CO CM	CM	O	N	K	o	CD	CM	cn	CD
CD	CD i- 0 LO	O	T1	Y“	en	b-	CM	CM CM		O
00	oo co q in	0	Τ-	10	τ-	cn	CM	00 0)	o	CD
	co b· b y-’	N	Ο)	cm“	α	N	oo	OO* 0>	05	CO
τ-	CD CD CD CD	CD	CD	T	CD	CD	CD	CD CD Φ CO	CD	m φ
								CO
								cn		co
								0		Q.
								X)		Φ
α > ca cn	E w w j2 2 ä&s *5 'C Q- <5 JD JD (D W P 3 «0	E □ •c cn © « ϋ o S □	E 2 u (f) Ä ω S O S □	E 2 ‘E C0 ® W ϋ o S 3	0) E Φ 'o. CO <0	cn _□ w cn	cn E Φ CL C0 cn	ô .2 o Ä .5 E o E *E te	cn E Φ ’o. CQ cn	E i m
CQ £	š = = e	•Q u o υ Φ	S o o Js o ®	0 o O to φ	O E	cn 2	o E	Φ O 0 £ o Φ	O E	.n O o
C*	» p p O	>XJ	> -Q	>0	o	ro	o	cn cq	o	>
O	tLLLl	s a	22	S 2	x	0	X	UJ O	X	S

2	2	2 ±:
•E	Έ	•E 2
Φ	Φ	Φ cn
B	B
CO	<0
0	0	Ώ Φ
o	o	o E
o	o	o —
	>»	>2? S φ
s

5	2 S d	o >
UJ	E ô	LU
	N C
z	O Φ	Z
<	·* -Ž	<
>	CQ φ ’c w	>
o	o
z	® -CO	z
UJ ž	> e O E CL E CO X	UJ ž
UJ	E °	UJ
ω	c cn	ω

0 b- 00 CO o

CM Y Y to <£>

0 w

b> ’t O Φ Y“

0 N τ-

T* T“ 0 0 o

0 0

0 σ>

CO 0 CM

CO cn en o

Ch 0 O CM 0

CO s o

0 CD O

b* K 0 0 b-

CO CM b· 0 0

0 o

CO O

σ

0 0

3

ο

ΤΟ

b. 0)

b. 0

T V

O Q

CM “3

o Q

O

LL

σ

o o

<

<

X

<

<

<

N

N

-1

<

<

<

<

<

<

D

0

0

T“

0

0

Τ’

O

O

0

0

0

o

O

0

0

CO

CM

CM

0

CM

CM

T

’t

O

’t

0

CM

0

00

in

cn

T—

0

o

t-

T

N

Τ'

0

t-

CM

CM

CM

CM

LO

co

’t

0

CM

0

τ-

τ-

Y“

0

CM

0

Τ’

Τ'

0

0

T*

T*

1-

0

b-

CM

o

Τ'

0

0

CM

0

Y

CM

CO

0

0

cn

0

b·

CD

y

0

W“

0

ο

ο

1—

cn

0

b·

0

O

CO

CM

CM

O

0

00

o

O

b-

b·

0

m

0 σ <

CO 0

bH 0

O O X

O O X

ΤΟ <

£

> Q

£ 0

o O

0 < 0

O Q

z 1=

0 0 1^

σ <

O O

ib

<

0

u_

LL

CM

H

H

0

<

0

<

o

LL

O

O

O)

Q_

V

T

r·

S

2

0

0

UJ

<

T“

□

0

V)

0

0

U)

CM

0

OT

0

0

ω

CO

ľj

0

0

0

<

<

<

H

ω

H

<

CM

0

<

°l

°i

0. 1

°l

°|

CO I

m I

0 I

X,

°l

X,

“l

I I

αι

m I

CD

CQ

m

CD

CD

CO

1 CD

1 CD

CD

m

CD

1 CD

CD

CD

CD

CD

0

0

0

0

0

0

O

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0	o
0	0	’t	0
0	0	Τ’	CO
	0		0
CM			CM
O	0	’t	0
0	0	0	0
O	O	o	O
O	O	o	O
CO	CO	CO	CO
Č	c	č	e

Tabuľka 4 (pokračovanie)

GB_BA1:SYCGROESL 3256 D12677 Synechocystis sp. groES a groEL gény. Synechocystis sp. 34,593 03.02.99

© © 00	© N	00	©	© ©	©	© h*	©	©	©
© © ©	© ©	©	©	© ©	©	© ©	©	©	©
d d d	d cô	00	d	CÔ ΤΓ		cô d	d		7“
q q τη	o o	o	o	q q	q	q q	o	7“	7“
K CM CD	CD 6	© '	d	7“ 7“			CD	cô	CÔ
o o ©	©	CM	o	CO o	o	© o	O	©	CM

O	o	©	©	CD ©	©	N	©	N	©	©
o	©	CO	©	© ©	©	©	©	O	©	©
CM		©		<□ ©	o	©	©	00	CO	©
d	©“	CO	CO	o d	©~	d	N	cô	oo	gT
	©	©	CO	©	©	©	©	©	©	©

— Q.	Q.	< Φ CO 4^ TT
(0 CO	CO	E o tí
□ CO s- s	CO o	s ® E o. o σ>
c E	E	φ o Φ
CD O	o	>> E
X I	X	CD S ω

~’S-Sí	w a
co co m	CO
2 w c	CO
g- O M	o
° E E	E
(D O □	o
XXX	x

Obsahuje časť BIK (NBK, BP4, BIP1) génu pre BCL2-interakt(vny usmrcovač (indukujúci apoptózu), a 40S ribozómový proteín S2 pseudogén a časť alternatívne zostrihnutého (splicing) nového acyltransferázového génu podobného C. elegans C50D2.7, obsahuje ESTs, STSs, GSSs, dva putatívne CpG ostrovčeky a genómový markér D22S1151, úplná sekvencia.

© ©	©		h* ©	W	© ©	Tí	00	CD
CO h*	o	O	cm	Tf	© T-	©	o	o
© ©	©	©		7“	CM ©	T“	©	©
N	w	00				2
©	r*.			©	oc
©	©	CM			1—	CM	CM
tí-	n	©	©	©	©	pr	ω	CO
	o	O	7- O	O	©
© (M		©	H <0	©	o S	X	©	©
O <	<	©	Z °	o	© ΰ	Ι-		7”
CO <f	$	<	= O	o	UJ =>	Ο	TT“	7”
ω -			Q	q ω	<	ω	ω
ω		© CM	<	ω S	m	x	x
7— j—	1—	H	4ŕ ’	7“ 7“	t·	d	d
< ω	ω	ω	>cc	X	< <	<	X	CC
m uj 1 i	UJ |	UJ |	O CL	CL	m cd | 1	© I	0-,	n_
1 1 m co	1 ©	CĎ	1 1 m m	CO	mm	1 m	m	1 CO
0 0	0	0	0 0	0	00	0 < 0	0

CM	i- to 4·	CQ oo	CO 05 CM CO	CQ	t—	0)
CO	b-	N	in	0) CO	in cm 4- s	CM	T-	0)
q	q	q	co	4; co	in q co 4;	Φ	T—
	cm“	in	σι*	4·“ ’ŕ	cm“ co“ co“ 10	0>“	co“	o“
m	CQ	CQ	CQ	LO	M- 4- CO CQ	CQ	CO	4·

05 4*

CO

CO

CO

b*

in

CD

ň

in

CO

CO

O

CM

0)

CO OO IO

CO b-

-e in

b*

o

05

CM

CO

4“

4·

CO

h*

00 CM

r* t- co

m cn

CM CM

CM

CO

4*

0)

CM

o

00

05

zz

b* cm i-

m 4·

O O

o

CO

CM

m

s

00

o

CO

0) CO

CO

CM O t“

LO o

CO CO

CO

o

0)

m

7“

O

o

o

5 <0

N.

7- -J J

CO —1

CO CO

CO

_l

05

<

u.

CM

LU

x

m

4* r*

N

x <

X <

< < <

<

Z

<

< D <

<

Z)

3 >

(0

CO CO CM

CO

CM

00 4* CM

CO CM

m

b.

4-

o

o

o

T“ O

LO

4* CO CO

r* m

o co

CO

CO

4·

o

CO

V

CD

00

00

05 O

LO

00 0) 7-

m 05

CM 05

05

M*

CM

o

CO

CO

O

CO

00

b- CO

CQ

CO 05 4-

CM co

in t-

CO

4*

4-

05

T“

CM

CM

CM t-

05	CM
4·	CM
00	00
	CM
CM	CM
CM	CM
O	O
CO	CO
£	E

GB_PR3:AC005618 176714 AC005618 Homo sapiens chromozóm 5, BAC kloň 249h5 (LBNL H149), úplná sekvencia. Homo sapiens 36,270 05.09.98

G)

0)

0)

0)

00

0)

0)

0)

G)

h- G)

0)

CD

00

G)

G)

σ>

G)

G)

O)

q

q

0)

q O)

O)

03

O>

d

ó

ó

d

d

d

có

có

d

ó

Ó

CO

CO

o

T-

7—

o

o

q

o

q

T“ τ-

7“

O

O

(O

(D

7-í

7-í

CO

d

d

in

ίΟ ví

Τ-

CO

CO

O

T“

T“

O

CM

T“

o

o

7—

CM O

Ο

CM

CM

O

O

CM

CM

G)

O)

CM

CM b*

CO

r*

1^

b-

b-

b·

O CO

co

CM

CM

o

to

to

o

(0

CO

q

CD

CO CO

<0

O

CO

o

o

O

CD

co“

co“

< to

to“

cm“

o

in

to

m

tí

tí

CO

co

CO

CO CO

CO

u N O	o h m N ž °	c £ .2-g
CO ’o	o « c u	<0 “
C	C	<0 o
Φ	3 ®	o íl·
ž		E s
(D	<0 Q)	O d)
(0	OC ω	X c

G) CM

G) CM

CO b-

CM

N Tí

O O) CM T-

o>

o

00

00

XÍ

o

r“

to

o

Tí

w

0)

7—

00

00

b* T“

to

to

00

<0

CO

CO

TÍ

CO

CO

CO

b-

T- CM

CM

o

o

CM

CM

CM

CM

CM

CM τ-

b*

to

to

to

Ο

O

0)

O)

Tí O

o

TÍ (0

00 <0

to

O C\J

O CM

b- CO t- to

00 to

o oo

o 00

O

o

<0

00

OO

<0

o o

o

7^

τ-

o Q.

o

o

to CM

CM Q

o

b* CM

b· CM

o o

O T~ CD q

o

o o

Ο o

_j

o

o

O

o

O

O

o

Z)

O

σ

o

0

<

<

LL

m

CD

D

□

<

ω <

<

<

<

Q

Ťŕ

Ťí

<

<

<

<

<

čó

CD čó

čó

ČO

ώ

T·

0

0

3

^í

^-í

ώ

ώ

0

^-’0

0

ω

CO

<

H

l·-

<

<

h-

h-

1-

< H

H

ω

CD

m I

T,

T(

co t

CD I

CD 1

wi

ω 1

I,

co r 1 t

I,

°ι

0i

co

CO

1 CO

CO

1 cn

1 cn

m

CO

1 CD

I 1 m m

CD

CO

m

0

0

ω

0

0

0

O

0

0

0 0

0

0

0

CD

D)

G)

G)

G)

00 F

G)

ID 03

03

03

00

00

cn

00

CO

0)

G)

G)

G)

G)

G) G)

G)

q q

q

q

G)

G)

q

q

q

F

Ó

Ó

Ó

Ó

CM

03

CM

CM

CM

CM

t-

O

r-

T·

O O

O

T- o

q

o

v“

o

o

o

CO

CD

CD

F

T“

05 ro

LD

F F

T“

cô

CO

CO

CM

CM

CM

O

O

O

CO

<0

CM t-

T—

O t-

T-

CM

O

o

r·

O

o

t- m	ro		M*	00
CM	CM	co	’t (O	CD	00
ro	ro	F	q
F	o*	F	00* F	F*	F*
CO	M-	CO	CO CO	CO	CO

	V“	CM
F	F	03
O CO	CO	00
03	T*	03
CM	τ-	O
O O	Ο	O
CD Q	O	O
Z) <	<	<
F	F	CM
00	co	CM
M* t-		T
T O)	03	00
CD 00	00	CO
M t-
		CM
O F	F	O)
G) CO	CO	00
CM τ-		03
Ο T	τ-	O
CD O	Ο	O
□ O	O	Q
0 <	<	<
Σ čo	čo
F 0	0	0
J H	F	H
0-T,	I,
CD CO	I m	m
0 0	0	0

GB_EST22:AI068560 965 AI068560 mgae0003aC11 f Magnaporthe grisea Apresóme štádium cDNA Knižnica Pyricularia grisea 40,073 09.12.999

Pyricularia grisea cDNA kloň mgae0003aC11f 5', mRNA sekvencia.

O
CD		CD
CD	t-	CD
G)	CM	F
O <	00 G)	O CM
<	<	Z)
		ro
	CD
CM	CM	CD
ro	CD

(0	CO
Ό	Ό
U	U
’c	C
o	o
E	E
CO	®
CO	«
CO	cn
CO	CO
c	c
o	o
E	E
o	o
	u.
d)	Φ
<	<
ro	ro
F	F
G)	G)
O	O
CO	CO
O	o
LL·	LL·
<	<

<	<	o	Q	o	t—z U_	LL
Ój	ój	r	T“		<	<
0	0	0	0	0	CM	ČM
I-	I—	I—	ŕ—	Κ-	<	<
	X,	x,	x,	Ι,	“l	m I
m	m	I m	I m	I m	m	m
0	0	0 CM 0	CM 0	0	0

7—	CM	CM	ro
	G)		CD	m·	CM
			o		00
			*“		00
G)	CM	03	o	F	CD
CO	CO	0)	CM	CD	F
CO	CO	CO		M-	ro
O	o	O	o	O	o
(0	CO	(0	CO	CO	CO
ZS	ZS	ZS	ZS	ZS	ZS

CO	CO	0)	0)	0)	CO	CO	0)
0)	0)	0)	0)	0)	0)	0)	q
CN	CM	Ó	O	Ó	CO	CO
	v-	v-			q	o	o
CO	co	CD	CD	CO	A	cxi	00
CM	CM	O	O	O	x-	o	CN

0> 0) q σ»	b- 0)
CO CD	CO
O Q	o
b^ xt	CÔ
CN CM	T“*

CN	0)	CM	00	CO	00		CN
CN	o	T“	00	CO	00	00	cn
in	CO	CO	q	<0	CO	CM	o
CD	co“	CO	co“	CO	co“	cn“	o“
CO	CO	CO	CO	CO	CO	xT	Xf

o	o				o
1- O	o	CN xt	co	XT	o	m
X“ O	o	X- O		Xfr	o	o
®o	o’	CO CO	χτ	00	o“	CM
b* o	o	in in	co“	in“	o	co“
CO X-	x—	co io	CO	io	v—	CO

C	C
o	Ό)
D)	D)
CL	Q_
O	P

o	0)	0)	CN	CN	CN	CO	10
CO	3		10	10	O		CN
			CO	CO	xT	ά	00
xt	m	LO		T“			00
in	o	O	v—		T”	CM	o
in	o	O	O	Q	O	CM	CD
0	Q	Q	O	O	Q	-3	<
<	<	<	<	<	<	<	<
			b.		oo
	00	00	CO	co	CO
	T“				00	CO
	m	10	o	o	co	O	0)
oo	m	10	CO	CO	CO	xT	CO
(D	oo	00	X“		x—	CN	3
O CO			CN	CN	CN	CO	10 CM
3			10	10	O		00
3	0)	0)	CO	CO		0)	00
10	xt	xT		T“			θ
ID	XT	xj-	Τ-	XT“		CN	tri
o	10	10	Ο	o	o	cn	uj
<	o	o	o	o	Q	<	s
	o	o	<r		<r
Xt	o	o				l—f	|C
			ÔÔ	čô	CÔ	O
ω			0	0	0	T“	H
ω	CN	CN	H	H	H	<	ω
0 ι	Z I	z I	T,	X,	X,	0Q I	UJ 1
1 CO	CĎ	1 CQ	CD	CQ	1 m	1 CD	CD
0	0	0	0	0	0	0	0

K		T™ ľF
Ώ f'-	F	O CO
w	CO	X CO
o 10	in	0> c\|
O Λ] O -	tM	íľ O
<>	>	< A
T~		x- O
CO CO	CO	00 b·
CN CO	CO	xT b*
o cn	05	00 b*
x- CN	CM	00 CO
z UJ	Z UJ	o
1^0	0	o X“ b·^
b- D_	x	b- b.
So	O	o in
gcr	tr	J®
o0-	x	í? O
O 0	0	x ω
< o	o	< 2
4’ -JJ		4’ 4:
CC <	<	CC <
o. m I t	m 1	x m 1 1
1 1 m m	1 m	1 1 m m
(5 0	0	0 0

CO r-	Y“
0) CN 10 x-	CO	3
CO CN	CO	0>
CM CN	10	O
O O	CO	O
A A		O
< <	=)	<
10		xt
10 CN X“ T-	xt	CO 3
CO x-	CO	3
10 CN	xT	co
CO X-	CO
b·	CO
O 3 in	2	00 0>
CN CN	co	o
CD O	tj-	o
O r”	Z)	U
A ŕ	0	<
2 2	o	xt
x“ r·»·		0
< <	<	1—
m m	m t	x(
| | m co	CD	1 CD
0 0	0	0

		CO
O	T	XT
xr	b.
co	b-	X“
o	xt xt	XT
co	co o	y—
lO	10 CO	CO
		T“
o	o o	o
CO	CO CQ	CO
č	C S	£

10	T“	0)
(0	o	CN
CO	xt	CO
X”	y—	X“
0)	XT	b*
CN	’t	CD
CO	CD	CD
	V“
o	O	O
<0	CO	CO
č	č	C

σ>

b-

b*

0) 00

0)

05

05

05

05

00

05

05

05

0)

05

05

q

0)

σ>

0) 0)

q

q

0)

0)

q

0)

0)

q

0)

0)

0)

q

ό

cm

CM

T-! cd

yJ

V“

Ó

ó

cd

cd

cd

05

05

ó

7- Q

Τ-

O

7“

o

q

o

O

O

q

φ

ó

o

0)

Ο

Ó

CO

id

in

cd

CM

cd

cd

CM

7- O

CO

CO

o

o

o

CM

CM

T—

o

o

7—

CM

in	CM	CO	05 05
o	0)	b*	in cm
q		00	q q
cd*	ó*	id	σΓ
co	M	co	CO O)

	ω	CO	Έ
φ	φ	Φ
co {g — ra x: 05	CX	Q.	S g
.Q	X)	<0 CO C x>
Q. O	□	2	o ®
o E (0 CO 2 ô	D O □	2 O) □	c >. Φ č? to o
O E	U.	U.	o ω

CO	CM	4-	b-	h*	4·	0)	CO	4-	o	00
o	xŕ	in		4-	N	4-	4-	oo		0)	o
q	<0	o			ID	O	q	C3		ω	T—
co*	ló	CO*	ID*	ID	0)	4·*	o*	b·*			CO*
CQ	CO	CO	CO	CQ		4-	4-	CO		CO	4·
		k_					h—
		o				O	o	CO		CO
		o				O	o	Φ		Φ
		.y				o	o	Q		Q
								>.		>7
		Φ o				Φ o	Φ o	E		E
(0 C Φ	CO c Φ	ω (0 Φ o	CO C Φ	(0 C Φ	E 3 •Z <0	o CO Φ o	o (0 Φ u	o k_ co x: o		o CO £ o
'o.	'o.	>7	Q.	‘cx			o		u	CO
CO	CO	E	CO	CQ	o o	E	E	CO		CO	>
CO o	CO o	o Q.	CO o	CO o	S □ •9 o o *—	o *-* Q.	o Q.	CO o ,N	φ X2	<0 O Φ N X)	CO E
E	E	Φ	E	E	Q Φ	Φ	Φ	lc	E	x E	CQ
o	o	4—·	o	o	>-Q	t	4·*	o	o	o o	Φ
I	x	ω	x	x	Š 2	ω	ω	ω	Q.	ω cx	N

CM

C0

ο Ε ο X

b.	b-	CM
CO	CO	CM
O	o	00
		CO
		0)
O	o	o
Q	O	-J
<	<	<
05	05
M-	4*	05
00	00	b*
b*	r*	b*
CO	co	CO
		CO
b.	b·
CO	CO
o	o
		CO
r	Y·
o	o	Q
o	o	ω
<	<	o
cd	ió	ω
0	0	T“
1—	H	<
x,	X I	m
I CQ	1 CQ	m
0	0	0

00	00	b*	b-	05
CO	CO		05	o	CO
b*	b-	O	4-	b.	b-
T·		in	05	ID	0)
CM	CM	o	4*	CO	O
		b*	O	O
-J	—1	0)	U	-1	-J
<	<	N	<	<	<
CO	CO
05	0)	O	4-	b·	b·
	7“	O	CO	b·	4-
CM	CM	CO	b·	4	05
CM	CM	CO	CO	CO	CM
CM	CM	CO	CO	CM	4*
00	ffl

CM	05	CO	o
00	ID	in	4*
	CO	o	T“
b.	CM	4-	γ-
CO	CO	CO	O
b·	b-	b-	CO
7“
o	o	o	o
CO	(0	CO	CQ
s	S	S	í

GB_GSS13:AQ489971 252 AQ489971 RPCI-11-247N23.TV RPCI-11 Homo sapiens genómový kloň RPCI-11-247N23,Homo sapiens 36,111 24.04.99 genómová súhrnná sekvencia.

rxa01823 900 GB_BA1:SCI51 40745 AL109848 Streptomyces coelicolor kozmid 151. Streptomyces coelicolor 35,779 16.08.99

b- b- CO

CD

O)

CD

O)

00

00

CD O)

O)

CD

cn

00

CD

O 0) 0)

O

CD

CD

CD

(D

CD

CD CD

CD

CD

CD

CD

(D

y^ <0

CD

(D

Ó

Ó

CD

CD

CD

<Φ

ó

CD

in

0 1-0

o

o

O

O

y- O

O

O

γ-

O

o

10 co b*

CD

CD

CO

σΐ

CD 00

Τ-

Τ-

ΙΩ

r* Wf

CN y-

Ο

Ο

Y“

CN

Υ-	CD CN	CD	CD	O	O	CO	CD	ID (D	CO
Ι-	0) Y-	O	O	CO	CO	CD	CN	CN Γ-	o
ΟΝ	CD CD	O	O		Y—	00	CN	ιο in	N
CD*	CD* N	CD*	CD*	(D*	CD*	N*	N	00* Y-*
CO	CO CO	CO	CO	CO	CO	CO	CO	CO CO	CO

O *	o	o
U	>	>
5 ξ	UJ	UJ
jg E	Z	z
o £. CD SP CO Φ	š	$
co w	O	o
Ό E* °-o	z	z
UJ	UJ
AL C	ô	ň
i“ Φ CN CD	2L UJ	JC UJ
N	CO	CO

1 >	co sí
O	K o
je Φ	Φ
(Λ	C CO
o	o o
£	x:
o	tj· O
'>»
c m o	N Ä O ®
*c o	E °
CL	O Q.
(0 2	E O 3
O	ω o

□ 'u	CO	□ •C 0)
Φ s	ω o	ω « 15 o	•Ω (Q (0 (Ú - tú £ £ D)
(0 n	D O	S 3 -2 o	k Q. O Soc
o o	Φ	O is Q Φ	S g «
>»	X)		Q 2 φ
S 2	5 2	O O E

CD	CO
CD	CD	ll
00	00	00
M“		m
X	X	X
c	c	E
		O v

CD

CD

b*

b-

’Φ

b·

00

00

f—

O

m

m

OO

00

oo

Y“

T“

co S!

o

r—

m

CD

CN

σι

O

O

y~

CM

o

CD

Y-

CD

m

Y“

Q

O

in o

CN

CN

00

04

”φ

CN

CD

b*

o

o

O

o

1- o

o

o

CN

O

o

00

CD

r-

o

O

O

o

00

b-

O

-J

-J

CD

-J

-J

Ό

N

N

<

<

<

<

N

N

D <

<

<

N

<

<

CN

O

CN

CN

r-

r-

CO

b.

b*

O

CD

CO

CO

’Φ

CD CO

CM

CM

o

CO

m

b·

in

CD

(D

CO

CD

00 CO

00

CO

o

o

o

CD

CD

CD

LO

LO

oo

00

τφ

(D

oo m

CO

CO

o

00

Y“

CO

o

10

CO

CD

o

O

00 Y“

CD

0)

Y“

04

O

CN

CO

CN

CN

CN

CO

CO Y-

CN

CM

T—

CO

CD 00	CD 00	CD 00		b-	04	1Λ O	CO	<0	M*
m t- b*				y_			ΐ CM	CD	CD	LL
in o q	O	O			CD	b-	X (D	00	00	CO	b-
w o q			T—		CN	CN	CD O		’N“	ID	o
CO CD >	O	O	O	O	X	X	Y o	X	X	X	o
d 3 ω	o	o	Q	Q	o	o	°	UJ	UJ	UJ	>
o ω uj m S	< čo	< čo	<	<		FS	iu£ n co	q	q	q Y“	ŕ s
T“ Y“ T“	0	0	0	0			0	0	0	0
< < <	1-	1-	H	1-	<	<	5 H	H	H	H	<
m co m	x	x	X,	x,	ffi	CD		X,	X	X	CD
tn CD cn	CD	CD	m	CD	m	CD1	CD CD	CD	I CO	1 CD	m
0 0 0	0	0	0	0	0	0	0 0	0	0	0	0

CO

in	00	00	CD	CD
b-	in	b.	CO	CN
co	LO	(D	CD
CO	T-		b-	CD
ID	oo	CD	CD
00	oo	00	00	CD
			Τ-
o	o	O	Ο	O
ca	Φ	CO	(Q	ca
č	2	č	č	S

LO

03

0>

03

03

03

i

b

CO CD

b

b

03

03

03 03 CO

σ>

0)

q

q

03

q

F O - 9S

q

03 03

03

q

03

03

03 03 03

CÓ

CO

F

F

Ó

ó

F

CÓ CÓ

ó

ó

CN

03

ó ó in

o

q

τ-

y—

T

T“

Τ-

o o

▼-

O

T- t- O

có

F

Ο

ó

F

F

b* 03

Ο

CÓ CÓ

T—

CÓ

F

CN CN F

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN τ-

CO

Ο τ-

CN

CN

o

O

CN CN CN

Ο

O

O

o

Ο

CO

O

LO

CO

CN

CN

F

o

O b-

O

O

LO

LO CO LO

N

O

N

b·

N

<0

q

O F

CN

CN

LO

CD

F CD LO

q

CO

tn

03

CO

CD

CO

o

O

CO

co

q

(D

F 0) Φ

F

in

in

0)

CO

CÓ

CM

o

O O

LO

LO

F*

CÓ

LO LO 03

F

co

co

CO

CO

CO

CO

t- LO

CO

CO

CO

CO

CO co CO

5	O >
UJ	UJ
z	z	fn
<	<	vJ LO £
>	>
o	o	CN Q ' O
z	z	’Z Je
UJ £	UJ ž	F Φ CN $2
UJ	UJ	(0
ω	ω	CQ >*

CN	CN
Q.	Q.
CO	CO
(D ·	CD .
w >	CO >
“3 O	“3 O
o -E	O ž
	Ω-8
C O	c *□
O -C	-2^=

CN CD

CO CO

CO CO

b CD

N CD

b. CD

CO CN

CO CN

F

to 03

ss

F

CN

CO

CO

F

F

St

LO

b t

o

O

CO

CD

5t S m

b

00

CO

CO

CD

CD

CD

CD

co

CO

CO

F

b

CD CO IX)

co

O

T*

T

O

O

O

03

00 O

o

o

CO

O

o o cď

O

o

o

O

O

O

LO

CO LO

o

o

o

O

q q Rj

s

O

m

tn

O

O

O

00

S 2

O

o

5

O

OOs

x

<

<

<

<

<

<

X

< s

<

<

<

<

< < X

00

00

co

in 03

in 03

LO 03

CO CD

00 CD

O) CM

b

00 00

T—

03

CN

CN

(D

CD

CD

CN

CN CO

b*

b*

F

O O b

CM

CD

F

F

LO

LO

in

T—

t- b

F

F

CN

03 03 CO

m

03

CO

CO

b

b

b

CD

CD CO

O

O

o

CO

03 03 O

CM

03

b

b*

T-

7-

7-

CN

r- F

7“

—

CD

03 03 CN

Z

b

b·

b

D. O

< CD

CO

CO

CO

0 Q CC

CN CD CN CO

00 00 CO CO

CO CO CO CO

CO F CD O O

CD F CD O O

CD 3 o o

CC š Z

co í oo F co >-

CN O CO o o

CN O CO O O

s CO

in 03 CD b o

3 S < 5Γ 'T X CO CD g O o H

<

O o

o

o

O

O

O

α

o

O

ω

o

o o 0

O

O <

CD <

CD <

<

<

<

0

>2 í-

<

<

x

O

O O 0

ω

F

F

Ťf

o

CN

CN

ČM

<

< < Q

čxi

7—

0

0

0

ŕ- —

0

0

0

F

e

<

—1

_1

ľj

F

F

1—

<

< <

F

F

J—

CC

X X <

m I

Q. I

Ο- ι

Q. i

X I

X I

X I

m I

Q. CO I 1

X.

X,

X,

Ο-

0.0.0

m

1 m

1 CD

1 m

1 m

m

1 m

1 m

1 1 m m

tn

1 m

m

Ι m

1 1 1 cn tn tn

0

0

0

0

0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

000

7—	b	0)	CO
	CO	o	in
t—	F	m	CD
			Τ’
O	0)	o	CO
CN	CN	CO	b
O	O	o	o
CN	CN	CN	CN
O	O	O	O
CO	CQ	CQ	CD
s	S	í	S

0)

0)

N

0)

CD

0)

0)

0)

0)

0)

0) CO

CO

CO

CO

q

q

05

q

q

q

0)

q

q

q

0) 0)

0)

O)

q

o

CN

CN

6

10

6

6

Y-^

Y—

CN CD

CD

0)

7Z

o

Τ-

·*—

Y“

q

Y

γη

O O

O

o

Y“

ó

Ο)

Ν'

K

CD

N*

Γ*

b^

cd

cd

cd Γ-

b*

CN

od

co

CN

o

Y

O

Q

T“

7“

O -r-

Y·

Y“

Y“

Ν' o

00	CO	Ν'	o	CO	CO	b·	CN	y- CN	CO	CN
	r-	r-	Ote	CN	CN	r-	0)	b- CO	N*	CO
to		Y“	o	4	Ν'	N	O	7- (D	Γ-	Ν'
co”	in“		o	co“	co“	co“	co“	0) co’	ιο’	ω’
CO	CO	CO	7—	CO	CO	CO	CO	CO CO	CO	CO

es □ xj u o -d O o

Q.

CO

E
(0	<0	.=	CO	CO	(0
c	c	Φ	c	c	c
Φ	Φ	tc c	Φ	Φ	Φ
o.	q.	o c S 3 D Q Φ	q.	‘o.	’q.
(0	(Q	(0	(0	(0
CO	<0	CO	<0	CO
o	O	<= i	o	o	o
E	E	dS	E	E	E
o	o	O □	o	o	o
X	X	O o)	x	X	I

CO	CO	E		E
c Φ	c Φ	□ ’u-	CO	□ •C CO	C0	0J φ
q. CD (0	‘o. (0 CO	Φ tí (0	’co o □	φ ω tS o CO □	e> <0 V)	E .S S c CO o
o E	o E	X3 O O	E Φ	XJ o o »o Φ	CO N	o- E U
o	o	>»jQ		£*
X	X	Σ	j	5 2	O	Σ Q-

X

c s> Φ	a 0) V)	·* J < c z ® Q E
CL	<	Q Φ
Φ	Q.	CO ®
10	1	£ >·
X h	o -J	Φ c q.m> co ä

b· CO

O b0)

CN

CN bΝ’ X

I

CD

CN

o	cn	0)	0)	CO	CO	0)	00
CO	10	o	o	CN	CN			O	10
Γ-	co	10	10		Y-	10 CO	CO	Y“	o
0)	r-	o	v-	Y-	o	o	CN co	00	γ-	o
o							0> CN	CN	ΙΟ	o
o	o	o	o	O	o	o	O o	Q	T“	o
ω		“2	g	O	o	o	x r*	b-	O	UJ
<	>	<	<	<	<	<	Q N	N	<	<
7-			S	CO	(O	CD
			LO	CO	CO	o	o		o
0)		co	«	CO	0)	0)	4 tn	10		CO
CN	CO	CD	Y—		10	10	Y— Y“		co	10
CN	CO	CO	Y—		b·	b·	CN N	Ν'	CO	00
	Ν'	10	»-		7—		CN CO	CO	r>	CN
									o	00
0)			0)	0)	CO	CO	10		o	10
CO		0)	O	o	N	CN	Ν' Ä		Y“	o
b-	10	10	10			7- O	O	Y*·	o
0)	Γ-	CO	T~		o	δ	5 $?	0)	(0	o
o		T~							o
o	O	O	o	o	o	o	J >*	>	o	UJ
o	£	“□	Q	o	o	o	5o	O	<	<
< (D	£ k.’	< o	< cd	< cd	< 10	< 10	íS	H 5	O Y—	0. 5
0	H		0	0	0	0	Y“		ω	CN
H	ω	<	H	H	H	H	£Ľ <	<	ω	<
X	UJ I	m 1	X,	x,	X,	X,	o. m 1 1	CD I	0ι	£D I
CO	1 m	CD	1 m	OD	1 CD	CD	1 1 m m	CD	CD	1 CD
0	0	0	0	0	0	0	0 0	0	0	0

N ΙΟ	0)
r- oj	cn
o o	o
CN CN	CN
o o	O
® (0	(0
2Í 2Í	2Í

03

03

03

03

03 00

03

CO

ro

ro

03

03

03

CD

03

q

q

03

q

03 03

q

q

03

03

1

q

03

03

q

q

ó

ó

03

ro

v*

CM

CM

CM N.

Ó

O

cd

y—

Τ-

O

o

O O

O

o

O

o

—_ ľ»· ’Z 03

o

o

Ó

Ο

Ó

03

xt CM

Ó

b*

fx

rx

CM 03

oi

fx

N

00

CD

CM

CM

t—

O

t- t—

CM

CM

»—

T—

f— T—

o

O

O

T“

03

0)

ro

03

x- xt

co

CO

CO

0>

N

0)

03

00

0)

b*

N

€0

CM

O X-

00

o

oo

00

CO

ro

ro

0)

00

ΙΛ

in

CO

ro

q rx

x-^

T—

CM

ro

4

4

03

rx’

co co’

4

03

4

CD

od

|x“

CD

(D

ro

ro

co

CO

CO

CO

co ro

Xt

CO

CO

co

CO

CO

CO

co

co

co

co

co o

r*·

N

N

CD

xt

Xt

CO

CO

CM <0

CO

CO

O

00

00

00

0)

CM 03

N

▼“

τ-

τ-

03

ro

ro

ro

00

03 00

co

O

Ο

Ο

03

rx

b*

co

co

T—

σ>

y—

CO

CO

t—

00

00

00

00 o g o o o <	CD CM CM O l	CO b* rx 00 CO	CM «J O ? Ä θ R ° Q LL	CM CM ro o fx T <	< o LU -J Q > I	0 ti 0 0	0 t 0 0	o V“ O o o UJ
Ťt	|X CO	cd	< <	Xt CM	Q.	q	q	<
0	H	ω	T CM	H	T“	t·—
1—	ω	ω	CC <	U)	-J	<	<	<
T,	UJ I	°ι	CL CD 1 1	UJ I		CO I	CD I	00 1
1 CQ	1 CD	m	co co	1 CO	1 CQ	1 CO	CD	CD
0	0	0	00	0	0	0	0	0

	CD	ro
xt	rx	fx
CM	rx	ro
03	»—	T—

0	CO 0	0	b-	rx	0	CD	to
q	0 0	0	0	0	q	0	0
có	xt có	CD	có	có	Τ-	to	CM
o	o q	0	0	0	Ο	0
có	có có	to	CM	CM	r·*	0	to
	CM CM	CM			0	CM
					0	O	0
CO	O CO	0	CO	CM	0	O	0
CO	CD CM	v-	CO	Q		O	0
ľx	h* xf			CM	o	O	0'
CM	b·’ 0’	rx’	co’	cd’	0	O	0
Xt	co co		CO	CO

CO 0	CO	0	0	0	CO	co
0 0	0	0	0	0	0	0
0 to	ó	N	CD	CÓ	CD	CM
x- 0		O	O	O	O	T-
CM Ó	Xt	CD	CÓ	CÓ	k	có
CM x-	CM	t“	X“			0
co CO CD CM	b.	CO 0	CD O	CD O		5
CM to	CO	N	O	O	CO	CO
0* x-’	co’	N	N	b·’	cm’	cm’
CO xt	CO	CO	CO	CO	to	to

	O	co	to	CD	O
0 CO	τ-	CM	CM	CO	CM	co	r- co	CM
CM x-	ΙΟ	CO	CO	5	O	§	xt 0	y—
x- CO	CM	to	to	XT	CM	CO Xt	CO
bcq 0	r-	0 CM	0 CM	CM CO	UJ Z UJ	0	0 0 2
_j 4-	N	0	O	b·	0	CL	(Λ —Z	xt
Z cm	co	to	to	b-	1—	UJ	k * CO Γ <° CO -T
o. 0 5 £	0 ž		<!	0 0 _J	Σ <	CL CC	b* rx
ž 5	σ> co		r:	0	0	0	ÍJ x. II XJ	0
Ψη			Q	Q	Q	Zr ° < W	u. <
Η	1—	P	ŕ-	μ	Y“	T-	CM H
< CO	ω	ω	ω	<	<	<	-i ω	Ó
m tu 1 1	LU 1	UJ 1	UJ 1	CD 1	m 1	m i	D. LU 1 i	OC
1 1 m cn	m	1 m	CD	1 m	1 m	ffi	1 1 m cd	m
0 0	0	0	0	0	0	0	0 0	0
0		0		0			CO
		to		b.			CM
5		0		xt			O
x”		Y“
CO		CO					CD
CO		to		CO			CD
CM		CM		CM			CM
CM		CM		CM			CM
O		O		O			O
CO		(0		CO			CO
č		č		C			£

. 0. .
1 >	—I >
1 O	1 O
1 JÉ	sf
Φ (0
*□	C '3
XZ	S _c
O	* Q
C	®'c
€0	CO
*D	c: *0
CO ’C	<ί « S δ
O
Q.	g Q
(0	c ω
3	p 3
Φ C	£ ® Q c
to	CO Λ
x	C

©	00	© 00	©
©	©	1 © ©	©
d	©	d co do	d
O	O	’T © ’T '“I	O
CÔ	d	co © o ©	CÔ
CM	T—	O 1- 04 7-	CM

©	©	©	©	00	©	©	b*
©	©	©	©	©	©	©	©
d	d	ό	ό	©	ό	ό	cô
ο	Ο		7“	ο	•r-		q
CD	©	d	d	©	04	d	y-I
ο	ο	ο	ο	ο	7“	7—	CM

©

y—

© o

©

o

b*

b· ©

O

©

CO

00

©

©

©

o

©

©

©

T“ ©

N

©

co

©

©

©

©

©

o

CM

00.

© o

©

o

©

CM ©

•7-

q

T-

cm_

©

©

©

d

©

©*

d ©*

00*

©*

©“

O* d

©*

ď

©

©

V-^

00*

00*

©*

©

©

©

© ©

©

©

©

tT ©

©

©

©

©

©

©

©

E 2 Έ CO Φ » (5 o g 2 g o	E 2 ‘C Φ	CO *co	m -g £ ® Φ ŕ“ ô o E	2 u Φ o E	2 Φ u E
ts CQ <O	O 2 U	m CO 2 S XJ o “ Φ č o c t	CQ 2 n o g E	28 2 E
o o Φ	O o	Φ	E
>XJ	>XJ	o o □	o □	o □
s a	s	2 **	I Q CT	O σ>	O oj

σ>	©	Q	2	2
ľj σ>	©	Q CO	lll cd	UJ ω
CM	CM	C	♦	♦
τ-	’t.	Φ	í	í
ι O	o1	‘q. CO	<o*	co'
Q.	Q.	CO	z	Z
CD	ω	o	T·
T	X	E	Ι-	H
H . oŕ	H . oí	o I 1—	Ε O	c o

			o			©	©
o	©		©			O	o
o	© Λ	©	©	©	CM 7-	O	o
o	© CO		CO	CM	t· b*	o	o
o	CM	o	T·	O	O b*	o	o
o	co O	b*	O	©	o 04	o	o
Q	© ω	7—	CQ	©	O 0)	CL	CL
<	N <	UJ	<		Z) N	<	<
	©					O	O
	©				CM ©	o	o
©	© »	T“	©	©	r- CM	o	o
o	© ©	©	©	©	© b-	©	©
o	© ©	©	00		© 04		T“
	v-		CM	©	©	©	©

CO

y-

T-

T- CM

©

W

CO £ o o o

O Q © 04

tT CM CM > 0

x c*> 2 w © © n- .— CM o

a> o

O s 00 Ύ O

© CM O © © D

-f §O

© o o o o o

© o o o o o

Φ O Q

© T— T“ O O

O CM © © 3

bCM © O O Q

bCM © O O Q

© CM © O

<

H

CD

cd m

CD

0

° t

Q_

0.

<

<

<

©

ôi

«S

S

X <

uj

<

O

D 5

<

<

«

©

CM

4ŕ

5Γ

Q

0

pj

H

7**

Ť- Ť“

LL

y-

0

0

1—

0

0

L-L

f-

<

<

CĽ <

<

<

<

< <

<

<

1-

H

CD

1—

H

<

X

CQ

m

Q. CD

0-,

CD

00 I

m co I 1

CQ I

CD I

X|

LU I

x

X

CQ |

m1

CD1

m1

ca'm1

m

1 m

1 m

CD CD

1 m

1 m

cn

CO

m

CD

CQ

CQ

0

0

0

o 0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

0

0

0

b*	CO ® CO	b- CO	®	®	0	0	0	0	®	b· © ® ® 0	N
q	0 0 0	0 0	0	0	0	q	0	0	0	0 0 q q 0	0
	««b	CM 4		©	4		0	b^	©	© ŕ CM CM	ώ
o	q q o	O O	q	O	o	τ-	o	o	O	O O O O O	q
	4^0)	b^ ©	co	b*	ώ	Ο	CO	K	b-	-4 ® xt 0	o
CM	r- i- CM	i“ CM	7“		CM	CO	f—	o		CM i“ O O CM	CM

CO

T“ b- ©

CM ®

®

CM

y—

0

CO

b-

co 0 0 ω

b-

0

o

v- CM co

xb CO

0

0

T“

b-

CO

CO

O

0 ® 0 τ-

o

xf

CD

*·. * A.

O ®

CM

«

CD

0

CM

0

ι- b- CO CM

’M’

ΧΓ

ω

CD* Vi 0*

O O

vi

vi

N*

O*

©*

r<

CO ® b- CD

Φ

0*

co

CO CO CO

xf

rt

rt

CO

Vi

CO

v>

CO CO CO

CO

CO

CO	CO	CO	Ο-	CO		Q.	CO “ 8.9 > Q.	h
c	c	c	Ο	c		O	D
Φ ’q.	Φ q.	Φ ‘o.	É Φ	o o		Φ	’u_ Φ	CO ’co
<0	(0	CQ	g		E o	O	o
<0 o	(0 o	CO <0 0=2	£ O u.	Φ £	(0 □	X o	S o. P	CO .Ω O	□ o
E	E	E ’o	CQ		ô	CQ		O	Φ
o	o	O CQ	Φ	&	CO	Φ	>«X3
x	n m	W	(0	m	W	ω -c	ž	4-·

®			τ-
o	CM CM	0 ®	Ο		CM
	CM CM m-		b-	©
	0 0 CD	i- ω		b*	0
CO	O O (D	-r- b*	o	b-
CO	O O CD	xľ ’T	o	CO
<	Q O O	o £	u.	0	U.
<	< < <	< S	<	N	<
	b- b® ®		o	O	©
	co © O	T“ T	b.	<r	®
0	© © 0	© ©	®	©	0
N	© © CO	CO CO	CM	0	0
CM	1- 1- T-		CO	CM	i—
®
O
	rt ’φ	—I
5	CM CM	I	o	Xf	CM
CO	CM CM t*	© o		©	©
«2	to to «J	t- Q	£	CO	0
	O O (0 O O to	_ —I 5 o	o o	O
CO	Q O o	o <	LL	h-	LL
< < <	< CD	<	5	<
h	có či H	H	CM		ôj
ω	OC CC <	< <	<	<	<
ω i	CL CL 0. 1 1 1	CL Φ I 1	m 1	Φ 1	m I
1 ffl	1 1 1 tn tn tn	1 1 00 CO	CO	CD	m
0	OCO	00	0	0	0

Q	CM	®
b-	b-
		CO
CM	CM	0
O	O	©
O	O	O
O	O	Φ
<	<	<
0	o
0	o
CO
©	b-	®
CO	xt
CM		i—

			o	O	0
0	©		©	©	©
xt	CM	ω	o	Q	W	xf
0	CM	co	o	O	CM	Xt
0	©	b-	CM	CM		CO
CM	<0	CM	CM	CM	t—	b-

	©	b-
CO	©	CM
CM	©	CO
b-	v—	4“
xf	©	b·
CM	CM	©
xŕ	^·	xŕ
CM	CM	CM
O	O	O
Φ	(Q	(Q
č	C	č

	Φ
O	CM	CO
b-	b·	0
Xt		©
CM	CM	O
O	O	®
O	O
O	O	xr
		co
xŕ	xŕ	H
x	CC	CO
Ο- ι	£L,	LU I
1 m	1 CD	1 m
0	0	0

	©	CM	CM
O	00	©	©
ω	O		CM
b-	T—		CM
	CM	b-	b-
T—	v—	CM	Xt
©	©	©	©
CM	CM	CM	CM
O	O	O	O
Φ	(Q	CQ	CQ
2	2	č	2

0) b*

0)

σ>

σ>

03

0)

N 00

oo

0)

00

CM

0)

0) 0)

0)

0)

q

q

0)

q

q

q

0) 0)

q

03

0)

0)

q

d cd

CD

d

ó

TÍ

cd

Χί-

7-í

7-í

CO CO

CD

(D

CD

d

d

o o

O

o

O

o

ο

Τ-

Τ-

O O

o

q

o

o

CO ó

7“

cd

00

d

co

d

Ο

Ο

od N

r<

N

có

od

O CM

T—

o

T—

o

CM

o

CM

CM

O t-

T-

CM

7“

CM

o

0) CO

03

CM

-’t

CM

0)

CM

co

r—

b- b.

co

00

co

CO

b-

’T '«T

0)

CO

N

N

CO

to

<0

S V-

h*

1

co

to

0)

tí <q

oa

in

r*

q

Τ-

to

cm

xfr

σ> in

r—

to

CM

O

CO

to“ xŕ

to“

co“

to“

r-“

Ο)

có

co“

to co*

d

oo“

co“

to“

có

co co

co

co

co

CO

co

CO

CO

co co

co

co

to

φ r>	W L· 5 8 g É	Q. <B CO o	CO D n U	CO Q. O *o	CO Q. O Ό	CO c o
E	&·£	E	£>S	£	ÍQ	b Φ
o	O 3	o	O 3	S	S	(0
CL	Q σ>	I	O Ď)	<	<	o

Tabuľka 4 (pokračovanie)

□ φ Q. Q.
>· m (0 <a <0
o o
0 E
gž
*0 C
> Φ	CO
*® B	0
O O-	CO
£ 00	o
	0

d		CM	CM		m
d	CO	CO		«
CO	co	^-
			b^		0 X
T“		to	CM		Φ
to	to	7-			Q.
		4-·	T*	00	E
C	C	C	C
Φ	Φ	Φ	Φ		o
E	E	E	E	g
03	o	0)	0)	y
φ	φ	φ	φ	3	>
CO	(0	(0	CO	c	g
É	E	E	É	>7 (0
Ό	o	*O	o	m	δ*
C	e	C	c	Λ
Φ	φ	Φ	Φ	P	R
O)	0)	0)	0)		Έ
*>»	*>»	*>»	'>*	o
c	c	C	c	c Λ	3C i

.2	D	3	3
*c	•0	•0	*0
φ	Φ	Φ	Φ
T* U	B	B	B
CO	CO	(0	CO
Λ	n	Λ	.Q
o	o	o	O
u	o	Q	O
	>»	>*	>7
S	S	S	Σ

CO o

to s

CO

Z)

	b*	CM O	CO CO CO 00	CO 00	CO b·.	to o
to	00	CO	<0 T		o	b·	03	CO
co	CO	to	<O o	o	CM	03	CO	CO
to	τ-	CM	τ- ν-	τ-	CM	CO	to
co	Ο	O	Ο o	Ο	O		CM
	CO	CO	LL -J	-J	-1	b*	CO	U-
o	<	<	< <	<	<	N	X	<

0)

o

to o

o

o

CM

xr

0)

co

T

o

0)

co *«r

’G*

CO

CM XT

0)

0)

co

00

CO

b-

03 00

00

b-

CO

’T

03

b* CO

b*

CO

to

00

to

03

to

to N

b*

CO

03

o

to

to b-

E

CO

CO

CM

CM

b-

to

CO CO

CO

CM

CM

CM

		03 00		to	to	to 00	to
<	o CO to	£ CM	a. 1—	0 CJ	co to co	co N to	CO to co	T“ r*00
ω < z	CD O o CD	N <	ZJ 0. 0	O < CL	xr D 0	00 <	D 0	CO o CD
o	<	CM CO	0	tn	q	to co	q	<
Ľ	ľj	H CD	<	ši	<	H CD	T“ <	Zď
CL I	CL i I	UJ t	CD 1	D. 1	m |	UJ I	CO I	0- I
1 CO	1 1 CO	1 CD	m	m	1 m	1 CD	1 m	1 m
0	0	0	0	0	0	0	0	0

	CO	m	to
to o p	CO CM O	CJ	£ CC	o CO co
		Q	UJ
c		H	UJ	LL
S	S	s	ω	<
			7—	d
<	<	<	<	<
CD 1	CO I	“l	CD I	CD I
CD	CD	m	1 m	CD
0	0	0	0	0

	CO	CO	T“
CM	CO	to	b-
CM	0)	O)	CD
		Tí
00 h-	00	CM 00
to	to	to	to
CM	CM	CM	CM
O	o	O	o
CO	CO	CO	CO
č	č	č	2

G)	CD	CO F	CD O)	CD	G) 0) O)	05		G)	05	0) G5	t- 05
q	0	0 05	q q	q	G) 05 05	q	1	05	q	q o>	q q
F	ó	t— F	F CM	CO	CD CD CÓ	CM	cm m	ro	CM	CD CD	O CM
q	t—	q q	O O	o	O O O	q	__ 'J' • 05	O		q o	T 9
ro	05	CM CO	CM Ó	F	CM CM 0	cô	(D 05	F	CD	CM 00	t— F
T“		CM O	CM t-	CM	O O CM	CM	o »-	O	Q	O CM	CM O

CD

05

F

co ro

co

CO < 1-

CM

CD

CM

CO

’t CM

CO 05

o

CD F

05

05 O

ro

F

(D

CD

CD

ί- CD

xľ CM

05

CO

q q

F

O τ-

xr

O

in

F

O

(0 xt

ro co

CM

CO

ro* co*

t-“ 00*

CO*

Ο)* O*

CD*

0)

T“

xf

G>*

ro* co*

F* co*

ro

ro

CO

xr co

CO

CO

co

CO

CO

CO

(O co

CO CO

o1 9- 4-> CO	x> (0 £ u.	E Φ	Q. (0 «
Q	w
E	o	o T	c	o
φ	E	b Φ	o	E
	o	CO		o

		<0		F
CM	CO	CM		CM
	ro	σ> q?	05 05	ro
	co	co <d	CO CO
CO		co <2	CO	o
o	o	σι 42	0 F
	CO	c» <	05 T-	O
<	<	X <	X X	<

_ CO oo	ro
ιλ b;	co	F	CO	CD
cn r*- oo	F		CO	ro
S -r- CO	CD	CO	CM	co
S o cm	o	o		o
” o T	o	o	CO	o
-5 ĽJ σ	o	05	O	05
< < <	<	<	<	<

ο

		ro	m τ
CM	CD	CO CM	CO CD
CM	05	ro cm	ro o>	00
	xí-	CM -M-	CM T-	7—

CD

CO	G5
CO
0 0 0	xf	CD	CO	G)
05 O CO	F	CO	CO	F
CO t- CD	CM		CD	F

CO i- M 0 co co co

CD

O CM F O O O v- ro

	CO	CD CM 05 CO	O	F CM ro	M* CO	00 F LO “ o CJ
CM O	ro CO Ύ—	-J O	i a·	o τ-	CO CO
	O	s 5	5 Z	Ο	UJ	o <
δ	m	lll	LU >	<	z	LLJ čxi
ω	<	< OT	0	5	< £
T—		F	F F	ω		ČM 0
<	<	< ω	< <	0	T—	<
m 1	m I	m tu 1 I	m m I 1	0i		m 0
t m	1 m	mm	1 1 m m	CO	CQ CD CD
0	0	0 0	0 0	0	000

ro CD	F	CO 00	CO ro	m N
F	CO	CM	co	CO CL
CD	O		o	t- o
O	o		o	CM O
O	G)	o	G5	CD (fí
O	<	<	<	m z —* ti
^4.	ro	ČM	ro	LU y
ČM	0	7“	0	O ’Σ
0	F	CD	F
1—	CD	CD	CD	‘2 tn
I,	ωι	0 I	UJ I
1 m	CD	m	1 CD	mm
0	0	0	0	0 0

		CM
O	0	G)	ro	7“	CM
o	F	0	0	ro	CD
ro		0	0	7“	CO
05	τΤ	00	0	CD	F
05	0	0	ro	F	F
ro	CD	CO	ro	CO	CD
CM	CM	CM	CM	CM	0
O	O	O	o	CO	O
(0	Λ	(Ú	flj	(0	(0
č	ZS	ZS	ZS	č	č

CO

0>

G)

G)

G)

0)

co

CO

CO

G) 00 G)

G) 0)

G)

CD

G)

q

q

G)

G)

G)

G)

q

q

q q q

G) G)

G)

q

b*

in

CN

CN

r<

G)

CN

CM G) G)

CD

CD

O

o

O

O

O

q

O

v

o o q

O τ-

O

o

,-ľ

G)

G)

CN

CN

r-

6

CN

cd CN ó

CD cd

T<J

r<

CO

CM

T“

O

O

O

CO

CN

o

i- O 'r-

Ί- CN

O

O

id

CN

▼—

b·

G)

'í

G)

M-

CO o o

CD G)

b·

CD

CO

CN

CO

CN

xt

CD

CN

N O

00 xf

CM

00

in

m

LD

CO

O

in co

o_

00-

O-

® o’

τ-

N

b-

co’

CD

cd’

G)

N

o’

co’

G>

<t coo

b·’ xŕ

cd’

oo’

co

co

CO

CO

CO

xt

xt

CO

CO

CO CO τ-

CO CO

CO

CO

Tabuľka 4 (pokračovanie}

ω	(0	»_ «	<0	CO	CO	(0
c	c	Φ c	c		c	c
φ	Φ	•S φ	Φ	2	Φ	Φ
'o.	‘o.	« g o.	Q.	Q	‘o.	Q.
CO	CO	z D) co	CO	CO	(0	CO
co	CO	Q. O W	CO	2	CO	CO
O	o	oco	O	E	o	o
E	E	g -S E	E	CO	E	E
o	O	2 ® o	o	□	o	o
X	x	Q E x	T	s	x	x

co CO	V“ O	τ- Ο	00 CN	LO	O o	G)
00	CD	O	CD	LD	b*
r* G) λ	’t	M-	CN	O	O)	δ
o	O	CO	Xj-	O	oo
	o	O		CN	CO	o
“i	ω	O	>	O	o	LĽ
<	<	<	<	<	<	<
	t—
	CO	CO				b.
v“	10	LD				CD
y—	co	CO	00	CN	CO	00
M“	G)	G)	LD	LO	r*	b·
h*	T-	»	CN		ID	CO
			00 CN O CN CO >	M-	o
			m	o
CD CO r·* G)	▼“ o 00 o	τΟ 00 χίο	CD O CN 0	to G) O 0 O	G) b* CO OO
LU	o	o	<	<	<	O
S O	O < xŕ	% xŕ	xŕ CO	O ω	ω	u. < ČN
	X	x	ω	ω	ω	<
Z “l	%	%	UJ I	°ι	°ι	CD I
I m	ω	m	x	m	m	1 m
0	0	0	0	0	0	0

O CO Λ	CO CO	O	CO
O ·»“ CD	G) LO	G)	O
O O CM	b* CO	G)	o
xr o v-	O b*	O	M·
CD LU LĽ	-J G)	X
Q < <	< N	<	o
	b*		xr
b- CO	0		CO
CN i- 00	τ- 00	o	IO
CO CO CO	CO O	o	00
xr co co	CO 0)	o	CO
▼“ Ύ~ Τ’-	CD x-	LO	CO

CO <D OJ		in
rr o io “j CO OJ 7X x— CD 0 ° Si O o	CD “2 S Q ω	o G) G) o
> UJ u.	ĽL
ω < <	OT X	< 2!
Šä2j	čo < CĹ
co m m 1 1 1	“l°-|	m 1
1 I 1 CO CO CD	mm	m
0 0 0	0 0	0

<

m i CD 0

G)	CO	CO
G)	o	b*
G)	Q)	co
G)	b-	CN
*φ	CD	G)
b*	b-	b*
CN	CN	CN
O	O	O
CQ	CO	(0
S	S	S

0)

05 G) 05

0

0 0

0)

0)

0)

00

CO

b*

0)

Φ b- 0)

b·

0)

0)

01

q

q

0) 0)

0)

0)

q

q

q

0)

0)

01

0)

0)

0)

ó

N

(D

τ-

CD N

CO

Φ

T“

T

0)

irí

CM

CM

01

CM

O

o

Ο

O O

O

o

o

O

q

O

O

O

O

CO

05

0

σι

CM t^

b-

0

0

oó

Φ

CO

b*

cô

o

CM

CM

T

i“ 0

CM

o

CM

CM

CM

o

CM

O

T-

b*	0 0 0	0	05	o	0		xt	v—	τ-	b-	O 0 0	0
b.	0)	0	CM	T“	0 0	T“	0	0	O	0	0	0	O CM 0	O
m	CM	0	b-	0	01 ID	0	0)	N	0	CM	0)	0	O 0 b-	v-
0	b-	o’	0)	b·’	T“	Φ	0“		O	00	0)	b-’	θ’ 0’ t-“	cd
	0	0	0			0	0	0		0	0)	0	xt	0

ω	<0 CO CO	ω	š g1	CO	CO	CO
c	c c c	□	c	c	c
(D	Φ Φ Φ	□	Φ	Φ	Φ
'o.	Q.Q.Q.	o	Q	’o.	’o.
CQ	CO CO Q	CO	5 c	CD	CQ	®
(0	CO CO (0	3	□ c	(0	<0	ω
0	000	E	E w	O	0	o
E	E E E	CO	« ž	E	E	E
0	000	3	3 (0	O	0	0
r	III	S	S CC	x	I	X

S	φ
<0	CO W
(Q	“ CQ
CT	X CD
O	Q. O
C	O c
ffl	CO CQ
Φ	2 ω
E	□ E

	0									Φ	0
0	0	CM							0)	Ο	Ο 0
0	0	b-	xfr O	0	Φ	b-	0	0	0	Τ-	Ο Φ
b*	0	Τ’	σ> ω	b-		0)	T“		0	Ο	CM 0
0	0)	0	αο ω		Φ	0	0	0	CM	χτ	CM CM

		τ	H			CN	n
CO ω	Φ οο 01 Ο 05 Ο	X m	—I ΙΟ	O	CM 0	0 Φ CN	0 m m·
ο Ο < « 0	Φ 0 Ο ο ο ο Ο Ο < < xf	r-j Q ω I σί	D. ω ω Z) S	I 0 ω Ξ> S	O bΦ D Z X	0 Φ σ < 0 ω	m N σ < in ω
Η	XX	X	O	0	Ó	ω	ω
I,	XX	0-,	5	I,	X	°!	®,
CQ	1 1 m co	1 CO	CD	1 m	1 1 CD	m	m
(5	0 O	0	(D	O	0	0	0

0	Φ φ	φ φ	ζ ιη				S
T“ ω	b- 0	b- 0	0 D.		0 CM	CM	Φ χί-	CM
’t σ	0) 0 <	05 0 <	fc C0	CM LL	CM Φ O	Q. 0	Ο 5	n. Z3
<	<£	$	Φ	O	X	<	I
σί	φ τ-	Φ	0 0	O Φ	U. <	x Q	Φ 0	X Q
ω ω	Η ω	1— ω	<	T“ <	ä	Ξ	hω
0 I	UJ |	ω I	CD 1	m 1	m 1	D. I I	ιωι	0-,
1 CD	1 C0	m	cn	1 m	1 CD	CD	m	CD
0	0	0	0	0	0	0	0	0

b.

0)	Φ
	b	00
	0
xt	01	y_
0)	O
b.	Φ	00
CM	CM	CM
O	O	O
CO	CQ	CQ
č	C	č

CM
00	Φ	Φ
b.		CM
0		b*
0	CM	O
0		CM
Φ	CM	CM
CM	0	0
O	O	O
CO	CO	<0
č	č	C

116

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava celkovej genómovej DNA Corynebacteríum glutamicum ATCC 13032

Kultúra Corynebacteríum glutamicum (ATCC 13032) sa pestovala cez noc pri 30 °C za intenzívneho pretrepávania vBHI médiu (Difco). Bunky sa zbierali centrifugáciou, supernatant sa odhodil a bunky sa resuspendovali v 5 ml tlmivého roztoku-l (5 % pôvodného objemu kultúry - všetky vyznačené objemy boli kalkulované na 100 ml objem kultúry). Zloženie tlmivého roztoku-l: 140,34 g/l sacharózy, 2,46 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 10 ml/l KH2PO4 roztoku (100 g/l, pH upravené s KOH na 6,7), 50ml/l M12 koncentrátu (10 g/l (NH^SO^ 1 g/l NaCI, 2 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 0,2 g/l CaCI₂, 0,5 g/l kvasinkového extraktu (Difco), 10 ml/l zmesi-stopových prvkov (200 mg/l FeSO₄ x H₂O, 10 mg/l ZnSO₄ x 7 H₂O, 3 mg/l MnCI₂ x 4 H₂O, 30 mg/ H3BO3, 20 mg/l CoCI₂ x 6 H₂O, 1 mg/l NiCI₂ x 6 H₂0,3 mg/l Na₂MoO₄x 2 H₂O, 500 mg/l komplexotvorného činidla (EDTA alebo kyseliny citrónovej), 100 ml/l zmesi vitamínov (0,2 mg/l biotínu, 0,2 mg/l kyseliny listovej, 20 mg/l kyseliny p -aminobenzoovej, 20 mg/l riboflavínu, 40 mg/l Ca-pantotenátu, 140 mg/l kyseliny nikotínovej, 40 mg/l pyridoxín hydrochloridu, 200 mg/l myoinozitolu). Lyzozým sa pridal k suspenzii na konečnú koncentráciu 2,5 mg/ml. Po asi 4 h inkubácii pri 37 °C, sa rozložila bunková stena a výsledné protoplasty sa zbierali centrifugáciou. Sediment sa raz premyl s 5 ml tlmivého roztoku-l a raz s 5 ml TE-tlmivého roztoku (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8). Sediment sa resuspendoval v 4 ml TE-tlmivého roztoku a pridalo sa 0,5 ml roztoku SDS (10 %) a 0,5 ml roztoku NaCI (5 M) Po pridaní proteinázy K na konečnú koncentráciu 200 pg/ml sa suspenzia inkubovala cca 18 hodín pri 37 °C. DNA sa purifikovala extrakciou s fenolom, fenolom-chloroformomizoamylakoholom a chloroformom-izoamylalkoholom podlá štandardných metód. Potom sa DNA vyzrážala pridaním 1/50 objemu 3 M octanu sodného a 2 objemov etanolu s následnou 30 minútovou inkubáciou pri -20 °C a 30 minútovou centrifugáciou pri 12 000 otáčkach za minútu (rpm) vo vysokorýchlostnej centrifúge s použitím SS34 rotora (Sorvall). DNA sa rozpustila v 1 ml TE-tlmivého roztoku obsahujúceho 20 pg/ml RNázy A a dialyzovala pri 4 °C proti 1000 ml TE-tlmivého roztoku najmenej 3 hodiny. Počas tohto času sa tlmivý roztok trikrát vymenil. K 0,4 ml alikvotným podielom dialyzovaného roztoku DNA sa pridalo 0,4 ml 2 M LiCI a 0,8 ml etanolu. Po 30 minútovej inkubácii pri 20 °C sa DNA získala cenrifugáciou (13 000 otáčok za minútu (rpm), Biofuge Fresco,

117

Heraeus, Hanau, Nemecko). DNA sediment sa rozpustil vTE-tlmivom roztoku. DNA pripravená týmto postupom sa môže použiť na všetky účely, vrátane metódy južných odtlačkov (southern blotting) alebo konštrukcie genómových knižníc.

Príklad 2

Konštrukcia genómových knižníc Corynebacterium glutamicum ATCC13032 v Escherichia coli

DNA pripravená podľa opisu v príklade 1 sa použila na konštruovanie kozmidových a plazmidových knižníc podľa známych a dobre zavedených metód (pozri napr. Sambrook, J. a kol. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press, alebo Ausubel, F. M. a kol. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons.).

Použiť sa môže akýkoľvek plazmid alebo kozmid. Predovšetkým sa použili plazmidy pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Sci. USA, 75, 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1156), plazmidy sérií pBS (pBSSK+, pBSSK- a ďalšie; Stratagene, LaJolla, USA), alebo kozmidy ako SuperCos 1 (Stratagene, LaJolla, USA) alebo Lorist6 (Gibson, T.J., Rosenthal, A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53, 283-286. Génové knižnice špecifické na použitie v C. glutamicum môžu byť konštruované použitím plazmidu pSL109 (Lee, H.S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4, 256-263).

Príklad 3

Sekvenovanie DNA a komputerová funkčná analýza

Na sekvenovanie DNA podľa štandardných metód sa použili genómové knižnice, opísané v príklade 2, predovšetkým sa použila metóda reťazovej terminácie použitím ABI377 sekvenčných prístrojov (pozri napr. Fleischman, R.D. a kol. (1995) „Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.“, Science, 269, 496-512). Použili sa sekvenčné priméry s nasledovnými nukleotidovými sekvenciami: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3', SEQ ID NO:677 alebo 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', SEQ ID NO:678.

Príklad 4

In vivo mutagenéza

118

In vivo mutagenéza Corynebacterium glutamicum sa môže uskutočniť pasážovaním plazmidu (alebo iného vektora) DNA do E. coli alebo iných mikroorganizmov (napr. do druhov Bacillus alebo kvasiniek ako Saccharomyces cerevisiae), čím sa zhorší ich schopnosť udržať si integritu svojej genetickej informácie. Typické mutátorové kmene majú mutácie v génoch reparačného systému DNA (napr. mutHLS, mutD, mutT, atď.; na porovnanie pozri Rupp, W.D.(1996) DNA repair mechanisms, v Escherichia coli and Salmonella, str. 2277-2294, ASM, Washington.) Takéto kmene sú dobre známe odborníkom, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Použitie takýchto kmeňov je uvedené napríklad v Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7,32-34.

Príklad 5

Transfer DNA medzi Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum

Niektoré druhy Corynebacterium a Brevibacterium obsahujú endogénne plazmidy (ako napr. pHM1519 alebo pBĽI), ktoré sa autonómne replikujú (pozri prehľad, napr. Martin, J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5,137-146). „Shuttle“ vektory pre Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum sa môžu ľahko konštruovať použitím štandardných vektorov pre E. coli (Sambrook, J. a kol. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press alebo Ausubel, F.M. a kol., (1994) „ Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons), ku ktorým sa pridal pôvodný alebo na tento účel replikovaný a vhodný markér z Corynebacterium glutamicum. Takéto zdroje replikácie sa výhodne zvolia z endogénnych plazmidov izolovaných z Corynebacterium alebo Brevibacterium druhov. Predovšetkým výhodné pre tieto druhy je použitie génov zodpovedných za rezistenciu na kanamycín (takých, ktoré sú odvodené zTn5 alebo Tn903 transpozónov) alebo na chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) „From Genes to Clones - Introduction to Gene technology, VCH, Weinheim) ako transformačných markérov. V literatúre existuje mnoho príkladov na konštrukciu „divého“ typu „shuttle“ vektorov, ktoré sa replikujú aj v E. coli aj v C. glutamicum, a ktoré sa môžu použiť na niekoľko účelov, vrátane nadmernej expresie génu (na porovnanie pozri napr. Yoshihama, M. a kol. (1985) J. Bacteriol. 162, 591-597, Martin J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5,137-146 a Eikmanns, B.J. a kol. (199V Gene, 102.93-98).

119

Použitím štandardných metód je možné klonovať gén, ktorý je predmetom záujmu, do jedného zo „shuttle vektorov opísaných vyššie a zaviesť takéto hybridné vektory do kmeňov Corynebacterium glutamicum. Transformácia C. glutamicum sa môže dosiahnuť pomocou protoplastovej transformácie (Kastsumata, R. a kol. (1984) J. Bacterioi. 159, 306-311), elektroporácie (Liebl, E. a kol. (1989) FEMS Microbioi. Letters, 53, 399-303) a v prípadoch, keď sa použijú špeciálne vektory, tiež pomocou konjugácie (ako sa to opisuje napr. v Schäfer, A. a kol. (1990) J. Bacterioi. 172,16631666). Tak isto je možný transfer „shuttle“ vektorov pre C. glutamicum do E. coli pomocou preparácie plazmidovej DNA z C glutamicum (použitím štandardných metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky) a jej transformovaním do E. coli. Takýto transformačný krok sa môže uskutočniť použitím štandardných metód, ale výhodné je použiť Mcr-deficitný kmeň E. coli, ako napríklad NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166,1-19).

Gény sa môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidov, ktoré obsahujú pCG1 (americký patentový spis č. US 4,617,267) alebo ich fragmentov a voliteľne gén rezistencie na kanamycín zTN903 (Grindley, N.D. a Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12), 7176-7180). Okrem toho sa gény môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidu pSL 109 (Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbioi. Biotechnol. 4, 256-263).

Okrem použitia replikačných plazmidov sa nadmerné exprimovanie génu môže tiež dosiahnuť pomocou integrácie do genómu. Genómová integrácia v C. glutamicum alebo iných Corynebacterium alebo Brevibacterium druhoch sa môže uskutočniť pomocou takých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky ako je homológna rekombinácia s genómovou(ými) oblasťou(ami), integrácia usmernená reštrikčnou endonukleázou (REMI) (pozri napr. nemecký patentový spis DE 19823834), alebo prostredníctvom použitia transpozónov. Tak isto je možné modulovať aktivitu génu, ktorý je predmetom záujmu, pomocou modifikovania regulačných oblastí (napr. promótora, represora a/alebo zosilňovača) pomocou sekvenčnej modifikácie, inzercie alebo delécie, využijúc miestne cielené metódy (ako je homológna rekombinácia) alebo metódy založené na náhodných prípadoch (ako transpozónová mutagenéza alebo REMI). Sekvencie nukleových kyselín, ktoré majú funkciu transkripčných terminátorov, sa tiež môžu vložiť 3' ku kódovacej oblasti jedného alebo viacerých génov podľa tohto vynálezu; takéto terminátory sú dobre

120 známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad voWinnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology. VCH, Weinheim.

Príklad 6

Stanovenie expresie mutantných proteínov.

Pozorovania aktivity mutovaných proteínov v transformovanej hostiteľskej bunke sa opierajú o fakt, že mutantný proteín sa exprimuje podobným spôsobom a v porovnateľnom množstve ako „divý“-typ proteínu. Na určenie úrovne transkripcie mutantného génu existuje vhodná metóda (indikátor množstva mRNA dostupnej na transláciu na génový produkt), a to metóda severných odtlačkov (Northern blot) (pozri odkaz napríklad Ausubel a kol.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York), pri ktorej sa primér určený na naviazanie ku génu, ktorý je predmetom záujmu, označí s detegovateľnou značkou, (obyčajne rádioaktívnou alebo chemoluminiscenčnou) tak, že keď sa celková RNA kultúry organizmu vyextrahuje, spracuje na géli, transferuje sa na stabilnú matricu a inkubuje s touto sondou, naviazanie a kvantita naviazania sondy indikuje prítomnosť a tiež množstvo mRNA pre tento gén. Táto informácia je dôkazom stupňa transkripcie mutantného génu. Celková bunková RNA sa môže pripraviť z Corynebacterium. glutamicum pomocou niekoľkých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, ako je opísané v: Bormann, E.R. a kol. (1992) Mol. Microbiol. 6,317-326.

Na stanovenie prítomnosti alebo relatívneho množstva proteínu translatovaného z tejto mRNA sa môžu použiť štandardné metódy, také ako metóda západných odtlačkov (Western blot), (pozri napríklad Ausubel, a kol. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York). Pri tomto procese sa celkový bunkový proteín extrahuje, gélovou elektroforézou sa separuje, prenesie sa na matricu, ako je nitrocelulózová matrica, a inkubuje sa so sondou, ako napríklad protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na požadovaný proteín. Táto sonda je obvykle označená s chemoluminiscenčnou alebo kolorimetrickou značkou, ktorá sa dá ľahko detegovať. Prítomnosť a množstvo pozorovanej značky poukazuje na prítomnosť a množstvo požadovaného mutantného proteínu prítomného v bunke.

Príklad 7

Rast geneticky modifikovanej Corynebacterium. glutamicum - médiá a podmienky kultivácie

121

Geneticky modifikovaná Corynebacterium. glutamicum sa pestuje na syntetickom alebo prírodnom rastovom médiu. Celý rad rôznych rastových médií pre Corynebacteria sú aj dobre známe, aj ľahko dostupné (Lieb, a kol., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 205-210; von der Osteň, a kol., (1998) Biotechnology Letters, H. 11-16; nemecký patentový spis DE 4,120,867; Liebl (1992) „The Genus Corynebacterium, v The Procaryotes, Volume II, Balows, A. a kol., eds. SpringerVerlag). Tieto médiá sa skladajú z jedného alebo viacerých zdrojov uhlíka, zdrojov dusíka, anorganických solí, vitamínov a stopových prvkov. Výhodnými zdrojmi uhlíka sú sacharidy ako mono-, di-, alebo polysacharidy. Napríklad, glukóza, fruktóza, manóza, galaktóza, ribóza, sorbóza, ribulóza, laktóza, maltóza, sacharóza, rafinóza, škrob alebo celulóza sú velYni dobrými zdrojmi uhlíka. Tak isto je možné dodávať sacharid do média prostredníctvom komplexných zlúčenín, ako je melasa alebo vedľajšie produkty pri rafinácii cukru. Tak isto sa môžu výhodne dodávať zmesi rôznych zdrojov uhlíka. Ďalšími možnými zdrojmi uhlíka sú alkoholy a organické kyseliny ako metanol, etanol, kyselina octová alebo kyselina mliečna. Zdrojmi dusíka sú obyčajne organické a anorganické zlúčeniny dusíka, alebo materiály, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny. Príkladnými zdrojmi dusíka sú plynný amoniak alebo amónne soli ako NH₄CI alebo (NFUJaSO^ NH₄OH, dusičnany, močovina, aminokyseliny alebo komplexné dusíkové zdroje ako macerovaný kukuričný mok, sójová múčka, sójový proteín, kvasinkový extrakt, mäsový extrakt a iné.

Zlúčeniny anorganických solí, ktoré sa môžu zahrnúť do médií sú soli vápnika, horčíka, sodíka, kobaltu, molybdénu, draslíka, mangánu, zinku, medi a železa vo forme chloridov, fosforečnanov alebo síranov. Aby sa udržali ióny kovov v roztoku, môžu sa pridať do média chelátotvomé zlúčeniny. Predovšetkým užitočnými chelátotvornými zlúčeninami sú dihydoxyfenoly, ako katechol alebo protokatechinát alebo organické kyseliny, ako napríklad kyselina citrónová. Médiá zvyčajne obsahujú aj ďalšie rastové faktory ako vitamíny alebo rastové promótory, napríklad také ako biotín, riboflavín, tiamín, kyselinu listovú, kyselinu nikotínovú, pantotenát a pyridoxín. Rastové faktory a soli často pochádzajú z komplexných zložiek média ako kvasinkového extraktu, melasy, macerovaného kukuričného moku a ďalších. Presné zloženie média veľmi závisí od bezprostredného pokusu a rieši sa individuálne pre každý špecifický prípad. Informácie o optimalizácii médií sú dostupné v príručke „Applied Microbiol. Physiology, Apractical Approach (eds. P. M. Rhodes, P. F.

122

Stanbury, IRL Press (1997) str. 53-73, ISBN 019 963577 3). Tiež je možné, aby sa zvolilo rastové médium od komerčných dodávateľov, ako štandard 1 (Merck) alebo BHI („grain heart infusion“, DIFCO) alebo ďalšie.

Všetky zložky média sa sterilizujú, buď tepelne (20 minút pri 1,5 bar a 121 °C) alebo sterilnou filtráciou. Zložky sa môžu sterilizovať spolu, alebo ak je to nutné, tak oddelene. Všetky zložky médií môžu byť prítomné na začiatku rastu, alebo sa môžu voliteľne pridávať kontinuálne alebo po dávkach.

Podmienky kultivácie sú určené pre každý pokus osobitne. Teplota by mala byť v rozsahu od 15 °C do 45 °C. Teplota sa môže udržiavať konštantná, alebo sa môže v priebehu pokusu meniť. Hodnota pH média by mala byť v rozpätí od 5 do 8,5, výhodne okolo 7,0 a dá sa udržiavať pomocou prídavku tlmivých roztokov k médiu. Príkladným tlmivým roztokom na tento účel je tlmivý roztok fosforečnanu draselného. Alternatívne alebo súbežne sa môžu používať syntetické tlmivé roztoky ako MOPS, HEPES, ACES a iné. Konštantné pH sa pri kultivácii môže tiež udržať pridaním NaOH alebo NH₄OH počas rastu. Ak sa použijú komplexné zložky do média, ako kvasinkový extrakt, nutnosť používať dodatočné tlmivé roztoky sa môže znížiť v dôsledku toho, že mnohé komplexné zlúčeniny majú vysokú tlmivú kapacitu. Ak sa na kultiváciu mikroorganizmov používa fermentor, tak pH sa dá tiež regulovať použitím plynného amoniaku.

Inkubačný čas je obvykle v rozpätí od niekoľkých hodín až do niekoľkých dní. Tento čas sa zvolí tak, aby sa umožnilo maximálne nazhromaždenie produktu v živnom kvapalnom médiu. Opísané rastové pokusy sa môžu uskutočňovať v rôznych nádobách, napríklad mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo sklenených bankách alebo sklenených alebo kovových fermentoroch rôznych veľkostí. Na skríning veľkého množstva klonov by sa mal mikroorganizmus pestovať v mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo trepacích bankách, buď s alebo bez miešacích zarážok. Výhodne sa používajú 100 ml trepacie banky naplnené na 10% (objemových) s požadovaným rastovým médiom. Banky by sa mali trepať na rotačnej trepačke (rozkmit 25 mm) pri rýchlostnom rozsahu 100 - 300 otáčok za minútu. Straty odparovaním sa môžu znížiť pomocou udržiavania vlhkého ovzdušia; alternatívne by sa mala uskutočniť matematická korekcia strát odparovaním.

123

Ak sa testujú geneticky modifikované klony, mal by sa tiež testovať nemodifikovaný kontrolný kloň alebo kontrolný kloň obsahujúci základný plazmid bez akejkoľvek inzercie. Médium sa inokuluje na 0,5 - 1,5 0D₆oo použitím buniek kultivovaných na agarových platniach ako napríklad CM platniach (10 g/l glukóza, 2,5 g/l NaCI, 2 g/l močovina, 10 g/l polypeptón, 5 g/l kvasinkový extrakt, 5 g/l mäsový extrakt, 22 g/l agar, pH 6,8 s 2 M NaOH), potom sa inkubuje pri 30 °C . Inokulácia média sa dosiahne buď tým, že sa zavedie suspenzia buniek C. glutamicum z CM platní vo fyziologickom roztoku alebo prídavkom kvapalnej predkultivovanej baktérie.

Príklad 8

In vitro analýza funkcie mutantných proteínov

Stanovenie aktivít a kinetických parametrov enzýmov je v danej oblasti techniky zavedené. Pokusy stanoviť aktivitu akéhokoľvek zmeneného enzýmu sa musia prispôsobiť špecifickej aktivite „divého*'-typu enzýmu, čo je v schopnostiach odborníka skúseného v odbore. Všeobecný prehľad o enzýmoch, ako aj špecifické detaily týkajúce sa štruktúry, kinetík, princípov, metód, aplikácií a príklady na stanovenie mnohých enzýmových aktivít sa dajú nájsť napríklad v nasledovných odkazoch: Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht, (1985) Enzýme Structure and Mechanism. Freeman, New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press, Oxford; Boyer, STR. D., ed. (1983) The Enzymes, 3^rd ed. Academic Press, New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^ ed. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., ΘΓββΙ, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^rd ed., vol. I -XII, Verlag Chemie, Weinheim; a Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, „Enzymes“. VCH, Weinheim, str. 352-363.

Aktivita proteínov, ktoré sa viažu na DNA sa môže merať pomocou niekoľkých dobre zavedených metód, ako DNA skúškou pásového posunu (band-shift) (tiež nazývanou gélová retardačná skúška). Vplyv takýchto proteínov na expresiu ďalších molekúl sa môže merať pomocou skúšok s reportérovým génom (tak ako to opisuje

Kolmar, H. a kol. (1995) EMBO J. 14, 3895-3904 a odkazy tam citované). Testovacie systémy reportérového génu sú dobre známe a zavedené na aplikovanie tak

124 v prokaryotických, ako aj eukaryotických bunkách, použitím takých enzýmov ako beta-galaktozidázy, zeleného fluorescenčného proteínu a niekoľkých ďalších.

Stanovenie aktivity membránovo-transportných proteínov možno uskutočniť podľa takých metodík, aké sa opisujú vGennis, R.B. (1989) „ Pores, Channels and Transporters“, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg, str. 85-137 a 270-322.

Príklad 9

Analýza vplyvu mutantného proteínu na produkciu požadovaného produktu

Vplyv genetickej modifikácie v C. glutamicum na produkciu požadovanej zlúčeniny (ako napríklad aminokyseliny) sa môže stanoviť modifikovaním mikroorganizmu vo vhodných podmienkach (ako sú vyššie opísané) a analyzovaním média a/alebo bunkovej zložky na zvýšenú produkciu požadovaného produktu (t.j. aminokyseliny). Takéto analytické metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky a zahŕňajú spektroskopiu, tenkovrstvovú chromatografiu, vyfarbovacie metódy rôzneho druhu, enzýmové a mikrobiologické metódy a analytickú chromatografiu, ako napríklad vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (pozri napríklad: Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 89-90 a str. 443-613, VCH, Weinheim (1985); Fallon, A. a kol.,(1987) Applications of HPLC in Biochemistry“ v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm a kol., (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: „Product recovery and purification“, str. 469-714, VCH, Weinheim; Belter, P.A. a kol. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery process for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, v Ulmann 's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, str. 1-27, VCH, Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Okrem merania konečného produktu fermentácie, je tiež možné analyzovať ďalšie zložky metabolických dráh, ktoré sa využívajú na produkciu požadovanej zlúčeniny, ako napríklad medziprodukty a vedľajšie produkty, aby sa stanovila celková účinnosť produkcie zlúčeniny. Analytické metódy zahrňujú merania hladiny živín v médiu (napr. sacharidov, uhľovodíkov, zdrojov dusíka, fosfátu a ďalších

125 iónov), merania zloženia a rastu biomasy, analýzu produkcie bežných metabolitov biosyntetických dráh a meranie plynov produkovaných počas fermentácie. Štandardné metódy pre tieto merania sú načrtnuté v Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, str. 103-129; 131-163; a 165-192 (ISBN 0199635773) a odkazoch tam citovaných.

Príklad 10

Purifikácia požadovaného produktu z kultúry C. glutamicum

Získanie požadovaného produktu z buniek C. glutamicum alebo supernatantu vyššie opísanej kultúry sa môže uskutočniť rôznymi metódami, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Ak požadovaný produkt nie je vylučovaný z buniek, bunky sa môžu zbierať z kultivácie pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach, potom sa bunky lyžujú štandardnými metódami, ako napríklad mechanickým zásahom alebo sonifikáciou. Bunkový debris sa odstráni centrifugáciou a supernatantná frakcia obsahujúca rozpustné proteíny sa nechá na ďalšiu purifikáciu požadovanej zlúčeniny. Ak je produkt vylučovaný z buniek C. glutamicum, potom sa bunky odstránia z kultúry pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach a supernatantná frakcia sa nechá na ďalšiu purifikáciu.

Supernatantná frakcia z oboch purifikačných metód sa podrobí chromatografii s vhodnou živicou, pri ktorej je požadovaná molekula buď zadržaná na chromatografickej živici, zatiaľ čo mnohé nečistoty nie; alebo pomocou živice sa zadržia nečistoty a nie vzorka. Takéto chromatografické kroky sa môžu opakovať, ak je potrebné, použitím rovnakej alebo rôznych chromatografických živíc. Odborník v danej oblasti techniky by mal byť veľmi skúsený vo výbere vhodných chromatografických živíc, v ich najúčinnejšej aplikácii na príslušnú molekulu, ktorá sa má purifikovať. Purifikovaný produkt sa môže zahustiť pomocou filtrácie alebo ultrafiltrácie a uchovávať pri teplote, pri ktorej stabilita produktu je maximálna.

V danej oblasti techniky je známych veľa purifikačných metód a predchádzajúca metóda purifikácie nie je limitujúcou. Takéto purifikačné metódy sú opísané napr. v Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-HilI, New York (1986).

Identita a čistota izolovaných zlúčenín sa môže stanoviť štandardnými metódami v danej oblasti techniky. Tieto zahŕňajú vysokúčinnú kvapalinovú

126 chromatografiu (HPLC), spektroskopické metódy, vyfarbovacie metódy, tenkovrstvovú chromatografiu, NIRS, enzýmovú .alebo mikrobiologickú skúšku. Takéto metódy analýzy sú zhrnuté v: Patek, a kol. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60, 133-140; Malakhova a kol. (1996) Biotekhnologiya H, 27-32; a v Schmidt a kol., (1998) Bioprocess Engineer. 19, 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH, Weinheim, str. 89-90, str. 521-540, str. 540-547, str. 559-566, 575-581 a str. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. a kol., (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in Biochemistry in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17.

Príklad 11

Analýza génových sekvencií podlá vynálezu

Porovnanie sekvencií a určenie percenta homológie medzi dvoma sekvenciami sú v danej oblasti techniky známe metódy a môžu sa uskutočniť použitím matematického algoritmu ako algoritmu podľa Karlina a Altschula (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-68, modifikovaného podľa Karlina a Altschula (1993) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 90, 5873-77. Takýto algoritmus je inkorporovaný do NBLAST a XBLAST programov (VERSION 2.0), Altschul, a kol. J. Mol. Biol. 215. 403-10. BLAST nukleotidové vyhľadávanie sa môže uskutočňovať s NBLAST programom, „score = 100“, „wordlenght = 12“, aby sa získali nukleotidové sekvencie homológne s MCT molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. BLAST proteínové vyhľadávanie sa môže uskutočniť s XBLAST programom, „score = 50“, „wordlength = 3“, aby sa získali aminokyselinová sekvencie homológne s MCT proteínovými molekulami podľa tohto vynálezu. Aby sa kvôli porovnaniam získali zoradenia s medzerami, môže sa využiť Gapped BLAST, ako sa to opisuje v Altschul a kol., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-3402. Keď sa používajú programy BLAST a Gapped BLAST, odborník skúsený v danej oblasti techniky bude vedieť, ako treba optimalizovať parametre programu (napr. XBLAST a NBLAST) na to, aby sa mohla analyzovať špecifická sekvencia.

Ďalším príkladom matematického algoritmu využívaného sa porovnanie sekvencií je algoritmus podľa: Meyers and Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4,1117). Takýto algoritmus je inkorporovaný do ALIGN programu (verzia 2.0), ktorý je

127 súčasťou GCG sekvenčného zoraďovacieho súboru programov. Ak sa používa na porovnávanie aminokyselinových sekvencií ALIGN program, môže sa použiť PAM120 „weight residue table, „gap length penalty 12“ a „gap penalty 4“. Dodatkové algoritmy pre sekvenčnú analýzu sú známe v danej oblasti techniky, a zahŕňajú ADVANCE a ADAM opísané v: Torelli a Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10, 3-5; a FASTA opísané v: Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85, 2444-8.

Percento homológie medzi dvoma aminokyselinovými sekvenciami sa môže tiež stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov (dostupných na http://www.gcg.com.), použitím buď Blosum 62 matice alebo PAM 250 matice a „gap weight“ 12,10,8, 6 alebo 4 a „length weighť 2,3 alebo 4. Percento homológie medzi dvoma nukleotidovými sekvenciami sa môže stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov, pri použití štandardných parametrov - „gap weighť 50 a „lenght weighť 3.

Porovnávacia analýza génových sekvencií podlá tohto vynálezu s tými, ktoré sú uvedené vGenbank sa uskutočnila pomocou metód, ktoré sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Bexevanis and Ouellete, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons, New York). Génové sekvencie podľa tohto vynálezu sa porovnali s génmi uvedenými v Genbanke trojkrokovým postupom. V prvom kroku sa uskutočnila BLASTIN analýza (napr. lokálna zoraďovacia analýza) pre každú sekvenciu podľa tohto vynálezu voči nukleotidovým sekvenciám uvedeným v Genbanke a najlepších 500 nálezov sa odložilo na dálšie analýzy. Ďalšie FASTA vyhľadávanie (napr. kombinovaná lokálna a globálna analýza zoradenia, v ktorej limitované oblasti sekvencií sú zoradené) sa uskutočnilo na týchto 500 nálezoch. Každá génová sekvencia podľa tohto vynálezu bola dálej globálne priradená ku každému z najlepších troch FASTA nálezov, použitím GAP programu v GCG súbore programov (použitím štandardných parametrov). Za účelom získania správnych výsledkov sa dĺžka sekvencie, vyňatá zGenbanky, upravila na dĺžku vyhľadávaných sekvencií pomocou metód dobre známych v danej oblasti techniky. Výsledky tejto analýzy sú uvedené v tabuľke 4. Výsledné údaje vyžadovali signifikantne kratšie komputerové časy v porovnaní s takouto širokou databázovou GAP (globálnou) analýzou, avšak sú identické s tými, ktoré by sa boli získali samostatne vykonanou GAP (globálnou) analýzou na každom géne podľa tohto vynálezu v porovnaní so všetkými odkazmi v Genbanke. Sekvencie

128 podľa tohto vynálezu, pre ktoré sa nezískali žiadne zoradenia mimo „cutoff“ hodnôt sú uvedené v tabuľke 4 tak, že tam chýbajú informácie o zoradení. Odborník skúsený v odbore si bude ďalej vedomý toho, že percento GAP homológie zoradenia, ktoré sa uvádza v tabuľke 4 pod hlavičkou „% homológie (GAP)“ je uvedené v európskom numerickom tvare, v ktorom - , · predstavuje desatinnú čiarku. Napríklad hodnota „40,345“ v tejto kolónke predstavuje „40,345

Príklad 12

Konštrukcia a funkcia DNA mikromatríc (DNA mikroradov)

Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu okrem toho použiť na konštrukciu a aplikáciu DNA mikromatríc (zostavenie, metodológia a použitia DNA mikromatríc sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad v Schena, M, a kol., (1995) Science 270, 467-470; Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367; DeSaizieu, A. a kol., (1998) Náture Biotechnology 16, 45-48; aDeRisi, J.L. a kol. (1997) Science 278,680-686).

DNA mikromatrice sú pevné alebo flexibilné podklady skladajúce sa z nitrocelulózy, nylonu, skla, silikónu alebo iných materiálov, k povrchu ktorých sa molekuly nukleovej kyseliny môžu pripojiť v určitom usporiadaní. Po vhodnom označkovaní sa môžu ďalšie nukleové kyseliny alebo zmesi nukleových kyselín hybridizovať s imobilizovanými molekulami nukleovej kyseliny a značka sa môže použiť na monitorovanie a meranie individuálnych signálnych intenzít hybridizovaných molekúl v určených oblastiach. Táto metodológia umožňuje súčasne kvantifikovať relatívne alebo absolútne množstvo všetkých alebo zvolených nukleových kyselín v použitej vzorke nukleovej kyseliny alebo zmesi. DNA mikromatrice preto umožňujú analýzu expresie veľkého počtu (až 6800 alebo viac) nukleových kyselín paralelne (pozri napr. Schena, M. (1996) BioEssays 18(5), 427431).

Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu tiež použiť na konštrukciu oligonukleotidových primérov, ktoré sú schopné amplifikovať definované oblasti jedného alebo viacerých C glutamicum génov pomocou takej nukleovokyselinovej amplifikačnej reakcie akou je polymerázová reťazová reakcia. Výber a konštrukcia 5'alebo 3'-oligonukleotidových primérov alebo vhodných spojovníkov umožňuje kovalentné pripojenie výsledných PCR produktov k povrchu podporného média,

129 opísaného vyššie (a tiež opísaného napríklad vSchena, M. a kol. (1995) Science 270, 467-470).

Nukleovokyselinové mikromatrice sa môžu tiež konštruovať pomocou oligonukleotidovej syntézy in situ podľa Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367. Pomocou fotolitografických metód sa presne určené oblasti matrice exponujú na svetle. Ochranné skupiny, ktoré sú fotolabilné, sa týmto spôsobom aktivujú a podliehajú nukleotidovej adícii, zatiaľ čo oblasti, ktoré sú maskované pred svetlom nepodliehajú žiadnej modifikácii. Nasledujúce cykly ochrany aaktivácie svetlom umožňujú syntézu rôznych oligonukleotidov v definovaných pozíciách. Malé, definované oblasti génov podľa tohto vynálezu sa môžu syntetizovať na mikromatriciach pomocou syntézy oligonuleotidov v pevnej fáze.

Molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu prítomné vo vzorke alebo zmes nukleotidov sa môžu hybridizovať s DNA mikromatricami. Tieto molekuly nukleovej kyseliny sa môžu značkovať podľa štandardných metód. Stručne, molekuly nukleovej kyseliny (napr. mRNA molekuly alebo DNA molekuly) sa značia pomocou inkorporácie izotopicky alebo fluorescečne značených nukleotidov, napr. počas reverznej transkripcie alebo syntézy DNA. Hybridizácia značených nukleových kyselín s DNA mikromatricami je opísaná (napr. vSchena, M. akol., (1995); Wodicka, L. a kol., (1997), citované vyššie; aDeSaizieu A. a kol. (1998), citované vyššie). Detekcia a kvantifikácia hybridizovanej molekuly je prispôsobená špecificky inkorporovanému značeniu. Rádioaktívne značenia sa môžu detegovať (napríklad podľa Schena, M. a kol., (1995) citované vyššie;) a fluorescenčné značenia sa môžu detegovať napríklad podľa metódy Shalon a kol. (1996) Genome Research 6, 639645).

Použitie sekvencií podľa tohto vynálezu na DNA mikromatricovú technológiu, ako sa opisuje vyššie, umožňuje porovnávacie analýzy rôznych kmeňov C. glutamicum alebo iných Corynebacteria. Napríklad, výskumy interkmeňových variácií založených na individuálnych transkripčných profiloch a identifikácia génov, ktoré sú dôležité pre špecifické a/alebo požadované vlastnosti kmeňa, ako je patogenita, produktivita a odolnosť voči stresu, sú uľahčené použitím nukleovokyselinových matricových metodík. Nukleovokyselinové matricové technológie je možné použiť tiež na porovnania profilu expresie génov podľa tohto vynálezu v priebehu fermentačnej reakcie.

130

Príklad 13

Analýza dynamiky bunkových proteínových populácií (proteómov)

Gény, kompozície a spôsoby podľa tohto vynálezu sa môžu aplikovať na výskum interakcií a dynamiky populácií proteínov, nazývaných „proteómy“. Proteínové populácie, ktoré sú predmetom záujmu, obsahujú, ale nie sú obmedzené na, celkovú proteínovú populáciu C. glutamicum (napr. v porovnaní s proteínovými populáciami iných organizmov) a tie proteíny, ktoré sú aktívne v špecifických podmienkach prostredia alebo v špecifických metabolických podmienkach (napr. počas fermentácie, pri vysokej alebo nízkej teplote, alebo pri vysokom alebo nízkom pH) alebo tie proteíny, ktoré sú aktívne počas špecifických fáz rastu a vývoja.

Proteínové populácie sa môžu analyzovať pomocou rôznych dobre známych metód, ako napríklad gélovou elektroforézou. Bunkové proteíny sa môžu získať, napríklad, lýzou alebo extrakciou a môžu sa navzájom separovať použitím rôznych elektroforetických metód. Polyakrylamidová gélová elektroforéza s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) separuje proteíny prevažne na základe ich molekulovej hmotnosti. Izoelektricko-fokusačná polyakrylamidová gélová elektroforéza (IEFPAGE) separuje proteíny pomocou ich izoelektrického bodu (ktorý odráža nielen aminokyselinovú sekvenciu, ale tiež potranslačné modifikácie proteínu). Ďalšou, výhodnejšou metódou proteínovej analýzy je následná kombinácia oboch IEF-PAGE a SDS-PAGE metód, známych ako 2-D-gélová elektroforéza (opísaná napríklad v Hermann a kol. (1998) Electrophoresis, 19, 3217-3221; Fountoulakis, a kol. (1998) Electrophoresis, 19, 1193-1202; Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 11841192; Antelmann, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1451-1463). Na proteínovú separáciu sa môžu tiež použiť ďalšie separačné metódy, ako napríklad kapilárna gélová elektroforéza; tieto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Proteíny, ktoré sa separovali pomocou týchto metodík, sa môžu vizualizovať štandardnými metódami, takými ako vyfarbovanie alebo značkovanie. Vhodné vyfarbovacie činidlá sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú Coomassie Brilliant

Blue, striebro alebo fluorescenčné farbivá, ako Sypro Ruby (Molekulové sondy).

Zahrnutie rádioaktívne značených aminokyselín alebo ďalších proteínových prekurzorov (napr. ³⁵S-metionínu, ³⁵S-cysteínu, ¹⁴C-značených aminokyselín, ¹⁵Naminokyselín, ¹⁵NO3 alebo ¹⁵NH₄ ⁺ alebo ¹³C-značených aminokyselín) do média

131

C.glutamicum umožňuje označiť proteín z týchto buniek pred ich separáciou. Podobne sa môžu použiť fluorescenčné značky. Tieto značené proteíny sa môžu extrahovať, izolovať a separovať podľa doteraz opísaných metodík.

Proteíny vizualizované týmito metódami sa môžu v ďalšom analyzovať meraním množstva použitého farbiva alebo značky. Množstvo určitého proteínu sa môže v ďalšom stanoviť kvantitatívne použitím, napríklad, optických metód a môže sa porovnať s množstvom iných proteínov v tom istom géli alebo v iných géloch. Porovnania proteínov na géloch sa môžu urobiť napríklad optickým porovnaním, spektroskopicky, zobrazovacím snímaním a analýzou gélov, alebo použitím fotografických filmov a zobrazení. Takéto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Aby sa stanovila identita ktoréhokoľvek daného proteínu, môže sa použiť priame sekvenovenie alebo iné štandardné metódy. Napríklad sa môže použiť Na/alebo C-koncové aminokyselinové sekvenovanie (ako Edmanova degradácia), ako aj hmotnostná spektrometria (výhodne MALDI alebo ESI metódy (pozri napr. Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192)). Tu poskytnuté proteínové sekvencie sa môže použiť na identifikáciu C. glutamicum proteínov pomocou týchto metodík.

Informácie získané týmito metódami sa môžu použiť na porovnanie podôb proteínovej prítomnosti, aktivity alebo modifikácie medzi rôznymi vzorkami z rozličných biologických podmienok (okrem iného napr. rôzne organizmy, časové podmienky fermentácie, stav média alebo rôzne biotopy). Údaje získané z takýchto pokusov samotných, alebo v kombinácii s ďalšími technológiami, sa môžu použiť na také rôzne aplikácie, ako na porovnanie správania sa rôznych organizmov v určitej (napr. metabolickej) situácii, na zvýšenie produktivity kmeňov, ktoré produkujú špeciálne chemikálie alebo na zvýšenie účinnosti produkcie špeciálnych chemikálií.

Ekvivalenty

Odborníci skúsení v danej oblasti techniky zistia alebo budú schopní len pomocou bežnej rutinnej praxe zistiť mnohé ekvivalenty ku špecifickým uskutočneniam podľa vynálezu, opísaným v tomto dokumente. Takéto ekvivalenty uskutočnení spadajú do rozsahu nasledujúcich patentových nárokov.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacterium glutamicum kódujúca MCT proteín alebo jeho časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené gény uvedené v tabuľke 1.
2. 2. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde uvedená molekula nukleovej kyseliny kóduje MCT proteín zapojený do produkcie špeciálnej chemikálie.
3. 3. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacterium glutamicum zvolená zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden F-označený gén uvedený v tabuľke 1.
4. 4. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
5. 5. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu zvolený zo skupiny aminokyselinových sekvencií zahrňujúcich sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
6. 6. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleotidovou sekvenciou zvolenou zo skupiny sekvencií zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
7. 7. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca najmenej 15 nukleotidový fragment nukleovej kyseliny obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.

   133
8. 8. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá sa hybridizuje s molekulou nukleovej kyseliny podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v stringentných podmienkach.
9. 9. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 alebo jej časť a nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu heterológny polypeptid.
10. 10. Vektor, obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
11. 11. Vektor podľa nároku 10, ktorý je expresným vektorom.
12. 12. Hostiteľská bunka transfekovaná s expresným vektorom podľa nároku 11.
13. 13. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde uvedenou bunkou je mikroorganizmus.
14. 14. Hostiteľská bunka podľa nároku 13, kde uvedená bunka patrí do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium.
15. 15. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde expresiou uvedenej molekuly nukleovej kyseliny sa moduluje produkcia špeciálnej chemikálie z uvedenej bunky.
16. 16. Hostiteľská bunka podľa nároku 15, kde uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
17. 17. Spôsob produkcie polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 12, vo vhodnom kultivačnom médiu, pričom sa produkuje polypeptid.
18. 18. Izolovaný MCT polypeptid z Corynebacterium glutamicum, alebo jeho časť.
19. 19. Polypeptid podľa nároku 18, kde uvedený polypeptid je zapojený do produkcie špeciálnej chemikálie.
20. 20. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z Foznačených génov uvedených v tabuľke 1.

    134
21. 21. Izolovaný polypetid obsahujúci prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jeho časť, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
22. 22. Izolovaný polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21, ktorý ďalej obsahuje heterológne aminokyselinové sekvencie.
23. 23. Izolovaný polypeptid, ktorý je kódovaný molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50% homológna s nukleovou kyselinou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené molekuly nukleovej kyseliny uvedené v tabuľke 1.
24. 24. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s aminokyselinovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z Foznačených génov uvedených v tabuľke 1.
25. 25. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky obsahujúcej vektor podľa nároku 12, pričom sa produkuje špeciálna chemikália.
26. 26. Spôsob podlá nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob dálej zahrňuje krok získania špeciálnej chemikálie z uvedenej kultúry.
27. 27. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob dálej zahrňuje krok transfekcie uvedenej bunky s vektorom podľa nároku 11, pričom sa získa bunka obsahujúca uvedený vektor.
28. 28. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka patrí do rodov Corynebacterium alebo Brevibacterium.
29. 29. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum,

    135

    Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitriiophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum, a tých kmeňov, ktoré sú uvedené v tabuľke 3.
30. 30. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že expresiou molekuly nukleovej kyseliny z uvedeného vektora sa moduluje produkcia uvedenej špeciálnej chemikálie.
31. 31. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
32. 32. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedenou špeciálnou chemikáliou je aminokyselina.
33. 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedená aminokyselina je zvolená zo skupiny zahrňujúcej lyzín, glutamát, glutamín, alanín, aspartát, glycín, serín, treonín, metionín, cysteín, valín, leucín, izoleucín, arginín, prolín, histidín, tyrozín, fenylalanín a tryptofán.
34. 34. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky, ktorej genómová DNA sa zmenila inklúziou molekuly nukleovej kyseliny, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
35. 35. Spôsob diagnostikovania prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje detekciu prítomnosti jednej alebo viacerých sekvencii z 1 až 676 sekvencii SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname v subjekte, pričom sekvencie nie sú alebo nie sú kódované žiadnou z Foznačených sekvencii uvedených v tabuľke 1, čím sa diagnostikuje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte.

    136
36. 36. Hostiteľská bunka, obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde molekula nukleovej kyseliny je porušená.
37. 37. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde molekula nukleovej kyseliny obsahuje jednu alebo viac nukleovokyselinových modifikácií sekvencií, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname.
38. 38. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny zahrňujúcej molekuly nukleových kyselín uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde regulačná oblasť molekuly nukleovej kyseliny je modifikovaná v porovnaní s regulačnou oblasťou “divého”-typu molekuly.