CZ20014660A3 - Geny Corynebacterium glutamicum kódující proteiny účastnící se membránové syntézy a membránového transportu - Google Patents

Description

Geny Corynebacterium glutamicum kódující proteiny membránové syntézy a membránového transportu účastnící se

Související přihlášky

Tato přihláška uplatňuje prioritu z US prozatímní patentové přihlášky č. 60/141031, po‘dané 25.6.1999. Tato přihláška uplatňuje prioritu z německé patentové přihlášky č.

19931454.3,	podané	8.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19931478.0,	podané	8.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19931563.9,	podané	8.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932122.,	podané 9	P7.1999,	německé patentové přihlášky č
19932124.8,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932125.6,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932128.0,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932182.5,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932190.6,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932191.4,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	Č . i
19932209.0,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932212.0,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932227.9,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932228.7,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932229.5,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19932230.9,	podané	9.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.

19932973.7,	podané	14.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19933005.0,	podané	14.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19933006.9,	podané	14.7.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19940764.9,	podané	27.8.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19940765.7,	podané	27.8.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19940766.5,	podané	27.8.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19940830.0,	podané	27.8.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19940831.9,	podané	27.8.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19940832.7,	podané	27.8.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.
19940833.5,	podané	27.8.1999,	německé	patentové	přihlášky	č.

• · ··· ·

19941378.9, pcdané 31.8.1999, německé patentové přihlášky č

19941379.7, pcdané 31.8.1999, německé patentové přihlášky č

19941395.9, pcdané 31.8.1999, německé patentové přihlášky č

19942077.7, pcdané 3.9.1999, německé patentové přihlášky č. 19942078.5, pcdané 3.9.1999, německé patentové přihlášky č. 19942079.3, pcdané 3.9.1999 a německé patentové přihlášky č. 19942088.2, pcdané 3.9.1999. Všechny uvedené přihlášky jsou zde tímto odkazem výslovně zahrnuty.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká izolovaných molekul nukleové kyseliny, označených jako MCT molekuly nukleové kyseliny, které kódují r.ové MCT proteiny Corynebacterium glutamicum. Vynález také poskytuje protismyslné molekuly nukleové kyseliny, rekombinantní expresní vektory obsahující MCT molekuly nukleové kyseliny a hostitelské buňky, do kterých byly vloženy expresní vektory. Vynález dále poskytuje , izolované MCT proteiny, mutované MCT proteiny, fúzní proteiny, antigenní pepcidy a způsoby pro zlepšení produkce požadované sloučeniny z C. glutamicum využívající genetické úpravy MCT genů v tomto organismu.

Dosavadní sta\^r techniky

Některé produkty a vedlejší produkty přirozených metabolických procesů v buňkách jsou použitelné v různých průmyslových aplikacích, například v potravinářském, krmivovém, kosmetickém a farmaceutickém průmyslu. Tyto molekuly, dohromady označované jako čistá chemická činidla zahrnují organické kyseliny, jak proteinogenní, tak neproteinogenrí aminokyseliny, nukleotidy a nukleosidy, lipidy a mastné kyseliny, díoly, karbohydráty, aromatické sloučeniny, vitamíny a kolaktory, a enzymy. Jejich produkce je • · • · «· · ·· • « · · · · • · · · · ·· · • · · ······· · 6 u · · · « · ·

J ······· «· * ······ nejvýhodnější pomocí průmyslové kultivace bakterií upravených tak, aby produkovaly a secernovaly velká množství požadované molekuly. Jedním výhodným organismem pro tento účel je

Corynebacteríum glutamicum, gram-pozitivní nepatogenní bakterie. Pomocí selekce kmenů byly vyvinuto mnoho mutantních kmenů, které produkují různé skupiny požadovaných sloučenin.

Nicméně, selekce kmenů s lepší produkcí určité molekuly je časově náročný a obtížný proces.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje nové bakteriální molekuly nukleové kyseliny, které mají různé použití. Mezi tato použití patří identifikace mikroorganismů, které mohou být použity pro výrobu čistých chemických Činidel, modulace produkce čistých chemických činidel v C. glutamicum nebo příbuzných bakteriích, typizace nebo identifikace C. glutamicum nebo příbuzných bakterií, použití jako referenční místa pro mapování genomu C. glutamicum, a použití jako markérů pro transformaci. Tyto nové. molekuly nukleové kyseliny kódují proteiny, které jsou zde označovány jako proteiny podílející se na stavbě membrány a membránovém transportu (MCT).

C. glutamicum je gram-pozitivní, aerobní bakterie, která se běžně používá v průmyslu pro velkoobjemovou produkci různých čistých chemických činidel a také pro degradaci uhlovodíků (jako například při ropných haváriích) a pro oxidaci terpenoidů. MCT molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být tedy použity pro identifikaci mikroorganismů, které mohou být použity pro produkci čistých chemických činidel, například pomocí fermentačních procesů.

Modulace exprese MCT molekul nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, nebo modifikace sekvence MCT molekul nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, může být • · • · · « ··« ···· • » · · * · · * • · ······· · 4 ♦ · · · · · • « · · ·····» použita pro modulaci produkce jednoho nebo více čistých chemických činidel z mikroorganismu (například pro zvýšení výtěžku nebo produkce jednoho nebo více čistých chemických činidel z Coryr.ebacterium nebo Brevibacterium spp) .

MCT nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro identifikaci mikroorganismu jako je Corynebacterium glutamicum nebo jeho blízký příbuzný, nebo pro identifikaci C. glutamicum nebo jeho příbuzného ve smíšené populaci mikrocrganismů. Vynález poskytuje sekvence nukleové kyseliny mnoha genů C. glutamicum; sondováním genomové DNA extrahované z kultury jediného mikroorganismu nebo směsi mikroorganismů za přísných podmínek za použití sondy odpovídající regionu.genu C. glutamicum, který je jedinečný pro tento organismus, je možno zjistit přítomnost tohoto organismu. Ačkoliv je Corynebacterium glutamicum samo o sobě nepatogenní, je příbuzné s kmeny patogenními u člověka, jako je Corynebacterium diphtheriae (kauzální agens záškrtu); detekce takových organismů má významný klinický význam.

MCT molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou také sloužit jako referenční body při mapování genomu C. glutamicum nebo genomu příbuzných organismů. Obdobně, tyto molekuly nebo jejich varianty nebo části, mohou sloužit jako markéry pro geneticky upravené kmeny Corynebacterium nebo Brevibacterium.

MCT proteiny kódované novými molekulami nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou schopné, například, provádět funkce podílející se na metabolismu (například biosyntéze nebo degradaci) sloučenin nutných pro biosyntézu membrány, nebo se mohou podílet na transmembránovém transportu jedné nebo více sloučenin z buňky nebo do buňky. Za dostupnosti klonovacích vektorů pro použití v Corynebacterium glutamicum, jako jsou • ·· · · · ·· •» « · · · * ···« • * ···· ·· ·

Ι· · 4 »····»· · · • · · · · · · ··· ···· ·,· · ·· «<»·· vektory popsané v Sinskey et al., US patent č. 4694119, a technik pro genetické úpravy C. glutamicum a příbuzných kmenů

Brevibacterium (například lactofermentum) (Yoshihama et al.,

J. Bacteriol 162: 591-597 1985); Katsumata et al. , J.

Bacteriol. 159: 306-311 (1984); a Santamaria et al., J. Gen.

Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)) jsou molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu použitelné při genetických úpravách tohoto mikroorganismu sloužících pro zlepšení produkce jednoho nebo více čistých chemických činidel. Tato zlepšená produkce nebo účinnost produkce čistého chemického činidla může být přímým důsledkem úpravy genu podle předkládaného vynálezu, nebo může být nepřímým důsledkem takové úpravy.

Existuje mnoho mechanismů, kterými může alterace MCT proteinu podle předkládaného vynálezu přímo ovlivnit výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce čistého chemického činidla z C. glutamicum obsahujícího takový pozměněný protein.

MCT proteiny, které se podílejí na exportu čistých chemických činidel z buňky mohou být zmnoženy nebo může být zvýšena jejich aktivita tak, že je větší množství těchto sloučenin secernováno do extracelulárního media, ze kterého jsou potom snadno získány. Obdobně, MCT proteiny, které se podílejí na importu živin nutných pro biosyntézu jednoho nebo více čistých chemických činidel (například fosfátu, síranu, dusíkatých sloučenin atd.) mohou být zmnoženy nebo může být zvýšena jejich aktivita tak, že se zvýší koncentrace takových prekursorů, kofaktorů nebo meziproduktů v buňce. Dále, mastné kyseliny a lipidy jsou sami o sobě čistými chemickými činidly; optimalizací aktivity nebo zvýšením počtu jednoho nebo více MCT proteinů podle předkládaného vynálezu, které se podílejí na biosyntéze těchto sloučenin, nebo snížením aktivity jednoho nebo více MCT proteinů, které se podílejí na degradaci těchto ·· sloučenin,, je možno zvýšit výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce molekul mastných kyselin a lipidů z C. glutamicum.

Mutagenese jednoho nebo více MCT genů podle předkládaného vynálezu může také vést k zisku MCT proteinů majících pozměněné aktivity, které nepřímo ovlivňují produkci jednoho nebo více čistých chemických činidel z C. glutamicum. Například, MCT proteiny podle předkládaného vynálezu podílející se na exportu odpadových produktů mohou být zmnoženy nebo může být zvýšena jejich aktivita tak, že normální metabolické zplodiny buňky (které mohou být produkovány ve vyšším množství v důsledku nadprodukce požadovaného čistého chemického činidla) jsou účinněji exportovány před tím, než mohou poškodit nukleotidy a proteiny v buňce (což sníží životaschopnost buňky) nebo než mohou interferovat s biosyntézou čistých chemických činidel (což snižuje výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce čistého chemického činidla). Dále, relativně vysoké intracelulární koncentrace požadovaného čistého chemického činidla mohou být sami o sobě toxické pro buňku, takže zvýšení aktivity nebo počtu transportérů schopných exportovat tuto sloučeninu z buňky může zvýšit životaschopnost buněk v kultuře, což může zvýšit počet buněk v kultuře produkujících požadované čisté chemické činidlo. MCT proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být také upraveny tak, že jsou produkována různá relativní množství různých lipidů a mastných kyselin. Toto může mít značný vliv na lipidové složení buněčné membrány. Protože má každý typ lipidu různé fyzikální vlastnosti, může alterace lipidového složení membrány významně měnit tekutost membrány. Změny v tekutosti membrány mohou ovlivňovat transport molekul skrz membránu, stejně jako integritu buňky, což má oboje významný vliv na produkci čistých chemických činidel z C. glutamicum ve velkoobjemové fermentační kultuře.

· «· · ·· • * · · · » · · · · · • « ···· ·· ·

Ι· · · ···»·«· · t • · · · » » · ·······«· Λ <·····

Předkládaný vynález poskytuje nové molekuly nukleové kyseliny, které kódují proteiny, zde označované MCT proteiny, které se mohou podílet na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo které se mohou podílet na transportu molekul přes tyto membrány. Molekuly nukleové kyseliny kódující MCT proteiny jsou zde označovány jako molekuly MCT nukleové kyseliny. Ve výhodném provedení se MCT protein podílí na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo na transportu molekul přes tyto membrány. Příklady takových proteinů jsou proteiny kódované geny uvedenými v tabulce I.

V souladu s tím se jeden aspekt předkládaného vynálezu týká izolovaných molekul nukleové kyseliny (například cDNA, DNA nebo RNA) obsahujících nukleotidovou sekvenci kódující MCT protein nebo jeho biologicky aktivní část, stejně jako fragmentů nukleové kyseliny vhodných jako primery nebo hybridizační sondy pro detekci nebo amplifikaci nukleové kyseliny kódující MCT (například DNA nebo rrtRNA) . Ve výhodných provedeních obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny jednu z nukleotidových sekvencí uvedených v lichých sekvencích Seznamu sekvencí (například SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7...) nebo kódující region nebo komplement jedné z těchto nukleotidových sekvencí. V jiném výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje na nebo je alespoň z 50%, lépe alespoň z 60%, ještě lépe alespoň z přibližně 70%, 80% nebo 90%, nejlépe alespoň přibližně z 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo více homologní s nukleotidovou sekvencí uvedenou v lichých sekvencích Seznamu sekvencí (například SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7...) nebo její částí. V jiném výhodném provedení kóduje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jednu z aminokyselinových ·· ·· • ♦ · • · · · · · · · · I * · · ·····*« · ·

Q · «»·«·» « O «♦····· ··· ·»··»· sekvencí uvedených v sudých SEQ ID NO: Seznamu sekvencí (například SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID

NO: 8...) . Výhodné MCT proteiny podle předkládaného vynálezu také mají alespoň jednu ze zde popsaných MCT aktivit.

V jiném výhodném provedení kóduje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu protein nebo jeho část, kde protein nebo jeho část obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je dostatečně homologní k aminokyselinové sekvenci podle předkládaného vynálezu (například k sekvenci označené sudými čísly v Seznamu sekvencí), například dostatečně homologní k aminokyselinové sekvenci podle předkládaného vynálezu tak, že protein nebo jeho část si udržuje MCT aktivitu. Výhodně si protein nebo jeho část kódovaný molekulou nukleové kyseliny zachovává schopnost podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány. V jednom provedení je protein kódovaný molekulou nukleové kyseliny z alespoň přibližně 50%, lépe alespoň z přibližně 60%, ještě lépe alespoň z přibližně 70%, 80% nebo 90%, nejlépe alespoň přibližně z 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo více homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například celou aminokyselinovou sekvencí vybranou ze sekvencí označených sudými čísly v Seznamu sekvencí). V jiném výhodném provedení je proteinem kompletní protein C. glutamicum, který je významně homologní s celou aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (kódovanou otevřeným čtecím rámcem uvedeným v příslušné liché sekvenci Seznamu sekvencí (například SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:

3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7...) ) .

V jiném výhodném provedení je izolovaná molekula nukleové kyseliny získána z C. glutamicum a kóduje protein (například ·· «· · · · ·· «· · · · « · · · · · • ···♦»! · · · · ♦········»·» ···«··«· ··» a··· «· a a * ····

MCT fúzní protein), který obsahuje biologicky aktivní doménu, která je alespoň z 50% nebo více homologní s jednou nebo více aminokyselinovými sekvencemi podle předkládaného vynálezu (například jednou aminokyselinovou sekvencí vybranou ze sekvencí označených sudými čísly v Seznamu sekvencí) a který je schopen podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány, nebo má jednu nebo více aktivit uvedených v tabulce 1, a který dále obsahuje heterologní sekvence nukleové kyseliny kódující heterologní polypeptidy nebo regulační regiony.

V jiném provedení má izolovaná molekula nukleové kyseliny délku alespoň 15 nukleotidů a hybridizuje za přísných podmínek na molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu (například sekvenci označenou lichými čísly v Seznamu sekvencí). Výhodně odpovídá izolovaná molekula nukleové kyseliny přirozené molekule nukleové kyseliny. Ještě lépe izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje přirozený MCT protein C. glutamicum nebo jeho biologicky aktivní část.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká vektorů, například rekombinantních expresních vektorů, obsahující molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, a hostitelských buněk, do kterých byly takové vektory vloženy.

V jednom provedení je taková hostitelská buňka použita pro produkci MCT proteinu kultivací hostitelské buňky ve vhodném mediu. MCT protein může být potom izolován z media nebo z hostitelských buněk.

V ještě jiném aspektu se vynález týká geneticky upraveného mikroorganismu, do kterého byl MCT gen vložen nebo ve kterém byl pozměněn. V jednom provedení byl genom mikroorganismu «· * ·· ·· • * 9 · · · · · * « · • · · · · · · · · , „ * ♦··'··♦♦·«··· «······· ··»··«· «» · ·♦ ··»· pozměněn vložením molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu kódující přirozenou nebo mutovanou MCT sekvenci jako transgenu. V jiném provedení byl endogenní MCT gen v genomu mikroorganismu pozměněn, například funkčně narušen, homologní rekombinací s pozměněným MCT genem. V jiném provedení byl endogenní nebo vložený MCT gen v mikroorganismu pozměněn jednou nebo více bodovými mutacemi, delecemi nebo inversemi, ale tento gen stále ještě kóduje funkční MCT protein. V ještě jiném provedení byl jeden nebo více regulačních regionů (například promotorů, represorů nebo induktorů) MCT genu v mikroorganismu pozměněn (například delecí, zkrácením, inverzí nebo bodovou mutací) tak, že došlo k modulaci exprese MCT genu. Ve výhodném provedení náleží mikroorganismus do rodu Corynebacterium nebo Brevibacterium, a zejména výhodné je Corynebacterium glutamicum. Ve výhodném provedení je mikroorganismus také použit pro produkci požadované sloučeniny, jako je aminokyselina, zejména lysin.

V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro identifikaci přítomnosti nebo aktivity Corynebacterium diphtheriae u jedince. Tento způsob zahrnuje detekci jedné nebo více aminokyselinových sekvenci nebo sekvencí nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu (například SEQ ID NO: 1-676) u jedince, což detekuje přítomnost nebo aktivitu Corynebacterium diphtheriae u jedince.

V ještě dalším aspektu se vynález týká izolovaného MCT proteinu nebo jeho části, například biologicky aktivní části.

Ve výhodném provedení je izolovaný MCT protein nebo jeho část schopen podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány. V jiném výhodném provedení je izolovaný MCT protein dostatečně homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu ·· · • · 1 ♦ · · # * · · · · » « • · · «· « • *· · (například se sudými sekvencemi ze Seznamu sekvencí) tak, že protein nebo jeho část si zachovává schopnost podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány.

Vynález také poskytuje izolovaný přípravek MCT proteinu.

Ve výhodných provedeních obsahuje MCT protein aminokyselinovou sekvenci podle předkládaného vynálezu (například sekvenci vybranou ze sudých sekvencí seznamu sekvencí). V jiném výhodném provedení se vynález týká izolovaného kompletního proteinu, který je významně homologní s celou aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sekvenci vybranou ze sudých sekvencí seznamu sekvencí) (kódovanou otevřeným čtecím rámcem uvedeným v sudých sekvencích seznamu sekvencí) . V ještě jiném provedení je protein alespoň z přibližně 50%, lépe alespoň z přibližně 60%, ještě lépe alespoň z přibližně 70%, 80% nebo 90%, nejlépe alespoň přibližně z 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo více homologní s celou aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sekvencí vybranou ze sekvencí označených sudými čísly v Seznamu sekvencí). V ještě jiném provedení obsahuje MCT protein aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z přibližně 50% nebo více homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například se sekvencí vybranou ze sekvencí označených sudými čísly v Seznamu sekvencí) a která je také schopna podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány, nebo má jednu nebo více aktivit uvedených v tabulce 1.

Alternativně může izolovaný MCT protein obsahovat aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná nukleotidovou sekvencí, která hybridizuje, například za přísných podmínek, • · • · · · · » · · * # ♦ · · » *··· » · ♦ ·

9 ·······♦ ¹ *- «·· ··«· «· · ·« ···· nebo která je alespoň z přibližně 50%, lépe alespoň z přibližně 60%, ještě lépe alespoň z přibližně 70%, 80% nebo

90%, nejlépe alespoň přibližně z 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo více homologní s nukleotidovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako sudá SEQ ID NO. Je také výhodné, aby výhodné formy MCT proteinů měly také jednu nebo více biologických aktivit MCT, které jsou zde popsány.

MCT-polypeptid, nebo jeho biologicky aktivní část, může být operativně navázán na non-MCT polypeptid za vzniku fúzního proteinu. Ve výhodném provedení má fúzní protein aktivitu, která se odlišuje od aktivity MCT proteinu samotného. V jiném výhodném provedení se tento fúzní protein podílí se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány. V zejména výhodném provedení moduluje integrace tohoto fúzního proteinu do buňky produkci požadované sloučeniny buňkou.

V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje, způsob pro skríning molekul, které modulují aktivitu MCT proteinu, buď tím, že interagují s proteinem samotným nebo substrátem nebo vazebným partnerem MCT proteinu, nebo tím, že modulují transkripci nebo translaci molekuly MCT nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu.

Další aspekt vynálezu se týká způsobu produkce čistých chemických činidel. Tento způsob zahrnuje kultivaci buněk obsahujících vektor řídící expresi molekuly MCT nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu tak, že dojde k produkci čistého chemického činidla. Ve výhodném provedení tento způsob dále obsahuje krok získání buňky obsahující takový vektor, ve kterém je buňka transfektována vektorem řídícím expresi MCT nukleové kyseliny. V jiném výhodném provedení tento způsob » ··! * dále zahrnuje krok získání čistého chemického činidla z kultury. V zejména výhodném provedení je buňka z rodu Corynebacterium nebo Brevibacterium, nebo je vybrána z kmenů uvedených v tabulce 3.

Další aspekt vynálezu se týká způsobů pro modulování produkce molekuly z mikroorganismu. Takový způsob zahrnuje kontaktování buňky s činidlem, které moduluje aktivitu MCT proteinu nebo expresi MCT nukleové kyseliny tak, že aktivita asociovaná s buňkou je změněna ve srovnání se stejnou aktivitou za nepřítomnosti činidla. Ve výhodném provedení je buňka modulována v jedné nebo více metabolických dráhách C. glutamicum pro složky buněčné membrány nebo je modulována v transportu sloučenin přes takové membrány tak, že je zlepšena produkce požadovaného čistého chemického činidla mikroorganismem. Činidlem, které moduluje aktivitu MCT proteinu, může být činidlo, které stimuluje aktivitu MCT proteinu nebo expresi MCT nukleové kyseliny. Příklady činidel, které stimulují aktivitu MCT proteinu nebo expresi MCT nukleové kyseliny, jsou malé molekuly, aktivní MCT proteiny a nukleové kyseliny kódující MCT proteiny, které byly vloženy do buněk. Příklady činidel, které inhibují aktivitu MCT proteinu nebo expresi MCT nukleové kyseliny, jsou malé molekuly a protismyslné molekuly MCT nukleové kyseliny.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobů pro modulování výtěžků požadované sloučeniny z buněk, které zahrnují vložení přirozeného nebo mutantního MCT genu do buněk, buď na samostatném plasmidu nebo za integrace do genomu hostitelské buňky. Při integraci do genomu může být tato integrace náhodná nebo může být provedena pomocí homologní rekombinace tak, že přirozený gen je nahrazen vloženou kopií, což způsobí modulaci produkce požadovaného genu buňkou. Ve výhodném provedení jsou výtěžky zvýšeny. V jiném výhodném • · • · · · · · » ♦ » • »·*♦ · · · • · * »»··»·· · Φ • · » · · · · * ··*· «··· provedení je uvedeným chemickým činidlem čisté chemické činidlo. Ve výhodném provedení je uvedeným chemickým činidlem aminokyselina. V zejména výhodných provedeních je uvedenou aminokyselinou L-lysin.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje MCT nukleové kyseliny a proteiny, které se podílejí v C. glutamicum na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán, nebo se podílejí se na transportu molekul přes tyto membrány. Molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro modulaci produkce čistých chemických činidel z mikroorganismů, jako je C. glutamicum, buď přímo (například tehdy, když má nadměrná exprese nebo optimalizace aktivity proteinu podílejícího se na produkci čistého chemického činidla přímý vliv na výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce mastné kyseliny z C. glutamicum), nebo nepřímo (například tehdy, když modulace proteinů podílejících se na metabolismu složek buněčné membrány vede k alteraci ve výtěžku, produkci a/nebo účinnosti produkce složek buněčné membrány, což může mít nakonec vliv na produkci jednoho nebo více čistých chemických činidel. Aspekty vynálezu jsou podrobněji popsány dále.

I. Čistá chemická činidla

Termín čisté chemické činidlo je známý v oboru a označuje molekuly produkované organismem, které jsou využitelné v různých průmyslových odvětvích, jako je farmaceutický, zemědělský a kosmetický průmysl. Mezi takové sloučeniny patří organické kyseliny, jako je kyselina vinná, kyselina itakonová, kyselina diaminopimelová, proteinogenní a nonproteinogenní aminokyseliny, purinové a pyrimidinové baze, nukleosidy a nukleotidy (jak je popsáno například v Kuninaka, • ·» ·· · ·· ·· • · · · · ♦ · ♦ * ♦ 9 « · · ♦ · · #« * • · * ♦ **«*··· · · • · · · · « · · ··· ··*· ·♦ * ·· ····

A. (1996) Nucleotides and related compounds, str. 561-612, v Biotechnology, svazek 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, a citované odkazy), lipidy, nasycené a nenasycené mastné kyseliny (například kyselina arachidonová), dioly (například, propandiol a butandiol), karbohydráty (například kyselina hyaluronová a trehalosa), aromatické sloučeniny (například aromatické aminy, vanilin a indigo), vitamíny a kofaktory (jak je popsáno v Ullmamťs Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A27, Vitamins, str. 443-613 (1996) VCH: Weinheim a citované odkazy; a Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995)

Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific a Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research Asia, 1.-3.9.1994 Penang, Malajsie, AOCS Press, (1995), enzymy, polyketidy (Cane et al. (1998) Science 282:

63-68), a jiná chemická činidla, jak je popsáno v Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation,

ISBN: 0818805086 a citované odkazy. Metabolismus a použití některých těchto čistých chemických činidel je podrobněji popsáno dále.

A. Metabolismus a použití aminokyselin

Aminokyseliny tvoří základní strukturální jednotky všech proteinů a jako takové jsou zásadní pro normální funkci buněk ve všech organismech. Termín aminokyselina je známý v oboru. Proteinogenní aminokyseliny, jichž je 20 typů, slouží jako strukturální jednotky proteinů, ve kterých jsou vázány peptidovými vazbami, zatímco neproteinogenní aminokyseliny (jichž jsou známy stovky) se obvykle nevyskytují v proteinech (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A2, str. 57-97, VCH: Weinheim (1985)). Aminokyseliny mohou mít Dnebo L-optickou konfiguraci, ačkoliv L-aminokyseliny jsou obvykle jediným typem nacházeným v přirozených proteinech.

* ♦ ·· • · ·♦· ·

Biosyntetické a degradační dráhy každé z těchto 20 proteinogenních aminokyselin byly dobře charakterizovány pro prokaryotické i eukaryotické buňky (viz například Stryer, L., Biochemistry, 3. vydání, strany 578-590 (1980)). Esenciální aminokyseliny íhistidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan a valin) jsou takto označovány proto, že v důsledku jejich komplexní biosyntézy je nutná jejich přítomnost v živinách a tyto aminokyseliny jsou snadno přeměnitelné jednoduchými biosyntetickými pochody na zbývajících 11 neesenciálních aminokyselin (alanin, arginin, asparagin, aspartát, cystein, glutamát, glutamin, glycin, prolin, serin a tyrosin). Vyšší živočichové si zachovávají schopnost syntetizovat některé z těchto aminokyselin, ale esenciální aminokyseliny musejí být získány z potravy proto, aby mohla proběhnout normální syntéza proteinů.

Kromě své funkce v biosyntéze proteinů jsou tyto aminokyseliny také zajímavými chemickými činidly sami o sobě a mnoho z nich má různé uplatnění v potravinářském, chemickém, kosmetickém, zemědělském a farmaceutickém průmyslu. Lysin je významnou aminokyselinou nejen při výživě člověka, ale také zvířat s jedním žaludkem, jako je drůbež a prasata. Glutamát se nejčastěji používá jako chuťové aditivum ((natriumglutamát, MSG) a používá se v potravinářském průmyslu, stejně jako aspartát, fenylalanin, glycin a cystein. Glycin, Lmethionin a tryptofan se používají ve farmaceutickém průmyslu. Glutamin, valin, leucin, isoleucin, histidin, arginin, prolin, serin a alanin se používají ve farmacii a v kosmetickém průmyslu. Threonin, tryptofan a D/L-methionin jsou běžnými potravinovými přísadami (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, str. 466-502, v Rehm et al. (eds.) Biotechnology svazek 6., kapitola 14a, VCH: Weinheim). Dále, bylo zjištěno, že tyto aminokyseliny jsou použitelné jako prekursory pro syntézu syntetických aminokyselin a

• · ♦ · • « * • · · w · ♦ proteinů, jako je N-acetylcystein, S-karboxymethyl-L-cystein, (S) -5-hydroxytryptofan a další, jak je popsáno v U]]mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A2, str. 57-97, VCH: Weinheim, 1985.

Biosyntéza těchto přirozených aminokyselin v organismech schopných jejich produkce, jako jsou bakterie, byla dobře charakterizována (pro přehled bakteriální biosyntézy aminokyselin a její regulace viz Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 17: 533-606). Glutamát je syntetizován redukční aminací α-ketoglutarátu, meziproduktu cyklu kyseliny citrónové. Glucamin, prolin a arginin jsou všechny postupně produkovány z glutamátu. Biosyntéza šeřinu je trojstupňový proces začínající na 3-fosfoglycerátu (meziproduktu při glykolýze) vedoucí k zisku této aminokyseliny po oxidaci, transaminaci a hydrolýze. Cystein a glycin jsou produkovány ze šeřinu; cystein kondenzací homocysteinu se serinem a glycin přeměnou vedlejšího řetězce β-uhlíku na tetrahydrofolát v reakci katalyzované serin-transhydroxymethylasou.

Fenylalanin a tyrosin jsou syntetizovány z prekursoru glykolytické a pentosa-fosfátové dráhy, kterým je erythrosa-4fosfát a fosfcenolpyruvát, v 9-stupňové biosyntetické dráze, která se liší pouze v posledních dvou stupních po syntéze prefenátu. Tryptofan je také produkován z těchto dvou počátečních molekul, ale jeho syntéza je 11-stupňovým procesem. Tyrcsin může být také syntetizován z fenylalaninu, v reakci katalyzované fenylalanin-hydroxylasou. Alanin, valin a leucin jsou všechny biosyntetické produkty pyruvátu, což je konečný produkt glykolýzy. Aspartát je tvořen z oxaloacetátu , meziproduktu cyklu kyseliny citrónové. Asparagin, methionin, threonin a lysin jsou produkovány konverzí aspartátu.

Isoleucin je tvořen z threoninu. Komplexní 9-stupňová dráha vede k produkci histidinu z 5-fosforibosyl-l-pyrofosfátu, aktivovaného cukru.

♦ ♦ ·♦ • · » · • · · • · · • · · ·· ···»

Aminokyseliny nadbytečné při syntéze proteinů v buňce nemohou být skladovány a místo toho jsou degradovány za vzniku meziproduktů pro hlavní metabolické dráhy buňky (pro přehled viz Stryer, L., Biochemistry 3. vydání, kapitola 21 Amino Acid Degradation and the Urea Cycle, str. 495-516 (1988)). Ačkoliv je buňka schopná konvertovat nežádoucí aminokyseliny na použitelné metabolické meziprodukty, je produkce aminokyselin nákladná ve smyslu energetických nároků, prekursorových molekul a enzymů nezbytných pro jejich syntézu. Proto není překvapivé, že biosyntéza aminokyselin je regulována zpětnovazebnou inhibicí, ve které přítomnost určité aminokyseliny zpomaluje nebo zcela zastavuje její vlastní produkci (pro přehled zpětnovazebných mechanismů v dráhách biosyntézy aminokyselin viz Stryer, L., Biochemistry 3. vydání, kapitola 24 Biosynthesis of Amino Acids and Heme , str. 575-600 (1988)). Proto je výdej jakékoliv konkrétní aminokyseliny omezen množství této aminokyseliny v buňce.

B. Metabolismus a použití vitamínů, kofaktorů a nutričních faktorů

Vitamíny, kofaktory a nutriční faktory jsou jinou skupinou molekul, kterou vyšší živočichové nemohou syntetizovat a proto musí přijímat v potravě, ačkoli mohou být tyto sloučeniny snadno syntetizovány jinými organismy, jako jsou bakterie.

Tyto molekuly jsou buď biologicky aktivními substancemi sami o sobě, nebo se jedná o prekursory biologicky aktivních substancí, které mohou sloužit jako nosiče nebo meziprodukty v mnoha metabolických dráhách. Kromě nutriční hodnoty mají takové sloučeniny také význam v průmyslu jako barviva, antioxidační činidla a katalyzátory, nebo mohou jinak napomáhat při zpracování (pro přehled struktury, aktivity a průmyslového použití těchto sloučenin viz např. Ullman^s ·« • · • * · • · · · • · ···· • » » • · * ·· ♦

··« ·

Encyclopedia of Industrial Chemistry , Vitamins, svazek. A27, str. 443-613. VCH: Weinheim, 1996.). Termín vitamín je v oboru dobře znám a zahrnuje živiny, které jsou nutné pro normální funkci organismu, ale které organismus sám nemůže syntetizovat. Skupina vitamínů může zahrnovat kofaktory a nutriční faktory. Termín kofaktor zahrnuje neproteinové sloučeniny nutné pro normální enzymatickou aktivitu. Takové sloučeniny mohou být organické nebo anorganické; kofaktorové molekuly podle předkládaného vynálezu jsou výhodně organické. Termín nutriční faktor zahrnuje dietní doplňky mající příznivé účinky na zdravotní stav rostliny nebo zvířete, zejména člověka. Příklady takových molekul jsou vitamíny, antíoxidační činidla a některé lipidy (například polynenasycené mastné kyseliny).

Biosyntéza těchto molekul v organismech schopných jejich produkce, jako jsou bakterie, byla důkladně charakterizována (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vitamins svazek A27, str. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G.

(1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong. A.S., Niki, E. & Packer, L. ( 1995) Nutrition, Lipids, Health, and Dísease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific a Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held Sept. 1-3, 1994, Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign. IL X, 374 S) .

Thiamin (vitamín Βχ) je produkován chemickou kopulací pyrimidinové a thiazolové skupiny. Riboflavin (vitamin B2) je syntetizován z guanosin-5'-trifosfátu (GTP) a ribosa-5'-fosfátu. Riboflavin, je potom použit pro syntézu flavin-mononukleotidu (FMN) a flavin-adenindinukleotidu (FAD). Rodina sloučeniny dohromady označovaných jako vitamín Be (například, pyridoxin, ♦ · • · · • ···♦ • · »· φ

·»»· pyridoxamin, pyrídoxa-5'-fosfát a komerčně používaný pyridoxin, hydrochlorid) jsou deriváty společné strukturální jednotky, 5-hydroxy-6-methylpyridinu. Pantothenát (kyselina pantothenová, (R)-(+)-N-(2,4-dihydroxy-3,3-dimethyl-l-oxobutyl)-13-alanin) může být produkován chemickou syntézou nebo fermentací. Konečným stupně biokonverze pantothenátu je ATP-řízená kondenzace β-alaninu a kyseliny pantoové. Enzymy odpovědné za konverzi na kyselinu pantoovou, na β-alanin a za kondenzaci na kyselinu pantothenovou jsou známé. Metabolicky aktivní formou pantothenátu je koenzym A, jehož biosyntéza pokračuje 5 dalšími kroky. Pantothenát, pyridoxal-5'-fosfát, cystein a ATP jsou prekursory koenzymu A. Tyto enzymy katalyzují nejen tvorbu pant^othenátu, ale také produkci kyseliny (R)-pantoové, kyselina (R)-pantolaktonové, (R)-panthenolu (provitamínu Bs) , pantetheinu (a jeho derivátů) a koenzymu A.

Biosyntéza biotinu z prekursorové molekuly pimeloyl-CoA v mikroorganismech byla studována podrobně a bylo identifikováno několik genů účastnících se této syntézy. Také bylo zjištěno, že mnoho příslušných proteinů se účastní Fecluster syntézy a jsou členy nifS třídy proteinů. Kyselina lipoová je odvozena od kyseliny oktanové s slouží jako koenzym v energetickém metabolismu, kde se stává součástí komplexu pyruvát-dehydrogenasy a komplexu α-ketoglutarát-dehydrogenásy. Foláty jsou skupinou substancí, které jsou všechny deriváty kyseliny listové, která je odvozena od kyseliny L-glutamové, kyseliny p-amino-benzoové a 6-methylpterinu. Biosyntéza kyseliny listové a jejích derivátů, z guanosin-5'-trifosfátu (GTP), kyseliny L-glutamové a kyseliny p-amino-benzoové, byla studována podrobně v některých mikroorganismech.

Corrinoidy (jako jsou kobalaminy a zejména vitamín B12) a porfyriny náleží do skupiny chemických sloučenin charakterizovaných tetrapyrolovým kruhovým systémem.

·· * ·· ·· • · · » ·> *>

« · · * · * ····*·» · · « · · · · · ·« * ·· ····

Biosyntéza vitamínu B12 je dosti komplexní a nebyla doposud zcela charakterizována, ale mnoho enzymů a substrátů účastnících se této syntézy je známých. Kyselina nikotinová (nikotinát) a nikotinamid jsou deriváty pyridinu, které se také označují termínem niacin. Niacin je prekursorem významných koenzymů NAD (nikotin adenin dinukleotid) a NADP (nikotinamid adenin dinukleotidfosfát) a jejich redukovaných forem.

Průmyslová produkce těchto sloučenin spočívá v bezbuněčné chemické syntéze, ačkoliv některé z těchto chemických činidel byly také produkovány průmyslovými kulturami mikroorganismů, jak tomu bylo U, například, riboflavinu, vitamínu Ββ, pant^othenátu a biotinu. Pouze vitamín B12 je produkován pouze fermentací, z důvodu komplexnosti jeho syntézy. Způsoby in vitro vyžadují významné vstupy ve formě materiálu a času, a často jsou velmi nákladné.

C. Metabolismus a použití purinů, pyrimidinů, nukleotidů a nukleosidů

Geny metabolismu purinů a pyrimidinů a jejich příslušné proteiny jsou důležitými cíly pro terapii nádorových onemocnění a virových infekcí. Výraz purin nebo pyrimidin označuje dusíkaté baze, které tvoří nukleové kyseliny, koenzymy a nukleotidy. Termín nukleotid označuje základní strukturální jednotky molekul nukleové kyseliny, které jsou tvořeny dusíkatou baží, pentosovým sacharidem (v případě RNA je sacharidem ribosa; v případě DNA je sacharidem Ddeoxyribosa) a kyselinou fosforečnou. Výraz nukleosid označuje molekulu, která slouží jako prekursor pro nukleotidy, ale která neobsahuje kyselinu fosforečnou, kterou nukleotidy obsahují. Inhibicí biosyntézy těchto molekul nebo jejich mobilizací za tvorby molekul nukleové kyseliny je možné •» · · · · · * · *' » • » • · ♦ » · ·♦·· · « · · «·»«···· zz ··· #··· ·· « ·· ···» inhibovat syntézu RNA a DNA; inhibicí této aktivity v nádorových buňkách může být inhibována schopnost dělení a replikace nádorových buněk. Dále, existují nukleotidy, které netvoří molekuly nukleové kyseliny, ale slouží spíše jako zásobníky energie (tj. AMP) nebo jako koenzymy (t.t. FAD a

NAD) .

Několik publikací popsalo použití těchto chemických činidel pro tyto indikace, pomocí ovlivnění metabolismu purinů a/nebo pyrimidinů (například Christopherson R.I. and Lyons, S.D.

(1990), Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents Med. Res. Reviews 10: 505-548). Studie enzymů účastnících se metabolismu pyrimidinů a purinů byly zaměřeny na vývoj nových léků, které mohou být použity například jako imunosupresiva a antiproliferační činidla (Smith. J.L., (1995) Enzymes in nucleotide synthesis,

Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 752-757; (1995) Biochem Soc.

Transact. 23: 877-902). Nicméně, purinové a pyrimidinové baze, nukleotidy a nukleosidy, mají další použití: jako meziprodukty při biosyntéze několika čistých chemických činidel (například thiaminu, 5-adenosyl-methioninu, folátů nebo riboflavinu), jako zásobníky energie pro buňku (např. ATP nebo GTP) a jako chemická činidla samotná, kdy se běžně používají jako dochucovací činidla (např. IMP nebo GMP) nebo pro některé lékařské aplikace (viz například Kuninaka_f A. (1996)

Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology svazek 6,

Rehrn el al., eds. VCH: Weinheim_f str. 561-612). Také enzymy účastnící se metabolismu purinu, pyrimidinů, nukleosidů nebo nukleotidů častě slouží jako cíle, proti kterým jsou vyvíjena chemická činidla pro ochranu plodin, včetně fungicidů, herbicidů a insekticidů.

Metabolismus těchto sloučenin u bakterií byl dobře charakterizován (pro přehled viz například Zalkín, H. a Dixon, «· * » · · • » · • · » » • · · · »·»« ·· « ·· *· • * · · • « e • · · • · · • · ··* · ·«

J.E. (1992) de novo purine nucleotide biosynthesis, v: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, svazek 42, Academie Press: str. 259-287; a Michal. G. (1999) Nucleotides and Nucleosides, kapitola 8 v: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology.

Wiley: New York). Metabolismus purinů byl předmětem intenzivního výzkumu a je zásadní pro normální fungování buňky. Porucha metabolismu purinů u vyšších organismů může způsobit závažné onemocnění, jako je dna. Purinové nukleotidy jsou syntetizovány z ribosa-5-fosfátu v sérii stupňů inosin-5'fosfát (IMP), což vede k produkci guanosin-5'-monof osf átu (GMP) nebo adenosin-5'-monofosfátu (AMP), ze které se snadno tvoří trifosfátové formy využité jako nukleotidy. Tyto sloučeniny se také využívají jako zásobníky energie, protože jejich degradace poskytuje energii pro mnoho různých biochemických procesů v buňce. Biosyntéza pyrimidinu pokračuje tvorbou uridin-5'-monofosfátu (UMP) z ribosa-5-fosfátu. UMP se potom přemění na cytidin-5'-trifosfát (CTP) . Deoxy- formy všech těchto nukleotidů se produkují v jednostupňové redukční reakci z difosfátribosové formy nukleotidu na difosfátdeoxyribosovou formu nukleotidu. Po fosforylaci se mohou tyto molekuly účastnit syntézy DNA.

D. Metabolismus a použití trehalosy

Trehalosa se skládá ze dvou molekul glukosy vázaných α,α1,1 vazbou, běžně se používá v potravinářském průmyslu jako sladidlo, přísada do sušených nebo mražených potravin a v nápojích. Nicméně, má také použití ve farmacii, kosmetice a biotechnologii (viz například Nishimoto et al., (1998), US patent č. 5759610; Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva, C.L.A and Pánek, A.D. (1996) Biotech. Ann. Rev. 2: 293-314; a Shiosaka, M., (1997),

·» « · · · • · « • · · ··«·

J. Japan 172: 97-102). Trehalosa je produkována enzymy z mnoha mikroorganismů a je uvolňována do media, ze kterého může být získána metodami známými v oboru.

II. Biosyntéza membrán a transmembránový transport

Buněčné membrány mají v buňce různé funkce, ^rvní a nejvýznamnější funkcí je to, že membrána odděluje obsah buňky od okolí, a tak způsobuje integritu buňky. Membrány mohou také sloužit jako bariéry zabraňující toku nebezpečných nebo nežádoucích sloučenin a také úniku žádoucích sloučenin.

Buněčné membrány jsou nepropustné pro nepodporovanou difusi hydrofilních sloučenin, jako jsou proteiny, molekuly vody a ionty, což je způsobeno jejich strukturou, která je tvořena dvojvrstvou lipidových molekul, ve kterých jsou polární skupiny od sebe (směrem vně a do nitra buňky) a nepolární skupiny k sobě (do centra membrány), což tvoří hydrofobní jádro (pro obecný přehled struktury a funkce membrány viz Gennis, R.B. (1989) Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg). Tato bariéra umožňuje buňkám udržovat relativně vysoké koncentrace požadovaných sloučenin a relativně nízké koncentrace nežádoucích sloučenin, které jsou obsaženy v okolním mediu, protože difuse těchto sloučenin je účinně blokována membránou. Nicméně, membrána také představuje účinnou bariéru pro import požadovaných sloučenin a export odpadních molekul. Pro překonání této obtíže jsou do buněčných membrán zapracovány různé transportérové proteiny, které usnadňují transmembránový transport různých sloučenin.

Existují dvě základní třídy těchto transportních proteinů: póry nebo kanály a transportéry. První jsou integrálními membránovými proteiny, někdy komplexy proteinů, které vytvářejí regulovaný otvor v membráně. Tato regulace neboli „otevírání je specifická pro molekuly, které mají být transportovány pórem nebo kanálem, takže jsou tyto • ···· • · · *· · · · · • · · · · • · · ···· ·

transmembránové konstrukty selektivně permeabilní pro specifické třídy substrátů; například draslíkový kanál je konstruován tak, že jím mohou procházet pouze ionty mající podobný náboj a velikost jako draslík. Kanály a póry mívají samostatné hydrofobní a hydrofilní domény tak, že hydrofobní povrch proteinu se může asociovat s vnitřkem membrány, zatímco hydrofilní povrch ohraničuje vnitřek kanálu a vytváří hydrofilní prostředí, kterým může procházet vybraná hydrofilní molekula. V oboru je známo mnoho takových pórů/kanálů, včetně draslíkového, vápníkového, sodíkového a chloridového kanálu.

Tento systém zprostředkovaný póry a kanály usnadňujícími difusi je omezen na velmi malé molekuly, jako jsou ionty, protože póry nebo kanály dostatečně velké pro průnik celých proteinů facilitovanou difusi by nemohly zabránit současnému průniku malých hydrofilních molekul. Transport molekul tímto procesem je někdy označován jako facilitovaná difuse, protože pro transport je nutný koncentrační gradient. Permeasy také umožňují facilitovanou difusi větších molekul, jako je glukosa a jiné sacharidy, do buňky, když je koncentrace těchto molekul na jedné straně membrány vyšší než na druhé. Oproti pórům nebo kanálům netvoří tyto integrální membránové proteiny (často, mající mezi 6-14 α-šroubovicemi v membráně) otevřené kanály skrz membránu, ale místo toho váží cílovou molekulu na povrch membrány a potom proběhne přestavba konformace tak že je cílová molekula uvolněna na opačné straně membrány.

Nicméně, buňky často potřebují importovat nebo exportovat molekuly proti existujícímu koncentračnímu gradientu (aktivní transport), což je situace, ve které nemůže dojít k facilitované difusi. Existují dva obecné mechanismy využívané buňkami pro takový membránový transport; symport nebo antiport, a transport vázaný na energii, jak je zprostředkován například ABC transportéry. Symportní a • ·· ·· © ·· ·· • · · « · · · ·«·· • · · · · · · t · gt · ♦ · * · ···· · · · ·

ΖΟ * · · · Λ · « · *·· ···· ·· * ·· ···· antíportní systémy spojují pohyb dvou různých molekul přes membránu (cestou permeas majících dvě samostatná vazebná místa pro dvě různé molekuly); při symportu jsou obě molekuly transportovány stejným směrem, zatímco při antiportu je jedna molekula importována, zatímco druhá je exportována. Toto je energeticky možné, protože jedna z těchto molekul se pohybuje v souladu s koncentračním gradientem, a tento energeticky výhodný děj je možný pouze při současném pohybu požadované sloučeniny proti koncentračnímu gradientu. Jednotlivé molekuly mohou být transportovány přes membránu proti koncentračnímu gradientu v energeticky řízeném procesu, jak je tomu u ABC transportérů. V tomto systému obsahuje transportní protein lokalizovaný v membráně vazebnou kazetu pro ATP; po vazbě na cílovou molekulu se ATP přemění na ADP+Pi, a uvolněná energie se využije pro transport cílové molekuly na opačnou stranu membrány, který je zprostředkován transportérem. Pro podrobnější popis všech těchto transportních systémů víz:

Bamberg, E. et al., 1993, Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Findlay,

J.B.C. (1991) Structure and function in membrane transport systems, Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 804-810; Higgins, C.F.

(1992) ABC transporters from miroorganisms to man, Ann. Rev.

Cell. Biol. 8: 67-113; Gennís, R.B. (1989) Pores, Channels a Transporters, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, str. 270-322; a Nikaido, H. and Saier, H. (1992) Transport proteins in bacteria: common themes in their design, Science 258: 936-942, a odkazy citované v uvedených odkazech.

Syntéza membrán je dobře charakterizovaný proces, na kterém se podílí mnoho složek, z nichž nejvýznamnější jsou molekuly lipidů. Syntéza lipidů může být rozdělena na dvě části: na syntézu mastných kyselin a jejich navázání na sn-glycerol-3fosfát, a adici nebo modifikaci polárních hlavových skupin.

• · *· · · · ♦ · · · * • · · · · • · · ····· ···· ·· 4 ·· e···

Mezí obvyklé lipidy využívané v bakteriálních membránách patří fosfolipidy, glykolipidy, sfingolipidy a fosfoglyceridy. Syntéza mastných kyselin začíná konverzí acetyl CoA buď na malonyl CoA působením acetyl CoA karboxylasy, nebo na acetylACP působením acetyltransferasy. Po kondenzační reakci tvoří tyto dva produkty dohromady acetoacetyl-ACP, který je konvertován sérií kondenzačních, redukčních a dehydratačních reakcí za zisku molekuly nasycené mastné kyseliny s požadovanou délkou řetězce. Produkce nenasycených mastných kyselin z takových molekul je katalyzována specifickými desaturasami buď aerobně, za využití molekulového kyslíku, nebo anaerobně (pro přehled syntézy mastných kyselin viz F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella, ASM Press: Washington D.C., str. 612-636 a citované odkazy; Lengeler et al., (ed.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart,

New York, a citované odkazy; a Magnuson, K. et al. (1993) Microbiological Reviews 57: 522-542, a citované odkazy). Cyklopropanové mastné kyseliny (CFA) jsou syntetizovány specifickou CFA-synthasou za použití SAM jako kosubstrátu. Rozvětvené mastné kyseliny jsou syntetizovány z aminokyselin s rozvětveným řetězcem, které jsou deaminovány za zisku rozvětvených 2-oxo-kyselín (viz Lengeler et al., (ed.) (1999)

Biology of Procaryotes. Thiemé: Stuttgart, New York, a citované odkazy). Jiným základním krokem při syntéze lipidů je přenos mastných kyselin na polární hlavové skupiny, působením - například - glycerol-fosfát-acetyltransferas. Kombinace různých prekursorových molekul a biosyntetických enzymů vede k produkci různých mastných kyselin, což má významný vliv na složení membrány.

III. Aspekty a způsoby podle předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález je založen, alespoň částečně, na objevu nových molekul, zde označovaných jako MCT nukleové kyseliny a • ·* ·«· ·· ···· · · · · · • · · · · · · f • · · · ······· 4 proteiny, které se podílejí na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány. V jednom provedení se MCT molekuly podílejí na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo se podílejí na transportu molekul přes tyto membrány. Ve výhodném provedení má aktivita MCT molekul podle předkládaného vynálezu podílející se na produkci složek membrány nebo membránovém transportu vliv na produkci požadovaného čistého chemického činidla C. glutamicum. V zejména výhodném provedení mají MCT molekuly podle předkládaného vynálezu modulovanou aktivitu, takže metabolické dráhy C. glutamicum, na kterých se MCT molekuly podílejí, mají také pozměněnou aktivitu, což vede přímo nebo nepřímo k modulaci výtěžku, produkce a/nebo účinnosti produkce daného čistého chemického činidla v C. glutamicum.

Termín MCT protein nebo MP polypeptid označuje proteiny, které se podílejí na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo na transportu molekul přes tyto membrány. Příklady MCT proteinů jsou proteiny kódované MCT geny uvedenými v tabulce 1 a v lichých sekvencích Seznamu sekvencí. Termíny MCT gen nebo sekvence MCT nukleové kyseliny označují sekvence nukleové kyseliny kódující MCT protein, které se skládají z kódujícího regionu a také příslušných netranslatovaných 3' a 5' regionů. Příklady MCT genů jsou geny uvedené v tabulce 1. Termíny produkce nebo produktivita jsou v oboru známé a označují koncentraci produktu fermentace (například požadovaného čistého chemického činidla) vytvořeného během dané doby v daném fermentačním objemu (například kg produktu za hodinu na litr). Termín účinnost produkce označuje dobu nutnou pro dosažení určité úrovně produkce (například jak dlouho bude trvat dosažení • · · · • · · • · ♦ • · · < « · · · a určitého stupně výdeje čistého chemického činidla). Termín výtěžek nebo výtěžek produktu/uhlík jsou v oboru známé a označují účinnost konverze zdroje uhlíku na produkt (tj. čisté chemické činidlo). Toto se obvykle udává jako kg produktu na kg zdroje uhlíku. Zvýšením výtěžku nebo produkce sloučeniny se zvyšuje množství získaných molekul této sloučeniny v daném množství kultury během dané doby. Termíny biosyntéza nebo biosyntetická dráha” jsou v oboru známé a označují syntézu sloučeniny, výhodně organické sloučeniny, buňkou z meziproduktu, což může být mnohostupňový a vysoce regulovaný proces. Termíny degradace nebo degradační dráha jsou v oboru známé a označují rozklad sloučeniny, výhodně organické sloučeniny, buňkou na produkty degradace (obecně řečeno menší nebo méně komplexní molekuly), což může být mnohostupňový a vysoce regulovaný proces.. Výraz metabolismus je v oboru známý a označuje všechny biochemické reakce, které probíhají v organismu. Metabolismus konkrétní sloučeniny (například metabolismus aminokyseliny, jako je glycin) se skládá ze všech biosyntetických, modifikačních a degradačních drah v buňce souvisejících s touto sloučeninou. . ..

V jiném provedení jsou MCT molekuly podle předkládaného vynálezu schopné modulovat produkci dané molekuly, jako je čisté chemické činidlo, v mikroorganismu, jako je C. glutamicum. Existuje mnoho mechanismů, kterými může alterace MCT proteinu podle předkládaného vynálezu přímo ovlivňovat výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce čistého chemického činidla v kmenu C. glutamicum obsahujícím takový pozměněný protein. MCT proteiny, které se podílejí na exportu čistých chemických činidel z buňky mohou být zmnoženy nebo může být zvýšena jejich aktivita tak, že je větší množství těchto sloučenin secernováno do extracelulárního media, ze kterého jsou potom snadno získány. Obdobně, MCT proteiny, které se podílejí na importu živin nutných pro biosyntézu jednoho nebo • · ·· ·

*

• · • · · · • ?

více čistých chemických činidel (například fosfátu, síranu, dusíkatých sloučenin atd.) mohou být zmnoženy nebo může být zvýšena jejich aktivita tak, že se zvýší koncentrace takových prekursorů, kofaktorů nebo meziproduktů v buňce. Dále, mastné kyseliny a lipidy jsou sami o sobě čistými chemickými činidly; optimalizací aktivity nebo zvýšením počtu jednoho nebo více MCT proteinů pcdle předkládaného vynálezu, které se podílejí na biosyntéze těchto sloučenin, nebo snížením aktivity jednoho nebo více MCT proteinů, které se podílejí na degradaci těchto sloučenin, je možno zvýšit výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce· mastných kyselin a lipidů z C. glutamicum.

Mutagenese jednoho nebo více MCT genů podle předkládaného vynálezu může také vést k zisku MCT proteinů majících pozměněné aktivity, které nepřímo ovlivňují produkci jednoho nebo více čistých chemických činidel z C. glutamicum. Například, MCT proteiny podle předkládaného vynálezu podílející se na exportu odpadových produktů mohou, být zmnoženy nebo může' být zvýšena jejich aktivita tak, že normální metabolícké zplodiny buňky (které mohou být produkovány ve vyšším množství vdůsledku ňadprodukce požadovaného čistého chemického činidla) jsou účinněji exportovány před tím, než·'mohou poškodit nukleotidy a proteiny v buňce (což sníží životaschopnost buňky) nebo než mohou interferovat s biosyntézou čistých chemických činidel (což snižuje výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce čistého chemického činidla). Dále, relativně vysoké intracelulární koncentrace požadovaného čistého chemického činidla mohou být sami o sobě toxické pro buňku, takže zvýšení aktivity nebo počtu transportérů schopných exportovat tuto sloučeninu z buňky může zvýšit životaschopnost buněk v kultuře, což může zvýšit počet buněk v kultuře produkujících požadované čisté chemické činidlo. MCT proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být také upraveny tak, že jsou produkována různá

I

• · i

I relativní množství různých lipidů a mastných kyselin. Toto může mít značný vliv na lipidové složení buněčné membrány. Protože má kažcý typ lipidu různé fyzikální vlastnosti, může alterace lipidového složení membrány významně měnit tekutost membrány. Změny v tekutosti membrány mohou ovlivňovat transport molekul skrz membránu, stejně jako integritu buňky, což má oboje významný vliv na produkci čistých chemických činidel z C. giutamicum ve velkoobjemové fermentační kultuře.

Izolované sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou obsaženy v genomu kmene Corynebacterium giutamicum uloženého v American Type Culture Collection pod č. ATCC 13032. Nukleotidové sekvence izolované C. giutamicum MCT DNA a předpokládané aminokyselinové sekvence MCT proteinů C. giutamicum jsou uvedeny v Seznamu sekvencí v lichých SEQ ID NO: a sudých SEQ ID NO:, v příslušném pořadí. Byly provedeny počítačové analýzy, které klasifikovaly a/nebo identifikovaly tyto nukleotidové sekvence jako sekvence, které kódují proteiny, které se u C. giutamicum podílejí na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. giutamicum, nebo na transportu molekul přes tyto membrány.

Předkládaný vynález se také týká proteinů, které mají aminokyselinovou sekvenci, která je významně homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sekvencí uvedenou v sudých SEQ ID NO: Seznamu sekvencí). V předkládaném vynálezu je protein mající aminokyselinovou sekvenci, která je významně homologní k dané aminokyselinové sekvenci, alespoň z 50% homologní s danou aminokyselinovou sekvencí, například s celou danou aminokyselinovou sekvencí. Protein mající aminokyselinovou sekvenci, která je významně homologní k dané aminokyselinové sekvenci, může být také alespoň z přibližně 50-60%, lépe alespoň z přibližně 60-70%, a ještě lépe alespoň z přibližně • · · ♦

70-80%, 80-90% nebo 90-95%, a nejlépe z alespoň přibližně 96%, 97%, 98%, 99% nebo více procent homologní s danou aminokyselinovou sekvencí.

MCT protein nebo jeho biologicky aktivní část nebo fragment podle předkládaného vynálezu se může podílet na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo na transportu molekul přes tyto membrány, nebo může mít jednu nebo více aktivit uvedených v tabulce 1.

Různé aspekty vynálezu jsou podrobně popsány v následujících oddílech.

A. Izolované molekuly nukleové kyseliny

Jeden aspekt vynálezu se týká izolovaných molekul nukleové kyseliny, které kódují MCT polypeptidy nebo jejich biologicky aktivní části, stejně jako fragmentů nukleových kyselin dostatečných pro použití jako hybridizační sondy nebo primery pro identifikaci nebo amplifikaci nukleové kyseliny kódující MCT (například MCT DNA). Termín molekula nukleové kyseliny, jak je zde použit, označuje DNA molekuly (například cDNA nebo genomové DNA) a RNA molekuly (například mRNA) a analogy DNA nebo RNA připravené za použití analogů nukleotidů. Termín také zahrnuje netranslatované sekvence na 3' a 5' koncích kódujícího regionu genu: alespoň přibližně 100 nukleotidů sekvence před 5' koncem kódujícího regionu a alespoň přibližně 20 nukleotidů sekvence za 3' koncem kódujícího regionu genu. Molekula nukleové kyseliny může být jednořetězcová nebo dvouřetězcová, ale výhodně se jedná o dvouřetězcovou DNA. izolovaná molekula nukleové kyseliny je taková molekula, která je separovaná od jiných molekul nukleové kyseliny, které jsou přítomny v přirozeném zdroji nukleové kyseliny. Výhodně je izolovaná •· ·· » ·· ·» • · · · · · · · · • · · · · φ · · * · · )··«··· · ¢, • · < * » · · • · · · · · · · * · · · « nukleová kyselina prostá sekvencí, které za přirozeného stavu sousedí s nukleovou kyselinou (tj. sekvencí přítomných na 5' a 3' koncích nukleové kyseliny) v genomové DNA organismu, ze kterého je nukleová kyselina získána. Například, v různých provedeních může izolovaná molekula MCT nukleové kyseliny obsahovat méně než přibližně 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb nebo 0,1 kb nukleotidových sekvencí, které za přirozeného stavu sousedí s molekulou nukleové kyseliny v DNA buňky, ze které je nuklecvá kyselina získána (například buňky C. glutamicum). Déle, izolovaná molekula nukleové kyseliny, jako je molekula DNA, může být významně prostá jiného buněčného materiálu, nebe kultivačního media, když je produkována rekombinantními technikami, nebo chemických prekursorů nebo jiných chemických činidel, když je syntetizována chemicky.

Molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, například molekula nukleové kyseliny mající sekvenci uvedenou v lichých SEQ ID NO: Seznamu sekvencí, nebo její část, může být izolována za použití standardních technik molekulární biologie a informacích o sekvenci, které jsou zde uvedeny.·

Například MCT DNA C. glutamicum může být izolována z knihovny C. glutamicum za použití celé nebo části,jedné z lichých SEQ ID NO: Seznamu sekvencí jako hybridizační sondy a za použití standardní hybridizační techniky (jak je popsána například v Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989).

Dále, molekula nukleové kyseliny obsahující celou nebo část sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu (například sekvenci uvedenou v lichých SEQ ID NO: Seznamu sekvencí) může být izolována polymerasovou řetězovou reakcí za použití oligonukleotidových primerů navržených podle této sekvence (například molekula nukleové kyseliny obsahující celou nebo čásc sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného

vynálezu (například sekvenci uvedenou v lichých SEQ ID NO: Seznamu sekvencí) může být izolována polymerasovou řetězovou reakcí za použití oligonukleotidových primerů navržených podle této stejné sekvence). Například, mRNA může být izolována z normálních endotelových buněk (například guanidiniumthiokyanatanovou extrakcí podle Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) a DNA může být připravena pomocí reverzní transkriptasy (například Moloney MLV reversní transkriptasy, která je dostupná od Gibco/BRL, Bethesda, MD; nebo AMV reverzní transkriptasy, která je dostupná od Seikagaku America, lne., St. Petersburg, FL). Syntetické oligonukleotidové primery pro amplifikaci v polymerasové řetězové reakci mohou být navrženy podle jedné z nukleotidových sekvencí uvedených v Seznamu sekvencí. Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být amplifikována za použití cDNA - nebo alternativně genomové DNA - jako templátu a vhodných oligonukleotidových primerů, za použití standardních technik PCR amplifikace. Takto amplifikovaná nukleová kyselina může být klonována do vhodného vektoru a charakterizována analýzou DNA sekvence. Dále, oligonukleotidy odpovídající MCT nukleotidové sekvenci mohou být připraveny standardními syntetickými technikami, například za použití automatizovaného DNA syntezátoru.

Ve výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jednu z nukleotidových sekvencí uvedených v seznamu sekvencí. Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, jak jsou uvedeny v seznamu sekvencí, odpovídají MCT DNA Corynebacterium glutamicum podle předkládaného vynálezu. Tato DNA obsahuje sekvence kódující MCT proteiny (tj. kódující region, uvedený v každé liché SEQ ID NO: Seznamu sekvencí), stejně jako 5' netranslatované sekvence a 3' netranslatované sekvence, které jsou také uvedené v lichých SEQ ID NO: Seznamu sekvencí.

• ·* · · · · · ·· «» o · · · · ·»·» • · · · · · ·· · • « ♦ · » ···· · · · *· • · * · · r · » ««···«· · · < * »· · ·

Alternativně mlže molekula nukleové kyseliny obsahovat pouze kódující region jakékoliv sekvence nukleové kyseliny ze seznamu sekvencí.

Pro účely předkládaného vynálezu je uváděno, že každá ze sekvencí nukleové kyseliny a aminokyselinových sekvencí uvedených v seznamu sekvencí má označení RXA, RXN, RXS nebo RXC následované 5 číslicemi (t.j. RXA02099, RXN03097, RXS00148 nebo RXC01748). Každá sekvence nukleové kyseliny se skládá ze tří částí: 5' předcházejícího regionu, kódujícího regionu a regionu následujícího. Každý z těchto tří regionů je označen stejným označením RXA, RXN, RXS nebo RXC pro eliminaci nejasností. Výraz jedna z lichých sekvencí seznamu sekvencí se pak týká jakékoliv sekvence nukleové kyseliny ze seznamu sekvencí, která může být také odlišena označením RXA, RXN, RXS nebo RXC. Kódující region každé z těchto sekvencí je translatován na příslušnou aminokyselinovou sekvenci, která je také uvedena v seznamu sekvencí, jako sudá SEQ ID NO: bezprostředně po příslušné sekvenci nukleové kyseliny.

Například kódující region pro RXA03097 je uveden v SEQ ID NO:

1, zatímco kódovaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 2. Sekvence molekul nukleové kyseliny podle vynálezu jsou pro snadnou korelaci označeny stejnými označeními RXA,

RXN, RXS nebo RXC jako jimi kódované aminokyselinové sekvence. Například aminokyselinové sekvence označené RXA02099,

RXN03097, RXS03148 nebo RXC01748 jsou translacemi kódujícího regionu nukleotidové sekvence molekul nukleové kyseliny RXA02099, RXN03097, RXS00148, resp. RXC01748. Souvislost mezi nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi RXA, RXN, RXS a RXC podle vynálezu a jejich SEQ ID NO: je uvedena v tabulce 1. Například nukleotidová sekvence RXA00104 je SEQ ID NO: 5 a aminokyselinová sekvence RXA00104 je SEQ ID NO: 6.

Několik genů podle předkládaného vynálezu jsou F-označené *

** »· · *· *· # · ♦ · · ··*· • » · « · «« · • · · ·····» v · • 1 Λ » φ · » ···«· ·· « «· · ··» geny. F-označer.ý geny jsou ty geny uvedené v tabulce 1, které mají F před RXA, RXN, RXS nebo RXC označením. Například, SEQ ID NO: 11, označená - jak je uvedeno v tabulce 1 - F

RXA02581, je F-označený gen, stejně jako SEQ ID NO: 31, 33 a (označené v cabulce 1 jako F RXA02487, F RXA02490 a F

RXA02809, v příslušném pořadí).

V jednom provedení nepatří molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu C. glutamicum, jak je uvedeno v tabulce 2. V případě dapD genu byla sekvence pro tento gen publikována ve Wehrmann, A. et al., (1998), J. Bacteriol. 180(12): 31593165. Nicméně, sekvence získaná předkladateli vynálezu je významně delší než publikovaná verze. Předpokládá se, že publikovaná verze má nesprávný start kodon a proto představuje pouze část skutečného kódujícího regionu.

V jednom výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu molekulu nukleové kyseliny, která je komplementární sekvencí k jedné z nukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu (například liché SEQ ID NO: Seznamu sekvencí) nebo její části. Molekula nukleové kyseliny, která je komplementární k jedné z nukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu, je taková molekula, která je dostatečně komplementární k jedné z nukleotidových sekvencí uvedených v Seznamu sekvencí (například liché SEQ ID NO: ) pro to, aby mohla hybridizovat na jednu z nukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu za tvorby stabilního duplexu.

V ještě jiném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyselony podle předkládaného vynálezu nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z přibližně 50%, 51%, 52%, 53%,

54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% nebo 60%, lépe alespoň ·♦ ·· • · · * • · · z přibližně 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% nebo )ň z přibližně 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 79% nebo 80%, ještě lépe alespoň z přibližně 85%, 86%, 87%, 88%, 89% nebo 90%, nebo

70%,	ještě lépe	ale
76%,	77%, 78%,	79% .
81%,	82%, 83%,	34%,
91%,	92%, 93%,	94%,
97%,	98%, 99% n	ebo

sekvencí podle předkládaného vynálezu (například lichou SEQ ID NO: Seznamu sekvencí! nebo její částí. Rozsahy a hodnoty mezi výše uvedenými rozsahy (například 70-90% identita, nebo 80-95% identita) také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Například, rozsahy hodnot identity využívající kombinace jakýchkoliv výše uvedených hodnot pro jako horních a/nebo dolních limitů jsou také zahrnuty. V dalším výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje, například za přísných podmínek, na jednu z nukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu nebo její část.

Dále, molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může obsahovat pouze část kódujícího regionu sekvence jedné z lichých SEQ ID NO: seznamu sekvencí, například fragment, který může být použit jako sonda nebo primer, nebo fragment, který kóduje biologicky aktivní část MCT proteinu. Nukleotidové sekvence určené z klonování MCT genů z C. glutamicum umožňují přípravu sond a primerů určených pro identifikaci a/nebo klonování homologů MCT v jiných typech buněk a organismů, stejně jako MCT homologů z jiných

Corynebacterií a nebo příbuzných druhů. Sondou/primerem obvykle je významně přečištěný oligonukleotid. Oligonukleotid se obvykle skládá z regionu nukleotidové sekvence, který hybridizuje na přísných podmínek na alespoň přibližně 12, lépe alespoň přibližně 25, ještě lépe přibližně 40, 50 nebo 75 sousedních nukleotidů kódujícího řetězce jedné • · • ♦ ♦ * · · · • · · * · · 9 • · ·

z nukleotidovýcn sekvencí podle předkládaného vynálezu (například liché SEQ ID NO: Seznamu sekvencí), protismyslné sekvenci k jedr.é z těchto sekvencí, nebo přirozených mutantních sekvencí. Primery na bázi nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být použity v PCR reakcích pro klonování homologů MCT. Sondy na bázi MCT nukleotidové sekvence mohou být použity pro detekci transkriptů nebo genomových sekvencí kódujících stejné nebo homologní proteiny. Ve výhodných provedeních obsahuje sonda dále na sebe navázanou značkovací skupinu, kterou může být například radioizotop, fluorescenční sloučenina, enzym nebo kofaktor enzymu. Takové sondy mohou býo použity jako součásti diagnostického testovacího kitu pro identifikaci buněk, které chybně exprimují MCT protein, například při měření množství nukleové kyseliny kódující MCT ve vzorku buněk, při detekování, koncentrací MCT mRNA nebo při stanovení toho, zda byl genomový MCT gen mutován nebo deletován.

V jednom provedení kóduje molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu protein nebo jého část, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je dostatečně homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (tj. sudou SEQ ID NO: seznamu sekvencí), takže si protein nebo jeho část zachovává schopnost podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C.

glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány. Termín dostatečně homologní označuje proteiny nebo jejich části mající aminokyselinové sekvence, které obsahují minimální počet identických nebo ekvivalentních (tj. například aminokyselinový zbytek mající podobný postraní řetězec jako aminokyselinový zbytek v sudé SEQ ID NO: seznamu sekvencí) aminokyselinových zbytků s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu, takže protein nebo jeho část si zachovává schcpnost podílet se na metabolismu sloučenin • ·· ·· · ·# «♦ · · · « · « • ·«··· * · * • · · · * ·<►·· e · · ♦

7Q ·««·*«··

J7 4·· ···· «· 4 f> ···· nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány. Proteiny podílející se na takových metabolických dráhách složek membrány nebo membránových transportních systémech mohou mít úlohu v produkci a sekreci jednoho nebo více čistých chemických činidel. Příklady takových aktivit jsou zde také popsány. Proto funkce MCT proteinu přispívá, přímo nebo nepřímo, k výtěžku, produkci a/nebo účinnosti produkce jednoho nebo více čistých chemických činidel. Příklady aktivit MCT proteinu jsou uvedeny dále v tabulce 1.

V jiném provedení je protein alespoň z přibližně 50-60%, lépe alespoň přibližně z 60-70%, lépe'alespoň přibližně z 7080%, 80-90%, 90-95% a nejlépe alespoň přibližně z 96%, 97%,

98%, 99% nebo více homologní s celou aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sudou SEQ ID NO: seznamu sekvencí).

Části proteinů kódované MCT molekulami nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně biologicky aktivními částmi jednoho z PST proteinů. Jak je zde použito, označuje termín biologicky aktivní část MCT proteinu označuje část, například doménu/motiv, MCT proteinu, která je schopna podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány, nebo má aktivitu uvedenou v tabulce 1. Pro určení toho, zda je MCT protein nebo jeho biologicky aktivní část schopna podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány, může být provede test enzymové aktivity. Takové testy jsou dobře známé odborníkům v oboru a jsou popsány například v příkladu 8.

Další fragmenty nukleové kyseliny kódující biologicky • · · · ·

• · · · aktivní části MÍT proteinu mohou být připraveny izolováním části jedné z aminokyselinových sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sudé SEQ ID NO: seznamu sekvencí), exprimováním kódované části MCT proteinu nebo peptidu (například rekcmbinantní expresí in vitro) a hodnocením aktivity kódované části MCT proteinu nebo peptidu.

Vynález dále zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, které se liší od jedné z nukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu (například od liché SEQ ID NO: seznamu sekvencí) (a jejich částí) v důsledku degenerace genetického kódu a které proto kódují stejný MCT protein jako nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu. V jiném provedení má izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nukleotidovou sekvenci kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí (například v sudé SEQ ID NO: ). V ještě dalším provedení kóduje molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu kompletní protein C. glutamicum, který je významně homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu kódovanou otevřeným čtecím rámcem uvedeným v sudé SEQ ID NO: seznamu sekvencí).

Odborník v oboru by si měl uvědomit, že v jednom provedení sekvence podle předkládaného vynálezu nezahrnují sekvence známé dříve v oboru, jako jsou například sekvence z Genbank uvedené v tabulkách 2 a 4, které byly známé před předkládaným vynálezem. V jednom provedení vynález zahrnuje nukleotidové a aminokyselinové sekvence mají procento identity s nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi podle předkládaného vynálezu, které je vyšší, než procento identity sekvencí dříve známých v oboru (například sekvencí z Genbank (nebo proteinů kódovaných takovými sekvencemi) uvedených v tabulce 2 neoo 4). Například, vynález zahrnuje nukleotidovou • ·· ·· * ·* ·* «·«· · · * · · · · • · ♦ « · · · * ♦ « · · · · ·♦·· · · ♦ >

• · « » · · · ♦ ··· ···· ·· · »« ···· sekvenci, která je z více než a/nebo alespoň ze 38% identická s nukleotidovou sekvencí označenou RXA01420 (SEQ ID NO: 7), nukleotidovou sekvenci, která je z více než a/nebo alespoň ze 43% identická s nukleotidovou sekvencí označenou RXA00104 (SEQ ID NO: 5), a nukleotidovou sekvenci, která je z více než a/nebo alespoň ze 45% identická s nukleotidovou sekvencí označenou RXA02173 (SEQ ID NO: 25) . Odborník v oboru bude schopen vypočítat dolní hranici procentuální identity pro jakoukoli sekvenci podle předkládaného vynálezu určením skóre procentuální identity vypočtené podle GAP, jak je uvedeno v tabulce 4 pro každou ze tří nej lepších sekvencí pro danou sekvenci, a odečtením nejvyšší GAP-vypočtené procentuální identity od 100%. Odborníkům v oboru bude také jasné, že sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence mají procentuální identitu vyšší než nejnižší takto vypočtený práh (například alespoň 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,

58%, 59% nebo 60%, lépe alespoň přibližně 61%, 62%, 63%, 64%,

65%, 66%, 67%, 68%, 69% nebo 70%, ještě lépe alespoň přibližně 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% nebo 80%, ještě lépe alespoň přibližně 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,

89% nebo 90%, nebo 91%, 92%, 93%, 94%, a nejlépe alespoň přibližně 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo vyšší) také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Odborníkům v oboru bude jasné, že kromě MCT nukleotidových sekvencí C. glutamicum uvedených v seznamu sekvencí jako liché SEQ ID NO: mohou v populací (například populaci C. glutamicum) existovat v důsledku polymorfismu DNA sekvence, které vedou ke změnám aminokyselinové sekvence MCT proteinů. Takové genetické polymorfismy v MCT genu mohou existovat mezi jedinci v populaci v důsledku přirozené variace. Termíny gen a rekombinantní gen označují molekuly nukleové kyseliny obsahující otevřený čtecí rámec kódující MCT protein, výhodně MCT protein C. glutamicum. Takové přirozené variace mohou vést • · · · · ·* ·♦ • * « · • « ♦ * ♦ * • · · ·· ···« k 1-5% varianci v nukleotidové sekvenci MCT genu. Jakékoliv nebo všechny nukleotidové variace a vzniklé aminokyselinové polymorfismy v MP, které jsou důsledkem přirozené variace a které nemění funkční aktivitu MCT proteinů, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Molekuly nukleové kyseliny odpovídající přirozeným variantám a no.o-C. glutamicum homologům MCT DNA C. glutamicum podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány podle jejich homologie s MCT nukleovou kyselinou C. glutamicum, která je zde popsána, za použití C. glutamicum DNA, nebo její části, jako hybridizační sondy ve standardních hybridizačních technikách za přísných hybridizačních podmínek. Proto má v jiném provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu délku alespoň 15 nukleotidů a hybridizuje za přísných podmínek na molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci lichých SEQ ID NO: seznamu sekvencí. V jiných provedeních má nukleová kyselina délku alespoň 30, 50, 100, 250 nebo více nukleotidů. Termín hybridizuje za přísných podmínek popisuje podmínky pro hybridizaci a promývání, při kterých nukleotidové sekvence alespoň ze 60% homologní zůstávají hybridizovány na sebe navzájem. Výhodně jsou podmínky takové, že nukleotidové sekvence alespoň ze 60%, lépe alespoň ze 70%, ještě lépe alespoň ze 75% nebo více homologní zůstávají hybridizovány na sebe navzájem. Takové přísné podmínky jsou známé odborníkům v oboru a jsou popsány například v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6. Výhodným příkladem přísných hybridizačních podmínek je hybridizace v oX chloridu sodném/citrátu sodném (SSC) při přibližně 45 °C, po které následuje jedno nebo více promytí v 0,2 X SSC, 0,1% SDS při 50-65 °C. Výhodně odpovídá izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, která hybridizuje za přísných podmínek na nukleotidovou sekvenci ··

4 4 · · · « · * « · 4 4 4 · 4 4 • · · · 4 ···· · 4 4

4 4 4 4 4 4 4

4444444 44 4 44 * podle předkládaného vynálezu, přirozené molekule nukleové kyseliny. Termín přirozená molekula nukleové kyseliny označuje RNA nebo DNA molekulu mající nukleotidovou sekvenci, které se vyskytuje v přírodě (například kóduje přirozený protein) . V jednom provedení kóduje nukleová kyselina přirozený MCT protein C. glutamicum.

Odborníkům v oboru bude jasné, že kromě přirozených variant MCT sekvence, které se mohou vyskytovat v populaci, mohou být do nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu vloženy mutace, které vedou ke změně aminokyselinové sekvence kódovaného MCT proteinu, bez změn funkčních schopností MCT proteinu. Například, nukleotidové substituce vedoucí k aminokyselinovým substitucím v neesenciálních aminokyselinách mohu být provedeny v nukleotidové sekvenci podle předkládaného vynálezu. Neesenciální aminokyselinový zbytek je zbytek, který může být alterován v přirozené sekvenci jednoho z MCT proteinů (například sudé SEQ ID NO: seznamu sekvencí) bez změny aktivity uvedeného MCT proteinu, zatímco esenciální aminokyselinový zbytek je nutný pro aktivitu MCT proteinu. Nicméně, jiné aminokyselinové zbytky (například ty, které nejsou konzervovány nebo jsou pouze semikonzervovány v doméně s MCT aktivitou) nemusí být esenciální pro aktivitu a proto jsou pravděpodobně vhodné pro alteraci bez alterace MCT aktivity.

V souladu s tím se další aspekt vynálezu týká molekul nukleové kyseliny kódujících MCT proteiny, které obsahují změny aminokyselinových zbytků, které nejsou esenciální pro MCT aktivitu. Takové MCT proteiny se liší v aminokyselinové sekvenci od sekvence sudých SEQ ID NO: seznamu sekvencí, ale zachovávají si alespoň jednu z MCT aktivit. V jednom provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny nukleotidovou sekvenci kódující protein, kde protein obsahuje • · * · · · ·* ·· ··<· ♦ · # ·<·· • · · · · · ·· · • * · » φ ♦··· · v · · • · · · · · · · ··· ·<··« ·> * ·· »*»· aminokyselinovou sekvenci alespoň z 50% homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu, která je schopna podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány, nebo podílet se na jedné nebo více aktivitách uvedených v tabulce 1. Výhodně je protein kódovaný molekulou nukleové kyseliny alespoň z 50-60% homologní s aminokyselinovou sekvencí jedné ze sudých SEQ ID NO: seznamu sekvencí, lépe alespoň z přibližně 60-70% homologní s jednou z těchto sekvencí, ještě lépe alespoň z přibližně 70-80%, 80-90%, 90-95% homologní s jednou z těchto sekvencí, a nejlépe alespoň z přibližně 96%, 97%, 98% nebo 99% homologní s jednou z aminokyselinový sekvencí podle předkládaného vynálezu.

Pro určení procenta homologie dvou aminokyselinových sekvencí (například jedné aminokyselinové sekvence podle předkládaného vynálezu a její mutantní formy) nebo dvou nukleových kyselin se sekvence přiřadí k sobě tak, aby bylo možné provést optimální srovnání (například mohou být db sekvence jednoho proteinu nebo nukleové kyseliny vloženy mezery, aby bylo dosaženo optimálního přiřazení s druhým proteinem nebo nukleovou kyselinou). Aminokyselinové zbytky nebo nukleotidy v odpovídajících aminokyselinových nebo nukleotidových pozicích se potom srovnávají. Když je pozice v jedné sekvenci (například jedné z aminokyselinových sekvencí podle předkládaného vynálezu) obsazena stejným aminokyselinovým zbytkem nebo nukleotidem jak tato pozice v jiné sekvenci (například mutantní formě aminokyselinové sekvence), tak jsou molekuly v této pozici homologní (tj. homologie aminokyseliny nebo nukleové kyseliny je ekvivalentní identitě aminokyseliny nebo nukleové kyseliny). Procento homologie mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu identických pozic v obou sekvencích (tj. % homologie = počet » ·· »· · ·· ·♦ 4 · · a · · • ♦ · · · · f « · * * · · *··»··» · «.

·♦♦♦···· identických pozic/celkovému počtu pozic x 100).

Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující MCT protein homologní s proteinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sekvencí suché SEQ ID NO: seznamu sekvencí) může být vyrobena vložením jedné nebo více nukleotidových substitucí, adicí nebo delecí do nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu tak, že do kódovaného proteinu je vložena jedna nebo více aminokyselinových substitucí, adicí nebo delecí. Mutace mohou být vloženy do jedné z nukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu standardními technikami, jako je místně cílená mutagenese a

PCR-zprostředkovaná mutagenese. Výhodně jsou konzervativní aminokyselinové substituce provedeny v jednom nebo více předpokládané neesenciálních aminokyselinových zbytků.

Konzervativní aminokyselinová substituce je taková, při které je aminokyselinový zbytek nahrazen aminokyselinovým zbytkem s podobným postraním řetězcem. Rodiny aminokyselinových zbytků majících podobné postraní řetězce byly definovány v oboru.

Tyto rodiny zahrnují aminokyseliny s bazickými postraními řetězci (například lysin, arginin, histidin), kyselými postraními řetězci (například kyselina asparagová, kyselina glutamová), nenabitými polárními postraními řetězci (například glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), nepolárními postraními řetězci (například alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), β-rozvětvenými postraními řetězci (například threonin, valin, isoleucin) a aromatickými postraními řetězci (například tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Tak je předpokládaný neesenciální aminokyselinový zbytek v MCT proteinu výhodně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem ze stejné rodiny vedlejších řetězců. Alternativně mohou být v jiném proveoení mutace vloženy náhodně do celé délky nebo do části MCT kódující sekvence, jak je tomu například při ·· ·« · ·* ·· » « · « · ♦ · · • ♦ ♦ ♦ · · · · « *« ·♦·*··· · · • · · · · · · ··« ·· · ·· ·*»· saturační mutagenesi, a vzniklé mutanty mohou být testovány na MCT aktivitu zde popsaným způsobem za účelem identifikace mutantů, které si zachovávají MCT aktivitu. Po mutagenesi jedné z nuklectidových sekvencí jedné z lichých SEQ ID NO: seznamu sekvencí může být kódovaný protein exprimován rekombinantně a aktivita proteinu může být určena, například, zde popsanými testy (viz příklad 8).

Kromě molekul nukleové kyseliny kódujících MCT proteiny popsaných výše se další aspekt předkládaného vynálezu týká izolovaných mclekul nukleové kyseliny, které jsou protismyslné k těmto molekulám. Protismyslná nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein, například sekvenci komplementární ke kódujícímu řetězci dvouřetězcové DNA molekuly nebo komplementární k mRNA sekvenci. Tak může být protismyslná nukleová kyselina navázána vodíkovými můstky na kódující nukleovou kyselinu. Protismyslná nukleová kyselina může být komplementární k celému MCT kódujícímu řetězci.

V jednom provedení je protismyslná molekula nukleové kyseliny protismyslná ke kódujícímu regionu kódujícího řetězce nukleotidové sekvence kódující MCT protein. Termín kódující region označuje region nukleotidové sekvence obsahující kodony, které jsou translatovány do aminokyselinových zbytků (například celý kódující region SEQ ID NO: 5 (RXN00104) obsahuje nukleotidy 1-756). V jiném provedení je protismyslná molekula nukleové kyseliny protismyslná k nekódujícímu regionu kódujícího řetězce nukleotidové sekvence kódující MCT. Termín nekódující region označuje 5' a 3' sekvence, které sousedí s kódujícím regionem, které nejsou translatovány na aminokyseliny (tj. regiony též označované jako 5' a 3' netranslatovar.é regiony) .

Podle sekvencí kódujících řetězců pro MCT, které jsou zde

A ·· * « · • * Λ 9 9 « * • · * « · · » · · · · · **· • · * · · ······· · · * ·· >· • · · · • · * » · * • « · ·· ··* » popsány (například liché SEQ ID NO: seznamu sekvencí) mohou být protismyslné nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu navrženy podle pravidel Watsonova a Crickova párování baží. Molekula protismyslné nukleové kyseliny může být komplementární k celému kódujícímu regionu MCT mRNA, ale lépe se jedná o oligonukleotid, který je protismyslný pouze k části kódujícího nebo nekódujícího regionu MCT mRNA. Například může být protismyslný oligonukleotid komplementární k regionu okolo translačního start místa MCT mRNA. Protismyslný oligonukleotid může mít například délku přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 nebo 50 nukleotidů. Protismyslná nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být vyrobena za použití chemické syntézy a enzymatických ligačních reakcí za použití postupů známých v oboru. Například může být protismyslná nukleová kyselina (například protismyslný oligonukleotid) syntetizována chemicky za použití přirozených nukleotidů nebo různě modifikovaných nukleotidů navržených pro zvýšení biologické stability molekul nebo pro zvýšení fyzikální stability duplexu vzniklého mezi protismyslnou a kódující nukleovou kyselinou, například mohou být použity fosforothioátové deriváty a akridinem substituované nukleotidy. Příklady modifikovaných nukleotidů, které mohou být použity pro přípravu protismyslné nukleové kyseliny, jsou 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-chloruracil, 5-joduracil, hypoxanthin, xanthin, 4-acetylcytosin, 5-( karboxyhydroxylmethyl)uráčil, 5-karboxymethylaminomethyl-2 -thiouridin, 5-karboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktosylqueosin, inosin, N6-isopentenyladenin, 1-methylguanin, 1-methylinosin, 2,2-dimethylguanin, 2-methyladenin, 2-methylguanin, 3-methylcytosin, 5-methylcytosin, N6-adenin, 7-methylguanin, 5-methylaminomethyluraci1, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosin, 5'-methoxykarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenin, kyselina *· »» · »· *· • 3 *·· ···· • *4«*» · « « • · · · ···«··· « *

ΛΟ ·· · ·» 4 · · · cO ··· ···· ·· · ·· »··» uráčil-5-oxyoctová (v), wybutoxosín, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosin, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thíouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, methylester kyseliny uracil-5-oxyoctové, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), 5-methyl-2-thiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxypropyl)uráčil, (acp3)w, a 2,6-diaminopurin. Alternativně může být protismyslná nukleová kyselina produkována biologicky za použití expresního vektoru, do kterého byla nukleová kyselina subklonována v protismyslné orientaci (tj. RNA transkribovaná z insertované nukleové kyseliny bude v protismyslné orientaci vzhledem k dané cílové nukleové kyselině, jak je podrobněji popsáno dále).

Molekuly protismyslné nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou obvykle aplikovány do buněk nebo jsou generovány in šitu tak, že mohou hybridizovat nebo se vázat na buněčnou mRNA a/nebo genomovou DNA kódující MCT protein a tak inhibovat expresi proteinu, například inhibicí transkripce a/nebo translace. Hybridizace může probíhat v důsledku běžné komplementarity nukleotidů vedoucí ke tvorbě stabilního duplexu, nebo se může jednat - v případě molekuly protismyslné nukleové kyseliny, která se váže na DNA duplexy, o specifické interakce v hlavní drážce dvojšroubovice. Protismyslná· molekula může být modifikována tak, aby se specificky vázala na receptor nebo antigen exprimovaný na povrchu vybraných buněk, například navázáním molekuly protismyslné nukleové kyseliny na peptid nebo protilátku, která se váže na receptor nebo na antigen na buněčném povrchu. Molekula protismyslné nukleové kyseliny může být také dopravena do buněk za použití zde popsaných vektorů. Pro dosažení dostatečných intracelulárních koncentrací protismyslných molekul jsou výhodné vektorové konstrukty, ve kterých je molekula protismyslné nukleové kyseliny umístěna pod kontrolou silného prokaryotického, virového nebo eukaryotického promotoru.

«· ·· · ·

9 φ · • ·

9»» ·*·<«

ΦΦ • Φ « 9 • * * · »· • 9

9999 »9 • »

9

9

9 ·

<

»999

V ještě jiném provedení je molekula protismyslné nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu α-anomerickou molekulou nukleové kyseliny, α-anomerická molekula nukleové kyseliny tvoří specifické dvouřetězcové hybridy s komplementární RNA, ve kterých - oproti obvyklým β-jednotkám - probíhají řetězce navzájem paralelně (Gaultier et al. (1987), Nucleic Acids

Res. 15: 6625-6641). Molekula protismyslné nukleové kyseliny může také obsahovat 2'-o-methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) nebo chimérický RNADNA analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330) .

V ještě jiném provedení protismyslná nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu ribozym. Ribozymy jsou katalytické RNA molekuly s ribonukleasovou aktivitou, které mohou štěpit jednořetězcovou nukleovou kyselinu, jako je mRNA, ke které obsahují komplementární region. Proto mohou být ribozymy (například hammerhead ribozymy (popsané v Haselhoff a Gerlach (1988) Nátuře 334:585-591) použity pro katalytické štěpení MCT mRNA transkriptů a tím pro inhibici translace MCT mRNA. Ribozym mající specificitu pro nukleovou kyselinu kódující MCT může být navržen podle nukleotidové sekvence MCT DNA, která je zde popsána (tj. SEQ ID NO: 5 (RXA00104)). Například může být vyroben derivát Tetrahymena L-19 IVS RNA, ve kterém je nukleotidová sekvence aktivního místa komplementární k nukleotidové sekvenci, která mé být štěpena v mRNA kódující MCT. Viz, například, Cech et al. U.S. Patent č. 4987071 a Cech et al. U.S. Patent č. 5116742. Alternativně může být MCT mRNA použita pro selekci katalytické RNA mající specifickou ribonukleasovou aktivitu ze souboru RNA molekul. Viz, například, Bartel, D. a Szostak, J.W. (1993) Science 261: 1411-1418 .

Alternativně může být exprese MCT genu inhibována cíleným navázáním nukleotidové sekvence komplementární k regulačnímu ·· · • · · • · · · · · • # * · · ···· · • · · · · ··# ··»« »· · ·· * · ·· •· • · ···· regionu MCT nukleotidové sekvence (například MCT promotoru a/nebo zesilovači transkripce) za tvorby trojšroubovicových struktur, které brání transkripci MCT genu v cílových buňkách. Viz Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C. et al·., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; a Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12): 807-15.

B. Rekombinantní expresní vektory a hostitelské buňky

Jiný aspekt vynálezu se týká vektorů, výhodně expresních vektorů, obsahujících nukleovou kyselinu kódující MCT protein (nebo jeho část). Termín vektor, jak je zde použit, označuje molekulu nukleové kyseliny schopnou přenášet jinou molekulu nukleové kyseliny, na kterou byla navázána. Jedním typem vektoru je plasmid, což je cirkulární dvouřetězcová DNA smyčka, do které mohou být ligovány další DNA segmenty. Jiným typem vektoru je virový vektor, ve kterém mohou být další DNA segmenty ligovány do virového genomu. Některé vektory jsou schopné autonomní replikace v hostitelské buňce, do které -byly vloženy (například bakteriální vektory obsahující bakteriální sekvenci rozpoznávající počátek replikace a episomální savčí vektory). Jiné vektory (například neepisomální savčí vektory) jsou integrovány do genomu hostitelské buňky pro vložení do hostitelské buňky a tak jsou replikovány společně s genomem hostitele. Dále, některé vektory mohou řídit expresi genů, na které jsou operativně navázány. Takové vektory jsou zde označovány jako expresní vektory. Obecně, expresní vektory použitelné v rekombinantních DNA technikách jsou často ve formě plasmidů. V předkládaném vynálezu jsou termíny plasmid a vektor zaměnitelné, protože plasmid je nejčastěji používanou formou vektoru. Nicméně, vynález zahrnuje další formy expresních vektorů, jako jsou virové vektory (například replikace-defektní retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry), které mají ekvivalentní funkce.

• · · • · « ·

Rekombinantní expresní vektory podle předkládaného vynálezu obsahují nukleovou kyselinu podle předkládaného vynálezu ve formě vhodné pro expresi nukleové kyseliny v hostitelské buňce, což znamená, že rekombinantní expresní vektory obsahují jednu nebo více regulačních sekvencí, vybraných podle hostitelské buňky použité pro expresi, které jsou operativně navázané na sekvenci nukleové kyseliny, která má být exprimována. V rekombinantním expresním vektoru termín operativně navázaný znamená, že daná nukleotidová sekvence je navázána na regulační sekvence způsobem, který umožňuje expresi nukleotidové sekvence (například v transkripčním/ translačním systému in vitro nebo v hostitelské buňce, když je vektor vložen do hostitelské buňky) . Termín regulační sekvence označuje promotory, zesilovače transkripce a jiné expresní kontrolní elementy (například polyadenylační signály). Takové regulační sekvence jsou popsány například v Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, CA (1990) . Mezi regulační sekvence patří sekvence, které řídí konstitutivní expresi nukleotidové sekvence v mnoha typech hostitelských buněk, a ty sekvence, které řídí expresi nukleotidové sekvence pouze v určitých typech hostitelských buněk. Výhodnými regulačními sekvencemi jsou, například, promotory jako je cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, Ιρρ-lac-, lacl^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, amy, SPO2, X-P_R- nebo X-P_L, které se využívají výhodně v bakteriích. Dalšími regulačními sekvencemi jsou, například, promotory z kvasinek a hub, jako je ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, rostlinné promotory, jako je CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos nebo ubiquitinový nebo phaseolinový promotor. Je také možno použít artificiální promotory. Odborníkům v oboru bude jasné, že charakter promotorů bude záviset na faktorech jako je výběr transformovaného hostitele, požadovaná úroveň exprese

proteinu a podobně. Expresní vektory podle předkládaného vynálezu mohou být vloženy do hostitelských buněk za dosažení produkce proteinů nebo peptidů, včetně fúzních proteinů nebo peptidu, kódovaných zde popsanými nukleovými kyselinami (například MCT proteiny, mutantní formy MCT proteinů, fúzní proteiny atd.).

Rekombinantní expresní vektory podle předkládaného vynálezu mohou být navrženy pro expresi MCT proteinů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Například mohou být MCT geny exprimovány v bakteriálních buňkách, jako je C. glutamicum, hmyzích buňkách (za použití bakulovirových expresních vektorů), kvasinkách a jiných houbách (viz Romanos, M.A. et al. (1992), Fcreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423-488; Van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991)

Heterologous gene expression in filamentous fungi v: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L.L. Lasure, eds., str. 396-428: Academie Press: San Diego; a van den Hondel,

C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991), Gene transfer systems a vector development for filamentous fungi, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., ed., str. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge ), buňkách řas a mnohobuněčných rostlin (viz Schmidt, R. a Willmitzer, L.

(1988) High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thalliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep.: 583-586), nebo savčích buňkách. Vhodné hostitelské buňky jsou dále popsány v Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, CA (1990). Alternativně může být rekombinantní expresní vektor transkribován a translatován in vitro, například za použití T7 promotorových regulačních sekvencí a T7 polymerasy.

Exprese proteinů v prokaryotických organismech je nejčastěji provedena pomocí vektorů obsahujících konstitutivní nebo indukovatelné promotory řídící expresi fúzních nebo nefúzních proteinů. Fúzní vektory přidávají mnoho aminokyselin ke kódovanému proteinu, obvykle na amino- konci rekombinantníhc proteinu. Takové fúzní vektory mají obvykle tři účely: (1) zvyšují expresi rekombinantního proteinu; (2) zvyšují rozpustnost rekombinantního proteinu; a (3) napomáhají při přečištění rekombinantního proteinu tím, že působí jako ligand při afinitním přečištění. Často je ve fúzních expresních vektorech proteolytické štěpící místo vloženo do regionu spojení fúzní skupiny a rekombinantního proteinu a toto místo umožňuje oddělení fúzní skupiny od rekombinantního proteinu po přečištění fúzního proteinu. Mezi takové enzymy a jejich rozpoznávací sekvence patří faktor Xa, trombin a enterokinasa.

Mezi typické expresní vektory patří pGEX (Pharmacia Biotech Inc.> Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: .31-40), pMAL. (New England Biolabs, Beverly, MA) a pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJi, které fúzují glutathion-S-transferasu (GST),

E vazebný protein pro maltosu nebo protein A, v příslušném pořadí, na cílový rekombinantní protein. V jednom provedení je kódující sekvence MCT proteinu klonována do pGEX expresního vektoru za vytvoření vektoru kódujícího fúzní protein obsahující, od N-konce do C-konce, GST-štěpící místo pro trombin-X protein. Fúzní protein může být přečištěn afinitní chromatografií za použití glutathion-agarosové pryskyřice. Rekombinantní MCT protein nefúzovaný na GST může být získán štěpením fúzního proteinu trombinem.

Příklady vhodných indukovatelných nefúzních E. coli expresních vekoorů jsou pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69:

301-315) pLG333, pACYC184, pBR322, pUC18, pUCl9, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pFLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III13-Bl, • · ♦ ·

···«··· ·· ·· · · • · · · • · · • · · · • · · • · · · · ·

Ágtll, pBdCl a pET lid (Studier et al., ®ene Expression

Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San

Diego, California (1990) 60-89; a Pouwels et al., ed., (1985), Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0444904018). Exprese požadovaného genu z pTrc vektoru spočívá v RNA polymerasové transkripci hostitele z hybridního trp-lac fúzního promotoru. Exprese cílového genu z pET lid vektoru spočívá v transkripci z T7 gnlO-lac fúzního promotor zprostředkovanou současně exprimovanou virovou RNA polymerasou (T7 gnl). Tato virová ral polymerasa je dodána hostitelskými kmeny BL21 (DE3) nebo HMS 174(DE3) z residentního profága nesoucího T7 gnl gen pod transkripční kontrolou lacUV 5 promotoru. Pro transformaci jiných bakterií mohou být vybrány jiné vhodné vektory.

Například je známo, že plasmidy pIJlOl, pIJ364, pIJ702 a pIJ361 jsou použitelné pro transformaci Streptomyces, zatímco plasmidy pUBUO, pC194 nebo pBD214 jsou vhodné pro transformaci Bacillus species. Mezi plasmidy použitelné pro přenos genetické informace do Corynebacterium patří pHMl519, pBLl, pSA77 nebo pAJ667 (Pouwels et al., ed. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0444904018).

Jednou strategií pro maximalizaci exprese rekombinantního proteinu je exprese proteinu v hostitelské.bakterii s narušenou kapacitou pro proteolytické štěpení rekombinantního proteinu (Gottesman, S., Gene Expression TechncíjÉjy: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, California (1990) 119-128). Jinou strategií je pozměnění sekvence nukleové kyseliny insertované do expresního vektoru tak, aby jednotlivé kodony pro každou aminokyselinu byly těmi kodony, které jsou přednostně využívané bakterií vybranou pro expresi, jako je C. glutamicum (Wada et al.

(1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Takové alterace sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být provedeny standardními technikami syntézy DNA.

• · ·· ··

V jiném provedení je expresní vektor pro MCT protein kvasinkový expresní vektor. Příklady vektorů pro expresi v kvasince S. cerevisiae jsou pYepSecl (Baldari, et al., (1987) Embo J., 6:229-234), 2 μ, pAG-1, Yep6, Yepl3, pEMBL Ye23, pMFa (Kurjan a Herskowitz, (1982) Cell, 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123) a pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektory a způsoby pro konstrukci vektorů použitelných v jiných houbách, jako jsou filamentosní houby, jsou ty, které jsou podrobně popsány v: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt. P.J. (1991), Gene transfer syste.ms and vector development for filamentous fungi, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., ed., str. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, a Pouwels et al., ed. (1985') Cloning Vectors, Elsevier: New York (IBSN 0444 904018).

Alternativně, mohou být MCT proteiny podle předkládaného vynálezu exprimovány ve hmyzích buňkách za použití bakulovirových expresních vektorů. Bakulovirové vektory vhodné pro expresi proteinů v kultivovaných hmyzích buňkách (například Sf 9 buňkách) jsou vektory pAc série (Smith et al. (1983)1 Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) a pVL.série (Lucklow a Summers (1989) Virology 170:31-39).

V jiném provedení mohou být MCT proteiny podle předkládaného vynálezu exprimovány v buňkách'jednobuněčných rostlin (jako jsou řasy) nebo v buňkách z vyšších rostlin (například spermatofyt, jako jsou kulturní plodiny). Příklady rostlinných expresních vektorů jsou vektory popsané v: Becker,

D., Kemper, E, Schell, J. a Masterson, R. (1992) New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border. Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; a Bevan. M. W. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation • «« «· · ·· ·· • · » · ··· · · · · • · · · · · * · « « · » · ······< · · ··· ···· ·· · ·· ·»··

Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721, a patří mezi ně pLGV23, pGHlac+, pBINlí, pAK2004 a pDH51 (Pouwels et al., eds. (1985)

Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0444904018).

V ještě jiném provedení je nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu exprimována v savčí buňce za použití savčího expresního vektoru. Příklady savčích vektorů jsou pCDM8 (Seed, B. (1987) Nátuře 329:840) a pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBC J. 6: 187-195). Při použití v savčích buňkách jsou řídící funkce expresního vektoru často dodány virovými regulačními elementy. Například, běžně používané promotory jsou odvozeny od polyomaviru, Adenoviru 2, cytomegaloviru a Simian Viru 40. Pro další vhodné expresní systémy pro prokaryotické a eukaryotické buňky viz kapitoly 16 a 17 v Sambrook, J., Fritsh. E. F. and Maniatis, T._z Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

V jiném provedení je rekombinantní expresní vektor schopen řídit expresi nukleové kyseliny přednostně v určitém typu buněk (například jsou tkáňově specifické regulační elementy použity pro expresi nukleové kyseliny). Tkáňově specifické regulační elementy jsou známé v oboru. Příklady vhodných tkáňově specifických promotorů jsou albuminový promotor (specifický pro játra: Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotory specifické pro lymfoidní tkáň (Calame and Eaton (1988), Adv. Immunol. 43: 235-275), zejména promotory Tlymfocytárních receptorů (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) a imunoglobuliny (Banerji et al. , (1983) Cell 33:

729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotory specifické pro neurony (například neurofilamentový promotor; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), promotory specifické pro pankreas (Edlund et al., (1985) ¥

·«

Science 230: 912-916) a promotory specifické pro mléčnou žlázu (například syrovátkový promotor; US patent č. 4873316 a Evropská patentová přihláška č. 264166). Dále jsou zahrnuty vývojově specifické promotory, například myší hox promotory (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) a promotor afetoproteinu (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537546) .

Vynález dále poskytuje rekombinantní expresní vektor obsahující DNA molekulu podle předkládaného vynálezu klonovanou do expresního vektoru v protismyslné orientaci. To znamená, že DNA molekula je operabilně navázaná na regulační sekvence způsobem, který umožňuje expresi (transkripcí DNA molekuly) RNA molekuly, která je protismyslná k MCT mRNA. Regulační sekvence operativně navázané na nukleovou kyselinu klonovanou v protismyslné orientaci mohou být vybrány tak, aby řídily kontinuální expresi molekuly protismyslné RNA v mnoha typech buněk, například se může jednat o virové promotory a/nebo zesilovače transkripce, nebo mohou být regulační sekvence vybrány tak, aby řídily konstitutivní, tkáňově specifickou nebo buněčně specifickou expresi protismyslné RNA. Protismyslný expresní vektor může být ve formě rekombinantního plasmidu, fagemidu nebo atenuovaného viru, ve kterém jsou protismyslné nukleové kyseliny produkovány pod kontrolou vysoce účinného regulačního regionu, jehož aktivita může být určena typem buňky, do které je vektor vložen. Pro přehled regulace genové exprese pomocí protismyslných genů viz Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, svazek 1(1), 1986.

Jiným aspektem vynálezu je hostitelská buňka, do které byl vložen rekombinantní expresní vektor podle předkládaného vynálezu. Termíny hostitelská buňka a rekombinantní *

'V

hostitelská buňka jsou zde zaměnitelné.Je třeba si uvědomit, že tyto termíny označují nejen konkrétní buňku, ale také potomstvo a potenciální potomstvo takové buňky. V důsledku modifikací, které se mohou vyskytovat v následujících generacích z důvodu mutací nebo vlivem prostředí nemusí být takové potomstvo ve skutečnosti identické s původními buňkami, ale spadá do rozsahu termínu, jak je zde použit.

Hostitelskou buňkou může být prokaryotická nebo eukaryotická buňka. Například může být MCT protein exprimován v bakteriálních buňkách, jako je C. glutamicum, hmyzích buňkách, kvasinkách nebo savčích buňkách (jako jsou ovariální buňky čínského křečka (CHO) nebo COS buňky). Jiné vhodné hostitelské buňky jsou známé odborníkům v oboru.

Mikroorganismy příbuzné s Corynebacterium glutamicum, které mohou být použity jako hostitelské buňky pro nukleové kyseliny a proteiny podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny v tabulce 3.

Vektorová DNA může být vložena do prokaryotických nebo eukaryotických buněk běžnými transformačními nebo transfekčními technikami. Termíny transformace a transfekce označují různé v oboru známé techniky pro vkládání cizorodé nukleové kyseliny (například lineární DNA nebo RNA (například linearizovaného vektoru nebo genového konstruktu bez vektoru) nebo nukleové kyseliny ve formě vektoru (například plasmidu, fágu, fasmidu, fagemidu, transposonu nebo jiné DNA) do hostitelské buňky, včetně současného srážení s fosforečnanem vápenatým nebo chloridem vápenatým, DEAE-dextranem zprostředkované transfekce, lipofekce nebo elektroporace. Vhodné metody pro transformaci nebo transfekci hostitelských buněk jsou uvedeny v Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, • · · • · 4 4

4

4 • · · ·· 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4444··« · · ·♦ · ·· ····

1989) a v jiných laboratorních manuálech.

O stabilní transfekci savčích buněk je známo, že v závislosti na expresním vektoru a transfekční technice pouze malá frakce buněk může integrovat cizorodou DNA do svého genomu. Pro identifikaci a selekci těchto integrantů je gen kódující selektovatelný markér (například resistenci na antibiotika) obvykle vložen do hostitelských buněk spolu s daným genem. Výhodnými selektovatelnými markéry jsou ty, které udílejí resistenci na léky jako je G418, hygromycin a methot^rexát. Nukleová kyselina kódující selektovatelný markér může být vložena do hostitelské buňky na stejném vektoru jako nukleové kyselina kódující MCT protein, nebo může být vložena na samostatném vektoru. Buňky stabilně transfektované vloženou nukleovou kyselinou mohou být identifikovány selekcí pomocí léku (například, buňky, které inkorporovaly gen pro selektovatelný markér budou přežívat, zatímco jiné buňky uhynou).

Pro vytvoření homologních rekombinantních organismů se připraví vektor, který obsahuje alespoň část MCT genu, do kterého byly vloženy delece, adice nebo substituce za účelem alterace, například narušení funkce, MCT genu. Výhodně je MCT genem MCT gen Corynebacterium glutamicum, ale může se jednat také o homolog z příbuzné bakterie nebo ze savce, kvasinky nebo hmyzu. Ve výhodném provedení je vektor navržen tak, že po homologní rekombinací je endogenní MCT gen funkčně narušen (tj. nadále nekóduje funkční protein; toto bývá též označováno jako knock-out vektor). Alternativně může být vektor navržen tak, že po homologní rekombinací je endogenní MCT gen mutován nebo jinak alterován, ale stále kóduje funkční protein (například může být pozměně předcházející regulační region, což pozmění expresi endogenního MCT proteinu). V homologním rekombinantním vektoru je pozměněná část MCT genu obklopena na

5' a 3' koncích další nukleovou kyselinou MCT genu, aby mohlo dojít k homologní rekombinaci mezi exogenním MCT genem na vektoru a endogenním MCT genem v mikroorganismu. Další sousedící MCT nukleová kyselina má dostatečnou délku pro úspěšnou homologní rekombinaci s endogenním genem. Obvykle vektor obsahuje několik kilobází sousedící DNA (na 5' a 3' koncích) (viz Thomas, K.R. a Capecchi M.R. (1987), Cell 51: 503, kde je uveden popis vektorů pro homologní rekombinaci). Vektor se vloží do mikroorganismu (například elektroporací) a buňky, ve kterých došlo k homologní rekombinaci mezi vloženým MCT genem a endogenním MCT genem se selektují za použití známých technik.

V jiném provedení může být připraven rekombinantní mikroorganismus, který obsahuje vybraný systém umožňující řízenou expresi vloženého genu. Například, umístění MCT genu ve vektoru pod kontrolu lac operonu umožňuje dosažen exprese MCT genu pouze za přítomnosti IPTG. Takové regulační systémy jsou dobře známé v oboru.

V jiném provedení je endogenní MCT gen v hostitelské buňce narušen (například homologní rekombinaci nebo jinými genetickými prostředky známými v oboru) 'tak, že exprese jeho proteinového produktu neproběhne. V jiném provedení je endogenní nebo vložený MCT gen v hostitelské buňce pozměněn jednou nebo více bodovými mutacemi, delecemi nebo inverzemi, ale stále ještě kóduje funkční MCT protein. V ještě jiném provedení je pozměněn jeden nebo více regulačních regionů (například promotorů, represorů nebo induktorů) MCT genu v mikroorganismu (například delecí, zkrácením, inverzí nebo bodovou mutací) tak, že je modulována exprese MCT genu. Odborníkům v oboru bude jasné, že hostitelské buňky obsahující více než jednu uvedenou modifikaci MCT genu a proteinu mohou být snadno připraveny za použití způsobů podle předkládaného *· · ·« ·· • · * · · · ♦ · · • · Φ ♦ · ·· * • ·· ······· · ♦ • · · · · · ·

6!

vynálezu a spacají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Hostitelská buňka podle předkládaného vynálezu, jako je prokaryotická nebo eukaryotická buňka v kultuře, může být použita pro produkci (tj. expresi) MCT proteinu. V souladu s tím vynález cále poskytuje způsoby pro produkci MCT proteinů za použití hostitelských buněk podle předkládaného vynálezu.

V jednom provedení způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle předkládaného vynálezu (do kterých byl vložen rekombinantní expresní vektor kódující MCT protein nebo do jejichž genomu byl vložen gen kódující přirozený nebo modifikovaný MCT protein) ve vhodném mediu do dosažení produkce MCT proteinu. V jiném provedení způsob dále zahrnuje izolování MCT proteinu z media nebo hostitelské buňky.

C. Izolované MCT proteiny

Další aspekt vynálezu se týká izolovaných MCT proteinů a jejich biologicky aktivních částí. Izolovaný nebo přečištěný protein nebo jeho biologicky aktivní část v podstatě neobsahuje buněčný materiál, když je produkován technikami rekombinantní DNA, nebo chemické prekursory nebo jiná chemická činidla, když je produkován chemickou syntézou. Termín v podstatě neobsahující buněčný materiál označuje přípravky MCT proteinu, ve krerých je protein separován od buněčných složek buněk, ve kterých je přirozeně nebo rekombinantně produkován.

V jednom provedení termín v podstatě neobsahující buněčný materiál označuje přípravky MCT proteinu obsahující méně než přibližně 30% (suché hmotnosti) non-MCT proteinu (též označovaného jako kontaminující protein), lépe méně než přibližně 20% non-MCT proteinu, ještě lépe méně než přibližně 10% non-MCT proteinu, a ještě lépe méně než přibližně 5% nonMCT proteinu. Když je MCT protein nebo jeho biologicky aktivní *

•· ·· · ·· ·· « · · · · · '» · « « · · · · · · · • · > ··#··*· · · ♦ · ♦ · · · · • «··· «· * ·· ··»· část produkován rekombinantně, tak také v podstatě neobsahuje kultivační medium, tj. kultivační medium tvoří méně než přibližně 20%, lépe méně než přibližně 10% a ještě lépe méně než přibližně 5% objemu proteinového přípravku. Termín v podstatě neobsahující chemické prekursory nebo jiná chemická činidla označuje přípravky MCT proteinu, ve kterých je protein separován od chemických prekursorů nebo jiných chemických činidel, která jsou použita při syntéze proteinu. V jednom provedení termín v podstatě neobsahující chemické prekursory nebo jiná chemická činidla označuje přípravky MCT proteinu obsahující méně než přibližně 30% (suché hmotnosti) chemických prekursorů nebo non-MCT chemických činidel, lépe méně než přibližně 20% chemických prekursorů nebo non-MCT chemických činidel, ještě lépe méně než přibližně 10% chemických prekursorů nebo non-MCT chemických činidel a nejlépe méně než přibližně 5% chemických prekursorů nebo non-MCT chemických činidel. Ve výhodných provedeních neobsahují izolované proteiny nebo jejich biologicky aktivní části kontaminující proteiny ze stejného organismu, ze kterého byl MCT protein získán. Obvykle jsou takové proteiny produkovány rekombinantní expresí, například, MCT proteinu C. glutamicum v mikroorganismu jako je C. glutamicum.

Izolovaný MCT protein nebo jeho část podle předkládaného vynálezu se může podílet na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány, nebo může mít jednu nebo více aktivit uvedených v tabulce 1. Ve výhodných provedeních obsahuje protein nebo jeho část aminokyselinovou sekvenci, která je dostatečně homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sekvencí sudých SEQ ID NO: seznamu sekvencí) tak, že protein nebo jeho část si zachovává schopnost podílet se na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C.

♦ · · ·· »· • · · · · · · • · · · · · · • ···♦··< e » • * · · · · ·· * · · · · · · glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány. Část proteinu je výhodně jeho biologicky aktivní část, jak je zde popsáno. V jiném výhodném provedení má MCT protein podle předkládaného vynálezu aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sudých SEQ ID NO: seznamu sekvencí. V ještě jiném provedení má MCT protein aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná nukleotidovou sekvencí, která hybridizuje, například hybridizuje za přísných podmínek, na nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu (například na sekvenci lichých SEQ ID NO: seznamu sekvencí). V ještě jiném výhodném provedení má MCT protein aminokyselinovou sekvenci, která je kódovaná nukleotidovou sekvencí, která je alespoň z přibližně 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% nebo 60%, lépe alespoň z přibližně 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% nebo 70%, ještě lépe alespoň z přibližně 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% nebo 80%, ještě lépe alespoň z přibližně

83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% nebo 90%, nebo

92%, 93%, 94%, a nejlépe alespoň z přibližně 95%, 96%,

97%, 98%, 99% nebo více procent homologní s nukleotidovou sekvencí podle předkládaného vynálezu nebo její částí. Rozsahy a hodnoty mezi výše uvedenými rozsahy (například 70-90% identita, nebo 80-95% identita) také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Například, rozsahy hodnot identity využívající kombinace jakýchkoliv výše uvedených hodnot pro jako horních a/nebo dolních limitů jsou také zahrnuty. Výhodné MCT proteiny podle předkládaného vynálezu také mají alespoň jednu ze zde uvedených aktivit MCT proteinu. Například, výhodný MCT protein podle předkládaného vynálezu obsahuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí, která hybridizuje, například hybridizuje za přísných podmínek, na nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu, a která se může podílet na metabolismu sloučenin nutných pro stavbu buněčných membrán v C. glutamicum, nebo podílet se na transportu molekul přes tyto membrány, nebo má jednu nebo více • ·♦ ·· · ·· ·· ·*·♦ ♦ < · * * ♦ ♦ • · · · · » · · « • * · · · >·♦· · · · * • · · · · ··· ··· ·«·· ·· ♦ ·· ···· aktivit uvedených v tabulce 1.

V jednom provedení je MCT protein v podstatě homologní s aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (například sekvencí sudých SEQ ID NO: seznamu sekvencí) a zachovává si funkční aktivitu proteinu jedné z aminokyselinových sekvencí podle předkládaného vynálezu, i když se odlišuje v aminokyselinové sekvenci v důsledku přirozené variace nebo mutagenese, jak je podrobně popsáno v oddíle I výše. V jiném provedení je MCT proteinem protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z přibližně 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% nebo 60%, lépe alespoň z přibližně 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,

66%, 67%, 68%, 69% nebo 70%, ještě lépe alespoň z přibližně

71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,. 79% nebo 80%, ještě lépe alespoň z přibližně 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,

88%, 89% nebo 90%, nebo 91%, 92%, 93%, 94%, a nejlépe alespoň z přibližně 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nebo více procent homologní s celou aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu a která má alespoň jednu ze zde popsaných aktivit MCT proteinu. Rozsahy a hodnoty mezi výše uvedenými rozsahy (například 70-90% identita, nebo 80-95% identita) také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Například, rozsahy hodnot identity využívající kombinace jakýchkoliv výše uvedených hodnot pro jako horních a/nebo dolních limitů jsou také zahrnuty. V jiném provedení se vynález týká kompletního proteinu C. glutamicum, který je v podstatě homologní s celou aminokyselinovou sekvencí podle předkládaného vynálezu.

Mezi biologicky aktivní části MCT proteinu patří peptidy obsahující aminokyselinové sekvence odvozené od aminokyselinové sekvence MCT proteinu, například aminokyselinové sekvence sudých SEQ ID NO: seznamu sekvencí nebo aminokyselinové sekvence proteinu homologního k MCT proteinu, který obsahuje méně aminokyselin než kompletní MCT protein, nebo kompletního proteinu, který je homologní k MCT proteinu, a vykazuje alespoň jednu aktivitu MCT proteinu. Obvykle obsahují biologicky aktivní části (peptidy, například peptídy délky 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 nebo více aminokyselin) doménu nebo motiv s alespoň jednou aktivitou MCT proteinu. Dále, jiné biologicky aktivní části, ve kterých jsou regiony proteinu deletovány, mohou být připraveny rekombinantními technikami a mohou být hodnoceny na jednu nebo více ze zde popsaných aktivit. Výhodně obsahují biologicky aktivní části MCT proteinu jeden nebo více vybraných domén/motivů nebo částí mající biologickou aktivitu.

MCT proteiny jsou výhodně produkovány rekombinantními DNA technikami. Například, molekula nukleové kyseliny kódující protein je klonována do expresního vektoru (jak byl popsán výše), expresní vektor je vložen do hostitelské buňky (jak bylo popsáno výše) a MCT protein je exprimován v hostitelské buňce. MCT protein může být izolován z buněk za použití vhodného přečišťovacího schématu využívajícího standardních technik pro přečištění proteinů. Alternativně k rekombinantní expresi může být MCT protein, polypeptid nebo peptid syntetizován chemicky za použití standardních technik peptidové syntézy. Dále, přirozený MCT protein může být izolován z buněk (například endotelových buněk), například za použití anti-MCT protilátky, která může být produkována standardními technikami za použití MCT proteinu nebo jeho fragmentu podle předkládaného vynálezu.

Vynález také poskytuje MCT chimérické nebo fúzní proteiny. MCT chimérický protein nebo fúzní protein obsahuje MCT polypeptid operativně navázaný na non-MCT polypeptid. MP polypeptid je polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci ·« • « ···· odpovídající MP, zatímco non MCT-polypeptid je polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající proteinu, který není významně homologní s MCT proteinem, například proteinu, který se liší od MCT proteinu a který je odvozen od stejného nebo jiné organosmu. Ve fúzním proteinu označuje termín operativně navázaný to, že MCT polypeptid a non-MCT polypeptid jsou fúzovány v čtecím rámci. Non-MCT polypeptid může být fúzován na N-konec nebo C-konec MCT polypeptidu. Například v jednom provedení je fúzním proteinem GST-MCT fúzní protein, ve kterém je MCT sekvence fúzována na C-konec GST sekvence. Takové fúzní proteiny mohou usnadnit přečištění rekombinantních MCT proteinů. V jiném provedení je fúzním proteinem MCT protein obsahující heterologní signální sekvenci na svém N-konci. V některých hostitelských buňkách (například savčích hostitelských buňkách) může být exprese a/nebo sekrece MCT proteinu zvýšena pomocí použití heterologní signální sekvence.

Výhodně je MCT chimérický nebo fúzní protein podle předkládaného vynálezu produkován standardními rekombinantními DNA technikami. Například, DNA fragmenty kódující různé polypeptidové sekvence jsou ligovány dohromady ve čtecím rámci za použití běžných technik, například za použití lepivých konců nebo stagger-ended konců pro ligaci, trávení restrikčními enzymy pro získání vhodných konců, doplnění vhodných kohesivních konců, zpracování alkalickou fosfatasou pro eliminaci nežádoucího spojování a enzymatické ligace.

V jiném provedení může být fúzní gen syntetizován běžnými technikami včetně automatických DNA syntezátorů. Alternativně může být provedena PCR amplifikace genových fragmentů za použití kotvících primerů, které způsobí vznik přesahů mezi dvěma sousedními genovými fragmenty, které mohou být potom tepelně navázány a reamplifikovány za zisku chimérické genové sekvence (viz například Current Protocols in Molecular

99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · Φ · · ·

9 99 9 9999 9 9 · * χ-γ ········

0/ 999 9999 99 9 9* 9999

Biology, ed. Ausubel et al., John Wiley and Sons, 1992). Dále na trhu existuje mnoho expresních vektorů, které již kódují fúzní skupinu (například GST polypeptid). Nukleová kyselina kódující MCT může být klonována do takového expresního vektoru tak, že fúzní skupina je ligována ve čtecím rámci s MCT proteinem.

Homology MCT proteinu mohou být generovány mutagenesí, například diskrétní bodovou mutací nebo zkrácením MCT proteinu. Termín homolog, jak je zde použit, označuje variantu MCT proteinu, která působí jako agonista nebo antagonista aktivity MCT proteinu. Agonista MCT proteinu si může zachovávat zcela stejné biologické aktivity MCT proteinu nebo jejich část. Antagonista MCT proteinu může inhibovat jednu nebo více aktivit přirozené formy MCT proteinu, například kompetitivní vazbou na předcházející nebo následující člen metabolické kaskády komponent buněčné membrány, která obsahuje MCT protein, nebo vazbou na MCT protein, který zprostředkovává transport sloučenin přes tyto membrány, a tak zabraňuje translokaci.

V alternativním provedení mohou být homology MCT proteinu identifikovány prohledáváním kombinatoriálních knihoven mutantů, například zkrácených mutantů, MCT proteinu na agonistickou nebo antagonistickou aktivitu vzhledem k MCT proteinu. V jednom provedení se různorodá knihovna MCT variant generuje kombinatoriální mutagenesí na úrovni nukleové kyseliny a je kódována různorodou genovou knihovnou. Různorodá knihovna MCT variant může být produkována například enzymatickou ligací směsi syntetických oligonukleotidů do genových sekvencí tak, že degenerovaná sada potenciálních MCT sekvencí je exprimovatelná ve formě jednotlivých polypeptidů, nebo alternativně, jako sada větších fúzních proteinů (například pro fágové zobrazení) obsahujících sadu MCT

• * * · · • · * · • · · « « · · • · · sekvencí. Existují různé metody, které mohou být použity pro produkci knihoven potenciálních MCT homologů z degenerované oligonukleotidové sekvence. Chemická syntéza degenerované genové sekvence může být provedena v automatickém DNA syntezátoru a syntetický gen může být potom ligován do vhodného expresního vektoru. Použití degenerované sady genů získání - v jedné směsi - všech sekvencí kódujících požadovanou sadu potenciálních MCT sekvencí. Způsoby pro syntézu degenerovaných oligonukleotidů jsou známé v oboru (viz například Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984, Science 198: 1056; Ike et al., (1983), Nucleic Acids Res. 11; 477 .

Dále, knihovny fragmentů kódujících MCT protein mohou být použity pro přípravu různorodé populace MCT fragmentů pro testování a následnou selekci homologů MCT proteinu. V jednom provedení může být knihovna fragmentů kódující sekvence připravena zpracováním dvoj řetězcového PCR fragmentu MCT kódující sekvence nukleasou za podmínek, při kterých vznikají zářezy četností pouze přibližně jedenkrát na molekulu, denaturací dvouřetězcové DNA, renaturací DNA za vzniku dvouřetězcové DNA, kte.rá může zahrnovat páry kódující/protismyslný řetězec z produktů s různými zářezy, odstranění jednoho řetězce z vytvořených duplexů zpracováním S1 nukleasou, a ligací získané knihovny fragmentů do expresního vektoru. Tímto způsobem může být získána expresní knihovna, která kóduje N-koncové, C-koncové a vnitřní fragmenty MCT proteinu různé velikosti.

V oboru je známo několik technik testování genových produktů kombinatoriálních knihoven připravených bodovou mutací nebo zkrácením, a pro testování cDNA knihoven na genové produkty mající vybrané vlastnosti. Takové techniky jsou

#· 99

9 9 9

9 9

použitelné pro rychlý skríning genových knihoven generovaných kombinatoriální mutagenesí MCT homologu. Nejčastěji používané techniky, které jsou vhodné pro vysoce účinnou analýzu, pro skríning velkých genových knihoven, obvykle zahrnují klonování genové knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformování vhodných buněk získanou knihovnou vektorů a expresi kombinaroriálních genů za podmínek, při kterých detekce požadované aktivity usnadňuje izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt byl detekován. Rekursivní souborová mutagenese (REM), nová technika, která zvyšuje frekvenci funkčních mutantů v knihovnách, může být použita pro skríningové testy pro identifikaci MCT homologů (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993)

Protein Engineering 6(3) : 327-331) .

V jiném provedení může být buněčný test použit pro analyzování různorodé MCT knihovny, za použití metod dobře známých v oboru.

D. Použití a metody podle předkládaného vynálezu

Popsané molekuly nukleové kyseliny, proteiny, homology proteinů, fúzní proteiny, primery, vektory a hostitelské buňky mohou být použity v jedné nebo více z následujících metod: identifikaci C. glutamicum a příbuzných organismů; mapování genomů organismů příbuzných s C. glutamicum; identifikaci a lokalizaci daných sekvencí C. glutamicum; evolučních studiích; stanovení regionů MCT proteinu nutných pro jeho funkci; modulaci aktivity MCT proteinu; modulaci metabolismu jedné nebo více složek buněčné stěny; modulaci transmembránového transportu požadované sloučeniny; a modulaci buněčné produkce požadované sloučeniny, jako je čisté chemické činidlo.

Molekuly MCT nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu

·· · © * • · 9 « · 9

mají různá použití. Za prvé, mohou být použity pro identifikaci organismu jako Corynebacterium glutamicum nebo jeho blízký příbuzný. Také mohou být použity pro identifikaci přítomnosti C. glutamicum nebo jeho příbuzného ve smíšené populaci mikroorganismů. Vynález poskytuje sekvence nukleové kyseliny mnoha genů C. glutamicum; sondováním genomové DNA extrahované z kultury jednoho nebo směsi mikroorganismů za přísných podmínek sondou pokrývající region genu C.

glutamicum, který je jedinečný pro tento organismus, je možno zjistit, zda je tento organismus přítomen. Ačkoliv je Corynebacterium glutamicum samo o sobě nepatogenní, je příbuzné s patogenními kmeny, jako je Corynebacterium diphtheriae. Corynebacterium diphtheriae je kauzálním agens záškrtu, rychle se rozvíjející, akutní febrilní infekce, která je jak lokální, tak systémová. U tohoto onemocnění se lokální léze rozvíjejí v horním respiračním traktu a projevují se jako nekrosy epitelových buněk; bacily secernují toxin, který se šíří těmito lézemi do vzdálených citlivých tkání v těle. Degenerativní změny způsobené inhibicí syntézy proteinů v těchto tkáních, mezi které patří srdce, sval, periferní nervy, nadledviny, ledviny, játra a slezina, vedou k systémovým projevům onemocnění. Záškrt má stále ještě vysokou incidenci v mnoha částech světa, včetně Afriky, Asie, východní Evropy a nezávislých státech po Sovětském svazu. Probíhající epidemie záškrtu v posledních dvou regionech má od roku 1990 za následek nejméně 5000 úmrtí.

V jednom provedení vynález poskytuje způsob pro identifikaci přítomnosti nebo aktivity Corynebacterium diphtheriae u jedince. Tento způsob zahrnuje detekci jedné nebo více sekvencí nukleové kyseliny nebo aminokyselin (například lichých nebo sudých SEQ ID NO: seznamu sekvencí) u jedince, což cetekuje přítomnost nebo aktivitu Corynebacterium diphtheriae u jedince. C. glutamicum a C. diphtheriae jsou • ·<· *« « <·· ·· ·· » « ··« «««« • ·*··* , · · 1 « « · · ···« · · · · • · ··· ··· ··· ···· ·« · ·· ···· příbuzné bakterie a mnoho molekul nukleové kyseliny a proteinů u C. glutamicum jsou homologní s molekulami nukleové kyseliny a proteinů u C. diphtheriae a proto mohou být použity pro detekci Corynebacterium diphtheriae u jedince.

Molekuly nukleové kyseliny a proteinů podle předkládaného vynálezu mohou také sloužit jako markéry pro specifické regiony genomu. Toto je použitelné nejen pro mapováni genomu, ale také pro funkční studie proteinů C. glutamicum. Například, pro identifikaci regionu genomu, na který se váže určitý DNAvazebný protein C. glutamicum, může být genom C. glutamicum tráven a fragmenty mohou být inkubovány s DNA-vazebnými proteiny. Ty fragmenty, které se váží na proteiny, mohou být dále sondovány molekulami nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, výhodně opatřenými snadno detekovatelnýni značkami; vazba takové molekuly nukleové kyseliny na genomový fragment umožňuje lokalizaci fragmentu do genomové mapy C. glutamicum a, při opakovaném provedení s různými enzymy, usnadňuje rychlé určení sekvence nukleové kyseliny, na kterou se protein váže. Dále, molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být dostatečně homologní se sekvencemi příbuzných druhů, takže mohou tyto molekuly nukleové kyseliny sloužit jako markéry pro konstrukci genomové mapy u příbuzných bakterií, jako je Brevibacterium lactof ermenturr..

Molekuly MCT nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné pro evoluční studie a studie týkající se struktury proteinů. Metabolické a transportní procesy, na kterých se účastní molekuly podle předkládaného vynálezu, jsou využívány mnoha druhy prokaryotických a eukaryotických buněk; srovnáváním sekvencí molekul nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu se sekvencemi kódujícími podobné enzymy z jiných organismů může být hodnocena evoluční příbuznost • ·· · · · · · ·· • · « · ··* · · · a • ····· ·· * « · · · ······· · * • · · · * · · · ··· ···· ·· · ·· ···· organismů. Obdobně, takové srovnávání umožňuje hodnocení toho, které regiony sekvence jsou konzervovány a které ne, což může napomoci pro určení těch regionů proteinu, které jsou zásadní pro funkci enzymu. Tento typ stanovení je významný pro proteinové inženýrství a může ukázat, co může protein tolerovat ve smyslu mutagenese bez ztráty funkce.

Úpravy molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou vést k produkci MCT proteinů majících funkční odlišnosti od přirozených MCT proteinů. Tyto proteiny mohou mít lepší účinnost a nebo aktivitu, mohou být v buňkách přítomny ve vyšších než obvyklých množstvích, nebo mohou mít nižší účinnost nebo aktivitu.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro vyhledávání molekul modulujících aktivitu MCT proteinu, buď tím, že interagují s proteinem samotným nebo substrátem nebo vazebným partnerem MCT proteinu, nebo tím, že modulují transkripci nebo translaci molekuly MCT nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. V takových způsobech je mikroorganismus exprimující jeden nebo více MCT proteinů podle předkládaného vynálezu kontaktován s jednou nebo více testovanými sloučeninami a hodnotí se efekt každé testované sloučeniny na aktivitu nebo úroveň exprese MCT proteinu.

Existuje mnoho mechanismů, kterými může alterace MCT proteinů podle předkládaného vynálezu mít vliv na produkci, výtěžek a/nebo účinnost produkce jednoho nebo více čistých chemických činodel z kmene C. glutamicum, který inkorporuje takový pozměněný protein. Získávání čistých chemických sloučenin z veikoobjemových kultur C. glutamicum je značně zlepšeno, když C. glutamicum secernuje požadované sloučeniny, protože takové sloučeniny mohou být snadno přečištěny z kultivačního media (oproti extrakci z buněk C. glutamicum).

Zvýšením množství nebo aktivity transportérových molekul, které exportují čisté chemické činidlo z buňky, je možno zvýšit množství produkovaného čistého chemického činidla, které je přítomné v extracelulárním mediu, což umožní snazší odběr a přečištění. Naopak, pro účinnější a větší produkci jednoho nebo více čistých chemických činidel je nutné vyšší množství kofaktorů, prekursorů a meziproduktů pro vhodnou biosyntetickou dráhu. Proto může zvýšení počtu a/nebo aktivity transportérových proteinů podílejících se na importu živin, jako jsou zdroje uhlíku (tj. sacharidy), zdroje dusíku (tj. aminokyseliny, amonné soli), fosfáty a síra zlepšit produkci čistého chemického činidla, v důsledku odstranění omezení biosyntézy pramenících z dodávky živin.Dále, mastné kyseliny a lipidy jsou sami o sobě čistými chemickými činidly, takže optimalizace aktivity nebo zvýšení počtu jednoho nebo více MCT proteinů podle předkládaného vynálezu, které se podílejí na biosyntéze těchto sloučenin, nebo narušení aktivity jednoho nebo více MCT proteinů, které se podílejí na degradaci těchto sloučenin, může vést ke zlepšení výtěžku, produkce a/nebo účinnosti produkce mastné kyseliny a lipidu z C. glutamicum.

Úprava jednoho nebo více MCT genů podle předkládaného vynálezu může také vést k zisku MCT proteinů majících pozměněné aktivity, které nepřímo ovlivňují produkci jednoho nebo více čistých chemických činidel z C. glutamicum. Například, normální biochemické procesy metabolismu vedou k produkci různých odpadových produktů (například peroxidu vodíku a jiných reaktivních druhů kyslíku), které mohou aktivně interferovat se stejnými metabolickými procesy (například peroxynitrit nitratuje vedlejší řetězce tyrosinu, čímž inaktivuje některé enzymy mající tyrosin v aktivním místě (Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226-235). Zatímco tyto odpadní produkty jsou obvykle vyloučeny, jsou kmeny C. glutamicum použité pro velkoobjemovou fermentaci * ·· ·«· ·· • 4 · · · · · ·· • · ·<··· · · • · ·· ·······> · « * · · » · · ······· «· · ·· optimalizovány pro nadprodukci jednoho nebo více čistých chemických činidel, a tak mohou produkovat více odpadních produktů, než normální C. glutamicum. Optimalizací aktivity jednoho nebo více MCT proteinů podle předkládaného vynálezu, které se podílejí na exportu odpadních molekul, je možno zlepšit životaschopnost buněk a udržet účinnou metabolickou aktivitu. Také přítomnost vysokých intracelulárních koncentrací požadovaného čistého chemického činidla může být toxická pro buňku, takže je zvýšením schopnosti buněk secernovat tyto sloučeniny možné zlepšit životaschopnost buněk.

Dále, MCT proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být také upraveny tak, že jsou produkována různá relativní množství různých lipidů a mastných kyselin. Toto může mít značný vliv na lipidové složení buněčné membrány. Protože má každý typ lipidu různé fyzikální vlastnosti, může alterace lipidového složení membrány významně měnit tekutost membrány. Změny v tekutosti membrány mohou ovlivňovat transport molekul skrz membránu, což může modifikovat transport odpadních produktů nebo produkovaných čistých chemických činidel nebo import živin. Takové změny tekutosti membrány mohou také. významně ovlivňovat integritu buňky; buňky s relativně slabšími membránami jsou náchylnější v prostřední velkoobjemového fermentoru k mechanickým stresům, které mohou poškodit nebo usmrtit buňku. Úpravou MCT proteinů podílejících se na produkci mastných kyselin a lipidů pro konstrukci membrány tak, že vzniklá membrána má složení odolnější vůči podmínkám v kulturách používaných pro produkcí čistých chemických činidel, se dosáhne zvýšení počtu přežívajících a dělících se buněk C. glutamicum v kultuře. Vyšší počet buněk C. glutamicum v kultuře se odrazí ve vyšším výtěžku, produkci nebo účinnosti produkce čistého chemického činidla v kultuře.

Výše uvedený výčet strategií mutagenese pro MCT proteiny vedoucí k zvýšeuí výtěžku požadované sloučeniny není vyčerpávající; variace těchto strategií mutagenese budou zřejmé odborníkům v oboru. Za použití těchto mechanismů mohou být molekuly nukleové kyseliny a proteinů podle předkládaného vynálezu použity pro přípravu C. glutamicum nebo příbuzných kmenů bakterií exprimujících mutované MCT nukleové kyseliny a proteiny, které zlepšují výtěžek, produkci a/nebo účinnost produkce požadované sloučeniny. Požadovanou sloučeninou může být jakýkoliv přirozený.produkt C. glutamicum, kterým může být konečný produkt biosyntetických reakcí a meziprodukt přirozených metabolických reakcí, stejně jako mohou být požadovanou sloučeninou molekuly, které se přirozeně nevyskytují v metabolismu C. glutamicum, ale které jsou produkovány kmene C. glutamicum podle předkládaného vynálezu.

Vynález bude nyní ilustrován v následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Všechny citace, patentové přihlášky, patenty, publikované patentové přihlášky, tabulky a seznamy sekvencí citované v této přihlášce jsou zde' uvedeny jako odkazy. 76 • · · · * < • · · · · • · · · * · • * · ······· • · · · ·

I · « · · ♦ · «

CM u

Tabulka 1: Geny podle předkládaného vynálezu §

ΙΛ s

i §

CZ)

o o o ^<

J J J o CQQ2

CZ) CZ) CZ) O< < < z gzg j j j y w w ω z

CO «1 C/3. S.

>>>->. X :*ž M o <·<·< Z Z Z Z S ř-bPp on og g

Q ω

ω •—í co

CQ

O

0

co

to

Ď-

0

10

Cu 0

CM

b

cn

CM

co

2

CM M-

O

M-

O

O

CD

M-

to

b.

b

co

to

CO

CM

b

CO

CO

CM

5Λ

CM CM

▼—

CO

tO

<«-“

to

CM

O)

to

Μ-

co

b CO

IO

b

O

CO

CO

CO

co σ>

X->

co

CO

CM

V“

b

CM

to

CO

T—

H

v- CM

Ύ—

CO

CM

CO

CO

CM

H

CM CO

co

M-

M-

IO -r-

to v- CO

10 to

CO

Z

Z

CO CD CD CO T- to

CO (O το tí <\i CO r<0 <O O O O O O O O > a:

> O O b- o O) cn O O O V<O CM O O O O

.. Z < < 2 ggg tC •£3 o O £z ® £ p O 5 ω

J?O •M Z s 9

J! O - ω

Z 1/5

-a •a » r—4 ω

^-1

I š

MU +-> ¹ C >»

CZ) íz '3

CM tO Tf b- o

O CO O CM CO ff) «7 S S LO co co m· to rNG*“T-r-r-NiN

CO v- v 00 CO ^í* o> b- b· co to cm e~i OoOOOOovOoOOOOoo qi>g:q:ccq:>> 0>00ϋϋ> >

or S ncoo s CMOOjycOCOCOOCO M-io^ipr-oob T-N^CMr-^r-O

00500000 ; 2 3 < < < z z w

.5 *53 Ó : £Z' •š O:

θ'! O CM M* CO 00 O CM UjICO-r-v-v-x-^r-CMCM co O bto M10 bCM Tb- v co <0 o o o o or ££ O o co b· b* b-cocob-ocNb-Ob-co

T-fPCDr-CJOT-COSO

CMCOM-OOCnCMOCOCMvO 00 O CM CM Tf o Ob-^^cMr-rr^cDcn

OoOOOOO^O^

O0OOOOO0O0 ο:>ο:ο:α:ο:α:>ο:>

o>ooooe>o>

b o <P b. o ®<mcmOOOoS ^οο'ί N cocog » o o-S o 000 o

o o

o:

o

Λ .Ξ

O £z O a

Έ θ' xf O 5 ω CM CM < CO

OOOCM-cfCOOOOCMM-CD CMCOCOCOCOCOM-M··^ M^- £<Z> 'W z 8° '1“ b~cn^-foinb-cr>r-cov) ťMCMfOCOCOCOCOM-M''’^ > υ > co W co ; 2 > ω c > š z y i L· · i Ν

UM

32-hg < = J5 ω

3>3ν£ > >“ -η < (Λ ^<S<

i: < Z. 5 = £ξ°3 > . CO < CO >CÍ <£

-<<§-< 3 K Z p Z > Ξ r- < r· ř O í 5 £

S ω < ω <

/» VJ

Q > > < x x Ο·<·<

X 5 Š2

ÍS2 < < <

C/5 t/) tS) << <

Η Η H XXX □ 3 □ QQD

33S

3 3 sž

O CJ U ~ rX < < < ^ 2 CM CM >Q >Q >Q

55 55 w w O O O ZZZ<<

> > í> _i _i O O O O O sss ss ujwwhh H Η H «- X

SSSgg &L&L&Í « ·

Vt J J > > > G o q y y <3 < < < o o o o o p p X X X ω E o o ς 2 3 m cn co m cn

\© Ό Ό Ό Ό \© (Ί hj H fj N rj r*S r«S reI nS fO H u u u u υ o ω ω w ω ω w

Z Z Z ooo 3££ «: < 5 5 5 B j j j OOO J J X > > > «:

£ί g·

				to			tO			CO
CM	K	cn	o	co	σ>	M·	to	b-	r~	co
CM	b-	<0	co	r~	to	CO	M-	O	r-	h-
O	to	(O	co	to	CM	CO	O)	o	co	CO
Μ*	CO		CM	r-	•M·	CM	*“		M·	V“

i— co

CM CO M- CO CO lO to*-cococor-~tn<0' co • tO • CM t— i·*»

CM co

CM CO O) CM __ fx. r- tO O> CO CM O t- <O O co <- tt co xr co o r-t—^rOvCO x— tO O> <M tO h- Γ- <O CO CO O

S5Ír>;Í-CMCMT-IO<OCMr-CMin

O

Μ^-

O

CO co < co < o < CM CM ·

					r-»			t-		co
cO	<0	’φ		<0	M-	CO	OT	CM	T-	T—
CO	Tf	to	co	O)		O	O		CO	CO
cn		co	to	co	E	CO	to	CO	CO O	to
CM	to	o	CO	co	V“	co			T- Tf

lO CO CO CM O) CO _ o o v- cm r- to o *? CO T- <o <- M- _ <M

COCOCOOCMr-COlOCOI^

CM <0

CM

CO CO CO co v- COtOO>CO<Oh*OOCJ)tO<OTCO<OCOCOCOCOIOCMCO<OO<OCO CMOxfCOCOCOtOO^-^CMCOiO CO*“CMT-^-T-T-’r-CO*-v-r-lO

M- to r- v CM CO CO CO CO <7> *- CO O O Oi V O> CO CM CM O CM £í to M- O> <0 CO 10 T- o -r- CM Tř n- CM O Tř o 'i- co cs, O M- M- co M· CO £^££££^££££^££{^£2^2:^^^32^^05^^ o ΟΟΟΟΟΟοθΟΟΟτ-ΟΟο<ΟΟο<Ε>θσοί-.ΟΟΟοΟΟ o ΟΟΟΟΟΟοΟΟΟΟοθΟθΟΟθΟΟΟΟ<->ΟΟθ£θΟ £> KccíEfcca:>£Q:ÉQ:>£a:>a:a:>Q:Q:cÉa:5c£tfcÉ>ixx > ϋοοοϋο>οϋθϋ>οο>ϋο>οοοο>οϋϋ>ϋϋ

CM ro o

a:

o r- o CD O 00 *- Μ- T- h- lO fMCMxsrCOCOOrob-^-CMfO^CM OCOh-CO^-COeo^-CMCMUlOtO X— OOOOOoOOOr-OO OOOOOOoOCDOoOO >ο:α:ο:ίχο:>ο:α:β:>ίτα: >OOQOO>OOO>OO o C £z

O 9 c

p &

= ω

ÍÓ ·* Z o Q

4) «— o Ž c/5

σ cm m· <o co

CMM-COCOOCMM-COCOOCMM-COCOOCMM-tOCOOCMMrtOCOOOOOO ΙΟ Ό ΙΓ) U) O CO (O CO (O t'·' C-- Γ··- f’'·' C— CO CO CO CO 00 O> O CŤ> O) O v v— v— r- n tn s ^t^insCTt-ninscň^fOiOHcnr-ninscnv-fýunsďíoooo ipiomib^OíOtoiOto^h-h-f^h-wcowwcochcncncncnT-T-T-rCMM-COCOOťMrrtOOOOCMM-CO v-^-f-^-CMCMCMCMCMCOCOCOcO .eomrx.OT-couhř^-o^coto v-v-^-t-CMCMCMCMCMCOCOfO • · · ···»

-7í

xr xf 'T xt \6 <O KO u u o o ω ω W W

0u u ς

W W ti N N N S >ω »w >w >U Η Η H h « W ti >κ >k >aí >ct ώ. ώ. cát d <ž

05

CO

CM

05

CO

CO

CO

xř

CM

05

r-

O

05

CM

CO

xj-

co

CO

05

T“

CO

CO

XT

co

co

fO

CM

XT

h-

O

co

T—

CO

co

CO

v—

CM

CO

co

CM

to

O

CO

05

t—

xr

CM

40

CM

r-

X

xf

CM

XT

r-

CM

r-

CO

CO

*—

05

xr

xr

CM

co σ> ’φ cm

COOOlOlOCMOCOOOOO) toosno^-tncocDcoNO CO 05 Γ— 05 CM CO t— <O CO Γ— CM tO 40t-t-05x-05CM*-CMCOC040 ti řz r- IDN fO CO CO O) to O O V- o CO xr Γ- CO CO CO CO o r- co ’τr- _ xr T- o s IT) s co CO CO CM ΙΟ O V CO O O ΤΟ o o φ o r- (\ O) ω io t-COx-CO»OCOt“C0COx-xCO to co (DpCN^^cor-ooscorr-Ov-OOOtOOr-T-rxf 05 r5f^o>H5ícO(MiocMr«-xř fMS*-gA<NCM(OCO*n<0 CO^SRoOOv-T-O» '•OÍ<x(NN(OCOCOO lOSSoo.OOOO J$gZ22222

co *- xr CM v- O) CM o co o 10 o co o co o> co xr

T- T- v V- co · co x~ x- CO 04 cO CO CM h* ™ CM r- CO CO O T- o o o o 2 o o o xf σ>

co

CM t- CO 05 xr co σ> co σ> cd in xf co x- o co coiocoo^cncoxrcMOcoio xfT-(D-r-COCr>CMCOCOOCOCJ) COCOT-T-O)h»CMO>T-COCOCO ΐΛΝΟΛΝΝΟίηΐΛΐΛΐηΐΛ mcMOcncococMcococococo x-CMCOOx-x“r~x~x“X“x-xoooooooooooo ° S? S? ° ° ° oooooooooooo

CM-S

CM

co

co

o

CM

CD

40

CD

05

co

CO

r-

co

Xf

05

xr

co

co

05

co

xr

05

xt

X?·

o

xr

xr

xr

tn

xr

co

to

o

o

40

v*

T—

r-

ř-

Γ-

co

Γ-

CM

o

CM

τ-

CM

CM

CM

O

O

CM

Τ-

o

Τ-

O

o

o

Ο

O

O

O

o

o

O

o

o

Ο

o

Ο

O

CD cm xr 05 05 05 tCOOr-int-COtQ

O CM 40 CO 05 CM CM cMcococovinioco io m oí co r- TtnuiM-h-cocomco

CD (Ώ *t lí) < <£) <O £ OOOOoOOo ΟΟΟΟοθΟο £τα:<χα:>α:α:> oooo>oo>

O TU¹ .

Í9 2? x Í2 h co :>sz s θ &z O s c

p o 5 ^ω < tZl

CO O CM CO CO O CM xf CO CO coxrxrxrxrxruimtntntn

O CM Xř co co o co co co co co rxrcoaoocMxrcocoocNxrco r-t-t-.cDCD«>cDcD0>o>0505 <U >»

Λ

O

G +-* co cd o £z o 9

Z co x- CO ir> Γ- 05 to co <O <0 co co coiob-cn^-cotnr^-o-r-cou·) κ-κ-Γ'-Γ'-οωοοωωσισισ» <υ o

cd

Ό cd íh

OĎ <υ

Q £o -rt Z 89 a

UJ Z co

COOCMxřCOCOOCM

0500000x-x~ v-CMCMCMCMCMCMCM

SOr-COlňSCDrσ>σ>οοοοοττ— τ— CM CM CM CM CM CM ·· ·« « · ♦ • · *

I · · · · * · • · · · • · » ··· >

’§

Λ>

a

S < < .· .

<

• 3 05 £

-1 H ř- <

O < < Z _T ti. U, ttí ca. c/3 co H OOn '< £ £ § &92P O jjc *<>>£ Éllz o £ £ t Q O O £

ctí

H

										co	Ct 0
	CO		O	O	O	b-	CO	CM	b-	co	v
b.	V“	co	O)	CM	O	CO		to		co
co	CO	CD	CM	CO	CM	M“	<r~	to	00	<0	H
CD	v—	V	co	CM	*“	CM	V“	CO co	co co		z

to

'tt

CM CM

Xf

0

CD

<0

b-

CO

CD

Ν'

CO

CD

v·

M“ CO

N-

CD

CM

co

10

co

iO

co

CD

CD

to

00

co

CO

ν-

VO CM

IO

v-

CO

íO

0

00

b-

v—

b.

CO

co

CO

CO

CD

CD

CO

αό

CD b-

CO

CM

CO

b-

0

co

b-

b-

CM

T-

CM

CM

CM

T-

CM

T—

to

co

CM Ν' CO

T-

v—

v-

v-

10

Ν’

10

CM

co

CO

•c

O

co

co

T“

b-

co

cd

Λ

co

0

Ν'

CD

CO

0

to

co

co

b·

V—

<6

co

”T

O

CO

co

co

10

τ-

O

V“

H

v-

CM

<0

cO

CM

CM

co

b»

ΟΝ

b.

CO

Z

b-

to

O

CD

b·

b*

00

CD

O

Ν’

CO

b-

to

Ν’

CO

CO

<0

co

v

Ν'

to

<0

co

CO

b-

CM

co

co

co

0

’Μ’

b-

0

0

0

O

O

0

0

0

0

O

O

0

0

0

O

O

0

0

0

0

0

O

O

qí o: o: ct oé o o o o o

CÉ o

cc o

ce > o; cc a > o>ooo>

cd tt co n· o cm coco <0 (N O S ch 10 li) ω XJ- CM CO T- <0 5ř O

CŇ r- CM v r- r- CM

CO tO b- O N“ b <0 cd o co cm M-to^rcocoiotr; tOM-OOO^-OtOxtOCOCOb-^CM OCObCOOV^NtnCMMCOinrcocNcncoT-T-cOT-i-coN-T-rre:

t- co co m co co bv b- b- <0 to cn <0 CM CO CO CO b- CM CO 0000000 0000000 a: cc cč a: qí <r a: ϋϋϋϋϋϋϋ o

o (C

O

10 cn cd co 0

Qm^O^^N^mObcOtOb S^mSScoJXZ^GXOcoocootO o O θ O O O O v- t— O *— O ΟοθΟ^ΟΟΟοοΟΟΟΟ K>c£>c:c:a:cr:>>>>>§ ϋ>ϋ>Οϋϋϋ>>>>>>

T- CO O CN Ν' U) _ co co 00 £> P CM CM CM ® ?§?s§

O <0

CM

O <

co o 2> o b- co CO to o CO b- <0 T- ΙΛ X tn (O Tν-Ο^'τ-ΓΜ’τo O S O O O < z o < < ω ω

« I φ 2 JZ n o <0

SOlOr-00 <M CM CO O v- v- CSI CM OOOOO < <

b- cd co <0 o CM £2i

cd bC0o2b-CXc0T-O<DC0C0C0x-bbOrjbobacobrwfNbo tOCOK^XM-CM^tCOOOCMOiCO t-CM^O^Ot-O^CMOCM^-CM ^Λ O S O-Sj 000000000 Z3Z£Í<<<WWWC/)OO o

,z

Q xr co co o cm

O T- ·*- T- CM CM ω CM CM CM CM CM

CO CO O CM M· (O co

CM CM CO CO CO CO CO

CM CM CM CM CM CM CM »3

Xj §

<U <υ ce c

Έ Ó

0Λ hť >-, Z o Q

O CM M- CO co O CM V Ν' V NT V tO tO CM CM CM CM CM CM CM

M- tocOOCMM^COCOOCMM-COCOOCM to tntococoíococob-b-b-b-b-coco CM CMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCM

-^•cotob-a»*r\ T- v- *- «- CM z: CM CM CM CM CM o

b- CD t- CO to b~ CM CM (O CO CO CO CM CM CM CM CM CM %

(Λ .2 m

£0 ·« Z 8 2 -ϊ o ž “ cd ·«— co m b- cn v co μ- xr xr -M- tt to

CM CM CM CM CM CM CM lOb-CDv-COtOb-CDT-COlOb-CDimtoiocococococob^b-b-b-b-co

CMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCM

TO

Η

κ-	c
φ	73 si
tr
o	0 q
CL	E
V) c	<
TO	Λ
L_	SX
l·—	73 yj
1 o	>,
CQ	•rt >
<	8 3 Z

CL

I

cn

CO

co

CM

cn

CO

xf

CO

b

CO

to

xr

O

to

σ> co

CM

co

o

co

CO

to

b

to

co

b

to

O

CM

•χ—

x—

to

b

co

CO

b

co

CO

b

co

b

b

CO

co to

co

Xt

lf)

m

b

b

to

cn

co

cn

V»

b

Xf

b

xf

co

xf

co

b

O

to

o

CO

CM

to

CO

to

x—

co

co

CO

CM

b

xt

x?

b CM

χ-

CO

T—

xr

xf

O

to

cn

co

xf

x—

to

CM

to

to

co

to

03

03

CM

to

CM

V“

O

b

co

b

b

CM

CM

CM

CM

CM

to

cn

O)

CM xf tO

ιό

X-

co

to CM

b

<O

CM

x“

«Γ*

CM

T~

xf

r-

CM

CM

cn

co

co

CM xf

x~

X—

x—

xf

CO

to

xf

CM

t—

CM

CM

to

to

to

m co cn cm cm *-· cn oo o · ·*- b xrcococnotocnoicocoto·»·“ CObbOCOxrr-CMbx-CMx(Nt—v-r-rMCDCOtOCOCDfOx-cOCNCMCM co to x- to ▼- o co (NinnoscostDco cm co b ců ν tsofocosoío^vcncntnxrr-ciforrsco SNNTrojstrr-oNorKDv-xjsomM - *· fOCMlOfOr-r-MCOfOT-r-D' • tO xf fO xř co cn o μ- C4 v M¹ c: lObocMcoxrcncotocM T>CNx-(DU?OnCJCF)r\ vcMv-ONNiominír:

cn m b cn cm xr to co co co co cn cm v b co b co cm x- o xr cm <\ί0(\ι0ο00ο0θθ^***^θ0*-θί0^000ν-00.»-.000,— Ot— OOOqjoox— oočoco ΟθΟ^ΟθθΟ^Ο^^Ο^ΟθΟθΟθ^Ο^οΟΟοΟΟΟοΟοΟΟΟοοΟΟΟΟΟΟ so:>a:>a:Q:>a:sixa:>c£>a:>cč>ircx:c:ar>cto:>G:[x:a:>a:>a:a:a:>>>>>>>> >ο>ϋ>ϋϋ>ο>ϋϋ>ϋ>ϋ>ϋ>οοοϋ>ϋθ>οοϋ>ϋ>θϋϋ>>>>>>>>

tc •C

x- T t- CO fexfí5totocox-§cotoí2to«o cNÍrcMcn^^^v-íNcoScQř»' ř-ί ox o cm cm oo ZZ ms 5=; b co 2? CM CM CM x- 2 O Q 5 O O

CM

cn	xf	CM	to	to	CO	CM
Xf	CM	O	V“	CM	cn	x—
b	CM	co	to	to	o	xr
CM	CM	χ-	CM	O	CM	o
O	O	Ο	O	O	o	o

:zzzzzzzz

COOOOCMxftOCOOCMxřtOCOOCMxítOCOOtMxftOOOOCMxtCOCOOCMXřtOCOOCMxtCOCOOCMxfCOCOO icocoa>cn<ncncnooooox~x--'-x-x-CMCMCM(MCMcofocofocoxrxrxtxrM’totototoio<o<ocococob I CM CM CM CM CM CM CM CO CO tO tO CO CO CO CO CO CO CO tO CO CO CO tO <O CO CO CO tO CO tO fO CO ΓΟ CO CO tO tO CO tO CO CO CO CO unbcn’-fotob<nx-fOtobOx-cotob<nx-fou3bcnx-foiObcnx-fOtobcnx~cotOb<nx—cotobcn 'CooocoCTcncncncnooooox—x-x-x-x-CNCMCMCMCMcotOfOcocoxrxrxrxrxrOtnminintocotototo i CM CM CM CN CM CM CM CM tO tO CO CO CO tO CO tO CO CO fO fO CO CO CO fO CO CO <O fO CO (O CO CO CO CO CO tO fO <O CO CO CO CO CO

H iř ,3

2 2 us tu tu p u O Ν Ν X •us >LU -LU (- ř- a LU LU LU >Gé£ »Otí »0É . ř- H a : aí aí _η > ο ο S • 4,1 ) C0 ζΛ £ : z z t < < Ν , : « οί ω ' (— Η* ι Ο O,“ : aí aí, • £ ;s^2 > Ο UJ ao . a. u. z

7 <

t—t VJ f->

US < £ m Ncomsiocn^rCDOCOmCOOCDLDOCDXfCOtO fMh-OOCOCO. VO-M-COxrcn^J· r-mco^cOCDLncocococjcNco

ΟΠίΛττώΝ'ίΟίΟτcocoovLOtovr^h-cn h-COCOcDOOCMOCO*'*··»(Dr-vinvOSCDr-CNCO co rcot-t>tn^fr~f-co<Dcocniom ['iggr-roHsooo-M·^·?

CNggíNT-OOr-T-^OOO oggoooooooooo co o eO&ktOCON^NONOr-N ÍO><>-<COCMxrvOOcOCOCOCO coxxcM*n-»--r-ooi^ooo ri^^v-Ox-x-r-x-x-COCOCO ,οοσοοοοοοο s2ZZZZ2Z2Z2

ϋ O S.Z o Q s

eOcMxrCOCOOCMxrcDOOOCMxrCD ^Uh-ssscocooajrocDcncno) <!Z)COCOCOCOCOCOťO(OCOCOCOCOCO n^fOLOsaiv-ninscn^-fOin “ r- r- b- r- r- co co oo co co cn cn σ> £y,<O ťOCOCOtOCOrhfOCOCOCOCOCO

LU

CO

1λ z

i a

o

C/5

Λ u:

2 2·^ > ·>· >

Z Z Z U1 UJ ítí > > >

Η H — >ω *ui > > >

N N N O O O cd cd cd <S) ϊ/j <S>

Z Z Z

3-lu lu lu . to co co p oooS SSSo 2 2 2 2 < < < s

Η Η H < cd cd cd 222g

CO CO CO

- - > Ét

CO < z ... „ cd 5

Η P H 2 O O O H cd cd cd /-x a. a. a.

£2 £3 Ξ o□ O □ Z>

'E ‘ω -tu ·ω H ř Η H co co co co > >· > > co co co co »U KJ 'U &o So & So OOOO Z Z Z Z.^ .

o o o o w o

SSS223S ££g£g>£ O O O O < a- O gC aí aí aí « H aí 0- CL Cl. CL H < CL

Li

US LU LU LU Η Η Η H OOOO cd cd cd CU A« CU fiU * z z ε 2 g S g z Oo^ < Ž £ “ Č-g»£ o 2 z g g|g§ s 2 3‘2l· ω « 5 m > 2 H W cz H < 2 z z z z z z cd CZ až aí aí cd

222222 co co co co <z> eo Z Z Z Z z Z

222222 Η Η Η Η Η H o o o o o o $$$%%% až eí aí as eí aí ffi oa as α ca m 222222 U1 US US US U3 US 2 2 2 2 2 2 : 2 :> ¹ Z LU :ě ;§ až S CZ! i Z ! a ř~

H 3 •x 2 _s ca sz a H S— zs až a 3 O < 3 a- co ΪΪΟ g £ g o o td fý Gε £; 5 2 z 5 ω S cd Η μ H

Cl a.

í- H a _S < < „ 03 03 Z o o o tZiZH

22g £ 5 co co >5 Z 2 O

22£ H :- ? O O O «! až o a- a. OOíl

83^ ss»· us us O ř- μ fe o o 2 aí cd >CL O- CO □

Z z

2 < < 1- (□ => a _s O O Η H až aí O O a. a. to (Λ Z Z < 3 „ a: a: z f- l·P o o a až až

O o. s_ aí

a. Q! <y □ Z Z Eo a a o O O r Z z d LU US . ř- H a o o aí až a a. a. sd í“ I“ až Z Z S 03 M £ tti us cd N N O < < a. > > 2 a. i > H — c/> < <

□ a a z z z

2 2 < < < Η Η H a a a a a a OOO H (- H až cd až O O O o. o. a.

to CO ζ/i Z Z Z <<< až cd až “ H O O O aí až až a. a. a.

σσσ z z z a a a ooo z z z w Ξ ω Η 1- H O O O až až až a. a. a.

>>> z z Z 03 03 03 LU 1U US

33^ > > > a. 2 2 Η Η H < < <

O) xř CD OO O O) CM co o

CN O 00 OONOQtO^NXtCTiS^ h- xj* CM Xf OCNT-COCDr-CMCOTfOOOO^fCOCOOO niClOTj-^Tfr-lDlO^^mihvN^CNCDlOr' co co m *cn v- cm co O O b- co CO t- OO « oo <o o ·«- co r— co o co

CD fv CO Kf CM co X- T- xf

CM b- Ob-O^cniOT-CMfOxb v-CMCMx— CMlOx-m^-COmcO-r-f-CM xf CO CO CO Xf CO CM in SNOICCT-r-T-fCrCOT-xJ-N.lO/rtlOCOOCOcO^CMOOCOxrcOOOCMCO <OCOO\fX-f<x-CNb'-CO|<x-’xr^,xrx-xrCNT-CNCN

O 03

OÍSZčCMCMCOUDCnCMLnCM oh?i?x-ox-00ooco oSSoooooooo Zgg<<<«C<«

Žu. LL S .£

H o

ť Ό c.	z O S
O	J ω
cx	< co
s	!*3
c3	.£
u	3
	λ
	í Ó
.s	5 z
	g 2 3 σ 3 US Z pc

• σ> co uo b~ cn i <J> O O o o o ) co xr ·χτ M- xr xr

M- CO T- CO o co tt r- m cm CO<DO<OcOt~ CO CM CM LO CM CM

O) o co tn xr bCO CM ’ t-- xf σ> CM -r- b~ cm σ> σ>

• CO X- CM

CO ΙΛ O co <7) O '‘f ”3· b— (\j O <*> b- O

O ζ— O f~í O O o O ° O °

IX > cd > CC Oí o>o>oo

OCM^COCOOCMxrCOCOOCNxtCOCOOCNMrCOCOOCM^OCOO

OOOOOv-^-x-x-^-CMCMCMCMCMCOCOCOCOCOM-^SSStí?

•cOLnh-aí^comb-cnx-comb-cnx-fOuDb-o

T-^-fMCMCMCMCMfOCOCOfOCOxtxbxí^X •^Tj-^^rj-xyxf^xrxrxfxbxfxrxbxbM·*!“^· >

O ’ež ϋ

C . a

CC C O O O O i x z = x x i •U2 -U2 -LL -U2 -UJ *Uj -LU H :- i- Η Η H t—

a, c3 *

H cn co co oj

OJ *4- CO S OJ ^'TroT-r-^or·- oí^-ojococQT-Dh-coTj-cocniD o. co v-coM-v-co-r-ojco^j-cniDiDcoT-cococococnTroT-o-cotDco locosT-fococosQiOr-incDXfpLncncocNncnoccicoMO CONT-r-r-t-rs.fpt-CDT-CDT-M^T-r-r-r-r-T-VlOtOCOr-ir) coosQxrssco

COOiyT-lD-tOO

OOJCOt-v-COCMCO v-s-CMt-O-CO^TCO

2' co

O- v- o

O CD *fO r- v OJ

CM (O

O oj r- d oj <\ s oj —

OJ CO O OJ V“ CO V) (Μ Ο» OJ *** CO CM xf O x- CO O CD O CO CD CO O CM O

COCMCOOv-rOCOOCOCOCOT-^COlDOír-h-CMOCOř-.M-CnOM-CMCMfQO. O V- CM CO sooscnoioin^-ocoo^cocfOJ^OfMtooiOcomooincoooT- xrmo^r γμ - ,n _ no --COCOťOOJCOCOv-v-h-COM-v-eOOJCOr-mrJ·· — v- O- OJ • o- m co co co • CO co Μ V

CO CM V

V <β CO D

V o O CO o o o o O o O O cl > cl cl O > Q O o

(X

O

IX

O co o

g ϋ

co cm xf m co o o· co id o- r-cocococococo^v-iDO- o>coT-cococncncn co ’r-'C0C0C0r-0.0._oir)_Třr--N._u>O04lDtnr--0J0JC0’4‘M-tDrslOCr>Tf-0.0JOC00Jf0M· OOOv-inb.h-.oCO^M-O-^OOv-^tOOOM-COCMCMi-^-M-OOCDxrcorx-ít.O 0000000<-j0ví00o00000000000^-00000000!p-0 ΟΟΟΟΟΟΟοθΟθΟο^θΟΟΟΟΟΟΟΟΟοΟΟΟΟΟΟΟΟοΟ cnxcX£xa:a:a:>cL>cLCL>a:££CLa;a:a:cLCLa:a:cL>a:a:cLa:oLa:cLa:>a:

ϋθ0ϋϋϋο>ϋ>ϋϋ>ϋΰϋθϋϋθϋϋϋϋ>ϋθθθϋθϋο>ΰ

SSgS S§S§ÍÍ o < o < o cč. u_ o. u. o:

tr>

, Γ?

T~OOCO^tCOOwOJOkjXt~»ť OOJM-OIOJCOOTCM'^*'*^^ ocMcococor-o-co OOOOv-OJCMCM oooooooo ; < < «ζ <ς <; < z

.......

co ^T-r-OOCDO-O-v-OJ-r-Oi^IÍt.CnCTiCOCnCnO.COXj OXc^O-fMCOOXOIťOCOCOCOř^OV M-AÍr-COCOh-OCOOJOH ^Sgogv-CDCOO^v-COt-OOVXot^tOOCOCOCOCMS -^^-oot-cmoo*“Cmooo5<5<oocmt-v“Cmo5í οοοοοοοοοοο^5<ο©οοοοο?< ' <·<'< <<<<<<2>$£<<<<<<Zp

. q_ ul cl ll. ll o_ u_ u o >.z oS c

e Ol = ω < <Z>

oj rr co co o oj

UD iD tO U) <o <D v o^- xr v v v

CO COOOJ^COCOOOJM-COCOOCM^COOOOCM^COOOOCMM-COcOOOJTrcOCOOOJ^rCD co coo-o-o-o-o«oocooocococr>cnc7>cncr>ooooOT-^’r-'r-'r-ojojOJOJOJcocococo

Tf ^'^^^'^''^^^''rM^V^M^^^VCOlOCOlOiOtOlOlOOtniOIOiDtOlDCDlOiDU) ^Ίο z

' v- co id r- cn , o ID u-> ID iD <n - v v v v v a

= U2 Z CD

O-CDT-COiDO.CnT-tODh-OJ^fOCDO.Cnv-COlDO.Cn-r-CODr^Ov-CODO-Cn^-COvD coior^o-o-o.o-cococoaooocncnaícncnooooo^-^-T-·»-’— oJCMOJOJOJcococo xj-^r^^r^r^Tj-TTxr^M^M-M-M^M^^TM^tDDlDDiDDDDlDiDlDtDDDíDtDiDD >ί^§ O ' u. >o.

·*. o i °· ^a'-§

> > > g og 5o 56 oo o o o ω ω ω SíS-sá p P P Z Z Z o o o 6á aí ai (x, c~ o*. ?5?ř β- ň_ fip => p z z z < < < <Z1 t/3 <Z> < < < ω ω ω S 2 S ti Cd Dí tam a o. o. a.

< < co co < < ω w S S ai ti . ω ω

CO cu Cl < H u.

s 2 2 aí tJ j W £ «3 fi- co co

I ⁴) λ ;

š

H

h. tO CO tr- cn cn n co τ- co r- o ir> o -v s 10 n r-- n· r- ΙΟ CN CO V- to co (D CN T- 00 „ , .

chonxrcncfiotccn^cír- co o co . ~ >, ~· — «-r-soT-tDnTfiOcnco^rj^N-T-in

CN

CD Nh- cocococooTj-cov-r-cncNCDcococn CO^T-h-.CNt-OCNb-CSJ^-b-COOCOCNCOh-CN ΦΝΟίΝΓ-’-Γ'-οομ-ΝΟ’-Νν-ΝΟ co

O V) S xf o

CO V v- v- CO v- 40 CO h- ''T Ν’ co r- r-. o fT-cncn^th-co co co o co o OCOCNr-CNCDCOCOi-tOtOCDOtOb-O <OT-v<DOooTrcomoT-(0in-r-c\io CNT-^-v-COCOCOb-CO^-tOCOCOCNlOO)’

CO T- CO co s lOh-T-ooocococor^v-oco

Γ- CN COCOCOC-vCOOCOCN^-COth-O COCOxrOCOCOCN^nOT-S

CNOOCNCN*— *-cOCOCOCOCOCON<NO>

cn o r- co

CO V CN l·- CO O i- co co í-- co cn

T- CO b- to CN CN

CD CO CO “*> CO OlO^*COOOCOOv-lOh-OCOCNCDVCOCNh-COrslCDCDlOh«.r«.C02ÍOCOf^<-CNCN r- CO lOSOSb-SSSntnoO r-.CO N-ON-SSCNn^CNr-r-^tn^COCOCNa)^

2 OOv-x-O*-'OO^-O*-T-O*-CNOC0OCNO*r-’«-C0CNCN^-O-r-O’r-x-’“

2 οοοοοοοοοοοοοσοοο o οοοοοοοο2^οοοοθ šš tN CO CO τ* S xt CO CO O CO CO in s s o n (O £:00000 o o o o o o > 02 C£ 02 02 02 >ϋϋϋϋϋ

CN 'r-Of^lOCOh-COCOCDtOOlOCDCnr-^COOCOaOOCDCNCNCOCN^CNCOCDlOrT-tONONCDOCDNCDCOtnOb-COCOCOCOSCOCOaiCONNNricOCDCOCltO ^O^COíhíNr-OfOOr-OT-CnCnOT-r-fOOCnOCD^^ranCON-OCnCO T-OCNCNfNOCOCNOCOCOCNCOCNCNCOCOr-O^-OOCNCNCNObíOOT-t-O OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOSOOOOO , z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z z >J z z z z z gg co

CD CO to co O CN o o < <

¹⁰ ίο ίο ^ro to z] un r- cn «Ο g o O V- VCN 5 S O T- CN §!!<§<

o Q

S.Z o 9

CO O CO Tf CO tO <NNO<00(NN<OCOO<NN<OCOOCNN<DCOO<NN(0©OCNNCO®OCNN v v v Ν·^ΐΖ)ΐΩΐΓ)ΐη{η(Ό(£)(θΐΰ^(^Ν^Να3Κ>©οο®σ)σ)σ)θσ>οοο toiooiotoiotoiouointoiotoiointnioinmiointominiomioioiocococo

ÍC

Z o Q <u —

Ξ O

Ž y>

r-. cd co co ΜΊ tO ^-cOkOb-ojr-cotOř^.cDT-cotor-cnx-cotoh-o^cotos.CT)’»—cotor^-o-r-co N-Tr^N-N-tntotnmcncocDcococDr^r-r^r-r-cooococoaocncncncDcnoo \otniotn\oto*ototn»ntotoiou~>»oiotnmtotniomm»nmm<oOiototot0

	<
8	Λ
	c *35 ΙΛ
<3
CL,	> O ju P4 3 Z

o lO S O ¹ σ

ω co i*Ý<O CO o CN Ν' co mOO*^T“^{T r}' -j4 cO CD <D CD CO CO

ω ω ω 2 Σ 5 S Σ Μ _{ω ω ω} α. ο°Γ “V é 2 Ζ .5 d 9 Ξ ΐ & αί < < οο 5 Ο X X

Ε

UX

ΓΟ

«.

ω ω

U- 2? ίιS ^ω 2 Η ς/5 Η

Τ— Γ— (*>

ιη oj s ο to σ> to τ- ο

I0xtt0v-0(NO<NT-O)r-<D CO CM {θτ-θτ-coOcOrocntocor- *~σ>

N CO CO r- D 'T tcotocotDtorocNxrto.cM m to to τ- co b- to

Ό lh T~ CO CD r— o co co co co to V tototocntoncM*O CD r- IO

O b- CD xf o o cn σ> σ> cm v- io

IO τ- o m bb- co in cm cn ω η v n co r- to cm to ř2 o

to

CM

M

CM CM ID cd o r— o xf· r- co cm b- to o co cm co σ> to s m co co o o τ- v σι co *- o

Tf-r-COT-CMCOtOCOi- CD CM CM ’ σ>

COSlO(£)Tt— cm to CO CM O O v- ΙΓ) M CM to CM 'T- to ω

’ω φ

JZ co co co σ> xf o τ- o uo co ^CO^fO^SSi⁰^⁰⁰^. O>2i9<OCMCMO) CMCMCMtN-COtO^tOtON-r-^-^t^r-^Í^K.h-r^tD v- »— v- bOoOojOOOv-OOOr-OO. V-OOO τ- τ- v- CO

O o Q ° o o o o oooo ce > a: > a. c: cc. > a: ce a. > κ <r > > > > >>>> o>o>eoo>ouo>oo>>>> >>>>

co o

I

O

ΙΛ <-> r~ ⁰⁰ Í2 fX r- £· r~ cm go g(M <O o o o o a- > o: § > o$o>>

CO CM b» CM to CM

SfNj^^tocNg^h-CNSScnrOT-csfto •S^rootO^SScOCOotOCnCDCDO) iQM^H^oSSo^^fMCNbíCNCN :005<00<00000 ;5gš$§£^<zzzz . ď li. li. ď tť Uto co co

CM CD

Τ- V τΓΟ o o o oooo 2 2 2 2 . li. Q. IL L- I gěěč ggg£ g c

§ ho ιο τ τ to -» tM o CM r. CO rf y- o

T- « Μ Π O <Z<Z2 ggggg ;o

I cá

ΙΖΪ

2?

8, .8,

I <

ΓνΟ o

,2 s

ryoo O CM to O O CM *tf to CO O CM <o co O CM ST-CMCMCMCMCNCOCOCOCOcO^rř-cí-^^rfcOUO ^tototototocototototototototototototo

M- tO CO O to 10 to to to to to o ¹ ^SCDr-nhSCDT-ninbCnT-niDSCD’Qi-^-cMCMrMcscsicococococoxrTrxrTr^io ; ScOtOtOCOtOlOtOtOtOtOCOtOlOlOtOtOlOlO ! O co to r- o m to «o to co to to to .3 o

4-*

O u

a

Ό >

£ §

®S

S o &z o 9 i ° w < co

M“ CO CO O CM <OtO<Ob-bto to to to to a

o a

o O £Z o 9 •| ω < co co γιο %

íó

-Λ 2 o Q <u i— θ'

U) Z co ntnbQ’totototobco to to to to

Ό £

CZ!

J?Or •«j 21 o Q’ _z O = ω

* ·· ·· · »· >· • · · · · · · · · » • · · » · · · · • · ·· ··♦···» * » ·· · · · · · ♦ *·· ···· ·· · ·· ···

Λ1036932_________J 3-dehydrochinát-dehydratasa

Λ 11)3850 8 pyc ( pyruvát-karboxylasa ·· 4

4« 44« 4 4 · ♦ • 444« ♦ · ·

44 4444444 ♦ ·

4 4 4 4 4 4

4444 44 4 44 ·4 4 4

• · • · •·· ··*· ·

* · *·

♦ · ♦· • 9 9 ·

Tabulka 2 (pokračování)

··

Μ I « · · • 9 9 9 • · · 9 · • · 9 ·

99999*9 ·· • 9 Μ • «9 · • 9 · • 9 · · • 9 9 9

9» *9*9

• ·« ·· · * · > · 9 · · « · V · 4 · • · ·· · · · »· • · · · % ···«·*· 19 »

99

9 9 9

9 ·

9 9

9 9

9999

♦ « *··· ·· «· • · · · »»» ···» »· ·ι(·

• ·· • φ · · φ φ φ φ • φ ··« φφφφ <· • · # · φ <

• φ ·· φ

• φ φ φφφφ •

φ *· ·

Φ Φ

Φ Φ

Φ «

ΦΦ

ΦΦ

Φ · • •

Φ

ΦΦ·Φ

• · 4 · *

4 · 4 4 · 4 4 · 4

4

• ·

• ·« · · · ·· ·· • · · · · · · ···· • · · · · · ·· ·

Ι· · 9 ······· · · • · · « · · * ······· ·· · ·· ····

H 9 · · · » * · • · · · · ···« • · · · · · · · · 9 » · * ·····«· · · « · ··· ··· ·«· ···· ·· 9 ·· ····

• · · «· ·· « » · · · · · • · · · · · · • * ···«··· · « • · · · · 9 • · · e · · · · ·

• · «* ·

. 99

Tabulka 3: Kmeny Corynebacterium a Brevibacterium, které mohu být použity v provedení předkládaného vynálezu

kmen	| druh	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
Brevibacterium	íammoniagenes	21054
Brevibacterium	íammoniagenes	19350
Brevibacterium	jammoniagenes	19351
Brevibacterium	íammoniagenes	19352
Brevibacterium	íammoniagenes	19353
Brevibacterium	íammoniagenes	19354
Brevibacterium	íammoniagenes	19355
Brevibacterium	jammoniagenes	19356
Brevibacterium	ammoniagenes	21055
Brevibacterium	ammoniagenes	21077
Brevibacterium	-ammoniagenes	21553
Brevibacterium	ammoniagenes	21580
Brevibacterium	ammoniagenes	39101
Brevibacterium	butanicum	21196
Brevibacterium	divaricatum	21792	P928
Brevibacterium	flavum	21474
Brevibacterium	flavum	21129
Brevibacterium	flavum	21518
Brevibacterium	flavum			B11474
Brevibacterium	flavum			B11472
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum	21128
Brevibacterium	flavum	21427
Brevibacterium	flavum	21475
Brevibacterium	flavum	21517
Brevibacterium	flavum	21528
Brevibacterium	flavum	21529
Brevibacterium	flavum			BJ1477
Brevibacterium	flavum			B11478
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum			B11474
Brevibacterium	healii	15527
Brevibacterium	ketoglutamicum	21004
Brevibacterium	ketoglutamicum	21089
Brevibacterium	ketosoreductum	21914
Brevibacterium	lactofermentum				70
Brevibacterium	lactofermentum				74
Brevibacterium	lactofermentum				77
Brevibacterium	lactofermentum	21798
Brevibacterium	lactofermentum	21799
Brevibacterium	lactofermentum	21800
Brevibacterium	lactofermentum	21801
Brevibacterium	lactofermentum			B11470
Brevibacterium	lactofermentum			B11471

• ·

100

kmen Ν'-	: druh	^íATCC /	FERM	NRRL	CECT	NCÍMB	rCBS-.	NCTC	DSMZ
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	llactofermenrum	21420
Brevibacterium	| lactofermentum	21086
Brevibacterium	! lactofermentum	31269
Brevibacterium	i 1 inens	9174
Brevibacterium	linens	19391
Brevibacterium	1 inens	8377
Brevibacterium	iparaffinolyticum					11160
, Brevibacterium	ispec.						717.73
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.	14604
Brevibacterium	spec.	21860
Brevibacterium	spec.	21864
Brevibacterium	spec.	21865
Brevibacterium	spec.	21866
Brevibacterium	spec.	19240
Corynebacterium	acetoacidophilum	21476
Corynebacterium	acetoacidophilum	13870
Corynebacterium	acetoglutamicum			B11473
Corynebacterium	acetoglutamicum			B11475
Corynebacterium	acetoglutamicum	15806
Corynebacterium	acetoglutamicum	21491
Corynebacterium	acetoglutamicum	31270
Corynebacterium	acetophilum			B367I
Corynebacterium	ammoniagenes	6872						2399
Corynebacterium	ammoniagenes	15511
Corynebacterium	fujiokense	21496
Corynebacterium	glutamicum	14067
Corynebacterium	glutamicum	39137
Corynebacterium	glutamicum	21254
Corynebacterium	glutamicum	21255
Corynebacterium	glutamicum	31830
Corynebacterium	glutamicum	13032
Corynebacterium	glutamicum	14305
Corynebacterium	glutamicum	15455
Corynebacterium	glutamicum	13058
Corynebacterium	glutamicum	13059
Corynebacterium	glutamicum	13060
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum	21513
Corynebacterium	glutamicum	21526
Corynebacterium	glutamicum	21543
Corynebacterium	glutamicum	13287
Corynebacterium	glutamicum	21851
Corynebacterium	glutamicum	21253
Corynebacterium	glutamicum	21514
Corynebacterium	glutamicum	21516
Corynebacterium	glutamicum	21299

« * • · « 9 « · · * · · · · · * · · < · · · · · • · · · · ···«··· · · «.

101

kmen druh	y ATCC í	FERM	fNRRL:	CECT	NCIMB	CBSí	NCTC	DSMZ
Corynebacterium	glutamicum	21300
Corynebacterium	íglutamicum	39684
Corynebacterium	Iglutamicum	21488
Corynebacterium	íglutamicum	21649
Corynebacterium	íglutamicum	21650
Corynebacterium	glutamicum	19223
Corynebacterium	glutamicum	13869
Corynebacterium	glutamicum	21157	• t
Corynebacterium	glutamicum	21158
Corynebacterium	glutamicum	21159
Corynebacterium	glutamicum	21355
Corynebacterium	glutamicum	31808
Corynebacterium	glutamicum	21674
Corynebacterium	glutamicum	21562
Corynebacterium	glutamicum	21563
Corynebacterium	glutamicum	21564
Coiynebacterium	glutamicum	21565
Corynebacterium	glutamicum	21566
Corynebacterium	glutamicum	21567
Corynebacterium	glutamicum	21568
Corynebacterium	glutamicum	21569
Corynebacterium	glutamicum	21570
Coiynebacterium	glutamicum	21571
Corynebacterium	glutamicum	21572
Corynebacterium	glutamicum	21573
Corynebacterium	glutamicum	21579
Corynebacterium	glutamicum	19049
Corynebacterium	glutamicum	19050
Corynebacterium	glutamicum	19051
Corynebacterium	glutamicum	19052
Corynebacterium	glutamicum	19053
Corynebacterium	glutamicum	19054
Corynebacterium	glutamicum	19055
Corynebacterium	glutamicum	19056
Corynebacterium	glutamicum	19057
Corynebacterium	glutamicum	19058
Corynebacterium	glutamicum	19059
Corynebacterium	glutamicum	19060
Coiynebacterium	glutamicum	19185
Corynebacterium	glutamicum	13286
Corynebacterium	glutamicum	21515
Corynebacterium	glutamicum	21527
Corynebacterium	glutamicum	21544
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum			B8183
Corynebacterium	glutamicum			B8182
Corynebacterium	glutamicum			B12416
Corynebacterium	glutamicum			B12417

* 4 γθ2

• ·· ·· ♦ · * ♦ · ♦ • · · ♦ * · ····>♦· · · • · « · ♦ », · » · · · ·

kmen •ňAJ-ýbsn';.	:druh	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	.CBS/,	NCTC	DSMZ
Corynebacterium	glutamicum			B12418
Corynebacterium	glutamicum			B11476
Corynebacterium	glutamicum	21608
Corynebacterium	lilium		P973
Corynebacterium	n itriloph i 1 us	21419				11594
Corynebacterium	spec.		P4445
Corynebacterium	spec.		P4446
Corynebacterium	spec.	31088
Corynebacterium	spec.	31089
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	15954							20145
Corynebacterium	spec.	21857
Corynebacterium	spec.	21862
Corynebacterium	spec.	21863

ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA

FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japan

NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA

CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain

NCIMB: National Collection of Industrial and Marině Bacteria Ltd., Aberdeen, UK

CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baam, NL

NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany

Pro přehled viz Sugawara, H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of microorganisms: Bacteria, fungi and yeasts (4^Λ edn), World federation for culture collections world data center on microorganisms, Saimata, Japen.

103A c c

C 4)

C3 ©

Q 3 o

LU

O cn cn 9 2. o q

-85_s £

l·-	H-	σ>	O	O	O	r- cn
O	O	c	LU	UJ	LU	o.
O	O		Q	Q	9	tu
rh	TJ·	r^.	ró	có	có	CO
o		--	O	o	o	co

>

<

fi •03

C >

>>

T3 (U »—< co ·>> >

4r «j áá £

λ

H

3S

m

uo

T-

CO

co

2

0

Q

Q

co

co

T“

CO

o

Ch

UJ

Ch UO

co

CO

co

CO

to o o

to cd o

Uf) Ch o

<O

Ch

m

*r

'«ί-

o r-

CO

O r- CM

O co

$ co

10

ur>

lO

CL H

tt

0. H

M· CO

o

o

o

--

CO

o

ο

>-

>-

<

<£

-5

—>

~)

X

T7

ZD

0

O

O

O

o

if)

O

X

O

O

O

Z>

O

li.

U_

O

<0

CO

CO

CL

CM

CL

0

<

<

<

lf)

O

O

o

<

<

H

xr CM H

t—

<

<

H

X

X

X

O

CO

O

0

co

CO

ř-

Q

CO

LU

co

CO

CO

S

2

CD

2

CM

CM

CM

O

X

O

<

O

O

O

Ť4

4-2

4-'

Ť-

O

O

42

CM*

T-

4-’

42

42

0

O

O

42

CM

ř-

<0

J-

t—

H

<

<

<

<

H

H

<

-J

<

<

<

<

H

h-

H

<

<

<

CL

X

X I

X I

ω I

CD |

CD 1

CD i

X I

X 1

CD i

CL |

CD i

CD

CD

CD

X

X

X

CD

CD 1

CD 1

CL 1

CD

1 ω

CD

to

CD

1 CD

1 CD

CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

t CO

i CD

co'

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

I CD

CD

O

O

O

O

O

O

O

o

o O

o O

O

O

O

o

O

0

O

O

O

O

O

O

r-

uf)

CM

un

CM

to

σ>

cn

Ch

O

ο

LU

Q

Ο

LU

Ο cl <

cl <

v o co O

CL <

H*

O

O

CL < O < 2 to

J— o

O

to o

tO

5ř

CM CM r- ^r CM CM mCO CM to co

T- rO

CM ’Μ· «Ο to to σ>

o o to o o rCM Μ ΓΜ CO CM CO to

to v

M* to

CM CO O v co

N N co o o

CM CO O V co

to ll ’Τ

< o

tT O cn CM CM

CM Tf O to CO

CM T o to co

in w Q

CO O M

co o

o tu CM to

o UJ CM to

Ξ O CL X

c- σ> CD o

m· c- CO CO o

co O to

CM CO co

CM CM

f-

S-

o

co

O <

LU

o

O

o

>-

>·

o

o

o

co

tO

O

CO

ω

<

2

“3

co

>

2>

co

O <

O <

tu

LU

o

O

O

O

UJ

X

O

X

X

o

co

o

ib

ÚĎ

2

o

o

<

<

CO

a

o

<

cm

CM

V-

X

CL

'«J· CO

O

co

co

ř^

ř-'

>

<.

i/)

co

’Μ’

o

o

co

co

CO

co

-r-

H-

H

CM

o

o

O

O

o

o

T—

Ύ—

r-

O

H

H

co

co

(O

IX

CO

<0

CO

CL

l·—

1-

H

_J

H

H

<

<

<

X

X

o

o

o

CL

CO

UJ

tu

tu

CL

X

X

X

X

CL

X

T

OJ

CO

CO

X

CO

CO

co

cc

1 co

1 co

CD

1 co

1 co

1 co

1 CD

co

1 CD

t co

CD

CD

CD

co

CD

CD

co

CD

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

O

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

104 £

>

>§

I a

Tt ctf £

X>

H to >. to .» ³ ro σι ϋ cn CL c

o eo %

<υ c

<υ

Οβ

4* 5 có cn

		•	··	»«		•
		* ·	• ·	•	♦	•
		•	•	•	f	•
		»	•	• ·	•	t ·
		«	•	*	•
		·* ·	* · · ·	·*
XT			n-	cn		cn
CD			cr>	CD		cn
Cn			cn	cn		cn
	co	to
1—	cn	cn	>-	á		Η·
o	CZ	a.	<	<		O
o	—J	<	:>	5		O

Cl <

□

73) ob <

Z

O υ

a

i •s &	§ -O £ u.	o Ό O co CM H	5 D a □	>> >» ! i CL CL h s
o	O	co	X
U	U	IX	&,	Z z

CM <

e co co cm o xr n m f\ (N r- <o

CL H O LU

CL h~ O UJ

o o xr fO CM <£

o LU fM

5 cn

xr CM o r» Ώ

cn tO to <o o

P X o o

to cn cn CM to

CD X. CM O

xT CM O σ

co o IO o o o

o o o _J CL

cn to r~~

O

O

O

O

O

LU

UJ

Q

CL

<

<

H

(O

O

O

XT CM

ω

to

LU

<

<

xj-

CO

ČM

<

T?

•ř-

H

^_'

X

CM

Ύ—'

l·-

to

o

ř-

ČM

<

<

ω

<

<

<

<

<

co

<

CO

H

<

<

CD

CD

LU

c

CD

CD

CD

CD 1

UJ |

CD

O t

X

CD

CD

1 CD

1 CD

1 CD

r'1

1 CD

CD

i CD

ta

CD

1 CD

1 CD

i CD

CD

CD

O

O

O

δ

O

O

O

O

O

o

O

O

O

O

CL σ

O

O

O

CL

H <

ω i

ω o

	iO	to
xT	Xf	to	IO
xT	CM	o		IO
co	co	o	o	<
to				to
M-	JO	o	CD	co
O	<(	o	D	O
co		<	CO	<
2	čo CM	xr	ω	O
ČM	l·“	O	λ-	Ť-
<	CO	H	<	_]
CD	UJ	X >	CD |	CL 1
1 CD	1 CD	1 ω	OD	ca
O	O	o	O	O

to to

CM ω

ui

•.O>

i..

105 £ 5 ό, 7 ? <

— uQ ? γμ cm d

O

LJ

Q <

CM d xr τ vω π ro co r— to to xr

co o o

co o o

Cl y z

o d o o

to to co r-

to CM to o

— O to

ΤΪ- Ο d d

to r- d to

Γ- ΟΟ O O

Γ- ΟΟ O o

Γ- ΟΟ o

to Γιο —)

to Γ- ιο

o to cn

cn Γ- ΟΟ CM

to CM d

o o o

»o co CM CM

to CM

«_> o Γ—

CM tO σ>

d to O) o

O < ·

O <

<

cc li.

O <

< xf

X CO

<

υ <

o <

o <

CO X

co X

o o O <

iO O

00 O LL

X CO

Ώ co

O IL

Γ— O σ>

O <

v d X

o UJ

Či

či

t—

to

X

d

d

d

d

T—

CO

<

m

m

n

< >

<

O

O

co

co

co

h-

v-

l·—

o

o

o

o

o

ČÍ

H

či

H

H-

ό

co

co

co

CO

Cč.

co

H

H

l·—

H

ó

<

<

<

<

<

<

<

CO

<

X 1

X 1

cc

o I

o

O

LU

0.

UJ

X

X

X

X

X

X

co

CO

co

m

CO

CD

ω

UJ

co

CO

co

CD

co

co

co

CO

CD1

m1

CD

CD

m1

CD

1 co

1 CD

CD

i co

1 co

co

1 co

1 CO

i co

1 co

J CO

O

o

o

o

o

o

o

o

o

o

O

o

o

o

o

o

Ό

o

o

o

o

o

o

o

‘~ V· · řifť>J*r~

106 <r <

a:

<

s (O *í

CM CT) co co σ» σ» σ> σ>

>- >

< <

► ·· ···<

<o , cn o cn LU < 9

Τ' rvi to cm'

Xf co co

Xf

CO CO f— CO CO CO

CM CM r- cn CM O cn xf co to' n n v co co co co

CM

CL

O ε

o

G

0ΰ ju

Qε

J2 řž r2 £

*-»

E

Έ

S í

s xf σ

<

co co o

I

CQ

O

CM l·—

CO

UJ m

O l·— co

LU

I

CQ

O >

O

H š

CO¹

O ď

xf co <2 ^q£ cď °xf XJ co ·= <n ε •o eS

Ž35 &ϊζ c

> O- &

'13 > O jo 15 32 .§ S | xj .c J2 Có 2 o.

co £ o £ CM θ 00 θ S tu N <

u. G £ £

M· r- N CM Xf CM CM ID CO tO xf O

CM cd co £2

J° « h- to m m o o o o O O <

o O _ _ <

< < cb <o co O cc o: hQ_ Q_ X t i i m ca cq O O O

CO rCM co o

CM

O

O <

co

O

CQ

O o co xf cn in o o to S O CD co co xr co o co o _ CM UJ CO cn cn £

LU O

CO

CO

LL <

<

CQ a

CL

I I CQ CQ CQ O O O

U.

<

xf x

CL i

CQ o

in in s o o> σ> xf o CM CM O xf x~ x~ CM CO

O Οχ- in O o Xf o CO rto to to • σ> cn «> m co co Xf xf o o o o O O < < co <o x x cl o. f i

CQ CD O O x < cl co i i

CQ CD o o <

CQ

I

CQ o

>

o

H <

CQ

I

CQ

O x o «5 ? o (O LU x <

CM < < CD CQ

I I CQ CD O O

O <

in

O

H

X

CQ*

O

O

O <

χίϋ

CQ

O

107

ΙΟ ο

><

ÍO <

«ο cn η co cn ιο un co *οο (Μ σ> ττ co οο <ο ο χΤ ο* •σ

Ε

ΣΖ <Ζ) </) (Ζ) ΙΟ) ·,“Χ >!>.·“ £ W υ υ ο

S 2 ο ο σ>

3 -5 -5 S ϊ ® “ υ >£ « 5 3 ít> w 5 ω υ '28 « ο. CJ ο (Λ υ Ο Π3 η ο.

<D Ε α>

€ ΰ ω υ ο) ο >. χ

Ο. · č' Η ε

&

CX ε

ο >

Ctí rCO

I

	od	O >		δ
		O		o
	3	< >
	£	Z <		c
ó	S	Q ε-		υ
o	§	o CZ3
c 1) >	£ 2	» & SÍ2		o co
<Λ	o			£
C	N	« Oí		O c
I	ε	§ ° 6 H	8	δ 00

*c o

B <0

X >>

rN co o

CO

CO

to O C\J o o co co (Ν

Ο

o o

o o

o o

o o

xř rtO

co CO

co CO o

co co o

00 co co

to

co Γ- ιο

cn N CO

<

1 cn

1 cn

K> CM

cn

r-

^j·

ΤΓ

O>

CM

CD

co

CD

00

co

co

cn

cn

un

to

o

-

Γ-

CO

CM

CM

O

CM

co

o

co

CO

co

cn

CD

CD

cn

co

o

o

o

to

V

<o

r-.

^·

CM

CM

to

to

o

o

o

CM

CM

xf

to-·

o

ZD

X

>-

^0

co

O

o

<f

O

CM

O

o

o

o

o

CO

CO

o

co

O

rf

O

CD o

o> θ

<

o

5

>

O

>

<

LJ

co

O

O

Q

co

CO

o

o

<

Ί.

'-k

H

cn

cn

O

Ε-

O

f-

X

ω

<

<

<

X

X

o

§

O co

O co

5

Q

Ω

2

<

<

Ξ

O <<

Ν'

CJ

co

cd

cd

cd

,L

<

cd

O

H

H—

co

4t*

H

*-<

ýL

co

L-’

co

O

O

O

δ

o

<d

H

H

CO

to

<

<

<

to

CL

to

<

Ó

<

co

<

co

H

H

H

H

H

CL

CO

X 1

UJ I

UJ 1

CD I

CD I

CD 1

O «

CL I

UJ I

CD i

a: I

CD 1

o

CD

O

X t

X

X 1

X

X |

CL I

UJ |

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

( CD

< CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CO

1 CO

1 CD

1 CD

i CD

1 CD

t CD

CD

1 CD

CQ

CD

o

O

O

o

O

o

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

x- O

- O

O

O

O

O

o o

<

<£

CL

I

CD

O

CO co cn

Hnťfafc

108

CO

CT>

CD

CD

σ) o

UJ

Q σ» cn μ· co v .% CM CO CO V V

CO CN -r- o Τ', cd Τ'* cd cd r·' co <o co co r~.

co co

CO cn co (/) t/l

v) ω-jý - z c c — c <u tu T3 ω t ~ ~ X) ro —

Ω. O. ·£ - C.

c o oce 03 0)

iáB o

O <

Es tú

Z I E£

S *S 3 «O s ~ O 3 a! sž tti §ι<9 '5 ® '5 ΰ o 10 o z <a & z 2· ctí rz ^α ctí <3 . g* KO íaí O

Ž2Ě £v (Z) m to σ cn o y cm co m cm cn m

CO CO CO O 'T v T- CM co

T- 1— CO x- CN ^r

CO

CN

O co co cn ’ co cn O cn j_

LU ά Q O O. <

* <f « ’ I <1 »“ < CM CN 00 ,

O co tN T- o (M cn o o t- co co cm <n m cn -r- «- <d ω co co v v m o υ o co ro co

Eg ‘<ú <3

B Í5 u 8 ^c c

-C -C —

-C -c .c ω <£>

cd

LU LU UJ Q

O

CO CO CD t- vT- T~ y M in s s o T- tn ro

CM

Ό

o

o

.'«t '

'cř

co

o

o

CO

CN

CN

co

Ν’ O

CD r- co CM θ

CD Τ' CO CN o

co D CN

co co ω Q

CM σι Τ' o o

CN σι τ- ο o

CO o Χί- ο o

CO o •n- o o

LL •v CN co

CN O O

CN O δ

cn co co o o

< Q ω 5

co ««t

un

m Τ' cn'

CN Τ'- co O o

m Τ' co • co CN

T' ’φ T- o o

Τ' r- o o

cn Τ' to o o

5

O

O

o

Ctí

Q

O

O

O

“1

O

O

O

2

o

T>

o

X

o

O

O

*<

O

O <

U.

_J

<

<

<

<

00

<

<

<

F-

CN

CO

U-

LU

o

<

<

<

co

<

UJ O

UJ

v

Ťf

(N

CN

X

cd

cd

CN

W

σ

T-

<

<

LU

CN

ÍN

CN

H

CN

CM

X

o

O

O

O

cd

O

o

O

H

H

(N

CN

O

O

O

CO

Ctí

Ctí

>

l·-

H

H

H

Ctí

F—

f—

F—

<

<

<

<

<

<

F—

l·-

F—

LU

Ο-

Ο-

z

O

X

X

X

X

Ο-

X I

X

X

CQ

Ο- ι

a. |

CQ

CO

CQ I

X

X t

X I

í CD

Ι CD

Ι CQ

1 CQ

l CD

t a

I CD

1 CO

1 CQ

Ι CQ

1 CQ

CQ*

1 CQ

1 CQ

1 co

1 CQ

CO

CQ

1 co

CO

CQ

CO

O

O

o

o

O

O

O

o

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

o

O

O

O

řgtf^jWbrrirrť

109 »9τ9· ořcr <

-O c o O X LLl LU < O Q 2 O O cn (J

LU

Q o

E o

X ω O O s

? 5 r ^a ω - Ό

O z = θ ω r E £ ω .· οί o d E IP

X 2 X X o

E o

X >>

Ó to m co cm to r- cn m co co to m to n~ r·-' t-‘ co n co co t <Λ </> *2 ω tu > η n y ~ °™ ώ Ό ra ^ω 3 3 ω iO cm

E o

v. ϋ <υ ý o c jq o n

CT 3 iL	co 3 Ll_	E o X	o	oj o <υ c JO >> -Ω ; a s a :
				03
		'/) C		C
υ	V	V		<2
υ c	Q C	i	CM	CM 3
£	O >	o	O	\O CA
	Lťí	£		5
υ	u	0	</0	c/n 2
co	CA	X	00	00 £

ll &

O

CM TCM CM co cn co cn co co <1) o <u ω ni LU O co co O O) co tn co cn cn TUO CD

Q QJ JO = E ro o

O X

Z> co

O

CM

Ο-

CM CM CO •t- uo cn tO CM tf)

CO Ί3· 2t o TJ- *£ CM CO £2 «Ο r- co

CO 03 CM

tT a

co CM o

00 m

X o

H Z

to o

to

ο £

CM CM 0-0 O O

v σ

>

>

3 o

V— O

co <

<_* o

2 L_

Γ- co co

δ

to

cr o

tn o cn o

CM

<

O

_j

G.

o

<

σ

00

cr

cr

<

o

o

O

O

O

F

b»

<

o

o

X

OJ

O

Q

<

00

lL

LL

H

H

co

<

O

<

o

T—

o

o

>

cn

xj-

<.

2

čl

Q_

σΐ

CL

T-

v—

s

:>

to

X

to

LU

u_ <<

X

to

O

H

00

T—

T-

to

co

v-

co

00

co

T-

O

oo

O

y. CM

to

CO

00

cr

<

<

<

to

00

_J

to

co

oo

<

<

<

H

to

H

<

to

<r

<r

<r

UJ

o

ti.

CO

c

ω

o

Ο

CL

ϋι

O

o

co

co

CD

X

o

X

CO

2

co

CO

co

CO

co

co

co

c

I co

co

co

1 CO

m

co1

co

] co

( co

CO

co1

to

í co

CO

1 £0

CO

CD

CD

co1

o

o

o

o

o

o

o

ο

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

Ι i rfaťMafljflfttfnřli Tl iííí

cn

110

444 44··

444·

O

LU

O

CD o o o m CM o cn‘ cn

Tf ΓΌ tO co x

< J.

5<

CO T(Z cn < ri Ξ> <υ

Φ < CO co cn cn cn cn cn cn cn cn cn cn cn cn cn cn

>-	>-	>	>-
<	<	<	<
:>			:>

CG CD γό cn o cn o r~ co ro un lo co co cm’ r-co co r- fO Tt r- c- m cn cm co cm* uo cn co co co co oo co cn cm

QfOlhCMV V CO_ li) M to

O- Tj- C\í o* 00* to V v g- o

V o £ z5 (Λ CD £ # <2 o

Ηϊ ω (/) (Z, >, u o CX CL F ^ro O o o o

-9 υ p p ~ n

O o c w £

S ° >

ES g 'c £3 03 <* >

O O •X J2

U3 t£j e c _ o ω <D <L X T3 χ ° ε <D O X X

CO a

oo co

Γ

C

O ’5b £

,<υ £

o c

<u

OJ) cá co >-o E 2 b n b b 22<<w<wccg c

CM

CO

O

CO

CO CO CM CO O- CM XT CO CO co cn t~ co cn xj· co r- Tř u> hcn cn cm cm cm m o o o cn o co co co co —» co co co

X < < < <

’ίΤ to CM l·- CO o co co cn cn cm cn cn cm co co v ^co co cn oo rco co o

CO r<o xr v <o *v- «- CM io io uo •ms co r*.

co ro

CO

CM (O o

cn co $ $

<	to	T~	v	<o CM
<1—	T-	F—	h~	h—
<	<	to	to	to
ω I	co I	LU 1	LU	LU I
1 ω	1 co	1 CO	co1	1 CO
o	o	o	o	O

’Φ ιθ O CO o	m o co o	σ> co	ΙΩ fO <o o un	x ί- ο: X H·	CM CO cn	CM 03 σ>	co r- CO >
o	o	LU	X	O	▼—	v—	a
o	O	O	to	<	to	co	H
<	<	to	5	CO	X	X
xr		ýu	^-1	ý—‘	CM	ΓΜ
X	ct	<	<	<	X	co	<
CL	CL	co 1	CQ 1	CD	Q_	a.	co
ω1	co	1 co	1 CD	i CD	1 CO	1 co	1 co
o	o	o	O	o < o	o	o

C0

X >- O

	co U-	Q	O	X	o oo	O co	o co
	L	O	_j	o	co	co	co
<	<	CO	co	to	<	<	<
	CM	CM				ť	H
Σ5	_J	<	<	<	<	<	<
Q.	X	CO	CO	ω 1	Ο- ι	Q_ I	CL I
i co	co1	CO	1 CO	1 CO	1 CO	1 CO	co
o	o	o	o	O	O	o	o

111 • 0¼ ·· t · • * • · • >

·»· ···« ·* · • · » « · » • · ···· » · t ·· * • · · • · » » · · ·· *<fc· <O <7>

_ Ch co cn σι to σι cn j °I> O> > ÓL £

Q. £) O OJ J ω O 2 00 σι ώ m CM T- CM 1σ> cn cn jó

-y+Sz h~

O p

ώ

CZ <

CZ <

co co CM CM CM CD σ> o σ- r-- r-r- o v <σ σι o f^· σ> o’ o’ μ· co co v 'j-

co co

CO Tf O

M CM o co xr v

T-CMv-Ttrř r- μ· o o o co m· co co co o co o co co

CD V- CM CM co co

CM

TZ σ> v

CD <v) m

CM CM *O

Ό S § £ 2 š ο -’τco f- ία: co co

CL LU LU t I I co co ω o o o

CO rf CO CM CO CO CD o r- cm < X xf LU X — %>. CO CD

O o r- <n cO (M Q (Ω o ®O o <o iq O ° X lU CL CD < < CO CM H CM < < < CO CL CO

I I I CD CO CD o o o lO

M

O

σ> m·	Q CL	co co o	co uo o	Q CL	o o	O o	UJ m CM	co CM o	Tf O
M-	_J	>	o	_J	O	O	o	δ
Σ3	O	ř-	o	O	<	<	LL	m	cn
CO ω	o	2	<	O	řr	rf	<	<	<
Ť-'		co	Ť~'	O	O	CM		T-
	<	<	CL	<	H	l·—	<	<	<
Z	co	co i	CL	co	X 1	X I	CD I	CD I	CD I
l CD	1 CD	1 co	1 co	1 co	1 CD	i CD	1 CD	f CO	CD
O	O	o	O	o	O	o	O	O	O

□ <

<0

H (O

I

CO o

o

CM co

Γ—

CM

O

X <

CD

O a·.

.áý^ÉartaaasKBtííWBSíítósi η:

ΗΟ

Ο

ΙΟ ο

ο.

<υ ω

ιΛ ο

UJ Ο. Ο <

^{υ υ} to ο <υ -S ο. Q Q 2 <

co xf CM 04 χτ- ιη xt

Xf

Ο	Ο χ-	Τ-	ο	ο	Ο	X—		ο	ο
ο	ω ο	Ο	ο	ο	(D	ο	ο	ο	ο
ο	χ ο	Ο	σ	σ	Ο	Ο	ο	ο	Ο
<	C0 <	<	<	<	Ο	<	<	<	<
d	ω <η	d	00	00		d	d	χτ	ΧΤ
Ο	χ- ο	Ο	W	ω	ν-	Ο	Ο	Ο	Ο
Η	< Η	Η	(0	(/>	—J	Η	Η	Η	Η
X I	ω χ 1 1	X I	Ο I	ο	X	X	X	X	X
ω	CO CÚ	C0	1 ω	£Ώ	ω	ω	1 ω	1 ω	1 ω
Ο	Ο Ο	ο	Ο	Ο	Ο	Ο	Ο	Ο	Ο

xj <Ω cm σ> ο ο σ> d ία: ω χ UJ I 1 ω ω ο ο <

ΙΟ)

UJ ο ο ο >

ο _ } I ω ω ο ο co

Ο τ- τ- τ- m X- X- χ- 04

I I 1 d d ΓΟΟ Ο 04 οι d iP Ο Ο χ- £ > > >- Ο ω uj ω ο Ο Ο Ο LL· <

Ο Ο Ο όί Η Η Η <1 X X X CQ

1111 ω <ε ω ω ο ο ο ο <

<

C0

I ω

ο ΐΙίιίΊΪΠιΊιιί rírfjrttriťí

113 o

UJ

Q ><

O

UJ o

o

UJ

Q

CL <

cn σ>

σ>

HO

O <£ o> cn <j> σ» c

CL <

o o UJ UJ Q O ro <D (Λ σ>

to to □

o

CL «3 o

v>

c tu 'cl ro (Λ o

E o

to cn o

c

TO <υ

E

TO

Z

CL

O </)

O

Q s

U

ŠP

	σ\			z	z
	2	c	c	>	< >
υ	ZZ	c	O	o	o
C3	I	e*	2	X	z
y	u	_		ω	ω
>	2?	Cu	CL	>	>
U	cd	υη	ι/Ί
CZ3	c	o	Q	ω	ω
<	o	^ř	”3*	<λ	00
z	2		2
ε	T	2	rt u	o	O
	c	TJ- »+>	2	E	E

y ^ε 3 .3 1 -5 « S §~ š£ 3 3£ i 8 íř& i⁹

E iť V> j- tZi &q o S o o

o

O <

tO o

o o

<

CM

H to

UJ

I

CD

O

O to

CM

CM

CM

to

to

2 UJ

2 UJ

o / \

to co

«Φ co

T

tO

to

O

M

m

O

O

U/

r-

to

O

M-

to

to

CD

o

<o

CO

V

O)

00

fx.

Q_

o_

o

co

co

co

CM

CM

CM

to to

•^r

Tf M

Τ-

2

V CM

O

co tO

O

o

o

to

TT CM

to CM

to co

σ> o

CD O

CM O

CM O

X

σ <

tO

to

č>

Ο

o

CM

Í5

θ

CL

X

7~

CD

CD

O

M-

o

O

O

O

to

o

o

O

O

O

<

S

o

CL

CL

y*

O

o

>

X

O

O

CL

CL

CM

o

o

<

<

<

O

O <

O

o

u.

CO

_l

H

o

<

<

LI.

U_

UJ

X

O -<

O

Γ0

co

tb

o

ČL

o

o

<

2

Σ

Σ

O

Ťr

v

T~

t—

q

co

*< CM

CM

O

O

o

^E

ř

Ťř

^E

Ťr

EE

EE

EJ

EE

O

o

CO

CO

co

H

H

H

<

co

£L

<

<

CL

<

<

<

<

H

f-

co

co

O |

2 I

2 I

η

X

X,

CD

UJ i

0.

CD

CD

CL

CD

CD 1

CD I

CD 1

X I

X I

o I

°l

”~l

1 CD

I CD

1 CD

CD

CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

f CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

CD

CD

ω

CD

O

O

o

O

O

o

O

O

O

O

O

O

O

(0 O

O

O

o

O

O

O

O

ř' 2

O 3 O cn

O ó

cn

cn

cn

cn

cn

114

cn

cn cn H

cn cn H

CO cn

cn cn CL

cn cn ώ

cn cn

cn cn

cn cn H

cn” cn

cn cn

cn cn

r- cn

r- cn

CO cn

cn

O

O

c Z3

<

<

Cl

cl

O

o.

CL

cn ZJ

c

> o

c

3

O to

O un

~~i

2

<d

QJ

O

< xr

< xr

< ló

—j

2 CD

~>

—>

co

xr

CM

CO

to

CM

uS

r-

co

o

o

CM

CM

cd

CD

CM

CM

CM

xr

n-

r-

xr

cn

CO

xr

o

co

O

σ>

cn

CM

m o

xr

xr

to

xr o

xr CM

co o

cn co

o

O O

N- r-

CM

cn cn

CD

to cd

Kg

Z (D &

o h o

JE ω >. >> o O O £ £ TO

Η H o o o <u

Q. Q_ N JD M JO

ΗO o

(Λ <Λ 88x

1H sřs.

ζΛ <Z> CZ)

< < <

σ>

co nχ± co

Xí >—f

I

I

to >to o

CL

O

O

CM <

CQ

I

CQ

O r- cm CO CM CO CM

CQ

CO

Q

CM

CM

CM

CQ

CO

Q o

to rcd cn σ> <o o to i- cm co

X—

5—

r-

o

n

to

co

co

m

o

CM

o

o

1“

V-

co

O

O

UJ

o

xr

xr

o

CM

V—

O

o

O

U)

<O

£—

O

CM

o

5

σ

σ

T“

co

CQ

>-

o

o

o

O

t)

O

o

z

2

O

to

lit

<£

<

<

IO

)

Z>

O

O

o

o

O

<.

<

o

(J

o

J-

O

O

Q_

CL

O

o

(O

H

<

<

<

<

cn

CD

co

v-

V)

V)

CO

CO

co

to

UJ

CQ

2

ťO

co

xr

xr

o

□

v·

o

o

T-

v*

(M

CM

J—

to

to

T-

v-

v-

CJ

o

o

O

1-

H

H

H

<

<

<r

_J

_J

to

co

co

<

<

<·

<r

H

J-

H

t—

X

X

CQ

I,

X

CQ

CQ

OJ

CL

CL

UJ

o

o

CQ

OJ

CQ

CL)

X

X,

x,

X

cn

ω

CO

CQ

m

to1

CQ

CQ

CD

CQ*

1 CD

CQ

CQ

CQ

CQ

CD

CQ

CQ

CQ

CQ

CD

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

O

O

O

O

o

o

o

o

O

>

O

H <

co

CQ

O iΐίι'ΠιίτιιΐιΒιιΐίΒ.ίΜΙίίίΜΜίϊιίΛΙτίΓΓϊ·¹ - - i^'Maa^c, ··

115 co to cn cn cn cn

>	Ó)				H	H	H	>	CL	CL	h-
<	□	cn O	o	o	O	O	O	o	<	<	O
	<	<	2	2	O	O	O	2			O
XT	ró	Λ	ó	ó	r-	r-	rZ	ó	tó	ró	Λ

O

O o

LU

Q co n o χτ rto cn co

Xf	m	xf O	(O CD	to CD	1 xf ll			2 O
r-	T	σι	CO	CO	co	h-	<
CM	to	o	XT	XT	m	O		O
>	XT	o	>-	5-	>·	O	u_	CL
O	U.	O	UJ	UJ	UJ	f·	m	<
	_j	<	O	O	o	P	<)	< >
2	UJ O	co		4-'	4-'	2	ω	W
4-’	o	O	o	O	T-	T-	T—
<	T—	H	H	H	h-	<	<	<
CD	2	X	X	X	X	CD	CD	CD
1 CD	CD	CD	CD	CD	CD	CD1	ffl	CD
o	o	o	o	o	o	o	u	o

o o O < CM _J CL	o CD < Zj CL	δ CD < U CL	o < XT O H X	o < xf O H X	o < Xf O H X
m1	CD1	CD	CD	CD	CD
o	o	o	o	o	o

116 cn cn rD cn on cn ο cn o

Η I— >* O O < 0 0 2

O

UJ o

o

UJ

Q ><

ř— o

o m co m v co m xr cn to

CL Cu	.z	a	>»
Λ C3 (Λ «Λ		8	ε o
o o %%	3 OJ)	& s	+-» CL žs
X X	d	u	00
Xf Xf			Xf

CD CD xf xf ir> <D CD in O O co O O CM O O r< < X lO

X o

_l <

cn cn rD cn cn o <n o> cm to Tcn

CD cn cn cd

O O CM to to xx- x~ O

h-

CD

CD

O

O

Xf x—

r-

O o

o

o

δ

O

δ

o

X

>

>

O

UJ

o

o o

O o

O o

O

O

J_ CM

5

O

“i

O

O

O

O

2

o

O

<

<

o

o

O

O

O

o

O

Ά.

<

<

<

<

<

<

o

l·—

l·—

o

Q_

<

<

<

<

o

o

to

CO

(b

fsj

O

CD

CD

to

tb

X

2

2

2

xf

xf

xf

xf

CM

H

o

F-

O

o

O

O

x—

4-

co

CM

O

CL

CL

CL

<

<

<

(/)

H

(Z)

<

H

H

l·—

f—

CQ

<

<

co

<

H

CL

CL

0.

CQ

CQ

CQ

UJ

X

UJ

CQ 1

X,

X

X

X,

Cl I

CD |

CQ 1

O i

CQ I

X 1

CQ1

1 CD

1 CD

t cn

CQ1

t cn

1 CQ

1 cn

CO

1 CQ

1 CQ

CQ

CQ1

cn

co

CD

CD

CQ

CQ

CQ

O

O

O

o

O

o

O

O

o

O

O

O

O

o

o

O

O

O

O

O

cn

n

r-

r-

co

o

to

CM

cd

cn

on

to

CD

iO

r- CO

co

CM CD

TÍ'liímiŽiiWrt6TttttMřžr r ·

L17

Η

Ο

Ο >

<

Ο

LLI

Ο ο

ο

ΙΟ ο

CL <

CL <

σ>

J- cn (X <

CL <

CO Ο τ- rcm co cm σ> rσ> co to τ- τ- co

CO co

co

CO

CM

to

to

to

to

to

CD

r— N

r—

UJ

UJ

ο

CM

CM

co cn g

CM

O

co

co

o

r—

r-

O>

CM

CM

co co o

CM O

N CO Γ—

N O un

to O Γ—

O UJ

O H

O F-

o

o co

cn o

cn o

o o o

<M Γ- ΓΟ

CM r— co

2

CM o

ř- co o

O to CM 3

O to CM

o o

1

Γ- 00

o o

o

*í

Q >

_J O

__j O

o o

CM =>

o O

o O

UJ <

CO <ζ

CO <

§

š

> <

3

< Ň

g*. r— fO

CQ cd

o <

U_ <

Ň CM

X CL

O o

O o

UJ <

X o

< cd

< cd

CL 2

cd CM

cd CM

CL UJ

o CO

cd co

O

H

ω

N

CM

1—

4-3

4-2

CM

CM

O

O

CM

F·

F·

4-2

F

H

F-

F·

H

<0

CO

CL

<

co

_J

<

<

<

<

F-

F-

<

co

CO

<

<0

CO

co

CO

X

UJ

°i

Ο-

CQ 1

UJ 1

CL

cd

CD

CQ

CQ

X

X

CD

UJ

UJ

CD

UJ

UJ i

UJ t

UJ 1

CQ*

CQ*

CQ

Ι ω

1 CD

1 CD

1 CQ

I CQ

J CQ

1 CD

t CQ

1 CD

1 CD

1 CD

CD*

CD

CO

CD

CQ

CD

CQ

O

O

O

O

Q

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

·^ία&· « · ><

co σι cn cn cn cn co co CO CM cm tn to o

o

03	cn		-	cn	cn	cn
cn	Ύ			V	cn	Ύ	cn
C	O UJ	o_	c:	O UJ	> o	H O	cn
~)	Q	<		Q	2	O	n
fi	có	có	cí-	có	có	O)	co
	O	CM		O	CM		CN
xr	xr	CO			to	o	co
xr	χτ	to	tD	5		co	Γ--
co	co	CM	CO	co	m	o	cn
cm	CM*	r-'	to*	to	XT	cn	co
m	uo	co	co	co	co	σ>	cn

o

O

LU U. CO CO

CM

LU 2

cn

«Λ

to

to

co

co r- r- o o —1

LU O H 2 <

o CL UJ CL CL

o to r- CO

o r- to to to

*T ř3 xT r-

CM CO CM XT r- σ

cn CM cn o o O

cn CM cn o o o

O 5 iO CM

xf CM CM > O

to P o o O

O 5 m CM >

XT CM CM > O

2 cn r* CM

CO to 03 o

cn δ f^-

O co m co o

CO CM O tr> co X»

CM δ o

>- o

CO o o o o o

CO o O o o o

O

O

O

LL

o

<

<

<

H

co

<

P

w

to

CD

CD

O

o

H

CL

CL

O

O

O

<

o co

LL

xf

có

có

2

2

CM

2

2

X

<

LU

<

o

ZD

2

<

<

4—’

4-2

4-'

CM

H

to

O

o

p

4-2

O

P

4L

có

4_'

P

4L

p

P

V

V

V-

<

<

<

to

ó

to

f—

H

<

<

l·-

<

<

CL

<

<

<

<

<

<

<

<

CD

CD

c·

CL

ω

CL I

O |

X I

X

CD 1

CQ

X

CD

CD

CL

CD

CL

CQ a

CD

CD

“l

CD I

CO I

CD

CD

c

CO

CQ

f CQ

1 co

CD

i CD

1 CO

I CD

1 CD

1 CD

1 CO

1 CD

1 CQ

i CQ

1 CD

CQ

1 CD

co

CD

CQ

O

O

ϋ

O

O

O

o

O

O

O

O

O

O

o

O

O

O

O

O

O

o

O

O

CD

CO

m

CO

to

CM

to

o

Γ-.

CM

cn

r-

CO

«0

cn

XT

O

o

P

to

co

LO r-

119

ΗΟ

Ο

FΟ ο

X , · ¹ cn

Δ CT σι j.

< Ο. 3 3 □ < < < -?

τ- -τ- xj- -4 σ>

Ο d τ- Γ— (£>

ο ο τ- cm cn to to χ- χτ σ>

ο ο ο ο’

'ίη a = § υ ο υ ^{rc w} <0 Q Οϊ (/) jQ Ο -Ο (/) 3

Ο — Ο □ =

ΙΟΙ cn ο

Γ— Γd co co cn to to ο xr m to to un cn r— to to d

X- οι χ- χ- Xco o

x- XT xf Xf Ol Ol to d οι oi xjto d

Ol o

cn m to xr oi co o cn oi d o tn to o- oi oi d οι oi

X

O

o O

o O

s

o O

o o

co o

3

O o

o o

to to

Χί-

O

r- O O

O

u>

o o

o o

co

>· o

O

<

<

<

<

o

d

O

O

o

ο

<

X

H

tZ

O

o

x*-

H

_J

d

d

Ol

χί-

χί-

p

<

<

<

<

CD

<

2

<

<

<

xr d l·-

2

2

O

O

H

Ο

Ο

4-2

ř

d

d

H

4-2

ói

4-2

Óí

xf

xf

4_'

H

l·*

</)

H

1-

<

(0

x

X

<

<

<

<

<

<

X

X

CO

<

<

X |

X 1

UJ I

X i

X

ω I

UJ

X 1

X

X

X

CD I

CD

CD

CD

X

X

UJ

CD

CD

CO

CQ

CD

CD

1 CD

CD

1 CD

ω

CQ

CD

CD

1 CD

1 CD

t CD

1 CQ

CQ*

ID1

cn1

1 CD

CD*

O

O

O

O

O

O

O

o

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

to o cn oj d oi d co xr o D p O u_ <

120 . °° cn σ> ο

CM ?2 00 -Το

LU

Ο

CT) σ> τé ” 9 ιο σ>

tO θ') X- Ο σ> co

Π3 — — ο _ω α> to CL ο ο ο ο ο re

2 re ^Λ' •g ο ·£ υ ι= ~ ε re ο >, Ο ε <υ Ε S 8 5 ° <υ f 5

s. c ε s

Φ Č? .2 £!

±3 Ο 3 Π3

W υ σι£

				<
	CM	CM		c
CM	Ό	so		tj 1
MO	i“—	X-
	b			>ϊ
·—		CM		c
no	XX		~x	o	CZ.
x* s	X» s	x> c p		’£. £	Ό O
I	i	1	G2	CL	c
OH P	on p	on o	3	¢0	p
00	ςο	uo	a	□	CL
£	&	£	-C £	X p	£ o
O G	Š	o c	£	Z.
P	P	ΡΛ	C/3	£	>>
on	on	on	aa	o	c
g		g	·£	3	p on

<υ

Ή

J á

b

J5 ο

tx

Jž □

o c

o p

o c

*a o

Ό . cd CM _

CO

Ο

CM

Ο to

o o

O

O o

v? <

o o

<

o.

<

25

<

□

δ

CM o

u.

<

CD

Z

CD

o

CL

O

O

CD

CD

<

CM

<

o

<

CO

o

W

O

co

O

<

<

CM

O

^_c

l·—

▼—

CM

Y—

H

Y—

r-

<

H

-J

_j

_J

ω

<

<

00

<

—I

CD

X

CL

CL 1

D_

UJ

CD

CL

CD 1

UJ

CD

CL

CL

CD*

1 CD

1 CD

I O

1 CD

CD*

CD

CD

i CD

1 CD

1 CD

1 CD

1 CD

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

X ιο <£> Ο <Ο ο ιυ g 9 < _ CD 1 I co ω Ο Ο □

Έ ts >>

s co b

o c

p on <

cd <D

£.43 <íť Γ2

E E c <υ <λ § § Í5 i

8Í 8 .§ = ffl = ^M 8 8 8 E ° o. ° .2 íl b

H il č Jb to Tř x^-

O CM CO to T— to

CO T- 00 χ- cO 7“ y- o O lu J CQ < < <

CM tO CM CD Μ M

		co	CD	to
to o	to ÍM	to co	č	o to to	CM
o	O	>-	o:	O
>	>	O	UJ
ř“	ř-	h—	UJ	u.	o
2	5	2	00	<	00
	^-Z	Ý~		ČM	Y—
<	<	<	<	<č	<
CD	CD	CD 1	CD I	CD |	CD I
1 CD	t CD	i co	t CD	1 CD	CD
O	o	o	O	o	O

σ>

X

LU <

CD

O

121 rcn θ'¹ cn cn c x>

C

O ?

<

rσι ω A o σ> 5 A A <

-104-,

O

UJ

Q ><

O

LU

Q ώ

cr> cn

Ύ cn co H cn cr>

O o —> A. U- A(\ A ro >

<

• to ··»·

CL

CJ to

tn xr co to un cn CM Tcn o cn cn o oo fO T- <0 xr co

T- xf cn <o co co

CD T- tn

CO xj- CT

to

Γ-

co Γ-

tn

Γ-

co

tD

co

XT

co

CO

xr tn

cn co o m $

2 2

O O 0. 2

(M to o δ

xT CO CO co UJ

<D tn r- o o

ΟΟ co CM xr O <

CD r- to o o O

ΟΟ o o cn <

CO CM xr co σ <

tf) co O O 2 <ς

co CM O CO

N CL O O co 2

CL CM CL CL 1—

co CM r-

O O CM to O σ

co m m to σ <

CD CO Γ- cn UJ

o co XT o o

r- O CO v 0 0

CM O CM CO >

to 0 xr CM σ <

tb

LU

>

<

2

UJ 4-f

CM

< t\i O

cn

<M

tb

-J LU

q

2

cn co

<

xr

2

o

O

xj·

o

H

A?

cn <S)

2

*< (M

tO

co H·

co

co l·—

q

to

CL

Q

co CO

W

Q

Xf

<ζ xT

CO H

00

co

<

<

σ)

JZ

<

co

H

to

to

CD

CM

co

Ó

Ó

co

CO

x·”

CL

CtC

00

co

UJ 1

CO |

CO ♦

O

2 t

CO I

O 1

X I

LU I

o 1

UJ

2

O

CL

CL

o

O

2

CL

0l

UJ <

o I

cn

CO

1 CO

ω

1 CO

1 CO

I CO

1 CO

1 m

i m

1 CO

1 CO

1 CQ

l CD

1 CD

( CD

l co

l CD

CD*

CD*

1 CD

1 CD

O

O

O

o

O

O

O

O

o

O

o

o

O

O

O

O

o

O

O

O

O

o

co co

O ι

co

O

I·9 ·*»♦

122

Tabulka 4 - pokračování rxa02749 999 GB BA2:AF086791 37867 AF086791 ^Z™^ontona-^{S m}°bilis kmen ZM4, klon 67EI0 gen pro malou podj.

karbamoylfosfát synthetasy (carA), velkou podj. karbamoylfosfát synthetasy ^{Zymomonas moblíls} 39.024 4-Nov-98 (carB), transkripční elongační fektor (greA), enolasu (eno), α-podj. pyruvat

Κω. O < O ><

O co o o b- ΤΓ O &>. o τ a o o m Tb- un co* co

CO CO o cn co cm N (Ό N oo cn o

T- n IT) rm cn m co b- ry Tχτ co

CO CO CD O O O ··« ·»·· «V « » · · • · · · » 9 ·»··

I · · ·« *

0« *· ► · « · » * » e » · » » · •4 ··«·

123

O co co o cm m o. Q o* m TV XT M· co o co o uo co cm co co CM CM CO

CM	0.	o	X
CO o	X		X
o	X	<	X
LL			*
<	o	CO	p
CM	t—	H
<	_J	ω
CD	CL I	UJ 1	X
i co	1 CD	1 CD	CD
O	O	O	O

124 ··· · · * ···· • · <···· 9 9 · • · ·· ······· · · ······· ·· · · ft ···· iř

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava celkové genomové DNA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Kultura Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) se kultivovala přes noc při teplotě 30°C za důkladného třepání v BHI mediu (Difco). Buňky se získaly odstředěním, supernatant se odstranil a buňky se resuspendovaly v 5 ml pufru-I (5% originálního objemu kultury - všechny uvedené objemy byly vypočteny pro 100 ml kultury. Složení pufru-I: 140,34 g/1 sacharosy, 2,46 g/1 MgSCg x 7H₂O, 10 ml/1 roztoku KH2PO4 (100 g/1, pH upraveno na 6,7 KOH), 50 ml/1 M12 koncentrátu (10 g/1 (NHU2SO4, 1 g/1 NaCl, 2 g/1 MgSO₄ x 7H₂O, 0,2 g/1 CaCl₂, 0,5 g/1 kvasinkového extraktu (Difco), 10 ml/1 směsi stopových prvků (200 mg/1 FeSCd x H₂O, 10 mg/1 ZnSCM x 7 H₂O, 3 mg/1 MnCl₂ x 4 H₂O, 30 mg/1 H3BO3 20 mg/1 CoCl₂ x 6 H₂O, 1 mg/1 NiCl₂ x 6 H₂O, 3 mg/1 Na₂Mo04 x 2 H₂O, 500 mg/1 komplexačního činidla (EDTA nebo kyselina citrónová), 100 ml/1 směsi vitaminů (0,2 mg/1 biotinu, 0,2 mg/1 kyseliny listové, 20 mg/1 kyseliny p-aminobenzoové, 20 mg/1 riboflavinu, 40 mg/1 ca-pant^othenátu, 140 mg/1 kyseliny nikotinové, 40 mg/1 pyridoxolu, hydrochloridu, 200 mg/1 myo-inositolu). Lysozym se přidal do suspenze v konečné koncentraci 2,5 mg/ml. Po přibližně 4 hodinové inkubaci při 37°C se buněčná stěna degradovala a vzniklé protoplasty se získaly odstředěním. Peleta se promyla jednou 5 ml pufru-I a jednou 5 ml TE-pufru (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Peleta se resuspendovala ve 4 ml TE-pufru a přidalo se 0,5 ml roztoku SDS (10%) a 0,5 ml roztoku NaCl (5 M). Po přidání proteinasy K v konečné koncentraci 200 pg/ml se suspenze inkubovala po dobu přibližně 18 hodin při teplotě 37°C. DNA se přečistila extrakcí fenolem, fenol-chloroformisoamylalkoholem a chloroformisoamylalkoholem za použití

125 • ·· ··· ·· ·· • · · · · · · ···· • ····· · · · • · ·· ······· · · • · · · · ··· ··· ···· ·· · ·· ···· standardních postupů. Potom se DNA vysrážela přidáním 1/50 objemu 3 M octanu sodného a 2 objemů ethanolu, potom se provedla 30 minutová inkubace při teplotě -20°C a 30 minutové odstředění při 12000 rpm v odstředivce s vysokou rychlostí za použití SS34 odstředivky (Sorvall). DNA se rozpustila v 1 ml TE-pufru obsahujícího 20 pg/ml RNAsy A a dialyzovala se při 4°C proti 1000 ml TE-pufru po dobu nejméně 3 hodin. Během této doby se pufr vyměnil 3-krát. Do 0,4 ml podílů roztoku dialyzované DNA se přidalo 0,4 ml 2 M LiCl a 0,8 ml ethanolu.

Po 30 minutové inkubaci při -20°C se DNA získala odstředěním (13,000 rpm, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Německo). DNA peleta se rozpustila v TE-pufr. DNA připravená tímto postupem mohla být použita pro všechny účely, včetně southernové hybridizace nebo konstrukce genomových knihoven.

Příklad 2: Konstrukce genomových knihoven Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 v Escherichia coli

Za použití DNA připravené způsobem podle příkladu 1 se kosmidové a plasmidové knihovny konstruovaly známými způsoby (viz například, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; nebo Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in

Molecular Biology, John Wiley & Sons.).

Může se použít jakýkoliv plasmid nebo kosmid. Použily se plasmidy pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156), plasmidy pBS série (pBSSK+, pBSSKa jiné; Stratagene, LaJolla, USA), nebo kosmidy jako je SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) nebo Lorist6 (Gibson,

T.J., Rosenthal A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53:283-286). Genové knihovny určené pro použití v C. glutamicum byly konstruovány za použití plasmidu pSL 109 (Lee, H.S. and A.J.

v

126

Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4: 256-263

Příklad 3: DNA sekvencování a počítačové funkční analýzy

Genomové knihovny popsané v příkladu 2 byly použity pro DNA sekvencování za použití standardních metod, konkrétně metody ukončení řetězce za použití ABI377 sekvencovacích přístrojů (viz například, Fleischman, R.D. et al. (1995) Whole-genome

Random Sequencing a Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science, 269:496-512). Použily se sekvencovací primery následujících nukleotidových sekvencí: 5'GGAAACAGTATGACCATG-3' nebo 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.

Příklad 4: Mutagenese in vivo

In vivo mutagenese Corynebacterium glutamicum může být provedena pasážováním plasmidové (nebo jiné vektorové) DNA v E. coli nebo jiném mikroorganismu (například Bacillus spp. nebo kvasinkách, jako je Saccharomyces cerevisiae), které mají narušenou schopnost uchování integrity genetické informace. Typické mutátorové kmeny měly mutace v genech pro systémy reparace DNA (například mutHLS, mutD, mutT, atd.; viz Rupp, W.O. (1996) DNA repair mechanisms, v: Escherichia coli and Salmonella, str. 2277-2294, ASM: Washington). Takové kmeny jsou dobře známé odborníkům v oboru. Použití takových kmenů je popsáno například v Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34.

Příklad 5: Přenos DNA mezi Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum

Několik kmenů Corynebacterium a Brevibacterium obsahuje endogenní plasmidy (jako například pHM1519 nebo pBLl), které se replikují autonomně (pro přehled viz například Martin, J.F.

127 ·· ·· · ·· «· • « ··* · · » ♦ • · · · · ·· · • · · ······· · · ··· ···· β« · «· ···· et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146). Člunkové vektory pro Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum mohou být snadno konstruovány za použití standardních vektorů pro E. coli (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; nebo Ausubel, F. M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology,

John Wiley & Sons), do kterých se přidá sekvence rozpoznávájící počátek replikace a vhodný markér pro

Corynebacterium glutamicum. Takové sekvence rozpoznávající počátek replikace jsou obvykle získány z endogenních plasmidů izolovaných z kmenů Corynebacterium a Brevibacterium. Vhodnými transformačními markéry pro tyto kmeny jsou geny pro resistenci na kanamycin (jako jsou geny získané z Tn5 nebo Tn903 transposonů) nebo chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim). V literatuře je popsáno mnoho příkladů konstrukce různých člunkových vektorů, které se replikují v E. coli a C. glutamicum a které mohou být použity pro několik účelů, včetně nadměrné exprese genu (pro přehled viz například, Yoshihama,

M. et al. (1985), Bacteriol. 162: 591-597; Martin J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5: 137-146; a Eikmanns, B.J. et al.

(1991) Gene, 102:93-98).

Za použití standardních metod je možno klonovat daný gen do člunkového vektoru popsaného výše a vložit takový hybridní vektor do kmene Corynebacterium glutamicum. Transformace C. glutamicum může být provedena protoplastovou transformací (Kastsumata, R. el al. (1984), J. Bacteriol. 159: 306-311), elektroporací (Lieblj E. el al. (1989) FEMS Microbiol.

Letters, 53:399-303) a v případech, kdy jsou použity speciální vektory, také konjugací (jako je popsáno například v Schafer,

A et al., (1990) J. Bacteriol., 172: 1663-1666). Je také možné přenést člunkové vektory pro C. glutamicum do E. coli přípravou plasmidů z C. glutamicum (za použití standardních

128 technik dobře známých v oboru) a jejich transformací do E. coli. Tento transformační krok může být proveden za použití standardních menod, ale výhodné je použití Mcr-deficientj|ího kmene E. coli, jako je NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol.

Biol. 166: 1-19).

Geny mohou být nadměrně exprimovány v kmenech C. glutamicum za použití plasmidů, které obsahují pCGl (U.S. patent č. 4617267) nebo jeho fragmenty, volitelně gen pro resistenci na kanamycin z TN903 (Grindley, N.D. and Joyce, C.M. (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77(12): 7176-7180). Dále, geny mohou být nadměrně exprimovány v kmenech C. glutamicum za použití plasmidu pSLIOS (Lee, H.S. a A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol . 4: 256-263).

Kromě použití replikujících se plasmidů může být nadměrná expres genu také provedena integrací do genomu. Genomová integrace C. glutamicum nebo jiných kmenů Corynebacterium nebo Brevibacterium může být provedena dobře známými metodami, jako je homologní rekombinace s genomovým regionem, integrace zprostředkovaná restrikčni endonukleasoou (REMI) (viz například DE patent 19823834), nebo pomocí použití transposonu. Je také možné modulovat aktivitu daného genu modifikací regulačních regionů (například promotoru, represoru a/nebo zesilovače transkripce) modifikací sekvence, insercí nebo delecí za použití místně cílených metod (jako je homologní rekombinace) nebo za použití metod založených na náhodném ději (jako je transposonová mutagenese nebo REMI). Sekvence nukleové kyseliny, které působí jako transkripční terminátory, může být také insertována 3' do kódujícího regionu jednoho nebo více genů podle předkládaného vynálezu; takové terminátory jsou dobře známé v oboru a jsou popsány, například, ve Winnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones Introduction to Gene Technology, VCH: Weinheim.

• · »

129

Příklad 6: Hodnocení exprese mutovaného proteinu

Pozorování aktivity mutovaného proteinu v transformovaných hostitelských buňkách spočívá ve faktu, že mutantní protein je exprimován podobným způsobem a v podobném množství jako přirozený protein. Použitelnou metodou pro zjištění úrovně transkripce mutantního genu (indikátor množství mRNA dostupné pro translaci genu na genový produkt) je Northernova hybridizace (viz například Ausubel el al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), při které je primer navržený pro vazbu na daný gen značen detekovatelnou koncovkou (obvykle radioaktivní nebo chemiluminiscentní) tak, že když je celková RNA kultury organismu extrahována, zpracována na gelu, přenesena na stabilní matrici a inkubována s touto sondou, tak ukazuje vazba a velikost vazby sondy na přítomnost a množství mRNA pro tento gen. Tato informace udává stupeň transkripce mutantního genu. Celková buněčná RNA může být připravena z Corynebacterium glutamicum několika metodami dobře známými v oboru, které jsou popsané například v Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.

Pro hodnocení přítomnosti nebo relativního množství proteinu transiatovaného z této mRNA mohou být použity standardní techniky, jako je westernová hybridizace (viz například Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). V tomto způsobu se extrahují veškeré buněčné proteiny, separují se gelovou elektroforesou, přenesou se na matrici, jako je nitrocelulosová matrice, a inkubují se se sondou, jako je protilátka, která se specificky váže na požadovaný protein. Tato sonda je obvykle opatřena chemiluminiscentní nebo kolorimetrickou značkou, která může být snadno detekována. Přítomnost a kvantita pozorované značky ukazuje přítomnost a kvantitu daného mutantního proteinu • 4

130

444 4444

v buňce.

Příklad 7: Kultivace geneticky modifikovaného Corynebacterium glutamicum - media a kultivační podmínky

Geneticky modifikovaná Corynebacteria se kultivují v syntetických nebo přirozených kultivačních mediích. Je známo mnoho různých kultivačních medií pro Corynebacteria, která jsou snadno dastupná (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol.

Biotechnol., 32:205-210; von der Osten et al. (1998)

Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patent DE -4120867: Liebl (1992) The Genus Corynebacterium, v: The Procaryotes, svazek 11, Balows, A. et al.. eds. Springer-Verlag). Tato media se skládají z jednoho nebo více zdrojů uhlíku, dusíku, anorganických solí, vitamínů a stopových prvků. Výhodnými zdroji uhlíku jsou sacharidy, jako jsou mono-, di- nebo polysacharidy. Například glukosa, fruktosa, mannosa, galaktosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, laktosa, maltosa, sacharosa, rafinosa, škrob nebo celulosa jsou velmi dobrými zdroji uhlíku. Je také možné dodat sacharid do media v komplexních sloučeninách, jako je melasa nebo jiné vedlejší produkty rafinace cukru. Může být také výhodné použít směsi různých zdrojů uhlíku. Jinými vhodnými zdroji uhlíku jsou alkoholy a organické kyseliny, jako je methanol, ethanol, kyselina octová nebo mléčná. Zdroji dusíku jsou obvykle organické nebo anorganické dusíkaté sloučeniny nebo materiály obsahující tyro sloučeniny. Příklady zdrojů dusíku jsou plynný amoniak nebo ammoniové soli, jako je NH₄C1 nebo (NH₄)₂SO₄,

NH₄OH, nitráty, močovina, aminokyseliny nebo komplexní zdroje dusíku, jako je kukuřičný výluh, sojová moučka, sojový protein, kvasinkový extrakt, masový extrakt a jiné.

Mezi anorganické soli, které může medium obsahovat, patří chloridové, fssforečné nebo síranové soli vápníku, hořčíku,

131

sodíku, kobaltu, molybdenu, draslíku, manganu, zinku, mědi a železa. Pro udržení iontů kovu v roztoku mohou být do media přidány chelatační sloučeniny. Zejména výhodnými chelatačními sloučeninami ;sou dihydroxyfenoly, jako je katechol nebo protokatechuat, nebo organické kyseliny, jako je kyselina citrónová. Prc media je také typické, že obsahují jiné růstové faktory, jako jsou vitamíny nebo činidla podporující růst, mezi které patří například biotin, riboflavin, thiamin, kyselina listcvá, kyselina nikotinová, pantothenát a pyridoxin. Růstové faktory a soli často pocházejí z komplexní složky media, například z kvasinkového extraktu, melasy, kukuřičného výluhu a jiných. Přesné složení media významně závisí na konkrétním pokusu a pro každý pokus je složení specifické. Informace týkající se optimalizace media jsou uvedeny v učebnici Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997), str. 53-73, ISBN 0 19963577 3). Je také možné použít kultivační medium od komerčních dodavatelů, jako je standard I (Merck) nebo EHI (grain heart infusion, DIFCO) nebo jiné.

Všechny složky media jsou sterilizované, buď teplem (20 minut při 1,5 baru a 121°C) nebo sterilní filtrací. Složky mohou být buď sterilizovány dohromady, nebo samostatně.

Všechny složky media mohou být přítomny na počátku kultivace, nebo mohou být případně přidávány kontinuálně nebo po dávkách.

Kultivační podmínky jsou definovány samostatně pro každý pokus. Teplota by měla být v rozmezí 15°C až 45°C. Teplota může být konstantní nebo může být měněna během pokusu. pH media by mělo být v rozsahu 5 až 8,5, výhodně přibližně 7,0, a může být udržováno přidáváním pufrů do media. Příkladem pufru vhodného pro tento účel je pufr obsahující fosforečnan draselný. Syntetické pufry, jako je MOPS, HEPES, ACES a jiné, mohou být alternativně nebo současně použity. Je také možné

132

• · • * · ·

• · · ·* ··· · udržovat konstantní pH kultury pomocí přidávání NaOH nebo NH4OH během kultivace. Pokud se používají komplexní složky media, tak může být potřeba pufrů redukována, protože mnoho komplexních sloučenin má pufrovací kapacitu. Pokud je pro kultivaci mikrodrSgnismu použit fermentor, může být pH také kontrolováno za použití plynného amoniaku.

Inkubační doba je obvykle v rozmezí od několika hodin do několika dnů. Tato doba je vybrána tak, aby se dosáhlo maximální akumulace produktu v mediu. Popsané pokusy mohou být provedeny v různých nádobách, jako jsou mikrotitrační plotny, skleněné zkumavky, skleněné baňky nebo skleněné nebo kovové fermentory různé velikosti. Pro skríning velkého počtu .klonů by měly být mikroorganismy kultivovány v mikrotitračních plotnách, skleněných zkumavkách nebo baňkách, s nebo bez přepážek. Výhodně se použijí 100 ml baňky, naplněné 10% (objem.) požadovaného kultivačního media. Baňka se může třepat na rotační třepačce (amplituda 25 mm) za použití rychlostí v rozmezí 100-300 rpm. Ztráty odpařováním mohou být minimalizovány udržováním vlhké atmosféry; jinak může být provedena matematická korekce pro ztráty odpařováním.

Když jsou testovány geneticky modifikované klony, tak by měl být také testován nemodifikovaný kontrolní klon nebo kontrolní klon obsahující základní plasmid bez jakéhokoliv insertu. Medium se naočkuje do ODeoo 0,5-1,5 za použití buněk kultivovaných na agarových plotnách, jako jsou CM plotny (10 g/1 glukosa, 2,5 g/1 NaCl, 2 g/1 močovina, 10 g/1 polypepton, g/1 kvasinkový extrakt, 5 g/1 masový extrakt, 22 g/1 NaCl, 2 g/1 močovina, 10 g/1 polypepton, 5 g/1 kvasinkový extrakt, 5 g/1 masový extrakt, 22 g/1 agar, pH 6,8 s 2M NaOH), které se inkubují při 30 °C. Inokulace media se provede buď naočkováním salinické suspenze buněk C. glutamicum z CM ploten nebo přidáním kapalné prekultury této bakterie.

»* · • · ·· 99 · ·

Příklad 8: Analýza funkce mutantních proteinů in vitro

Stanovení aktivit a kinetických parametrů enzymů je dobře známé v oboru. Pokusy pro určení aktivity jakéhokoliv daného pozměněného enzymu musí být navrženy s ohledem na specifickou aktivitu přirozeného enzymu, což je známé odborníkům v oboru. Přehled enzymů obecně, stejně jako specifických podrobností týkajících se struktury, kinetiky, principů, metod, aplikací a příkladů stanovení mnoha enzymových aktivit jsou uvedeny, například, v následujících odkazech: Dixon, M., and Webb,

E.C., (1979) Enzymes, Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme

Structure a Mechanism, Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms, Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology, Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3. vydání, Academie Press: New York; Bisswanger, H., (1994)

Enzymkinetik, 2. vydání, VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., GraPl, M., ed. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3.vydání, svazek I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; a Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) svazek A9, Enzymes, VCH: Weinheim, str. 352-363.

Aktivita proteinů, které se váží na DNA, může být měřena několika dobře známými metodami, jako je test posunu proužků DNA (též označovaný jako gelový retardační test) . Vliv takových proteinů na expresi jiných molekul může být měřen za použití testů s reportérovým genem (jak jsou popsány v Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 a odkazech zde citovaných). Testovací systémy s reportérovými geny jsou dobře známé a zavedené pro prokaryotické a eukaryotické buňky a využívají enzymy jako je beta-galaktosidasa, zelený fluorescentní protein a několik dalších.

134

Stanovení aktivity membránových transportních proteinů může být provedeno za použití technik, které jsou popsány například v Gennis, R.B. (1989) Pores, Channels and Transporters, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, str. 85-137; 199-234; a 270-322.

Příklad 9: Analýza vlivu mutantního proteinu na produkci požadovaného produktu

Vliv genetické modifikace v C. glutamicum na produkci požadované sloučeniny (jako je aminokyselina) může být hodnocen kultivací modifikovaného mikroorganismu za vhodných podmínek (jako jsou například podmínky popsané výše) a analýzou media a/nebo buněčných složek na zvýšenou produkci požadovaného produktu (tj. aminokyseliny). Takové analytické techniky jsou dobře známé v oboru a patří mezi ně spektroskopie, chromatografie na tenké vrstvě, různé typy barvení, enzymatické a mikrobiologické metody a analytická chromatografie, jako je vysoceúčinná kapalinová chromatografie (viz například Ullmann, Encyclopedia of Industrial Chemistry, svazek A2, str. 89-90 a str. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. et al., (1987) Applications of HPLC in

Biochemistry v: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, svazek 17; Rehm et al. (1993)

Biotechnology, svazek 3, kapitola III: Product recovery and purification, strany 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bicseparations: downstream Processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials,

John Wiley a Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, v: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, sv. B3, kapitola II, strana 1-27, VCH: Weinheim; a Dechow, F.J. (1989) Separation and purification

135 ·9 ► 9 9 4

9999 techniques in biotechnology, Noyes Publícations).

Kromě měření konečného produktu fermentace je také možné analyzovat jiné složky metabolické dráhy využívané pro produkci požadované sloučeniny, jako jsou meziprodukty a vedlejší produkty, pro stanovení celkové produktivity organismu, výtěžku a/nebo účinnosti produkce sloučeniny, mezi analytické metody patří stanovení koncentrace živin v mediu (například sacharidů, uhlovodíků, zdrojů dusíku, fosfátů a jiných iontů), měření složení biomasy a růstu, analýza produkce běžných metabolitů biosyntetických drah a měření plynů produkovaných během fermentace. Standardní metody pro tato měření jsou uvedena v Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes a P.F. Stanbury, ed., IRL Press, str. 103-129; 131-163; a 165-192 (ISBN: 0199635773) a odkazy zde citované.

Příklad 10: Přečištění požadovaného produktu z kultury C. glutamicum

Získání požadovaného produktu z buněk nebo supernatantu C. glutamicum ve výše uvedené kultuře může být provedeno různými způsoby známými v oboru. Pokud není produkt secernován z buněk, mohou být buňky získány z kultury odstředěním při nízké rychlosti a potom mohou být lyžovány standardními technikami, jako například mechanicky nebo sonikací. Buněčná drť se odstraní odstředěním a supernatant obsahující rozpustné proteiny se uchová pro další přečištění požadované sloučeniny. Pokud je produkt secernován z buněk C. glutamicum, tak se buňky odstraní z kultury odstředěním při nízké rychlosti a supernatant se odebere pro další přečištění.

Supernatant z jakékoliv přečíšťovací metody se zpracuje chromatografií s vhodnou pryskyřicí, ve které je požadovaná

136 • »» ·* · ·· «♦ ···· ··« ···» • · « ♦ · * · ♦ · • · · · ···♦··· · * • · · · · · · · ··· ···· ·· · ·· ···· molekula buď zachována na chromatografické pryskyřici, zatímco nečistoty nikcliv, nebo kde jsou nečistoty zachyceny na pryskyřici, zacímco vzorek nikoliv. Takové chromatografické stupně mohou týt opakovány podle potřeby, za použití různých chromatografických pryskyřic. Odborník v oboru bude schopen vybrat vhodné chromatografické pryskyřice a jejich nejvhodnější použití pro konkrétní přečišťované molekuly. Přečištěný produkt může být zahuštěn filtrací nebo ultrafiltrací a může být uskladněn při teplotě, při které je stabilita produktu maximální.

V oboru jsou známé různé sestavy přečišťovacích metod a uvedené metody přečištění byly uvedeny pouze jako příklad. Takové přečišťovací techniky jsou popsány, například, v Bailey, J.E. & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).

Identita a čistota izolované sloučeniny může být hodnocena standardními technikami. Mezi takové techniky patří vysocevýkonná kapalinová chromatografie (HPLC), spektroskopické metody, barvení, chromatografie na tenké vrstvě, NIRS, enzymatické testy nebo mikrobiologické testy. Takové analytické metody jsou popsány v: Patek et at. (1994) Appl. Environ. Micrcbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 2732; a Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) svazek A27, VCH: Weinheim, str. 89-90, str. 521-540, str. 540547, str. 559-566, 575-581 a str. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons;

Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry v: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, svazek 17.

0» ·♦

137 *

• · · 0 • 0 • 0 • ·

0 00 0 0

·

0 00 · • 4 ·· • · < · 0 0 0 0 0 0 • 0 0 • 0 000·

Příklad 11: Analýza genových sekvencí podle předkládaného vynálezu

Porovnání sekvencí a stanovení procenta homologie mezi dvěma sekvencemi jsou techniky známé v oboru a lze je provést za použití matematického algoritmu, jako je algoritmus podle Karlin a Altschul (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:226468, modifikovaný podle Karlin a Altschul (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Takový algoritmus je použit v NBLAST a XBLAST programech (verze 2.0) (Altschul, et al.

(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10). BLAST nukleotidové vyhledávání může být provedeno s NBLAST programem, skóre =

100, délka slova = 12, za účelem získání nukleotidových sekvencí homologních s molekulami MCT nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. BLAST proteinové vyhledávání může být provedeno s XBLAST programem, skóre = 50, délka slova = 3, za účelem získání aminokyselinových sekvencí homologních s molekulami MCT proteinu podle předkládaného vynálezu. Pro získání přiřazení s mezerami pro srovnání může být použito Gapped BLAST, jak je popsáno v Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Při použití BLAST a Gapped BLAST programů bude odborník v oboru znát, jak optimalizovat parametry programu (například XBLAST a NBLAST) pro konkrétní analyzovanou sekvenci.

Jiným příkladem matematického algoritmu použitého pro srovnání sekvencí je algoritmus podle Meyerse a Millera ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 1117). Takový algoritmus je použit v ALIGN programu (verze 2.0), který je součástí softwaru pro přiřazení GCG sekvence. Při použití ALIGN programu pro srovnání aminokyselinových sekvencí může být použita PAM120 tabulka váhy zbytků, penále za délku mezery 12 a penále za mezeru 4. Další algoritmy pro analýzu sekvence <9*

138 ·* · • « · « * · 9 9 * • 9 9 · *99

9 9

• 9

9»99

9 * 9 • 999« 9 9 · 9 jsou známé v cooru a patří mezi ně ADVANCE a ADAM, které jsou popsány v Torelli a Robotti, (1994), Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5; a FASTA, popsaný v Pearson a Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8.

Procento hcmologie mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi může být také určeno za použití GAP programu v GCG softwaru (dostupném na http://www.gcg.com), za použití buď Blosum 62 matrice, nebo PAM250 matrice, váhy mezery 12, 10, 8, 6 nebo 4 a váhy délky mezery 2, 3, nebo 4. Procento homologie mezi dvěma sekvencemi nukleové kyseliny může být určeno za použití GAP programu v GCG softwaru, za použití standardních parametrů, jaro je váha mezery 50 a váha délky 3.

Srovnávací analýza genových sekvencí podle předkládaného vynálezu se sekvencemi, v Genbank může být provedena za použití technik známých v oboru (viz například Bexevanis a Ouellette, ed., (1998), Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, John Wiley and Sons: New York). Genové sekvence podle předkládaného vynálezu se srovnávaly s geny v Genbank ve crojstupňovém procesu. V prvním stupni se provedla BLAS1N analýza (například analýza lokálního přiřazení) pro každou ze sekvencí podle předkládaného vynálezu proti nukleotidovým sekvencím v Genbank, a nejúspěšnějších 500 se použilo pro další analýzu. Následné FASTA prohledávání (například kombinovaná lokální a globální analýza přiřazení, ve které jsou přiřazovány omezené regiony sekvencí) bylo provedeno na rěchto 500 sekvencích. Každá genová sekvence podle předkládaného vynálezu byla potom globálně přiřazena k prvním třem nejúspěšnějším sekvencím z FASTA, za použití GAP programu v GCG softwaru (za použití standardních parametrů). Pro získání správných výsledků se délka sekvencí získaných z Genbank přizpůsobila délce testovaných sekvencí za použití metod dobře známých v oboru. Výsledky této analýzy jsou

139

uvedeny v tabulce 4. Získaná data se shodují s daty získanými z GAP (globální) analýzy samotné, když byla provedena na každém z těchto genů podle předkládaného vynálezu s každou z referenčních sekvencí z Genbank, ale tato analýza vyžaduje kratší čas výpočrů ve srovnání s takovou GAP (globální) analýzou databáze. Sekvence podle předkládaného vynálezu, pro které nebylv z j ištěrí& přiřazení nad hraniční hodnotou, jsou uvedeny v tabulce 4 jako sekvence bez informací o přiřazení. Odborníkům v oboru bude jasné, že procenta homologie podle GAP přiřazení uvedená v tabulce 4 označených % homologie (GAP) jsou uvedena v Evropském numerickém formátu, kde znamená desetinou čárku. Například hodnota 40,345” v tomto sloupci znamená 40,345%.

Příklad 12: Konstrukce a práce s DNA mikročipy

Sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být dále použity při konstrukci a použití DNA mikročipů (návrh, metody a použití DNA čipů jsou dobře známé v oboru a jsou popsány, například, v Schena, M. et al. (1995), Science 270: 467-470; Wodicka, L. et al., (1997), Nátuře Biotechnology 15: 13591367; DeSaizeu, A. et al., (1998), Nátuře Biotechnology 16: 45-48; a DeRisi, J.L. et al., (1997), Science 278: 680-686).

DNA mikročipy jsou pevné nebo flexibilní nosiče skládající se z nitrocelulosy, nylonu, skla, silikonu nebo z jiných materiálů. Molekuly nukleové kyseliny mohou být navázány na povrch v určitém pořadí. Po vhodném značení mohou jiné nukleové kyseliny a směsi nukleových kyselin hybridizovat na imobilizované molekuly nukleové kyseliny a značka může být použita pro monitorování a měření jednotlivých intenzit signálů hybridizovaných molekul v definovaných regionech. Tato metoda umožňuje simultánní kvantifikaci relativních nebo absolutních množství všech nebo vybraných nukleových kyselin • · • ·

140 · .....

• · · · ··· ···· ·· v aplikovaném vzorku nukleových kyselin. DNA mikročipy tedy umožňují paralelní analýzu exprese mnoha (například 6800 nebo více) nukleových kyselin (viz například Schena, M. (1996), BioAssays 18(5): 427-431).

Sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro navržení oligonukleotidových primerů, které mohou amplifikovat definované regiony jednoho nebo více genů C. glutamicum v reakci pro amplifikaci nukleové kyseliny, jako je polymerasové řetězová reakce. Volba a návrh 5' a 3' oligonukleotidových primerů nebo vhodných spojovacích sekvencí umožňuje kovaleutní navázání vzniklých PCR produktů na povrch vhodného nosiče, jak byly popsány výše (a jak je také popsáno ve Schena, M. eo al., (1995), Science 270: 467-470).

Mikročipy nukleových kyselin mohou být také konstruovány oligonukleotidovou syntézou in šitu, jak je popsáno ve Wodicka, L. et al., 1997, Nátuře Biotechnology 15: 1359-1367. Ve fotolitografických metodách se přesně definované regiony matrice vystaví světlu. Chránící skupiny, které jsou fotolabilní, jsou takto aktivovány a proběhne nukleotidová adice, zatímco na regionech, které jsou chráněny před· světlem, neproběhne žádná modifikace. Následné cykly chránění a aktivace světlem umožní syntézu různých oligonukleotidů v definovaných pozicích. Malé, definované regiony genů podle předkládaného vynálezu mohou být syntetizovány na mikročipách pomocí oligonukleotidové syntézy na pevné fázi.

Molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu přítomné ve vzorku nebo ve směsi nukleotidů mohou hybridizovat na mikročipy. Tyto molekuly nukleové kyseliny mohou být značeny za použití standardních metod. Stručně, molekuly nukleové kyseliny (například RNA molekuly nebo DNA molekuly) se značí pomocí inkorporace izotopově nebo fluorescentně

141 • · · · · · ·

značených nukleotidů, například během reverzní transkripce nebo syntézy DNA. Hybridizace značených nukleových kyselin na mikročipy je popsána v literatuře (například ve Schena, M. et al., (1195), výše; Wodicka, L. et al., (1997), výše; a

DeSaizieu A. et al., (1998), výše). Detekce a kvantifikace hybridizovaných molekul se provede podle specifické použité značky. Radioaktivní značky mohou být detekovány, například, způsobem popsaným ve Schena, M. et al., (1995), výše, a fluorescentní značky mohou být detekovány například způsobem podle Shalon et al. , (1996), Genome Research 6: 639-645).

Použití sekvencí podle předkládaného vynálezu v technice DNA mikročipů, jak je popsáno výše, umožňuje srovnávací analýzu různých kmenů C. glutamicum nebo jiných Corynebacterií. Například výzkum mezikmenových variací na bázi jednotlivých transkripčních profilů a identifikace genů, které jsou významné pro specifické a/nebo žádoucí vlastnosti kmenů, jako je patogennost, produktivita a tolerance vůči stresu, je usnadněn díky technice sestav nukleových kyselin. Také jsou pomocí techniky mikročipů nukleových kyselin možná srovnání profilu exprese genů podle předkládaného vynálezu během fermentace.

Příklad 13: Analýza. dynamiky populací buněčných proteinů (Proteomika)

Geny, prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro studium interakcí a dynamik populací proteinů, což je označováno jako proteomika. Mezi zajímavé populace proteinů patří, například, celková populace proteinů C. glutamicum například ve srovnání s populacemi proteinů v jiných organismech), ty proteiny, které jsou aktivní za specifických metabolických podmínek nebo ve specifickém prostředí (například během fermentace, při vysoké nebo nízké

142

teplotě, nebo při vysokém nebo nízkém pH) , nebo ty proteiny, které jsou aktivní během specifických fází růstu a vývoje.

Proteinové populace mohou být analyzovány za použití dobře známých technik, jako je gelová elektroforesa. Buněčné proteiny mohou být získány, například, lýzou nebo extrakcí, a mohou být separovány od sebe za použití různých elektroforetických technik. Elektroforesa na dodecylsíran sodný-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) separuje proteiny zejména podle jejich molekulové hmotnosti. Polyakrylamidová gelová elektroforesa s izoelektrickým fokusování (IEF-PAGE) separuje proteiny podle jejich izoelektrického bodu (který odráží nejen aminokyselinovou sekvenci, ale také posttranslační modifikace proteinu). Jinou, výhodnější metodou analýzy proteinů je postupné kombinování IEF-PAGE a SDS-PAGE, které je známé jako 2-D-gelová elektroforesa (jak je popsáno například v Hermann et al. (1998) Electrophoresis 19: 32173221; Fountoulakis et al. (1998) Electrophoresis. 19: 11931202; Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192; Antelmann et al. (1997) Electrophoresis' 18: 1451-1463). Pro separaci proteinů mohou být použity i jiné separační techniky, jako je kapilární gelová elektroforesa, které jsou dobře známé v oboru.

Proteiny separované těmito technikami mohou být vizualizovány standardními technikami, jako je bavení nebo značení. Vhodná barvení jsou známá v oboru a patří mezi ně Coomassie Brilliant Blue, barvení stříbrem nebo fluorescentní barviva jako je Sypro Ruby (Molecular Probes). Použití radioaktivně značených aminokyselin nebo jiných prekursorů proteinů (například ³⁵S-methioninu, ³⁵S-cysteinu, ¹⁴C-značených aminokyselin, ⁵N-aminokyselin, ¹⁵NO3 nebo ¹⁵NH4⁺ nebo ¹³Cznačených aminokyselin) v medium pro C. glutamicum umožňuje značení proteinů z těchto buněk před jejich separací. Mohou

143 • · · · · • · · · být také použity fluorescentní značkovací činidla. Tyto značené proteiny mohou být extrahovány, izolovány a separovány za použití technik popsaných dříve.

Proteiny vizualizované těmito technikami mohou být dále analyzovány měřením množství použitého barviva nebo značkovacího činidla. Množství daného proteinu může být určeno kvantitativně za použití, například, optických metod, a může být srovnáváno s množstvím jiných proteinů ve stejném gelu nebo v jiných gelech. Srovnání proteinů na gelech může být provedeno, například, opticky, spektroskopicky, skanováním obrazu a analýzou gelů, nebo použitím fotolitografických filmů a sít. Takové techniky jsou dobře známé v oboru.

Pro určení ioentity daného proteinu může být použito přímého sekvenccvání nebo jiných standardních technik. Například může být použito N- a/nebo C-koncové aminokyselinové sekvencování (jako je Edmanova degradace), stejně jako hmotnostní spektrometrie (zejména MALDI nebo ESI techniky (viz Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192)). Zde uvedené proteinové sekvence mohou být použity pro identifikaci proteinů C. glutamicum pomocí těchto technik.

Informace získaná těmito metodami může být použita pro srovnání charakierů přítomnosti proteinu, aktivity nebo modifikací mezi různými vzorky z různých biologických podmínek (například z různých organismů, z různé doby fermentace, podmínek media nebo různých biotopů, mimo jiné). Data získaná z takových pokusů samostatně, nebo v kombinaci s jinými technikami, mohou být použita pro různé aplikace, jako je srovnání chování různých organismů v dané (například metabolické) siiuaci, pro zvýšení produktivity kmenů, které produkují čistá chemická činidla nebo pro zvýšení účinnosti produkce čistých chemických činidel.

144

Odborníkům v oboru bude jasné, nebo budou schopni určit běžnými pokusy, mnohé ekvivalenty specifických popsaných provedení předkládaného vynálezu. Takové ekvivalenty spadají do rozsahu následujících patentových nároků.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná molekula nukleové kyseliny z Corynebacterium glutamicum kódující MCT protein, nebo její část, s podmínkou, že molekula nukleové kyseliny se neskládá z jakéhokoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.
2. 2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde uvedená molekula nukleové kyseliny kóduje MCT protein podílející se na produkci čistého chemického činidla.
3. 3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny Corynebacterium glutamicum vybraná ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako liché SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, nebo její část, s podmínkou, že molekula nukleové kyseliny se neskládá z jakéhokoli z genů.uvedených v tabulce 1 označených F.
4. 4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující polypeptidovou sekvenci, vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako sudé SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, s podmínkou, že molekula nukleové kyseliny se neskládá z jakéhokoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.
5. 5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující přirozenou alelickou variantu polypeptidu vybraného ze skupiny aminokyselinových sekvencí zahrnující sekvence uvedené jako sudé SEQ ID NC: v seznamu sekvencí, s podmínkou, že molekula nukleové kyseliny se neskládá z jakéhokoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.
6. 6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z 50 % homologní s nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako liché SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, ·· ·

   146 • · · · · nebo její čász, s podmínkou, že molekula nukleové kyseliny se neskládá z jakéhokoli z genů uvedených v tabulce 1 označených

   F.
7. 7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující fragment alespoň 15 nukleotidů nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako liché SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, s podmínkou, že molekula nukleové kyseliny se neskládá z jakéhokoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.
8. 8. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která za přísných podmínek hybridizuje na molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
9. 9. Izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 nebo její část a nukleotidovou sekvenci kódující heterologní polypeptid.
10. 10. Vektor, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
11. 11. Vektor podle nároku 10, kde se jedná o expresní vektor.
12. 12. Hostitelská buňka, transfektovaná expresním vektorem podle nároku 11.
13. 13. Hostitelská buňka podle nároku 12, kde uvedená buňka je mikroorganismus.
14. 14. Hostitelská buňka podle nároku 13, kde buňka náleží do rodu Corynebacterium nebo Brevibacterium.

    44 4
15. 15. Hostitelská buňka podle nároku 12, kde exprese uvedené molekuly nukleové kyseliny vede k modulaci produkce čistého chemického činidla uvedenou buňkou.
16. 16. Hostitelská buňka podle nároku 15, kde uvedené čisté chemické činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující: organické kyseliny, pročeinogenní aminokyseliny, neproteinogenní aminokyseliny, purinové a pyrimidinové baze, nukleosidy, nukleotidy, lipidy, nasycené a nenasycené mastné kyseliny, dioly, karbohydráty, aromatické sloučeniny, vitamíny, kofaktory, pokyketidy a enzymy.
17. 17. Způsob výroby polypeptidu vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 12 ve vhodném kultivačním mediu za produkce polypeptidu.
18. 18. Izolovaný MCT polypeptid z Corynebacterium glutamicum nebo jeho část.
19. 19. Polypeptid podle nároku 18, kde uvedený polypeptid se podílí na produkci čistého chemického činidla.
20. 20. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako sudé SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, s podmínkou, že aminokyselinová sekvence není kódovaná jakýmkoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.
21. 21. Izolovaný polypeptid obsahující přirozenou alelickou variantu polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako sudé SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, nebo její část, s podmínkou, že aminokyselinová sekvence není kódovaná jakýmkoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.

    148
22. 22. Izolovaný polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 18 až 21, který dále obsahuje heterologní aminokyselinové sekvence.
23. 23. Izolovaný polypeptid, který je kódovaný molekulou nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z 50 % homologní s nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako liché SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, s podmínkou, že molekula nukleové kyseliny se neskládá z jakéhokoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.
24. 24. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z 50 % homologní s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvence uvedené jako sudé SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, s podmínkou, že aminokyselinová sekvence není kódovaná jakýmkoli z genů uvedených v tabulce 1 označených F.
25. 25. Způsob výroby čistého chemického činidla vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buňky obsahující vektor podle nároku 12 tak, že dojde pro produkci čistého chemického činidla.
26. 26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok získání čistého chemického činidla z uvedené kultury.
27. 27. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok transfekce uvedené buňky vektorem podle nároku 11 za zisku buňky obsahující uvedený vektor.

    149 • · ♦ * ·♦ ·· • » * · • * · • * ♦ · • · · · • ···«·»
28. 28. Způsob pošle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedená buňka patří do rodu Corynebacterium nebo Brevibacterium.
29. 29. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedená buňka je vybrána ze skupiny zahrnující: Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divariactum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentun, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum a kmeny uvedené v tabulce 3.
30. 30. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že exprese molekuly nukleové kyseliny z uvedeného vektoru vede k modulaci produkce uvedeného čistého chemického činidla.
31. 31. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedené čisté chemické činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující: organické kyseliny, proteinogenní aminokyseliny, neproteinogenní aminokyseliny, purinové a pyrimidinové baze, nukleosidy, nukleotidy, lipidy, nasycené a nenasycené mastné kyseliny, dioly, karbohydráty, aromatické sloučeniny, vitamíny, kofaktory, polyketidy a enzymy.
32. 32. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedeným čistým chemickým činidlem je aminokyselina.
33. 33. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že aminokyselina je vybrána ze skupiny zahrnující: lysin,

    150 « «« * ♦· • · · r · · 4 · · · · • 9 9 9 9 9 · · ♦

    9 9 99 9 9999 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9

    9999999 99 9 99 9999 glutamát, glutamin, alanin, aspartát, glycin, serin, threonin, methionin, cystein, valin, leucín, isoleucin, arginin, prolin, histidin, tyrcsin, fenylalanin a tryptofan.
34. 34. Způsob výroby čistého chemického činidla vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buňky, jejíž genomová DNA byla pozměněna zapracováním molekuly nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
35. 35. Způsob diagnostiky přítomnosti Corynebacterium diphtheriae u jedince vyznačující se tím, že zahrnuje detekci přítomnosti jedné nebo více ze SEQ ID NO: 1-676 seznamu sekvencí u jedince, s podmínkou, že se nejedná o sekvence nebo sekvence kódované jakoukoliv sekvencí uvedenou v tabulce 1 označenou F, čímž se diagnostikuje přítomnost nebo aktivita Corynebacterium diphtheriae u jedince.
36. 36. Hostitelská buňka, obsahující molekulu nukleové kyseliny vybranou ze skupiny skládající se z molekul nukleové kyseliny uvedených jako liché SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, kde tato molekula nukleové kyseliny je narušena.
37. 37. Hostitelská buňka, obsahující molekulu nukleové kyseliny vybranou ze skupiny skládající se .z molekul nukleové kyseliny uvedených jako liché SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, kde molekula nukleové kyseliny obsahuje jednu nebo více modifikací nukleové kyseliny vzhledem k sekvenci uvedené jako lichá SEQ ID NO: v seznamu sekvencí.
38. 38. Hostitelská buňka, obsahující molekulu nukleové kyseliny vybranou ze skupiny skládající se z molekul nukleové kyseliny uvedených jako liché SEQ ID NO: v seznamu sekvencí, kde regulační region molekuly nukleové kyseliny je modifikován vzhledem k přirozenému regulačnímu regionu molekuly.