KR20030002295A - 막 합성 및 막 운반 관련 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)으로부터 신규 MCT 단백질을 코딩하는, MCT 핵산 분자로 명명된 단리된 핵산 분자를 기재한다. 본 발명은 또한 안티센스 핵산 분자, MCT 핵산 분자를 함유하는 재조합 발현 벡터 및 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 단리된 MCT 단백질, MCT 단백질 돌연변이, 융합 단백질, 항원성 펩티드, 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 MCT 유전자의 유전 공학을 기초로 하여 상기 생물체로부터 목적하는 화합물의 생산을 향상시키는 방법을 제공한다.

Description

막 합성 및 막 운반 관련 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 {Corynebacterium Glutamicum Genes Encoding Proteins Involved in Membrane Synthesis and Membrane Transport}

관련 출원

본 출원은 본 출원일 이전에 출원된 미국 가특허 출원 제60/141031호 (1999년 6월 25일 출원)을 우선권으로 주장한다. 본 출원은 또한 독일 특허 출원 제19931454.3호 (1999년 7월 8일 출원), 독일 특허 출원 제19931478.0호 (1999년 7월 8일 출원), 독일 특허 출원 제19931563.9호 (1999년 7월 8일 출원), 독일 특허 출원 제19932122.1호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932124.8호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932125.6호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932128.0호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932180.9호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932182.5호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932190.6호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932191.4호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932209.0호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932212.0호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932227.9호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932228.7호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932229.5호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허 출원 제19932230.9호 (1999년 7월 9일 출원), 독일 특허출원 제19932927.3호 (1999년 7월 14일 출원), 독일 특허 출원 제19933005.0호 (1999년 7월 14일 출원), 독일 특허 출원 제19933006.9호 (1999년 7월 14일 출원), 독일 특허 출원 제19940764.9호 (1999년 8월 27일 출원), 독일 특허 출원 제19940765.7호 (1999년 8월 27일 출원), 독일 특허 출원 제19940766.5호 (1999년 8월 27일 출원), 독일 특허 출원 제19940830.0호 (1999년 8월 27일 출원), 독일 특허 출원 제19940831.9호 (1999년 8월 27일 출원), 독일 특허 출원 제19940832.7호 (1999년 8월 27일 출원), 독일 특허 출원 제19940833.5호 (1999년 8월 27일 출원), 독일 특허 출원 제19941378.9호 (1999년 8월 31일 출원), 독일 특허 출원 제19941379.7호 (1999년 8월 31일 출원), 독일 특허 출원 제19941395.9호 (1999년 8월 31일 출원), 독일 특허 출원 제19942077.7호 (1999년 9월 3일 출원), 독일 특허 출원 제19942078.5호 (1999년 9월 3일 출원), 독일 특허 출원 제19942079.3호 (1999년 9월 3일 출원), 및 독일 특허 출원 제19942088.2호 (1999년 9월 3일 출원)을 우선권으로 주장한다. 상기 모든 출원의 전체 내용은 본원의 참고 문헌에 명백히 포함된다.

세포에서 자연발생적으로 일어나는 대사 과정의 일부 산물 및 부산물은 식품, 사료, 화장품 및 제약 산업을 비롯한 다양한 산업 분야에 사용된다. 총체적으로 "정밀 화학물질"로 불리는 이들 분자로는 유기산, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 및 효소가 있다. 이들의 생성은 원하는 특정 분자를 대량으로 생산하고 분비하도록 개발된 박테리아의 대규모 배양을 통해 가장 편리하게 수행된다. 이러한 목적에 특히 유용한 생물체는 그람 양성의 비병원성 박테리아인 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 균주 선별을 통해, 일련의 바람직한 화합물을 생산하는 다수의 돌연변이 균주가 개발되어 있다. 그러나, 특정 분자의 생산을 위해 개량된 균주의 선별은 시간 소모적이고 어려운 과정이다.

<발명의 요약>

본 발명은 다양한 용도를 갖는 신규 박테리아 핵산 분자를 제공한다. 이들 은 정밀 화학물질의 생산에 사용될 수 있는 미생물의 확인; 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 관련 박테리아에서의 정밀 화학물질의 생산 조절; 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 관련 박테리아의 타이핑 또는 확인; 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈을 맵핑하기 위한 기준점 및 형질전환용 마커로서의 용도로 사용된다. 이들 신규 핵산 분자는 본원에서 막 구성 및 막 운반 (MCT) 단백질로 불리는 단백질을 코딩한다.

코리네박테리움 글루타미쿰은 다양한 정밀 화학물질의 대량 생산, 탄화수소의 분해 (예컨대, 광유 스필) 및 테르페노이드의 산화를 위해 공업적으로 통상 사용되는 그람 양성 호기성 박테리아이다. 따라서, 본 발명의 MCT 핵산 분자는 예를 들어, 발효 공정에 의해 정밀 화학물질을 생산하는 데 이용할 수 있는 미생물을 확인하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 MCT 핵산의 발현 조절 또는 본 발명의 MCT 핵산 분자의 서열 변이를 이용하여 미생물로부터 하나 이상의 정밀 화학물질을 생산하는 것을 조절할 수 있다 (예를 들어, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 종으로부터 하나 이상의 정밀 화학물질을 수득하거나 생산하는 것을 개선하기 위함).

본 발명의 MCT 핵산은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 그와 가까운 동족체일 수 있는 생물체를 확인하거나, 혼합된 미생물 집단에서 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 그와 가까운 동족체의 존재를 확인하는 데 사용할 수도 있다. 본 발명은 동일 또는 혼합 미생물 집단의 배양물 중의 추출 게놈 DNA를 엄격한 조건 하에 코리네박테리움 글루타미쿰에 고유한 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 영역에 걸친 프로브를 사용하여 탐침함으로써 상기 생물체의 존재를 확인할 수 있는 다수의 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 핵산 서열을 제공한다. 비록 코리네박테리움 글루타미쿰 자체가 병원성이 아닐지라도, 코리네박테리움 디프테리아 (디프테리아의 병원체)와 같은, 인간에게 병원성인 종과 관련되어 있고, 이러한 생물체의 검출은 임상적으로 상당히 중요하다.

본 발명의 MCT 핵산 분자는 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 또는 관련 생물체의 게놈을 맵핑하기 위한 기준점으로도 사용할 수 있다. 유사하게, 이들 분자, 그의 변이체 또는 일부는 유전공학적으로 조작된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 종을 위한 마커로 사용할 수 있다.

본 발명의 신규 핵산 분자에 의해 코딩되는 MCT 단백질은 예를 들어, 막 생합성에 필요한 화합물의 대사 (예를 들어, 생합성 또는 분해)에 관련된 기능을 수행하거나, 세포내로 또는 세포로부터 1종 이상의 화합물의 막횡단 운반을 보조할 수 있다. 미국 특허 제4,649,119호 (Sinskey et al.)에 개시된 클로닝 벡터와 같은 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 클로닝 벡터, 및 코리네박테리움글루타미쿰 및 관련된 브레비박테리움 종(예컨대, 락토페르멘툼)의 유전 조작 기술 (Yoshihama et al, J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984); and Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 22372246 (1984))을 이용하여, 본 발명의 핵산 분자를 이 생물체가 하나 이상의 정밀 화학물질의 보다 효율적인 생산자가 되도록 상기 생물체의 유전공학적 조작에 사용할 수 있다. 본 발명의 유전자 조작은 정밀 화학물질의 생산 또는 생산 효율에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 MCT 단백질의 변형에 의해 상기 변형된 단백질을 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 정밀 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율에 직접적으로 영향을 줄 수 있는 여러 기작이 있다. 세포로부터의 정밀 화학물질 분자의 배출에 관여하는 이러한 MCT 단백질을, 이러한 화합물이 보다 쉽게 회수되는 세포외 매질로 더 많은 양이 분비되도록, 그의 수 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 1종 이상의 정밀 화학물질의 생합성에 필요한 영양분(예를 들어, 포스페이트, 술페이트, 질소 화합물 등)의 유입에 관여하는 MCT 단백질을, 이러한 전구체, 보조인자 또는 중간체 화합물의 세포내 농도가 증가되도록, 그의 수 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 지방산 및 지질 자체는 바람직한 정밀 화학물질이며, 이러한 화합물의 생합성에 관여하는 1종 이상의 본 발명의 MCT 단백질의 활성을 최적화하거나 또는 그의 수를 증가시킴으로써, 또는 이러한 화합물의 분해에 관여하는 1종 이상의 MCT 단백질의 활성을 손상시킴으로써, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 지방산 및 지질 분자의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 증가시킬수 있다.

또한, 본 발명의 하나 이상의 MCT 유전자에 돌연변이를 유발시켜 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 1종 이상의 목적하는 정밀 화학물질을 생산하는데 간접적으로 영향을 주는, 활성이 변화된 MCT 단백질을 제조할 수 있다. 예를 들어, 폐 생성물의 배출에 관여하는 본 발명의 MCT 단백질을, 세포의 정상적인 대사성 폐기물(목적하는 정밀 화학물질의 과다생산으로 인해 양이 증가될 수 있음)이 세포내에서 뉴클레오티드 및 단백질을 손상시키거나(세포의 생존율이 감소됨) 또는 정밀 화학물질 생합성 경로를 방해하기(목적하는 정밀 화학물질의 수율, 생산 또는 생산 효율이 저하됨) 전에 효과적으로 배출되도록, 그의 수 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 세포내에서 비교적 다량인 정밀 화학물질은 그 자체로도 세포에 독성을 띨 수 있어서, 세로로부터 이 화합물을 배출시킬 수 있는 운반자의 활성 또는 수를 증가시킴으로써, 배양물내 세포의 생존율을 증가시킬 수 있고, 다시 말하면, 배양물내에서 목적하는 정밀 화학물질을 생산하는 세포수를 더 증가시킬 수 있다. 적절한 양의 다른 지질 및 지방산 분자가 생산되도록 본 발명의 MCT 단백질을 조작할 수도 있다. 이는 세포막의 지질 조성에 중요한 영향을 줄 수 있다. 각 지질 타입은 다른 물리적 특성을 가지기 때문에, 막의 지질 조성에 있어서의 변화는 막의 유동성을 상당히 변화시킬 수 있다. 막 유동성에서의 변화는 막을 통한 분자의 운반뿐 아니라 세포의 일체성에 영향을 줄 수 있으며, 이들 모두는 대규모 발효 배양에서 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 정밀 화학물질의 생산에 상당한 영항을 준다.

본 발명은 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있는, 본원에서 MCT 단백질로 언급되는 단백질을 코딩하는 신규 핵산 분자를 제공한다. MCT 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 본원에서 MCT 핵산 분자로 언급된다. 바람직한 실시양태에서, MCT 단백질은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여한다. 이러한 단백질의 예로는 하기 표 1의 유전자 세트에 의해 코딩되는 것들이 포함된다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 MCT 단백질 또는 그의 생물학적 활성 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 (예를 들어, cDNA, DNA 또는 RNA) 뿐만 아니라 MCT 코딩 핵산 (예를 들어, DNA 또는 mRNA)의 검출 또는 증폭을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 적합한 핵산 단편에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 목록에 있는 홀수 번호 서열로 기재된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7....) 중 하나, 또는 이들 뉴클레오티드 서열 중 하나의 코딩 영역 또는 그의 상보체를 포함한다. 특히 바람직한 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 목록에 있는 홀수 번호 서열 (예를 들어, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7....)로 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부와 혼성화하거나, 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 목록 중의 짝수 번호 서열 (예를 들어, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8....)로 기재된 아미노산 서열 중 하나를 코딩한다. 본 발명의 바람직한 MCT 단백질은 본원에 기재된 MCT 활성 중 적어도 하나를 갖는 것도 바람직하다.

다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는데, 여기서 상기 단백질 또는 그의 일부는 본 발명의 아미노산 서열과 충분한 상동성이 있는 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 목록 중의 짝수 번호 서열을 갖는 서열), 예를 들어, 상기 단백질 또는 그의 일부가 MCT 활성을 유지할 수 있을 만큼 본 발명의 아미노산 서열과 충분한 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질 또는 그의 일부는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 유지한다. 한 실시양태에서, 상기 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질은 본 발명의 아미노산 서열 (예컨대, 서열 목록 중의 짝수 번호 서열을 갖는 서열로부터 선택된 전체 아미노산 서열)과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상, 또는 그 이상의 상동성이 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 단백질은 본 발명의 전체 아미노산 서열 (서열 목록 중의 상응하는 홀수 번호 서열 (예를 들어, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7....)에 나타낸 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩됨)과 실질적으로 상동성이 있는 전장의 코리네박테리움 글루타미쿰 단백질이다.

다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래하고, 본 발명의 아미노산 서열 중 하나 (예를 들어, 서열 목록 중의 짝수 번호 서열 중 하나의 서열)와 약 50% 이상 또는 그 이상의 상동성이 있으며 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있거나, 표 1에 기재된 활성 중 하나 이상을 갖는 생물학적 활성 도메인을 포함하며, 이종 폴리펩티드 또는 조절 영역을 코딩하는 이종 핵산 서열도 포함하는 단백질 (예를 들어, MCT 융합 단백질)을 코딩한다.

다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 그 길이가 15개의 뉴클레오티드 이상이고 본 발명의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열 목록 중의 홀수 번호 서열)을 포함하는 핵산 분자와 엄격한 조건 하에 혼성화한다. 바람직하게는, 단리된 핵산 분자는 자연 발생 핵산 분자에 상응한다. 보다 바람직하게는, 단리된 핵산은 코리네박테리움 글루타미쿰의 MCT 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위를 코딩한다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예를 들어, 재조합 벡터, 및 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하여 MCT 단백질을 생산하는 데 사용한다. 이어서, MCT 단백질을 배지 또는 숙주 세포로부터 단리할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 MCT 유전자가 도입되거나 변이된 유전 변이 미생물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 미생물의 게놈은 야생형 또는 돌연변이 MCT 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 트랜스진으로서 도입하여 변이시킨다. 다른 실시양태에서, 미생물의 게놈 내의 내인성 MCT 유전자는 변이된 MCT 유전자와의 상동 재조합에 의해 변이되고, 예를 들어, 기능적으로 파괴 (disrupt)된다. 다른 실시양태에서, 미생물 내의 내인성 또는 도입 MCT 유전자는 하나 이상의 점 돌연변이, 결실 또는 역위에 의해 변이되었지만, 여전히 기능성 MCT 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 미생물에 있는 MCT 유전자의 하나 이상의 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 억제자 (repressor) 또는 인듀서 (inducer))을 (예를 들어, 결실, 말단의 절단 (truncation), 역위 또는 점 돌연변이에 의해) 변이시켜 MCT 유전자의 발현을 조절한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속, 특히 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰에 속한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 아미노산, 특히 바람직하게는 라이신과 같은 원하는 화합물의 생산에도 사용된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 한 대상체에서 코리네박테리움 디프테리아의 존재 또는 활성을 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 한 대상체에서 본 발명의 하나 이상의 핵산 또는 아미노산 서열을 검출하는 것을 포함하므로 (예컨대, 서열 1 내지 676으로서 서열 목록에 기재된 서열), 상기 대상체에서 코리네박테리움 디프테리아의 존재 또는 활성을 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 단리된 MCT 단백질 또는 그의 일부, 예를 들어, 그의 생물학적 활성 부위에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 MCT 단백질 또는 그의 일부는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 당과 같은 탄소 화합물의 대사 또는 산화적 인산화와 같은 과정에 의한 에너지 분자 (예, ATP)의 생산과 관련된기능을 수행할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 MCT 단백질 또는 그의 일부가 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 유지하도록 이 MCT 단백질 또는 그의 일부는 본 발명의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 목록에서 짝수 서열 번호의 서열)에 대해 충분히 상동성이 있다.

본 발명은 MCT 단백질의 단리된 제제를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, MCT 단백질은 본 발명의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 목록 중의 짝수 번호 서열)을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 전체 아미노산 서열 (서열 목록 중의 짝수 번호 서열)과 실질적으로 상동성이 있는 단리된 전장 단백질 (서열 목록 중의 상응하는 홀수 번호 서열에 기재된 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩됨)에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단백질은 본 발명의 전체 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 목록 중의 짝수 번호 서열)과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상, 또는 그 이상의 상동성이 있다. 다른 실시양태에서, 단리된 MCT 단백질은 본 발명의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 목록 중의 짝수 번호 서열) 중 하나와 약 50% 이상 또는 그 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함하고, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있거나, 표 1에 기재된 하나 이상의 활성을 갖는다.

별법으로, 단리된 MCT 단백질은 서열 목록에 기재된 짝수 번호 서열 중 하나의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하거나, 예를 들어, 엄격한 조건 하에서 혼성화하거나, 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상, 또는 그 이상의 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, MCT 단백질의 바람직한 형태가 본원에 기재된 하나 이상의 MCT 생물활성을 갖는 것이 바람직하다.

MCT 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 부위를 MCT 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드와 작동가능하게 결합하여 융합 단백질을 형성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이 융합 단백질의 활성은 MCT 단백질만의 활성과 다르다. 바람직한 실시양태에서, 이 융합 단백질은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이 융합 단백질을 숙주 세포에 도입시켜 숙주 세포로부터 원하는 화합물의 생산을 조절한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 MCT 단백질 자체, 이 MCT 단백질의 기질 또는 결합 파트너와 상호작용시키거나 본 발명의 MCT 핵산 분자의 전사 또는 번역을 조절함으로써 MCT 단백질의 활성을 조절하는 분자를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 정밀 화학물질의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 MCT 핵산 분자를 발현하는 벡터를 포함하는 세포를 배양하여 정밀 화학물질을 생산하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 MCT핵산을 발현하는 벡터로 세포를 형질감염시켜 상기 벡터를 함유하는 세포를 수득하는 단계도 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 배양물로부터 정밀 화학물질을 회수하는 단계도 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속으로부터 유래하거나 표 3에 기재된 균주로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면은 미생물로부터 분자가 생산을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 MCT 단백질 활성 또는 MCT 핵산 발현을 조절하는 물질과 세포를 접촉시켜 세포 관련 활성이 상기 물질의 부재 하의 상기 활성에 대해 상대적으로 변화시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포막 성분에 대한 하나 이상의 대사 경로 또는 이 막을 통한 화합물의 운반에 대하여 세포를 조절하여, 이 미생물에 의한 목적하는 정밀 화학물질의 수율 또는 생성율을 향상시킨다. MCT 단백질 활성을 조절하는 물질은 MCT 단백질 활성 또는 MCT 핵산 발현을 자극하는 물질일 수 있다. MCT 단백질 활성 또는 MCT 핵산 발현을 자극하는 물질의 예로는 소분자, 활성 MCT 단백질, 및 세포에 도입된 MCT 단백질을 코딩하는 핵산이 있다. MCT 활성 또는 발현을 억제하는 물질의 예로는 소분자 및 안티센스 MCT 핵산 분자가 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 별개의 플라스미드 상에 유지되어 있거나 숙주 세포의 게놈 내로 도입되어 있도록 야생형 또는 돌연변이 MCT 유전자를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 세포로부터 목적하는 화합물의 수율을 조절하는 방법에 관한 것이다. 게놈 내로 삽입되면 (이러한 삽입은 무작위적일 수 있거나 천연 유전자가도입된 카피로 대체되도록 하는 상동 재조합에 의해 일어날 수 있음) 세포로부터 목적하는 화합물의 생산이 조절된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 수율은 증가한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 화학물질은 정밀 화학물질이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 정밀 화학물질은 아미노산이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 아미노산은 L-라이신이다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막 성분의 대사 또는 이 막을 통한 화합물의 운반에 관여하는 MCT 핵산 및 단백질 분자를 제공한다. 본 발명의 분자는 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물로부터 정밀 화학물질의 생산을 직접적으로 조절하는 데 사용할 수 있거나 (예를 들어, 지방산 생합성 단백질의 과다 발현 또는 최적화가 변형된 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 지방산의 수율, 생산, 및(또는) 생산 효율에 직접적으로 영향을 주는 경우), 또는 목적하는 화합물의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율의 증가에 간접적으로 영향을 줄 수 있다 (예를 들어, 세포막 성분의 대사 조절은 수율, 생산 및(또는) 생산 효율, 또는 세포막의 조성을 변화시켜, 즉 1종 이상의 정밀 화학물질의 생산에 영향을 줄 수 있는 경우). 본 발명의 측면은 아래에 더 자세히 기재되어 있다.

I. 정밀 화학물질

용어 "정밀 화학물질"은 당업계에 잘 인지되어 있고, 제약, 농업 및 화장품 산업과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 산업에 이용되는 생물체에 의해 생산되는 분자를 포함한다. 이러한 화합물로는 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산과 같은 유기산, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드 [예를 들어, 문헌 (Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim)에 기재되어 있고 이들의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예컨대, 아라키돈산), 디올 (예를 들어, 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들어, 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들어,방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 [문헌 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27,"Vitamins", p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim) 및 그에 포함된 참고문헌; 및 문헌(Ong, A. S., Niki, E. & Packer, L. (1995)"Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research Asia, held Sept. 1-3,1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)에 기재되어 있음], 효소, 폴리펩티드 (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68), 및 문헌 (Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086) 및 그 내의 참고문헌에 기재된 다른 모든 화학물질이 있다. 이들 정밀 화학물질 중 일부의 대사 및 용도는 아래에 더 자세히 기재될 것이다.

A. 아미노산 대사 및 용도

아미노산은 모든 단백질의 기본 구조 단위를 구성하므로 모든 생물체에서 정상적인 세포 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 인지되어 있다. 아미노산 중 단백질원성 아미노산은 20 종이고 이들이 펩티드 결합에 의해 결합되어 있는 단백질에 대한 구조 단위로 작용하는 반면, 비단백질원성 아미노산 (수백 종이 공지되어 있음) 정상적으로는 단백질에서 발견되지 않는다 [문헌 Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)을 참조함]. 비록 L-아미노산이 일반적으로 천연 발생 단백질에서 발견되는 유일한 형태일지라도 아미노산은 D-광학 또는 L-광학 구조일 수 있다. 20종의 단백질원성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로의 특징은 원핵세포 및 진핵세포 둘다에서 잘 규명되어 있다 [예를 들어, 문헌 (Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pages 578-590 (1988))을 참조함]. 생합성의 복잡성으로 인한 일반적인 영양 요구물이기 때문에 "필수" 아미노산이라고 불리는 아미노산 (히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린)은 단순한 생합성 경로에 의해 나머지 11종의 "비필수" 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신)으로 쉽게 전환된다. 고등동물은 필수 아미노산 중 일부를 합성하는 능력을 보유하지만, 상기 필수 아미노산은 식사로부터 공급되어야 정상적인 단백질 합성이 일어난다.

단백질 생합성에서의 아미노산의 기능 이외에, 이들 아미노산은 그 자체가 흥미로운 화학물질이고, 다수의 아미노산이 식품, 사료, 화학물질, 화장품, 농업 및 제약 산업에 다양하게 사용될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 라이신은 인간 뿐만 아니라 가금 및 돼지와 같은 단위동물의 영양에 있어서도 중요한 아미노산이다.글루타메이트는 향미제 첨가물 (모노-소듐 글루타메이트, MSG)로서 가장 흔히 사용되고, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시트테인도 식품 산업 전반에 걸쳐 광범위하게 사용된다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약 산업에 사용된다. 글루타민, 발린, 류신, 이소류신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 및 화장품 산업 둘다에 사용된다. 트레오닌, 트립토판 및 D/L-메티오닌은 통상적인 사료 첨가제이다 (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids technical production and use, p. 466-502 in Rehm et al. (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim). 또한, 이들 아미노산은 합성 아미노산 및 단백질, 예컨대, N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판, 및 문헌 (Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97, VCH: Weinheim, 1985)에 기재된 다른 것의 합성을 위한 전구체로 유용하다는 것이 밝혀져 있다.

이들 천연 아미노산을 생산할 수 있는 생물체, 예컨대, 박테리아에서의 이들 천연 아미노산의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 [박테리아 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 자세한 것은 문헌 (Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606)을 참조함]. 글루타메이트는 시트르산 사이클의 중간체인 α-케토글루타레이트의 환원 아미노화에 의해 합성된다. 그 다음에 글루타민, 프롤린 및 아르기닌 각각이 글루타메이트로부터 생성된다. 세린의 생합성은 3-포스포글리세레이트 (해당작용의 중간체)로 시작되며, 산화, 트랜스아미노화 및 가수분해 단계 후 세린을 생성하는 3 단계 과정이다. 시스테인 및 글리신 둘다 세린으로부터 생성되는데, 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합에 의해 생성되며, 글리신은 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에서 측쇄 β-탄소 원자가 테트라히드로폴레이트로 전달되어 생성된다. 페닐알라닌 및 티로신은 프레페네이트의 합성 후 최종 두 단계에서만 다른 9 단계 생합성 경로에서 해당작용 및 펜토스 포스페이트 경로 전구체인 에리쓰로스 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 트립토판도 이들 두 초기 분자로부터 합성되지만, 그의 합성은 11 단계 경로이다. 티로신은 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 합성될 수도 있다. 알라닌, 발린 및 류신은 해당작용의 최종 생성물인 피루베이트의 모든 생합성 산물이다. 아스파르테이트는 시트르산 사이클의 중간체인 옥살로아세테이트로부터 형성된다. 아스파라진, 메티오닌, 트레오닌 및 라이신 각각은 아스파르테이트의 전환에 의해 생성된다. 이소류신은 트레오닌으로부터 형성된다. 복잡한 9 단계 경로에서 활성화된 당인 5-포스포리보실-1-피로포스페이트로부터 히스티딘이 생성된다.

세포의 단백질 합성 필요량을 초과하는 아미노산은 저장될 수 없고, 그 대신에 분해되어 세포의 주요 대사 경로에 대한 중간체로 제공된다 [자세한 것은 문헌 (Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle" p. 495-516 (1988))을 참조함]. 세포가 불필요한 아미노산을 유용한 대사 중간체로 전환시킬 수 있다 하더라도, 아미노산 생성은 에너지, 전구체 분자, 및 이들 아미노산을 합성하는 데 필요한 효소를 고려할 때 손실이 큰 합성이다. 따라서, 특정한 아미노산의 존재가 그 자신의 생성을 서서히 또는 완전히 중지시키는피드백 억제에 의해 아미노산의 생합성이 조절된다는 것은 놀라운 일이 아니다 [아미노산 생합성 경로의 피드백 기작에 대한 전체적인 내용은 문헌 (Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 24 "Biosynthesis of Amino Acids and Heme" p. 575-600 (1988))을 참조함]. 따라서, 임의의 특정 아미노산의 산출량은 세포에 존재하는 아미노산의 양에 의해 제한된다.

B. 비타민, 보조인자 및 영양제의 대사 및 용도

비타민, 보조인자 및 영양제는 박테리아와 같은 다른 생물체에 의해 쉽게 합성된다 하더라도 고등동물이 합성 능력을 상실하여 섭취해야 하는 분자의 또 다른 군을 구성한다. 이들 분자는 그 자체가 생활성 물질이거나, 다양한 대사 경로에서 전자 캐리어 또는 중간체로 작용할 수 있는 생물학적 활성 물질의 전구체이다. 이들의 영양 가치 이외에, 이들 화합물은 색소, 항산화제 및 촉매로서, 또는 다른 과정의 보조제로서 상당한 산업적 가치를 갖는다 (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업적인 용도에 대한 것은 예컨대, 문헌 (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996)을 참조함]. 용어 "비타민"은 당업계에 인지되어 있고, 생물의 정상적인 기능을 위해서는 필요하지만 생물이 스스로 합성할 수 없는 영양분을 포함한다. 비타민 군은 보조인자 및 영양제 화합물도 포함할 수 있다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소 활성이 일어나는 데 필요한 비단백질원성 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 유기성 또는 무기성일 수 있고, 본 발명의 보조인자 분자는 유기성인 것이 바람직하다. 용어 "영양제"는 식물 및 동물, 특히 인간에게 건강상 유익한 식이성 보충물을 포함한다.이러한 분자의 예로는 비타민, 항산화제 및 일부 지질 (예를 들어, 다불포화 지방산)이 있다.

이들을 생성할 수 있는 생물체, 예컨대, 박테리아에서 일어나는 이들 분자의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease "Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S).

티아민 (비타민 B₁)은 피리미딘과 티아졸 잔기의 화학적 커플링에 의해 생성된다. 리보플라빈 (비타민 B₂)는 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP) 및 리보스-5'-포스페이트로부터 합성된다. 그 다음, 리보플라빈은 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMN) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)의 합성에 사용된다. 총칭하여 "비타민 B₆"로 불리는 화합물 족 (예를 들어, 피리독신, 피리독사민, 피리독사-5'-포스페이트 및 시판되는 피리독신 히드로클로라이드)은 모두 통상적인 구조 단위인 5-히드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트 (판토텐산, (R)-(+)-N-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)은 화학적인 합성 또는 발효에 의해생성될 수 있다. 판토테네이트의 생합성의 최종 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-유도 축합으로 구성된다. 판토산으로 전환하는 생합성 단계, β-알라닌으로 전환하는 생합성 단계 및 판토텐산으로의 축합에 관여하는 효소는 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사 활성 형태는 보조효소 A인데, 이 보조효소 A를 위한 생합성은 5 단계 효소 반응으로 진행된다. 판토테네이트, 피리독살-5'-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 보조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토테네이트의 형성을 촉매할 뿐만 아니라 (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀 (프로비타민 B₅), 판테테인 (및 그의 유도체) 및 보조효소 A의 생성도 촉매한다.

미생물에서 전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터 바이오틴이 생합성되는 것은 자세히 연구되어 있고 관련된 여러가지 유전자가 확인되어 있다. 상응하는 다수의 단백질이 Fe-클러스터 합성에도 관여하는 것으로 밝혀져 있고 이들 단백질은 nifS 클래스 단백질의 구성원이다. 리포산은 옥타노산으로부터 유도되고, 에너지 대사에서 보조효소로 작용하는데, 상기 리포산은 에너지 대사에서 피루베이트 데히드로게나제 결합체 및 α-케토글루타레이트 데히드로게나제 결합체의 일부가 된다. 폴레이트는 모두 폴산의 유도체 물질의 군이고, 폴산은 L-글루탐산, p-아미노-벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유도된다. 대사 중간체인 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP), L-글루탐산 및 p-아미노-벤조산으로부터 출발하는, 폴산 및 그의 유도체의 생합성은 일부 미생물에서 상세히 연구되어 있다.

코리노이드 (예컨대, 코발라민 및 특히 비타민 B₁₂) 및 포피린은 테트라피롤고리계에 의해 특징지워지는 화학물질의 군에 속한다. 비타민 B₁₂의 생합성은 그 특징이 완전히 규명되어 있지는 않지만 다수의 효소 및 기질이 현재 공지되어 있다는 점에서 충분히 복잡하다. 니코틴산 (니코티네이트) 및 니코틴아미드는 "니아신"으로도 불리는 피리딘 유도체이다. 니아신은 중요한 보조효소인 NAD (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드), NADP (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트) 및 그들의 환원형의 전구체이다.

이들 화합물의 대량 생산은 비록 이들 화학물질 중 일부, 예를 들어, 리보플라빈, 비타민 B₆, 판토테네이트 및 바이오틴이 미생물의 대량 배양에 의해서도 생산된다 하더라도 세포-유리 화학 합성에 주로 의존한다. 비타민 B₁₂만이 발효에 의해 전적으로 생성되는데, 이는 비타민 B₁₂의 합성의 복잡성 때문이다. 시험관내 방법론은 재료 및 시간, 종종 많은 비용의 상당한 투입을 요구한다.

C. 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 대사 및 용도

퓨린 및 피리미딘 대사 유전자 및 이들의 상응하는 단백질은 종양 질환 및 바이러스 감염의 치료에 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 보조효소 및 뉴클레오티드의 구성 성분인 질소 함유 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 질소 함유 염기, 오탄당 (RNA의 경우, 상기 당은 리보스이고; DNA의 경우, 상기 당은 D-데옥시리보스임) 및 인산으로 구성된, 핵산 분자의 기본 구조 단위를 포함한다. 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드의 전구체로 작용하지만 뉴클레오티드가 갖는 인산 잔기가 없는 분자를 포함한다. 이들 분자의 생합성을 억제하거나 핵산 분자를 형성하기 위한 이들 분자의 동원을 억제함으로써, RNA 및 DNA 합성을 억제하는 것이 가능하고; 암세포에 표적화시키는 방식으로 상기 활성을 억제함으로써 종양 세포의 분열 및 복제 능력을 억제할 수 있다. 또한, 핵산 분자를 형성하기 보다는 에너지 저장물(즉, AMP) 또는 보조효소 (즉, FAD 및 NAD)로 작용하는 뉴클레오티드도 있다.

이들 화학물질이 퓨린 및(또는) 피리미딘 대사에 영향을 줌으로써 상기 의학적 증상에 사용될 수 있다는 것은 여러 가지 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, Christopherson, R. I. and Lyons, S. D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents. "Med. Res. Reviews 10: 505-548). 퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 효소의 연구는 예를 들어, 면역억제제 또는 항증식제로 사용할 수 있는 신약의 개발에 초점을 두고 있다 (Smith, J. L., (1995) "Enzymes in nucleotide synthesis." Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23: 877-902). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 여러 가지 정밀 화학물질 (예를 들어, 티아민, S-아데노실-메티오닌, 폴레이트 또는 리보플라빈)의 생합성에 있어서 중간체로서의 용도, 세포를 위한 에너지 캐리어 (예를 들어, ATP 또는 GTP)로서의 용도, 및 통상적으로 향 상승제 (예를 들어, IMP 또는 GMP)로 사용되는 화학물질 자체를 위한 용도 또는 여러 가지 의학 용도를 갖는다 [예를 들어, 문헌 (, Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, p. 561612)을 참조함]. 또한, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 효소를 표적으로 사용하여 살진균제, 제초제 및 살충제를 비롯한, 농작물 보호용 화학물질을 개발하는 연구가 증가하고 있다.

박테리아에 있어서 이들 화합물의 대사의 특징은 규명되어 있다 (예를 들어, 자세한 내용은 문헌 (Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992)" de novo purine nucleotide biosynthesis", in: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press:, p. 259-287; and Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides", Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York)을 참조함). 퓨린의 대사는 집중적인 연구의 대상이고, 세포의 정상적인 기능에 필수적이다. 고등 동물의 손상된 퓨린 대사는 통풍과 같은 심각한 질환을 초래할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP) 또는 아데노신-5'-모노포스페이트 (AMP)를 생성시키는 중간체 화합물인 이노신-5'-포스페이트 (IMP)를 통해 일련의 단계에서 리보스-5-포스페이트로부터 합성되고, 이들 GMP 또는 AMP로부터 뉴클레오티드로 사용되는 트리포스페이트가 용이하게 형성된다. 이들 화합물은 에너지 저장물로도 사용되므로, 이들의 분해는 세포에서 다수의 다양한 생합성 과정을 위한 에너지를 공급한다. 피리미딘 생합성은 리보스-5-포스페이트로부터의 유리딘-5'-모노포스페이트 (UMP)의 형성에 의해 진행된다. 그 다음, UMP가 시티딘-5'-트리포스페이트 (CTP)로 전환된다. 이들 모든 뉴클레오티드의 디옥시 형태는 뉴클레오티드의 디포스페이트 리보스 형태가 뉴클레오티드의 디포스페이트 데옥시리보스 형태로 전환되는 1 단계 환원 반응에서 생성된다. 인산화시, 이들 분자는 DNA 합성에 관여할 수 있다.

D. 트레할로스의 대사 및 용도

트레할로스는 α,α-1,1 결합에 의해 결합된 두 가지 당 분자로 구성된다. 트레할로스는 감미료, 건조 또는 동결 식품용 첨가제로서 식품 산업, 및 음료 산업에 통상적으로 사용된다. 그러나, 제약, 화장품 및 생물공학 산업에도 사용된다 [예를 들어, 문헌 (Nishimoto et al., (1998) 미국 특허 제5,759,610호; Singer, M. A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460467; Paiva, C. L. A. and Panek, A. D. (1996) Biotech. Ann. Rev. 2: 293-314; and Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172: 97-10)을 참조함]. 트레할로스는 다수의 미생물로부터 효소에 의해 생성되고 주위 배지내로 자연적으로 방출되는데, 트레할로스는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 상기 배지로부터 수득할 수 있다.

II. 막 생합성 및 막횡단 운반

세포막은 세포에서 다양한 기능을 수행한다. 첫째, 세포막은 세포 함유물을 주변 환경으로부터 분리시키며, 따라서 세포에 일체성을 부여한다. 막은 또한 위험성이거나 또는 원치 않는 화합물의 유입뿐 아니라 목적하는 화합물의 유출에 대한 장벽으로 작용할 수도 있다. 세포막은 본래, 극성 헤드 기가 외부를 향하고 있고(각각 세포의 외부 및 내부를 향해) 비극성 테일이 이층의 중심으로 내부를 향하고 있어서 소수성 코어를 형성하는 그의 구조로 인해 단백질과 같은 소수성 화합물, 물 분자 및 이온의 비촉진성 확산에 대해 불투과성이다(일반적으로, 막 구조및 기능의 조사를 위해서는, 문헌(Gennis, R. B. (1989) Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg)을 참조한다). 이 장벽은 세포가 주변 매질내에 포함되어 있는 것보다 목적하는 화합물은 더 높은 농도로 유지하고 원치 않는 화합물은 상대적으로 더 낮은 농도로 유지할 수 있게 만드는데, 이는 이들 화합물의 확산이 막에 의해 효과적으로 차단되기 때문이다. 그러나, 막은 또한 목적 화합물의 유입 및 폐 분자의 배출에 대한 효과적인 장벽으로도 존재한다. 이러한 곤란함을 극복하기 위해, 세포막은 막을 여러 종류의 화합물의 막횡단 운반을 촉진시킬 수 있는 많은 종류의 운반체 단백질을 포함하고 있다. 이러한 운반 단백질로는 포어 또는 채널 및 운반체의 두가지 일반적인 종류가 있다. 포어 또는 채널은 전체 막 단배질, 때로는 단백질 복합체로서, 막을 통하여 조절성 구멍을 형성한다. 이러한 조절 또는 '게이팅'은 일반적으로 포어 또는 채널에 의해 운반될 분자에 대해 특이적(이 막횡단 구조물은 특정 종류의 기질에 대해 선택적으로 투과성이 됨)이며, 예를 들어, 칼륨 채널은 유사한 전하 및 크기를 갖는 이온 만이 통과할 수 있도록 구성된다. 채널 및 포어 단백질은, 이 단백질의 소수성 면이 막의 내부와 결합하는 반면 친수성 면은 채널의 내부에 늘어서 있음으로 인해 선택된 친수성 분자가 통과할 수 있는 보호된 친수성 환경을 제공하도록, 분리된 소수성 및 친수성 도메인을 갖는 경향이 있다. 칼륨, 칼슘, 나트륨 및 클로라이드 이온에 대한 것을 비롯하여 이러한 많은 포어/채널이 당업계에 공지되어 있다.

촉진성 확산에 대한 상기의 포어 및 채널-매개 시스템은 이온과 같은 매우 작은 분자에 한정되는데, 이는 촉진성 확산에 의해 전체 단백질을 통과시키기에 충분한 크기의 포어 또는 채널이 더 작은 친수성 분자의 통과를 막을 수는 없기 때문이다. 이러한 과정에 의한 분자의 운반은 농도 구배의 동력이 필요하기 때문에 '촉진성 확산'이라고 때때로 표현한다. 투과효소는 또한, 글루코스 또는 기타 당의 농도가 세포의 한 측면에서 다른 측면보다 더 큰 경우, 세포내로 이들과 같은 더 큰 분자의 촉진성 확산(또한 '유니포트(uniport)'라고도 함)을 허용한다. 포어 또는 채널과는 대조적으로, 이러한 전체 막 단백질 (종종 막횡단 α-나선을 6 내지 14개 가짐)은 막을 통해 열린 채널을 형성하기보다는 막의 표면에서 표적 분자와 결합하고, 이어서 표적 분자가 막의 반대 측면으로 방출되도록 형태적 변화를 수행한다.

그러나, 세포는 흔히 촉진성 확산이 일어날 수 없는 상황에서 존재하는 농도 구배에 거슬러 분자의 유입 또는 유출('능동 수송')시켜야 할 필요가 있다. 이러한 막 운반에 대하여 세포에 의해 이용되는 두가지 일반적인 메카니즘, 즉 심포트 또는 안티포트, 및 ABC 운반체에 의해 매개되는 것과 같은 에너지-연계성 운반이 있다. 심포트 및 안티포트 시스템은 막을 가로질러 두가지 다른 분자의 이동을 연결시키는데(두가지 다른 분자에 대한 두가지 별도의 결합 부위를 갖는 투과효소를 통해); 심포트에서는, 두 분자가 같은 방향으로 운반되지만, 안티포트에서는 한 분자는 유입되고 다른 분자는 유출된다. 에너지면에서, 이러한 운반은 두 분자 중 하나가 농도 구배에 따라 이동하기 때문에 가능한 것이며, 에너지면에서 유리한 이 작용은 우세한 농도 구배에 거슬러 목적하는 화합물을 동시에 이동시키는 경우에만 허용된다. 단일 분자는 ABC 운반체에 의해 이용되는 것과 같은 에너지-추진 과정에서 농도 구배에 거슬러 막을 통해 운반될 수 있다. 이 시스템에서, 막에 위치하는 운반 단백질은 ATP-결합 카세트를 갖는데, 표적 분자가 결합하게 되면, ATP는 ADP + Pi로 전환되고, 그로 인해 방출된 에너지가 이용됨으로써 운반체에 의해 촉진되는 막의 반대 측면으로의 표적 분자의 이동을 추진시킨다. 이러한 운반 시스템 모두에 대한 보다 상세한 설명으로는 문헌[Bamberg, E. et al., (1993)"Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes", Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Findlay, J. B. C. (1991)"Structure and function in membrane transport systems", Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 804-810; Higgins, C. F. (1992)"ABC transporters from microorganisms to man", Ann. Rev. Cell Biol. 8: 67-113; Gennis, R. B. (1989)"Pores, Channels and Transporters", in: Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, p. 270-322; and Nikaido, H. and Saier, H. (1992) "Transport proteins in bacteria: common themes in their design", Science 258: 936-942] 및 이들 문헌 각각에 포함된 참고 문헌을 참조한다.

막의 합성은 많은 성분을 포함하는 잘 확립된 과정이며, 이들 성분 중 가장 중요한 것은 지질 분자이다. 지질 합성은 두 부분, 즉 지방산의 합성 및 지방산의 sn-글리세롤-3-포스페이트로의 부착, 및 극성 헤드 기의 부가 또는 변형으로 구분될 수 있다. 박테리아 막에서 이용되는 전형적인 지질로는 인지질, 당지질, 스핑고지질 및 포스포글리세라이드가 포함된다. 지방산 합성은 아세틸 CoA가 각각 아세틸 CoA 카르복실라제에 의해 말로닐 CoA로, 아세틸트랜스아실라제에 의해아세틸-ACP로 전환됨으로써 시작된다. 축합 반응에 이어서, 이들 두 생성물 분자는 함께 아세토아세틸-ACP를 형성하며, 이는 일련의 축합, 환원 및 탈수 반응에 의해 전환되어 목적하는 쇄 길이를 갖는 포화 지방산 분자를 생성한다. 이러한 분자로부터 불포화 지방산의 생성은 특정 불포화효소에 의해 산소 분자의 도움으로 호기적 또는 혐기적으로 촉진된다[지방산 합성에 대한 참고문헌으로는 문헌[F. C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D. C., p. 612-636 and references contained therein; Lengeler et al. (eds) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, and references contained therein; and Magnuson, K. et al., (1993) Microbiological Reviews 57: 522-542] 및 이들 문헌에 포함된 참고문헌을 참조한다]. 시클로프로판 지방산(CFA)은 기질로서 SAM을 사용하여 특정 CFA-신타제에 의해 합성된다. 분지쇄 지방산은 탈아민하되어 분지쇄 2-옥소-산을 생성하는 분지쇄 아미노산으로부터 합성된다[문헌[Lengeler et al., eds. (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York] 및 이 문헌에 포함된 참고문헌을 참조한다]. 지질 합성에서 다른 필수적인 단계는, 예를 들어, 글리세롤-포스페이트-아실트랜스퍼라제에 의한 극성 헤드 기 상으로의 지방산의 전이이다. 다양한 전구체 분자 및 생합성 효소를 병용하여 막의 조성에 큰 영향을 미치는 여러 지방산 분자를 생성한다.

III. 본 발명의 요소 및 방법

본 발명은, 부분적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막 형성을 조절하며 이 막을 통한 분자의 이동을 조절하는, 본원에서 MCT 핵산 및 단백질 분자로 언급되는 새로운 분자의 발견을 기초로 한다. 한 실시양태에서, MCT 분자는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 및 이 막을 통한 분자의 운반에 관여한다. 바람직한 실시양태에서, 막 성분의 생산 및 막 운반을 조절하는 본 발명의 MCT 분자의 활성은 이 생물에 의한 목적하는 정밀 화학물질의 생산에 영향을 준다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 MCT 단백질이 조절하는 코리네박테리움 글루타미쿰 대사 경로가 수율, 생산 및(또는) 생산 효율면에서 조절되고, 막을 통한 화합물의 운반 효율이 변경되어, 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 목적하는 정밀 화학물질 생산의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율이 직접적 또는 간접적으로 조절되도록 본 발명의 MCT 분자의 활성을 조절한다.

용어 "MCT 단백질" 또는 "MCT 폴리펩티드"에는 코리네박테리움 글루타미쿰 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사, 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 단백질이 포함된다. MCT 단백질의 예에는 표 1에 기재된 MCT 유전자 및 홀수 서열 번호의 서열에 의해 코딩되는 것들이 포함된다. 용어 "MCT 유전자" 또는 "MCT 핵산 서열"에는 코딩 영역 및 이에 대응하는 번역되지 않는 5' 및 3' 서열 영역으로 이루어진, MCT 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 포함된다. MCT 유전자의 예로는 표 1에 기재된 것들이 포함된다. 용어 "생산" 또는 "생산성"은 당업계에서 인식되는 용어이며, 소정의 시간 및 소정의 발효 용적내에서 형성되는 발효 생성물의 농도(예를 들어, 1시간에 1리터 당 kg 생성물)가 포함된다. 용어 "생산 효율"에는 특정 생성물 농도를 달성하는데 요구되는 시간(예를 들어, 세포가 특정 비율의 정밀 화학물질 생성물을 얻는데 걸리는 시간)이 포함된다. 용어 "수율" 또는 "생성물/탄소 수율"은 당업계에서 인식되는 용어이며, 탄소 공급원의 생성물(즉, 정밀 화학물질)로의 전환 효율이 포함된다. 이 용어는 일반적으로는, 예를 들어, 탄소 공급원 kg 당 생성물 kg으로 표기된다. 화합물의 수율 또는 생산율을 증대시킴으로써, 소정의 시간 동안 얻어지는 수득량의 배양물 중 이 화합물의 회수된 분자의 양 또는 유용한 분자의 양은 증가하게 된다. 용어 "생합성" 또는 "생합성 경로"는 당업계에서 인식되는 용어이고, 세포에 의한 중간체 화합물로부터의 화합물, 바람직하게는 유기 화합물의 합성을 포함하며, 다단계의 고도로 조절되는 과정일 수 있다. 용어 "분해" 또는 "분해 경로"는 당업계에서 인식되는 용어이고, 세포에 의한 화합물, 바람직하게는 유기 화합물의 분해 생성물(일반적으로 말해서, 더 작거나 덜 복잡한 구조의 분자)로의 분해를 포함하며, 다단계의 고도로 조절되는 과정일 수 있다. 이어서, 특정 화합물의 대사(예를 들어, 글리신 등의 아미노산의 대사)에는 이러한 화합물과 관련되는 세포의 전체 생합성, 변형, 및 분해 경로가 포함된다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 MCT 분자는 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물에서 정밀 화학물질 등의 목적하는 분자의 생산을 조절할 수 있다. 본 발명의 MCT 분자의 변형이 변형된 단백질을 혼입하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 정밀 화학물질 생산의 수율, 생산율 및(또는) 생산 효율에 직접 영향을 줄 수 있는 다수의 메카니즘이 있다. 세포로부터의 정밀 화학물질 분자의 배출에 관여하는 이러한 MCT 단백질을, 이러한 화합물이 보다 쉽게 회수되는 세포외 매질로 더 많은 양이 분비되도록, 그의 수 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 1종 이상의 정밀 화학물질(예를 들어, 포스페이트, 술페이트 질소 화합물 등)의 생합성에 필요한 영양분의 유입에 관여하는 MCT 단백질을, 이러한 전구체, 보조인자 또는 중간체 화합물의 세포내 농도가 증가되도록, 그의 수 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 지방산 및 지질 자체는 바람직한 정밀 화학물질이며, 이러한 화합물의 생합성에 관여하는 1종 이상의 본 발명의 MCT 단백질의 활성을 최적화하거나 또는 그의 수를 증가시킴으로써, 또는 이러한 화합물의 분해에 관여하는 1종 이상의 MCT 단백질의 활성을 손상시킴으로써, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 지방산 및 지질 분자의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 1종 이상의 MCT 유전자의 돌연변이유발에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 1종 이상의 목적하는 정밀 화학물질의 생산에 직접적으로 영향을 주는, 변화된 활성을 갖는 MCT 단백질을 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, 폐 생성물의 배출에 관여하는 본 발명의 MCT 단백질을, 세포의 정상적인 대사성 폐기물(목적하는 정밀 화학물질의 과다생산으로 인해 양이 증가될 수 있음)이 세포내에서 뉴클레오티드 및 단백질을 손상시키거나(세포의 생존율이 감소됨) 또는 정밀 화학물질 생합성 경로를 방해하기(목적하는 정밀 화학물질의 수율, 생산 또는 생산 효율이 저하됨) 전에 효과적으로 배출되도록, 그의 수 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 세포내에서 비교적 다량인 정밀 화학물질은 그 자체로도 세포에 독성을 띨 수 있어서, 세로로부터 이 화합물을 배출시킬 수 있는 운반자의 활성 또는 수를 증가시킴으로써, 배양물내 세포의 생존율을 증가시킬 수 있고, 다시 말하면, 배양물내에서 목적하는 정밀 화학물질을 생산하는 세포수를 더 증가시킬 수 있다. 적절한 양의 다른 지질 및 지방산 분자가 생산되도록 본 발명의 MCT 단백질을 조작할 수도 있다. 이는 세포막의 지질 조성에 중요한 영향을 줄 수 있다. 각 지질 타입은 다른 물리적 특성을 가지기 때문에, 막의 지질 조성에 있어서의 변화는 막의 유동성을 상당히 변화시킬 수 있다. 막 유동성에서의 변화는 막을 통한 분자의 운반성뿐 아니라 세포의 일체성에 영향을 줄 수 있으며, 이들 둘 다는 대규모 발효 배양에서 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 정밀 화학물질의 생산에 상당한 영항을 준다.

본 발명의 단리된 핵산 서열은 명칭이 ATCC13032로 부여된, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 분양받을 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 게놈내에 포함되어 있다. 단리된 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT DNA의 뉴클레오티드 서열 및 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT 단백질의 예상 아미노산 서열은 각각 서열 목록에 홀수 서열 번호 및 짝수 서열 번호로 나타나 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열을, 세포막 성분의 대사에 관여하는 단백질 또는 이 막을 통한 화합물의 운반에 관여하는 단백질을 코딩하는 서열로서 분류 및(또는) 확인하는 컴퓨터 분석을 수행하였다.

본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 목록의 짝수 서열 번호의 서열)과 실제적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 선택되는 아미노산 서열과 실제적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질은 선택되는 아미노산, 예를 들어, 선택되는 전체 아미노산 서열에 대해 약 50% 이상의 상동성이 있다. 선택되는 아미노산 서열과 실제적으로상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질은 선택되는 아미노산 서열에 대해 약 50 내지 60% 이상, 바람직하게는 약 60 내지 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 70 내지 80%, 80 내지 90%, 또는 90 내지 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성이 있다.

본 발명의 MCT 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분 또는 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여하거나 또는 표 1에 기재된 활성을 한가지 이상 가질 수 있다.

본 발명의 다양한 측면은 하기 서브섹션에 보다 상세히 기재되어 있다.

A. 단리된 핵산 분자

본 발명의 한 측면은 MCT 폴레펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 일부를 코딩하는 단리된 핵산 분자뿐 아니라 MCT-코딩 핵산(예를 들어, MCT DNA) 확인 또는 증폭을 위한 혼성화 프로브 또는 프라이머로 사용하기에 충분한 핵산 단편에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성되는 DNA 또는 RNA 유사체를 포함하는 의미이다. 이 용어에는 또한 유전자의 코딩 영역의 3' 및 5' 말단의 둘 다에 위치하는 비번역 서열, 코딩 영역의 5' 말단으로부터 상류의 약 100개 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 이 유전자의 코딩 영역의 3' 말단으로부터 하류의 약 20개 이상의 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되는 것이다. 바람직하게는, "단리된" 핵산은 이 핵산이 유도되는 생물의 게놈 DNA에서 본래 핵산의 양측면에 있는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)을 가지고 있지 않다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 단리된 MCT 핵산 분자는 이 핵산이 유도되는 세포(예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포)의 게놈 DNA에서 본래 핵산 분자의 양측면에 있는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 보다 작은 크기의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 게다가, "단리된" 핵산 분자, 예를 들어, DNA 분자는, 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 다른 세포 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질을 실제적으로 함유하지 않는다.

표준 분자 생물학 기술 및 본원에 제공되는 서열 정보를 이용하여, 본 발명의 핵산 분자, 예를 들어, 서열 목록의 홀수 서열 번호의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 일부를 단리할 수 있다. 예를 들어, 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열 중 하나의 전부 또는 일부를 혼성화 프로브로 사용하고 표준 혼성화 기술(예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같은 혼성화 기술)을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 라이브러리로부터 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT DNA를 단리할 수 있다. 더우기, 본 발명의 핵산 서열(예를 들어, 이와 동일한 서열을 기초로 하여 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 본 발명의 핵산 서열(예를 들어, 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열) 중 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산 분자를 단리할 수 있음)을 기초로 하여 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 본 발명의 핵산 서열(예를 들어, 홀수 서열 번호의 서열) 중 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산 분자를 단리할 수 있다. 예를 들어, mRNA는 정상 내피세포로부터 (예를 들어, 문헌[Chirgwin et al.(1979) Biochemistry 18:5294-5299]의 구아니디늄-티오시아네이트 추출 방법에 의해) 단리할 수 있고, DNA는 역전사효소(예를 들어, Gibco/BRL(Bethesda, MD)로부터 입수가능한 몰로네이(Moloney) MLV 역전사효소; 또는 세이까가꾸 아메리카, 인크.(Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL)로부터 입수가능한 AMV 역전사효소)를 사용하여 제조할 수 있다. 서열 목록에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나를 기초로 하여 중합효소 연쇄반응 증폭을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계할 수 있다. 본 발명의 핵산은 cDNA 또는, 별법으로, 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 표준 PCR 증폭 기술에 따라 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산을 적절한 벡터내에 클로닝하고 DNA 서열 분석에 의해 특성화할 수 있다. 또한, MCT 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 표준 합성 기술, 예를 들어, 자동 DNA 합성기를 사용하여 제조할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 목록에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함한다. 서열 목록에 기재된 바와 같은 본 발명의핵산 서열은 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT DNA에 상응한다. 이 DNA는 MCT 단백질을 코딩하는 서열(즉, 서열 목록에서 홀수 서열 번호의 서열에 나타낸 "코딩 영역")뿐 아니라 서열 목록에서 각 홀수 서열 번호의 서열에 나타낸 5' 비번역 서열 및 3' 비번역 서열도 포함한다. 또는, 핵산 분자는 서열 목록의 핵산 서열 중 하나의 코딩 영역만을 포함할 수 있다.

본 출원의 목적을 위해, 서열 목록에 기재된 핵산 및 아미노산 서열 각각은 명칭 "RXA", "RXN", "RXS" 또는 "RXC"에 이어 5개의 숫자를 갖는 확인을 위한 RXA, RXN, RXS 또는 RXC 수(즉, RXA02099, RXN03097, RXS00148 또는 RXC01748)를 가지는 것으로 이해될 것이다. 핵산 서열 각각은 세 부분, 즉 5' 상류 영역, 코딩 영역 및 하류 영역으로 이루어져 있다. 혼란을 방지하기 위해, 이들 세 영역의 각각은 동일한 RXA, RXN, RXS 또는 RXC 명칭에 의해 확인된다. 이외에, "서열 목록의 홀수 서열 중 하나"는 서열 목록에서 핵산 서열 중 어떤 것을 의미하며, 또한 이들의 다른 RXA, RXN, RXS 또는 RXC 명칭에 의해 구별할 수도 있다. 이 서열 각각의 코딩 영역은 또한 서열 목록에 짝수 서열 번호로 기재되어 있는 대응 아미노산(대응 핵산 서열은 바로 밑에 기재되어 있음)으로 번역된다. 예를 들어, RXA03097에 대한 코딩 영역은 서열 1에 기재되어 있으며, 그가 코딩하는 아미노산 서열은 서열 2에 기재되어 있다. 본 발명의 핵산 분자의 서열은, 이들이 쉽게 상호관련될 수 있도록, 이들이 코딩하는 아미노산 분자로서 동일한 RXA, RXN, RXS 또는 RXC 명칭에 의해 확인된다. 예를 들어, RXA02099, RXN03097, RXS00148 및 RXC01748로 명명된 아미노산 서열은 각각 핵산 분자 RXA02099, RXN03097, RXS00148 및 RXC01748의 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역의 번역물이다. 본 발명의 RXA, RXN, RXS 및 RXC 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과 이들의 배정된 서열 번호 사이의 대응관계는 표 1에 기재되어 있다. 예를 들어, 표 1에 기재된 바와 같이, RXA00104의 뉴클레오티드 서열은 서열 5에 나타나 있고, RXA00104의 아미노산 서열은 서열 6에 나타나 있다.

본 발명의 유전자들 중 몇몇은 "F-명칭 유전자"이다. F-명칭 유전자는 표 1에 기재된 유전자들을 포함하며, 이들은 RXA, RXN, RXS 또는 RXC 명칭 앞에 'F'를 갖는다. 예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같이, "F RXA02581"로 명명된 서열 11은 F-명칭 유전자이며, 서열 31, 33 및 43(표 1에서 각각 "F RXA02487", "F RXA02490" 및 "F RXA02809"로 명명됨)도 마찬가지이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 표 2에 기재된 것들을 포함하지 않는다. dapD 유전자의 경우, 이 유전자에 대한 서열은 문헌[Wehrmann, A., et al, (1998) J. Bacteriol. 180(12):3159-3165]에 공개되어 있다. 그러나, 본 발명자들이 얻은 서열은 공개된 서열 형태 보다 상당히 더 길다. 공개된 서열 형태는 정확하지 않은 개시 코돈에 의존한 것이며, 따라서 실제 코딩 영역의 단편만을 나타낸 것이라고 생각된다.

바람직한 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열) 중 하나의 보완물인 핵산 분자을 포함한다. 본 발명에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 하나에 대해 보완적인 핵산 분자는 서열 목록에 나타낸 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 홀수 서열 번호의 서열) 중 하나에 대해 충분히 보완적인 것이어서, 그는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 혼성화함으로써 안정한 이중쇄를 형성한다.

바람직한 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열 중 한 서열)과 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 또는 60% 이상, 바람직하게는 약 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 또는 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 90%, 또는 91%, 92%, 93%, 94% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부를 포함한다. 상기 언급된 범위에 대해 중간 정도의 범위 및 동일성 수치(예를 들어, 70 내지 90% 동일 또는 80 내지 95% 동일)는 본 발명에 포함되는 것이다. 예를 들어, 상기에서 상한치 및(또는) 하한치로 언급된 수치들 중 임의 조합을 이용한 동일성 수치 범위는 본 발명에 포함되는 것이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는, 예를 들어 엄격 조건하에, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 그의 일부와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

게다가, 본 발명의 핵산 분자는 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열 중 한 서열의 코딩 영역의 일부만을, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있는 단편 또는 MCT 단백질의 생물학적으로 활성인 일부를 코딩하는 단편을 포함할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 MCT 유전자의 클로닝으로부터 결정되는 뉴클레오티드 서열을 이용하여 다른 유형의 세포 및 생물체에서 MCT 상동체뿐만 아니라 다른 코리네박테리아 또는 관련 종으로부터 MCT 상동체를 확인하고(하거나) 클로닝하는데 사용하기 위해 설계된 프로브 및 프라이머를 생성시킬 수 있다. 프로브/프라이머는 통상적으로 사실상 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 엄격 조건하에 본 발명의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열 중 하나) 중 하나의 센스 가닥, 이들 서열들 중 하나의 안티-센스 서열, 또는 자연 발생적인 그의 변이체의 약 12개, 바람직하게는 약 25개, 보다 바람직하게는 약 40, 50 또는 75개 이상의 연속된 뉴클레오티드와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 기초로 한 프라이머는 MCT 상동체를 클로닝하기 위한 PCR 반응에서 사용될 수 있다. MCT 뉴클레오티드 서열을 기초로 한 프로브를 사용하여 동일하거나 상동성인 단백질을 코딩하는 전사체 또는 게놈 서열을 찾을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 프로브는 그에 부착되는 라벨 기를 추가로 포함하며, 예를 들어, 라벨 기는 방사성동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다. 이러한 프로브는, 예를 들어 세포 시료 중 MCT-코딩 핵산 수준을 측정함으로써, 예를 들어 MCT mRNA 수준을 검출하거나 또는 게놈 MCT 유전자가 변이되었는지 또는 결실되었는지를 결정함으로써, MCT 단백질을 잘못 발현시키는 세포를 확인하기 위한 진단용 시험 키트의 일부로 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 목록의 짝수 서열 번호의 서열)과 충분히 상동성이 있는 아미노산 서열을포함하는 단백질 또는 그의 일부를 코딩하며, 이 단백질 또는 그의 일부는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 유지한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "충분히 상동성인"이란 본 발명의 아미노산 서열에 대해 동일 또는 동등한 최소 수의 아미노산 잔기(예를 들어, 서열 목록의 짝수 번호 서열 중 하나의 서열에서의 하나의 아미노산 잔기와 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 일부를 의미하며, 이 단백질 또는 그의 일부는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있다. 이러한 막 성분의 대사 경로 또는 막 운반 시스템의 단백질 구성원은, 본원에 기재된 바와 같이, 1종 이상의 정밀 화학물질의 생산 및 분비에서 작용할 수 있다. 이러한 활성의 예는 또한 본원에 기재되어 있다. 따라서, "MCT 단백질의 기능"은 1종 이상의 정밀 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율에 직접 또는 간접적으로 기여한다. MCT 단백질 활성의 예는 표 1에 기재되어 있다.

또다른 실시양태에서, 단백질은 본 발명의 전체 아미노산 서열(예를 들어, 서열 목록의 짝수 서열 번호의 서열)과 약 50% 내지 60% 이상, 바람직하게는 약 60% 내지 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 90% 내지 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성이 있다.

본 발명의 MCT 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질의 일부는 바람직하게는 MCT 단백질 중 하나의 생물학적으로 활성인 일부이다. 본원에 사용된 바와 같이,용어 "MCT 단백질의 생물학적으로 활성인 일부"는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여하거나 또는 표 1에 기재된 바와 같은 활성을 갖는 MCT 단백질의 일부, 예를 들어, 그의 도메인/모티프를 포함한다. MCT 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부가 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있는지를 결정하기 위해, 효소 활성의 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석 방법은, 실시예 8에 기재된 바와 같이, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다.

MCT 단백질의 생물학적으로 활성인 일부를 코딩하는 다른 핵산 단편은 MCT 단백질 또는 펩티드의 코딩 부분을 발현시키는(예를 들어, 시험관내에서 재조합 발현시킴으로써) 본 발명의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 목록의 짝수 서열 번호의 서열) 중 하나의 일부를 단리하고, MCT 단백질 또는 펩티드의 코딩되는 부분의 활성을 평가함으로써 제조할 수 있다.

본 발명은, 본 발명에 나타낸 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열) 중 하나와 상이하지만 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것과 동일한 MCT 단백질을 코딩하는 핵산 분자(및 그의 단편)를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 목록에 나타낸 아미노산 서열(예를 들어, 짝수 서열 번호의 서열)을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 아미노산 서열(서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열에나타낸 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩됨)과 실제적으로 상동성인 전장의 코리네박테리움 글루타미쿰 단백질을 코딩한다.

당업자라면, 한 실시양태에서 본 발명의 서열이 본 발명의 이전에 이용가능했던, 표 2 또는 4에 기재된 진뱅크(Genbank) 서열과 같은 선행 기술의 서열을 포함하는 것이 아님을 알 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 선행 기술의 서열(예를 들어, 표 2 또는 4에 기재된 진뱅크 서열(또는 이러한 서열에 의해 코딩되는 단백질))보다 더 큰 본 발명의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 동일성(%)을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 RXA01420(서열 7)로 명명되는 뉴클레오티드 서열보다 더 크고(크거나) 그와 38% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, RXA00104(서열 5)로 명명되는 뉴클레오티드 서열보다 더 크고(크거나) 그와 43% 이상의 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열 및 RXA02173(서열 25)로 명명되는 뉴클레오티드 서열보다 더 크고(크거나) 그와 45% 이상의 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 당업자라면, 주어진 서열에 대한 3개의 최고 히트 각각에 대해 표 4에 나타낸 GAP-계산된 동일성(%) 점수를 조사하고, GAP-계산된 가장 높은 동일성(%)를 100에서 차감하여 본 발명의 임의 주어진 서열에 대한 동일성(%)의 하한 역치를 계산할 수 있을 것이다. 당업자라면 또한 이렇게 계산된 하한 역치보다 더 큰 동일성(%)(예를 들어, 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 또는 60% 이상, 바람직하게는 약 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 또는 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,86%, 87%, 88%, 89%, 또는 90%, 또는 91%, 92%, 93%, 94% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성)을 갖는 핵산 서열 및 아미노산 서열이 본 발명에 포함됨을 알 것이다.

당업자라면, 서열 목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT 뉴클레오티드 서열 이외에도, MCT 단백질의 아미노산 서열에서의 변화를 초래하는 DNA 서열의 다형성이 집단(예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 집단)내에 존재할 수 있음을 알 것이다. MCT 유전자에 있어서의 이러한 유전적 다형성은 자연적인 변화로 인해 집단내의 개체들 사이에 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 MCT 단백질, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 자연적인 변화는 통상적으로는 MCT 유전자의 뉴클레오티드 서열을 1 내지 5% 변화시킨다. 자연적인 변화의 결과이며 MCT 단백질의 기능적 활성을 변화시키지 않는, MCT 유전자의 임의 및 모든 이러한 뉴클레오티드 변화 및 그에 따라 나타난 아미노산의 다형성은 본 발명의 범위내이다.

천연 변이체 및 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT DNA의 비-코리네박테리움 글루타미쿰 상동체에 대응하는 핵산 분자는, 본원에 개시된 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT 핵산에 대한 이들의 상동성에 기초하여, 엄격 혼성화 조건하에 표준 혼성화 기술에 따라 혼성화 프로브로서 코리네박테리움 글루타미쿰 DNA 또는 그의 일부를 사용하여 단리할 수 있다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 뉴클레오티드 15개 이상의 길이이며, 엄격 조건하에 서열 목록의 홀수 서열 번호의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 혼성화한다. 다른 실시양태에서, 핵산은 뉴클레오티드 30개, 50개, 100개 또는 250개 이상의 길이이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엄격 조건하에 혼성화하는"은 서로에 대해 통상적으로 60% 이상의 상동성인 뉴클레오티드 서열이 서로 혼성화된 채로 남아 있는, 혼성화 및 세척을 위한 조건을 설명하는 의미이다. 바람직하게는, 이 조건은 서로에 대해 통상적으로 약 65% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 75% 이상 상동성인 서열이 서로에 대해 혼성화된 채로 남아 있는 조건이다. 이러한 엄격 조건은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있으며, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾을 수 있다. 엄격 혼성화 조건에 대한 바람직한 비제한적 실시예는 약 45 ℃에서 6 ×염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중의 혼성화 이후에 50 내지 65 ℃에서 0.2 ×SSC, 0.1% SDS 중의 1회 이상의 세척이다. 바람직하게는, 엄격 조건하에 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 본 발명의 단리된 핵산 분자는 자연 발생적인 핵산 분자에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같이, "자연 발생적인" 핵산 분자는 자연에 존재하는(예를 들어, 천연 단백질을 코딩하는) 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 한 실시양태에서, 핵산은 천연 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT 단백질을 코딩한다.

집단내에 존재할 수 있는 MCT 서열의 자연 발생적인 변이체 이외에도, 당업자라면 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열내의 변이에 의해, MCT 단백질의 기능성을 변화시키지 않고, 코딩된 MCT 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 일으킴으로써변화를 도입할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 일으키는 뉴클레오티드 치환이 본 발명의 뉴클레오티드 서열에서 일어날 수 있다. "비필수 아미노산" 잔기가 상기 MCT 단백질의 활성을 변화시키지 않으면서 MCT 단백질(예를 들어, 서열 목록의 짝수 서열 번호의 서열) 중 하나의 야생형 서열로부터 변화될 수 있는 잔기인 반면 "필수" 아미노산 잔기는 MCT 단백질 활성에 요구된다. 그러나, 다른 아미노산 잔기(예를 들어, MCT 활성을 갖는 도메인에서 보존되지 않거나 또는 반보존된 잔기)는 활성에 필요하지 않을 수도 있으며, 따라서 MCT 활성을 변화시키지 않으면서도 변화시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 또다른 측면은 MCT 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기에서의 변화를 포함하는 MCT 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 MCT 단백질은 서열 목록에서 짝수 서열 번호의 서열로부터의 아미노산 서열이 다르며, 본원에 기재된 MCT 활성 중 적어도 하나를 보유한다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는, 본 발명의 아미노산 서열과 약 50% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하며, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있거나, 또는 표 1에 기재된 바와 같은 활성을 1가지 이상 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질은 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열 중 하나의 아미노산 서열에 대해 약 50 내지 60% 이상, 보다 바람직하게는 이러한 서열 중 하나에 대해 약 60 내지 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 이러한 서열 중 하나에 대해 약 70 내지 80%, 80 내지 90%, 90 내지 95% 이상, 가장바람직하게는 본 발명의 아미노산 서열 중 하나에 대해 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동성이 있다.

두 아미노산 서열(예를 들어, 본 발명의 아미노산 서열 중 하나 및 그의 변이체 형태) 또는 두 핵산 서열의 상동성(%)을 결정하기 위해, 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬시킨다(예를 들어, 다른 단백질 또는 핵산과의 최적의 정렬을 위해 하나의 단백질 또는 핵산의 서열내에 갭을 도입시킬 수 있다). 이어서, 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 대응하는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 한 서열(예를 들어, 본 발명의 아미노산 서열 중 하나)내의 위치가 다른 서열(예를 들어, 아미노산 서열의 변이체 형태)내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이 있는 것이다(즉, 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산의 "상동성"은 아미노산 또는 핵산의 "동일성"과 동등한 의미이다). 두 서열 사이의 상동성(%)은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이다(즉, 상동성(%) = 동일한 위치의 개수/위치의 총 개수 ×100).

코딩되는 단백질내에 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 도입되도록 본 발명의 뉴클레오티드 서열내에 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가 또는 결실을 도입시킴으로써, 본 발명의 단백질 서열(예를 들어, 서열 목록의 짝수 서열 번호의 서열)과 상동성인 MCT 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 생성시킬 수 있다. 부위-지시적 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법과 같은 표준 기술에 의해 본 발명의 뉴클레오티드 서열들 중 하나에 변이를 도입할 수 있다.바람직하게는, 예상되는 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 보존된 아미노산 치환을 수행할 수 있다. "보존된 아미노산 치환"이란 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 군에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파라긴산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, MCT 단백질에서 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 군으로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 또는, 또다른 실시양태에서, 변이는, 예를 들어, 포화 돌연변이유발법에 의해 MCT 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 도입될 수 있으며, MCT 활성을 보유하는 변이체를 확인하기 위해, 생성된 변이체를 본원에 기재된 MCT 활성에 대하여 스크리닝 할 수 있다. 서열 목록의 홀수 서열 번호의 서열들 중 한 뉴클레오티드 서열을 돌연변이유발시킨 다음, 코딩된 단백질을 재조합적으로 발현시킬 수 있고, 예를 들어 본원에 기재된 분석법을 이용하여 단백질의 활성을 결정할 수 있다(실시예 8을 참조).

상기 기재된 MCT 단백질을 코딩하는 핵산 분자 이외에, 본 발명의 다른 측면은 그와 안티센스인 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. "안티센스" 핵산은 단백질을 코딩하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들어 이중쇄 cDNA 분자의 코딩 가닥에 대해 상보적인 또는 mRNA 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산과 수소 결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 MCT 코딩 가닥과 또는 그의 일부에만 상보적일 수 있다. 한 실시양태에서, 안티센스 핵산 분자는 MCT 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "코딩 영역"에 대해 안티센스이다. 용어 "코딩 영역"은 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 영역(예를 들어, 서열 5(RXA00104)의 전체 코딩 영역은 뉴클레오티드 1에서 756을 포함함)을 의미한다. 또다른 실시양태에서, 안티센스 핵산 분자는 MCT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "비코딩 영역"에 대해 안티센스이다. 용어 "비코딩 영역"은 아미노산으로 번역되지 않는, 코딩 영역의 양측에 있는 5' 및 3' 서열(즉, 5' 및 3' 비번역 영역이라고도 함)을 의미한다.

본원에 개시된 MCT를 코딩하는 코딩 가닥 서열(예를 들어, 이 서열은 서열 목록에서 홀수 서열 번호로 기재되어 있음)을 기초로 하여, 왓슨(Watson)과 크릭(Crick)의 염기쌍 규칙에 따라 본 발명의 안티센스 핵산을 설계할 수 있다. 이 안티센스 핵산 분자는 MCT mRNA의 전체 코딩 영역에 대해 상보적일 수 있지만, 보다 바람직하게는 MCT mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 일부에만 안티센스인 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 MCT mRNA의 번역 개시 부위 주변의 영역에 대해 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 뉴클레오티드 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 길이이다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 방법을 이용하는 화학적 합성법 및 효소적 라이게이션 반응법을 이용하여 작제할 수 있다. 예를 들어, 자연 발생적인 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 안티센스와 센스 핵산 사이에 형성된 이중쇄의 물리적인 안정성을 증가시키기 위해 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여(예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있음), 안티센스 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)을 화학적으로 합성할 수 있다. 안티센스 핵산을 생성하는데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 비부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린이 포함된다. 또는, 핵산이 안티센스 방향으로 서브클로닝된 발현 벡터(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사되는 RNA는 목적하는 표적 핵산에 대해 안티센스 방향임. 하기 서브섹션에 추가로 설명되어 있음)를 사용하여 안티센스 핵산을 생물학적으로 생성시킬 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 통상적으로 세포에 투여되거나 또는 이들이 MCT 단백질을 코딩하는 세포의 mRNA 및(또는) 게놈 DNA와 혼성화하거나 또는 그와 결합함으로써, 예를 들어 전사 및(또는) 번역을 저해함으로써, 단백질의 발현을 억제하도록 반응계내에서 생성된다. 혼성화는 안정한 이중쇄를 형성하는 통상의 뉴클레오티드 상보성에 의한 것이거나 또는, 예를 들어, 이중 나선의 메이저 그루브에서 특이적 상호작용을 통해 DNA 이중쇄와 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에 의한 것일 수 있다. 안티센스 분자는, 예를 들어 안티센스 핵산 분자를 세포 표면의 수용체 또는 항원과 결합하는 펩티드 또는 항체에 연결시킴으로써, 그가 선택된 세포 표면에서 발현되는 수용체 또는 항원과 특이적으로 결합하도록 변형시킬 수 있다. 또한, 본원에 기재된 벡터를 사용하여 안티센스 핵산 분자를 세포에 전달시킬 수도 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위해서는, 안티센스 핵산 분자가 강력한 원핵세포, 바이러스 또는 진핵세포 프로모터의 조절하에 놓여 있는 벡터 구조물이 바람직하다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자이다. α-아노머 핵산 분자는 상보적 RNA와 특이적 이중 가닥 하이브리드를 형성하며, 이 때 통상의 β-유닛과는 대조적으로, 가닥들은 서로에 대해 평행한 상태로 있다(Gaultier et al.(1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). 안티센스 핵산분자는 2'-o-메틸리보뉴클레오티드(Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue et al.(1987) FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수도 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 라이보자임이다. 라이보자임은 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매성 RNA 분자이며, 그와 상보적 영역을 갖는 mRNA 등의 단일 가닥 핵산을 절단할 수 있다. 따라서, 라이보자임(예를 들어, 햄머헤드(hammerhead) 라이보자임(문헌[Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591]에 기재되어 있음))을 사용하여 MCT mRNA 전사체를 촉매적으로 절단함으로써 MCT mRNA의 번역을 억제할 수 있다. 본원에 개시된 MCT DNA의 뉴클레오티드 서열(즉, 서열 5(RXA00104))을 기초로 하여 MCT-코딩 핵산에 대해 특이성을 갖는 라이보자임을 설계할 수 있다. 예를 들어, 테트라히메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체를 제작할 수 있으며, 여기서 활성 부위의 뉴클레오티드 서열은 MCT-코딩 mRNA에서 절단되는 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이다[예를 들어, 세치(Cech) 등의 미국 특허 제4,987,071호 및 세치(Cech) 등의 미국 특허 제5,116,742호를 참조]. 또는, MCT mRNA를 사용하여 RNA 분자의 푸울로부터 특정 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매성 RNA를 선별해낼 수 있다[예를 들어, 문헌[Bartel, D. and Szostak, J.W.(1993) Science 261:1411-1418]을 참조].

또는, MCT 뉴클레오티드 서열의 조절 영역(예를 들어, MCT 프로모터 및(또는) 인핸서)에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 표적 세포에서 MCT 유전자의 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성시킴으로써 MCT 유전자의 발현을억제시킬 수 있다[일반적으로, 문헌[Helene, C.(1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann.N.Y. Acad.Sci.660:27-36; and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15]을 참조].

B. 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포

본 발명의 다른 측면은 벡터, 바람직하게는 MCT 단백질 (또는 그의 일부)을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"란 그에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산을 지칭한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"란 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 고리를 의미한다. 벡터의 다른 유형인 바이러스 벡터는 추가의 DNA 절편을 바이러스 게놈 내로 라이게이션시킬 수 있다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제될 수 있다 (예를 들면, 박테리아 복제 기점을 가진 박테리아 벡터 및 포유류의 에피솜 벡터). 다른 벡터 (예를 들면, 포유류의 비-에피솜 벡터)는 숙주 세포 내로 도입된 후 숙주 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈을 따라 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서는 그러한 벡터를 "발현 벡터"로 언급한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용하는 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태를 갖는다. 플라스미드는 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에, 본 명세서에서는 "플라스미드"와 "벡터"를 혼용할 수 있다. 그러나, 본 발명에는 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터 (예를 들면, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노 바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함된다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 포함하며, 적합한 형태란 상기 재조합 발현 벡터가 발현용 숙주 세포를 기준으로 선택된 하나 이상의 조절 서열 (발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결됨)을 함유하고 있음을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"이란, 원하는 뉴클레오티드 서열이 (예를 들면, 시험관내 전사/번역 시스템 내 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내에서) 발현가능하도록 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"이란, 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소 (예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 한다. 그러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열에는 다수의 숙주 세포 유형 내에서 뉴클레오티드 서열이 구성적으로 발현되도록 하는 것과 특정 숙주 세포 내에서만 뉴클레오티드 서열이 발현되도록 하는 것이 포함된다. 바람직한 조절 서열에는, 예를 들어 박테리아에서 바람직하게 사용되는 cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, λ-P_R- 또는 λP_L와 같은 프로모터가 있다. 추가의 조절 서열에는, 예를 들어 ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH와 같은 효모 및 진균으로부터의 프로모터, CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos나 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터와 같은 식물로부터의 프로모터가 있다. 또한 인공 프로모터도 사용할 수 있다. 당업자는 발현 벡터가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 정도 등과 같은 인자들에 따라 다르게 고안될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주세포에 도입됨으로써 본 명세서에 기술된 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드 (예를 들면, MCT 단백질, MCT 단백질의 돌연변이 형태, 융합 단백질 등)를 비롯한 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서의 MCT 단백질 발현용으로 고안될 수 있다. 예를 들어, MCT 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포 (바쿨로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 및 다른 진균류 세포 (문헌 [Romanos, M.A.et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review",Yeast8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J.et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet ＆ L.L. Lasure, eds., p.396-428: Academic Press: San Diego; and van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F.et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 참조), 조류 및 다세포 식물 세포 (문헌 [Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) High efficiencyAgrobacterium tumefactiens-mediated transformation ofArabidopsis thalianaleaf and cotyledon explants"Plant Cell Rep.:583-586] 참조) 또는 포유류 세포 내에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel,Gene Expression Technology: Methods inEnzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 더 기술되어 있다. 별법으로, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 재조합 발현 벡터를 시험관 내에서 전사 및 번역시킬 수 있다.

원핵 세포 내에서의 단백질 발현은 대체로 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도가능한 프로모터 함유 벡터로 수행한다. 융합 벡터는 그의 코딩되는 단백질에, 일반적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단 뿐 아니라 C-말단에 다수의 아미노산을 부가하거나, 그 단백질의 적절한 영역 내에서 다수의 아미노산을 융합시킨다. 그러한 융합 벡터는 전형적으로 다음의 세 가지 목적, 1) 재조합 단백질의 발현 증가, 2) 재조합 단백질의 가용성 증가, 및 3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용함에 의한 재조합 단백질 정제 상의 용이함을 위한 것이다. 대개 융합 발현 벡터 내에서는 융합 부분과 재조합 단백질의 접합부에 단백질 절단 부위가 도입되어 있어서 융합 단백질을 정제한 후 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리할 수 있다. 그러한 효소 및 그의 동족 인식 서열에는 응고인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제 등이 있다.

전형적인 융합 발현 벡터에는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; 문헌 [Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988)Gene67:31-40] 참조), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 등이 있으며, 이들은 각각 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 프로틴 A (protein A)를 표적 재조합 단백질에 융합시킨다. 한 실시양태에서는 MCT 단백질의 코딩 서열을 pGEX 발현 벡터 내로 클로닝하여 N-말단 내지 C-말단에 GST-트롬빈절단 부위-X 단백질을 함유하는 융합 단백질 코딩 벡터를 생성하였다. 상기 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 수지를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. GST에 융합되지 않은 재조합 MCT 단백질은 융합 단백질을 트롬빈으로 절단함으로써 얻을 수 있다.

적합한 유도가능한 비-융합 대장균 발현 벡터의 예로는 pTrc (문헌 [Amannet al.,(1988)Gene69:301-315] 참조), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pINIII113-B1, λgt11, pBdCl 및 pET 11d (문헌 [Studieret al.,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89] 및 문헌 [Pouwelset al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018] 참조)가 있다. pTrc 벡터에서 표적 유전자는 trp-lac 혼성 융합 프로모터로부터 숙주 RNA 폴리머라제의 전사에 의해 발현된다. pET 11d 벡터에서 표적 유전자는 T7 gn 10-lac 융합 프로모터로부터 동시 발현된 바이러스 RNA 폴리머라제 (T7 gn1)가 매개하는 전사에 의해 발현된다. 이 바이러스 폴리머라제는 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 존재하는, lacUV 5 프로모터의 전사 조절 하에 T7 gn1 유전자를 함유하는 λ프로파지로부터 공급된다. 다양한 박테리아의 형질전환을 위해 적절한 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 pIJ101, pIJ364, pIJ702 및 pIJ361은 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 형질전환시키는데 유용한 것으로 알려진 반면, 플라스미드 pUB110, pC194 또는 pBD214는 바실루스 (Bacillus) 종을 형질전환시키는데 적합하다. 코리네박테리움 내로 유전 정보를전달하는데 사용되는 플라스미드에는 pHM1519, pBL1, pSA77 또는 pAJ667 (문헌 [Pouwelset al.,eds.(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018] 참조) 등이 있다.

재조합 단백질의 발현을 극대화하는 한가지 전략은 재조합 단백질에 대한 단백질 분해성 절단력이 손상된 숙주 박테리아 내에서 상기 단백질을 발현시키는 것이다 (문헌 [Gottesman, S.,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128] 참조). 다른 전략으로는 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변형하여 각각의 아미노산에 대한 개별적인 코돈이 발현을 위해 선택된 박테리아 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 글루타미쿰)가 선호하는 코돈이 되도록 하는 것이 있다 (문헌 [Wadaet al.(1992)Nucleic Acids Res. 20:2111-2118] 참조). 이처럼 본 발명의 핵산 서열의 변형은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.

다른 실시양태에서, MCT 단백질 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 발현 벡터의 예로는 pYepSec1 (문헌 [Baldari,et al.,(1987)Embo J.6:229-234), 2μ, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYe23, pMFa (문헌 [Kurjan and Herskowitz,(1982)Cell30:933-943) 참조), pJRY88 (문헌 [Shultzet al.,(1987)Gene54:113-123] 참조) 및 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 등이 있다. 사상 진균류와 같은 다른 진균류용으로 적절한 벡터 및 벡터의 제조 방법으로는 문헌 [van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector developmentfor filamentous fungi, in:Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy,et al.,eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 및 문헌 [Pouwelset al.,eds.(1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (IBSN 0 444 904018)]에 상술된 것들이 포함된다.

별법으로, 바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 MCT 단백질을 곤충 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포 (예를 들면, Sf 9 세포)에서의 단백질 발현용 바쿨로바이러스 벡터에는 pAc계 (문헌 [Smithet al. (1983)Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 참조) 및 pVL계 (문헌 [Lucklow and Summers (1989)Virology170:31-39] 참조) 등이 있다.

다른 실시양태에서는 단세포 식물 세포 (예를 들어, 조류) 또는 고등 식물 (예를 들면, 작물 식물과 같은 종자 식물)로부터의 식물 세포 내에서 본 발명의 MCT 단백질을 발현시킬 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 문헌 [Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border",Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197], 문헌 [Bevan, M.W. (1984) "BinaryAgrobacteriumvectors for plant transformation",Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721]에 상술된 것들이 포함되며 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 및 pDH51 (문헌 [Pouwelset al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018] 참조)가 포함된다.

또 다른 실시양태에서는 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포 내에서 본 발명의 핵산을 발현시킨다. 포유류 발현 벡터의 예로는 pCDM8 (문헌 [Seed, B.(1987)Nature329:840] 참조) 및 pMT2PC (문헌 [Kaufmanet al. (1987)EMBO J. 6:187-195] 참조) 등이 있다. 포유류 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 대개 바이러스 조절 요소에 의한 것이다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된 것이다. 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에 적합한 다른 발현계에 대해서는 문헌 [Chapters 16 and 17 of Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]을 참조한다.

다른 실시양태에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 유형에서의 차별적인 핵산 발현이 가능하도록 한다 (예를 들면, 조직-특이적 조절 요소가 핵산을 발현시키는데 사용된다). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 예로는 알부민 프로모터 (간-특이적; 문헌 [Pinkertet al. (1987)Genes Dev. 1:268-277] 참조), 림프양-특이적 프로모터 (문헌 [Calame and Eaton (1988)Adv. Immunol. 43:235-275] 참조), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (문헌 [Winoto and Baltimore (1989)EMBO J. 8:729-733] 참조)와 면역글로불린의 프로모터 (문헌 [Banerjiet al. (1983)Cell33:729-740], 문헌 [Queen and Baltimore (1983)Cell33:741-748] 참조), 뉴런-특이적 프로모터 (예를 들면, 뉴로필라멘트 프로모터; 문헌 [Byrne and Ruddle (1989)PNAS86:5473-5477] 참조), 췌장-특이적 프로모터 (문헌 [Edlundet al. (1985)Science230:912-916] 참조) 및 유선(乳腺)-특이적 프로모터 (예를 들면, 유장(乳漿) 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 번호 제264,166호 참조) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 발생-조절 프로모터, 예를 들어 쥐과 hox 프로모터 (문헌 [Kessel and Gruss (1990)Science249:374-379] 참조) 및 α-페토프로틴 프로모터 (문헌 [Campes and Tilghman (1989)Genes Dev. 3:537-546] 참조)도 포함된다.

본 발명은 안티센스 방향으로 발현 벡터 내에서 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 함유하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다. 즉, 상기 DNA 분자는 MCT mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 (상기 DNA 분자의 전사에 의한) 발현이 가능하도록 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 예를 들어, 바이러스 프로모터 및(또는) 인핸서처럼 다양한 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자가 지속적으로 발현되도록 하는 것으로 선택할 수 있으며, 또는 안티센스 RNA가 구성적, 조직-특이적 또는 세포형 특이적으로 발현되도록 하는 조절 서열을 선택할 수도 있다. 안티센스 발현 벡터는 고효율의 조절 영역의 조절 하에서 안티센스 핵산을 생산하는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화 바이러스의 형태일 수 있으며, 그 활성은 상기 벡터가 도입된 세포 유형에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하여 유전자 발현을 조절하는 것에 대해서는 문헌 [Weintraub, H.et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참조한다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 혼용되고 있다. 그러한 용어는 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손도 의미하는 것으로 이해한다. 세대를 지나면서 돌연변이나 환경의 영향으로 인해 임의의 변형이 나타날 수 있기 때문에, 사실 그러한 자손은 부모 세포와 동일하지 않지만, 여전히 본 명세서에서 사용하는 용어의 범위에 포함된다.

숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, MCT 단백질은 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포 (예를 들어, 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 COS 세포) 내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질 분자를 위한 숙주세포로서 용이하게 사용할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 관련 미생물이 표 3에 기재되어 있다.

벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염", "접합" 및 "형질도입"이란, 이종 핵산 (예를 들면, 선형 DNA 또는 RNA (예를 들면, 선형화 벡터이거나, 또는 벡터 없는 단독 유전자 구조물)) 또는 벡터 형태의 핵산 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 파스피드, 파지미드, 트랜스포손 또는 다른 DNA)을 숙주 세포 내에 도입하는 다양한 공지 기술을 의미하는 것이며, 여기에는 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 동시 침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 리포펙션법(lipofection), 천연 감응법 (natural competence), 화학물질 매개 전달법, 또는 전기천공법 등이 포함된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 적합한 방법은 문헌 [Sambrooket al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)] 및 다른 실험 매뉴얼에서 찾을 수 있다.

포유류 세포의 안정적 형질감염에 대해서는, 발현 벡터와 이용된 형질감염 기술에 따라, 단지 일부 소수 세포만이 그의 게놈 내로 외래 DNA를 통합한다는 것이 알려져 있다. 이들 통합체를 확인하고 선별하기 위해, 일반적으로 선택가능한 표지 (예를 들면, 항생제 내성)를 코딩하는 유전자를 목적 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입시킨다. 바람직한 선택가능한 표지에는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선택가능한 표지를 코딩하는 핵산은 MCT 단백질을 코딩하는 그 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 또는 별도의 벡터 상에서 도입될 수도 있다. 도입된 핵산이 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선택법을 통해 확인할 수 있다 (예를 들면, 선택가능한 표지 유전자가 혼입된 세포는 생존할 것이나, 그렇지 않은 다른 세포는 사멸한다).

상동성 재조합 미생물을 제조하기 위해서, 결실, 부가 또는 치환을 도입시켜 MCT 유전자를 변형 (예를 들면, 기능을 파괴)시킨 MCT 유전자의 적어도 일부를 함유하는 벡터를 제조한다. 바람직하게는 이 MCT 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT 유전자이지만, 관련 박테리아로부터의 상동체뿐만 아니라 포유류, 효모 또는 곤충 기원으로부터의 상동체일 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 상동성 재조합에 의해 내인성 MCT 유전자가 기능적으로 파괴 (즉, 더이상 기능적 단백질을 코딩하지 않음, "녹아웃 (knock-out)" 벡터로도 지칭됨)되도록 고안된다. 별법으로, 상기 벡터는 상동성 재조합에 의해 내인성 MCT 유전자가 돌연변이되거나 달리 변형되었지만 여전히 기능적 단백질을 코딩 (즉, 상류 조절 영역이 변형되어 내인성 MCT 단백질의 발현이 변형될 수 있음)하도록 고안된다. 상동성 재조합 벡터에는 변경된 MCT 유전자 일부의 5' 및 3'의 측면에 MCT 유전자의 추가적인 핵산이 위치하여 벡터에 의해 운반된 외인성 MCT 유전자와 미생물 내의 내인성 MCT 유전자 사이에 상동성 재조합이 일어나도록 한다. 추가된 측면 MCT 핵산은 내인성 유전자와 성공적으로 상동성 재조합 되기에 충분한 길이를 갖는다. 전형적으로, 수 킬로베이스의 측면 DNA (5' 및 3' 말단 둘 다)가 상기 벡터 내에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해 기술하는 문헌 [Thomas, K.R., and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503] 참조). 상기 벡터는 (예를 들면, 전기천공법에 의해) 미생물 내로 도입되고, 도입된 MCT 유전자와 내인성 MCT 유전자가 상동성 재조합된 세포를 공지된 기술에 의해 선별한다.

다른 실시양태에서, 도입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것으로 선택된 시스템을 함유하는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 벡터 상에 lac 오페론의 조절을 받는 MCT 유전자가 포함된 경우에는 오직 IPTG의 존재 하에서만 MCT 유전자가 발현될 수 있다. 그러한 조절 시스템은 당업계에 공지되어 있다.

다른 실시양태에서, 숙주 세포 내의 내인성 MCT 유전자를 (예를 들면, 상동성 재조합 또는 당업계에 공지된 다른 유전적 수단에 의해) 파괴하여 그의 단백질산물이 발현되지 않게 한다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포 내의 도입된 MCT 유전자 또는 내인성 MCT 유전자는 하나 이상의 점 돌연변이, 결실 또는 역위에 의해 변경되지만, 여전히 기능적 MCT 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 미생물 내에 있는 하나 이상의 조절 영역 (예를 들면, 프로모터, 억제자 또는 인듀서)이 (예를 들면, 결실, 절단, 역위 또는 점 돌연변이에 의해) 변경되어 MCT 단백질의 발현이 변한다. 당업자라면, 상기 기술한 MCT 유전자 및 단백질 변형을 하나 이상 함유한 숙주 세포가 본 발명의 방법을 이용하여 용이하게 생성될 수 있으며 이들이 본 발명에 포함되는 것임을 이해할 것이다.

배양물 중의 원핵 또는 진핵 숙주 세포와 같은 본 발명의 숙주 세포는 MCT 단백질의 생산 (즉, 발현)에 이용된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 이용한 MCT 단백질의 생산 방법을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 (MCT 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되거나, 야생형 또는 변형된 MCT 단백질을 코딩하는 유전자가 게놈 내로 도입된) 숙주 세포를 MCT 단백질이 생산될 때까지 적합한 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 상기 배지 또는 숙주 세포로부터 MCT 단백질을 단리하는 것을 추가로 포함한다.

C. 단리된 MCT 단백질

본 발명의 다른 측면은 단리된 MCT 단백질 및 그의 생물학적 활성 부위에 관한 것이다. "단리된" 또는 "정제된" 단백질이나 그의 생물학적 활성 부위는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 경우 실질적으로 세포 물질이 없으며, 또는 화학적으로합성된 경우에는 실질적으로 화학적 전구체나 다른 화학 물질이 없다. 용어 "실질적으로 세포 물질이 없는 것"이란 천연적으로 또는 재조합에 의해 MCT단백질을 생산하는 세포의 세포 구성 물질로부터 상기 단백질을 분리한 MCT 단백질 제제를 포함한다. 한 실시 태양에서, 용어 "실질적으로 세포 물질들이 없는 것"은 비-MCT 단백질 (본 명세서에서 "오염 단백질"로도 지칭함) 함량이 약 30％ 미만 (건 중량), 바람직하게는 약 20％ 미만, 보다 바람직하게는 약 10％ 미만, 가장 바람직하게는 약 5％인 MCT 단백질 제제를 포함한다. 또한, MCT 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위가 재조합에 의해 생산되는 경우, 실질적으로 배양 배지가 없는 것이 바람직하다. 즉, 배양 배지 함량이 약 20 부피％ 미만, 보다 바람직하게는 약 10 부피％ 미만, 가장 바람직하게는 5 부피％ 미만으로 나타나는 단백질 제제가 바람직하다. 용어 "실질적으로 화학적 전구체나 다른 화학 물질이 없는 것"이란 MCT 단백질의 합성에 관여한 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질로부터 상기 단백질을 분리한 MCT 단백질 제제를 포함한다. 한 실시 태양에서, 용어 "실질적으로 화학적 전구체나 다른 화학 물질이 없는 것"은 화학적 전구체 또는 비-MCT 화학 물질의 함량이 약 30％ 미만 (건 중량), 바람직하게는 약 20％ 미만, 보다 바람직하게는 약 10％ 미만, 가장 바람직하게는 약 5％인 MCT 단백질 제제를 포함한다. 바람직한 실시 태양에서, 단리된 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위는 MCT 단백질이 유래된 생물체로부터의 오염 단백질이 없는 것이다. 전형적으로, 그러한 단백질은 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물 내에서 코리네박테리움 글루타미쿰 MCT 단백질의 재조합 발현에 의해 생산된다.

본 발명의 단리된 MCT 단백질 또는 그의 일부는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있거나, 또는 표 1에 기재된 하나 이상의 활성을 가질 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 상기 단백질 또는 그의 단편은 본 발명의 아미노산 서열과 충분히 상동성인 (예, 서열 목록에서 서열 번호가 짝수인 서열) 아미노산 서열을 포함하며 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 유지한다. 상기 단백질의 일부는 바람직하게는 본 명세서에서 기술한 것처럼 생물학적 활성 부위이다. 다른 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 MCT 단백질은 서열 목록에서 서열 번호가 짝수인 서열에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 또다른 바람직한 실시 태양에서, MCT 단백질은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 (예, 서열 목록에서 서열 번호가 홀수인 서열)에 혼성화하는 (예를 들어, 엄격 조건 하에서 혼성화하는) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는다. 또다른 바람직한 실시 태양에서, MCT 단백질은 본 발명의 핵산 서열 또는 그의 일부 중 하나와의 상동성이 약 50％, 51％, 52％, 53％, 54％, 55％, 56％, 57％, 58％, 59％ 또는 60％ 이상, 바람직하게는 약 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％ 또는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％ 또는 80％ 이상, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％ 또는 90％ 이상, 또는 91％, 92％, 93％, 94％ 이상이고, 더욱 바람직하게는 약 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는다.또한, 상기 언급된 범위에 대해 중간 정도의 범위 및 동일성 수치 (예를 들어, 70 내지 90% 동일 또는 80 내지 95% 동일)는 본 발명에 포함되는 것이다. 예를 들어, 상기에서 상한치 및(또는) 하한치로 언급된 수치들 중 임의 조합을 이용한 동일성 수치 범위는 본 발명에 포함되는 것이다. 또한, 본 발명의 바람직한 MCT 단백질은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 MCT 활성을 보유하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 MCT 단백질은 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 (예, 엄격 조건 하에서 혼성화)하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하며, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포막의 구성에 필요한 화합물의 대사 또는 이 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있거나, 또는 표 1에 기재된 하나 이상의 활성을 가질 수 있다.

다른 실시 태양에서, MCT 단백질은 실질적으로 본 발명의 아미노산 서열 (예, 서열 목록에서 서열 번호가 짝수인 서열)과 상동성이며, 상기 I란에서 상술한 것처럼 자연적 변이나 돌연변이 발생으로 인하여 아미노산 서열이 다름에도 본 발명의 아미노산 서열 중 하나의 단백질의 기능적 활성을 보유한다. 따라서, 다른 실시 태양에서, MCT 단백질은 본 발명의 전체 아미노산 서열과의 상동성이 약 50％, 51％, 52％, 53％, 54％, 55％, 56％, 57％, 58％, 59％ 또는 60％ 이상, 바람직하게는 약 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％ 또는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％ 또는 80％ 이상, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％ 또는 90％ 이상, 또는 91％, 92％, 93％, 94％ 이상이고, 더욱 바람직하게는 약 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상인 아미노산 서열을 포함하며, 본 명세서에 기술된 MCT 활성 중 하나 이상을 가지고 있다. 또한, 상기 언급된 범위에 대해 중간 정도의 범위 및 동일성 수치 (예를 들어, 70 내지 90% 동일 또는 80 내지 95% 동일)는 본 발명에 포함되는 것이다. 예를 들어, 상기에서 상한치 및(또는) 하한치로 언급된 수치들 중 임의 조합을 이용한 동일성 수치 범위는 본 발명에 포함되는 것이다. 다른 실시 태양에서, 본 발명은 본 발명의 전체 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 전장의 코리네박테리움 글루타미쿰 단백질에 관한 것이다.

MCT 단백질의 생물학적 활성 부위는 MCT 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열 목록에서 서열 번호가 짝수인 서열)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하거나 MCT 단백질과 상동성인 단백질의 아미노산 서열을 포함하며 전장 MCT 단백질 또는 MCT 단백질과 상동성이며 하나 이상의 MCT 단백질 활성을 보이는 전장 단백질보다 적은 수의 아미노산을 함유한다. 전형적으로, 생물학적 활성 부위 (펩티드, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 펩티드)은 MCT 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 또한, 상기 단백질의 다른 영역이 결실되어 다른 생물학적 활성 부위는 재조합 기술에 의해 제조할 수 있으며 본원에서 기술한 하나 이상의 활성을 측정할 수 있다. 바람직하게는, MCT 단백질의 생물학적 활성 부위는 생물학적 활성이 있는 하나 이상의 선택된 도메인/모티프 또는 그의 일부를 포함한다.

MCT 단백질은 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터 (상기 기술된 바와 같음) 내로 클로닝되고, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 (상기 기술된 바와 같음) 내로 도입되고, MCT 단백질은 상기 숙주 세포 내에서 발현된다. 그후 상기 MCT 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 이용하여 적절한 정제 단계를 통해 세포로부터 단리될 수 있다. 재조합 발현과는 별법으로, MCT 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 표준 펩티드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 게다가, 천연 MCT 단백질은, 예를 들어 본 발명의 MCT 단백질 또는 그의 일부를 사용한 표준 방법에 의해 생산될 수 있는 항-MCT 항체를 사용하여 세포 (예, 내피 세포)로부터 단리할 수 있다.

또한 본 발명은 MCT 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 MCT "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비-MCT 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 MCT 폴리펩티드를 포함한다. "MCT 폴리펩티드"란 MCT에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭하며, "비-MCT 폴리펩티드"란 실질적으로 MCT 단백질과 상동성이 없는 단백질, 예를 들어 MCT 단백질과 다르며 동일한 또는 상이한 생물체로부터 유래된 단백질에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 융합 단백질에서, 용어 "작동가능하게 연결된"이란 MCT 폴리펩티드 및 비-MCT 폴리펩티드가 프레임 내에서 서로 융합된 것을 의미한다. 상기 비-MCT 폴리펩티드는 MCT 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서, 융합 단백질은 MCT 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합된 GST-MCT 융합 단백질이다. 그러한 융합 단백질은 재조합 MCT 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있다. 다른 실시 태양에서, 융합 단백질은 그의 N-말단에 이종 신호 서열을 함유하는 MCT 단백질이다. 특정한 숙주 세포 (예, 포유류 숙주 세포) 내에서, MCT단백질의 발현 및(또는) 분비는 이종 신호 서열을 이용함으로써 증가될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 MCT 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 별개의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편을 통상적인 기술에 따라, 예를 들어 라이게이션을 위해 블런트-말단 또는 엇갈린 (stagger-ended) 말단을 이용는데, 적절한 말단을 만들기 위해 제한 효소로 절단하고, 경우에 따라 접착 말단을 채워 넣고, 바람직하지 않은 연결을 피하기 위해 알칼라인 포스파타제를 처리하고, 효소로 라이게이션시킴으로써 동일 프레임 내에 함께 라이게이션시킨다. 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기 등을 사용하는 통상적인 기술로 합성될 수 있다. 별법으로, 2개의 연속된 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행을 생성케하는 앵커 프라이머를 사용하여 유전자 단편을 PCR 증폭할 수 있으며, 이는 추후 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubelet al. John Wiley ＆ Sons: 1992] 참조). 또한, 융합 부분 (예를 들면, GST 폴리펩티드)을 이미 코딩하고 있는 발현 벡터들이 많이 시판되고 있다. MCT 코딩 핵산을 그러한 발현 벡터 내로 클로닝시켜 융합 부분을 MCT 단백질로 동일 프레임 내에서 연결시킬 수 있다.

MCT 단백질의 상동체는 돌연변이유발법, 예를 들어 분별 점 돌연변이 또는 MCT 단백질의 말단의 절단에 의해 생성될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상동체"란, MCT 단백질의 활성에 대한 아고니스트 또는 길항제로 작용하는 MCT 단백질의 변이체 형태를 지칭하는 것이다. MCT 단백질 아고니스트의 생물학적활성은 MCT 단백질의 것과 실질적으로 동일하거나, 그에 버금갈 수 있다. MCT 단백질의 길항제는 예를 들어 MCT 단백질을 포함하는 세포막 성분 대사의 캐스캐이드의 하류 또는 상류 구성원에 경쟁적으로 결합함으로써, 또는 이 막을 통한 화합물의 운반을 조절하는 MCT 단백질과 결합하여 전위를 방지함으로써 MCT 단백질 자연 발생 형태의 활성 하나 이상을 억제할 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 MCT 단백질의 상동체는 MCT 단백질 돌연변이체 (예를 들면, 말단 절단 돌연변이체)의 조합 라이브러리를 MCT 단백질 아고니스트 또는 길항제 활성에 대해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, MCT 변이체의 혼재된 (variegated) 라이브러리는 핵산 수준에서의 조합 돌연변이유발법으로 생성되며, 혼재된 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. MCT 변이체의 혼재된 라이브러리는 예를 들어 합성 올리고뉴클레오티드 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 라이게이션시켜 잠재적 MCT 서열의 다의성 (degenerate) 세트가 개별적인 폴리펩티드로서 발현가능하게 하거나, 별법으로 그 안에 MCT 서열의 세트를 함유한 거대 융합 단백질 (예를 들면, 파지 디스플레이)로서 발현가능하게 할 수 있다. 다양한 방법들을 사용하여 다의성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 MCT 상동체의 라이브러리를 생산할 수 있다. 자동 DNA 합성기를 사용하여 다의성 유전자 서열을 화학적으로 합성할 수 있고, 그 다음, 상기 합성 유전자를 적절한 발현 벡터 내로 라이게이션시킬 수 있다. 유전자 다의성 세트를 이용하면 원하는 세트의 가능한 MCT 서열을 코딩하는 모든 서열을 하나의 혼합물 내에 제공할 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면,문헌 [Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3], 문헌 [Itakuraet al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323], 문헌 [Itakuraet al. (1983) Science 198:1056], 문헌 [Ikeet al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477] 참조).

또한, MCT 단백질 코딩 유전자의 단편 라이브러리를 이용하여 MCT 단백질 상동체에 대한 스크리닝 및 그 후의 선별을 위한 MCT 단편의 혼재된 집단을 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 새김눈 (nick)이 분자 당 약 한 번만 일어나는 조건 하에서 뉴클레아제를 MCT 코딩 서열의 이중 가닥 PCR 단편에 처리하고, 상기 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 상기 DNA를 탈변성 (renaturation)시켜 다른 새김눈 생성물로부터의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성케하고, S1 뉴클레아제를 처리하여 재형성된 이중 가닥으로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 라이게이션시킴으로써 코딩 서열 단편의 라이브러리를 제조할 수 있다. 이 방법에 의해, 다양한 크기를 갖는 MCT 단백질의 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 코딩하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.

점 돌연변이 또는 말단의 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 산물 스크리닝 및 선택된 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리 스크리닝을 위한 몇몇 기술이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 기술은 MCT 상동체의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리를 신속하게 스크리닝하는 데 사용할 수 있다. 가장 널리 사용되는 기술로서, 거대 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 고처리능 분석에서 사용가능한 기술로는 대표적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키고, 원하는 활성의 검출이 검출되는 유전자 산물을 코딩하는 벡터의 단리를 용이하게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 라이브러리 내 기능성 돌연변이의 빈도를 증가시키는 새로운 기술인 재귀적 앙상블 돌연변이유발법 (Recursive ensemble mutagenesis) (REM)을 스크리닝 분석 시험과 함께 사용하여 MCT 상동체를 확인할 수 있다 (문헌 [Arkin and Yourvan (1992)PNAS89:7811-7815], 문헌 [Delgraveet al. (1993)Protein Engineering6(3):327-331] 참조).

또다른 실시양태에서, 당업계에 공지된 방법을 이용한 세포계 분석법을 이용하여 변화된 MCT 라이브러리를 분석할 수 있다.

D. 본 발명의 용도 및 방법

본원에 기재한 핵산 분자, 단백질, 단백질 상동체, 융합 단백질, 프라이머, 벡터 및 숙주세포는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 연관된 생물체의 동정, 코리네박테리움 글루타미쿰과 연관된 생물체의 게놈 맵핑, 코리네박테리움 글루타미쿰의 목적 서열의 동정 및 위치 확인, 진화 연구, 기능에 필요한 MCT 단백질 부위의 결정, MCT 단백질 활성의 조절, 1종 이상의 세포막 성분의 대사 조절, 1종 이상의 화합물의 막횡단 운반의 조절, 및 정밀 화학물질과 같은 목적 화합물의 세포 생산 조절 등의 방법 중 하나 이상에 사용할 수 있다.

본 발명의 MCT 핵산 분자는 다양한 용도를 갖는다. 첫째, 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 그의 가까운 동족체의 존재를 확인하는데 사용할 수 있다. 또한, 혼합된 미생물군에서 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 그의 가까운 동족체의 존재를 확인하는 데에 사용할 수 있다. 본 발명은 단일 또는 혼합된 미생물군 배양물에서 추출한 게놈 DNA를 엄격한 조건하에서 코리네박테리움 글루타미쿰에 고유한 유전자 영역에 걸친 프로브를 사용하여 탐침함으로써 상기 생물체의 존재를 확인할 수 있는 다수의 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 핵산 서열을 제공한다.

코리네박테리움 글루타미쿰 자체는 병원성이 아니지만, 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae)와 관련이 있다. 코리네박테리움 디프테리아는 국부 및 전신성 병변을 수반하여 급속도로 진행되는 급성 발열 감염인 디프테리아의 원인균이다. 이러한 질병에서는, 호흡관 상부에 국소 병변이 발생하고 상피 세포에 괴사성 손상을 수반하고, 바실러스가 독소를 분비하여 상기 병변을 통해 신체 말단에 감염되기 쉬운 조직으로 퍼지게 된다. 심장, 근육 말초 신경, 부신, 신장, 간 및 비장을 비롯한 상기 조직에서 단백질 합성의 억제에 의해 발생하는 퇴행성 변화는 질병의 전신성 병리 현상을 일으킨다. 디프테리아는 아프리카, 아시아, 동유럽 및 구 소련 연합의 독립 국가를 비롯한 세계의 여러 지역에서 높은 발병율을 유지하고 있다. 동유럽 및 구 소련의 독립 국가에서 계속되는 유행성 디프테리아는 1990년 이래 5,000명 이상의 사망자를 가져왔다.

한 실시 태양에서, 본 발명은 개체에서 코리네박테리움 디프테리아의 존재 또는 활성을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 개체에서 본 발명의 1종 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 (서열 목록에 홀수 또는 짝수 서열 번호로 각각 나타냄)을 검출함으로써 개체에서 코리네박테리움 디프테리아의 존재 또는 활성을 검출하는 것을 포함한다. 코리네박테리움 글루타미쿰과 코리네박테리움 디프테리아는관련있는 박테리아이며, 코리네박테리움 글루타미쿰의 많은 핵산 및 단백질 분자는 코리네박테리움 디프테리아의 핵산 및 단백질 분자와 상동성을 가지므로 개체에서 코리네박테리움 디프테리아를 검출하는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 분자는 게놈의 특정 영역의 마커로 기능을 한다. 이러한 기능은 게놈 맵핑뿐 아니라 코리네박테리움 글루타미쿰 단백질의 기능 연구에서도 유용성이 있다. 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈을 절단하여 단편을 DNA 결합 단백질과 인큐베이션시켜, 코리네박테리움 글루타미쿰의 특정 DNA 결합 단백질이 결합하는 게놈 영역을 확인할 수 있다. 단백질에 결합하는 영역은 또한 본 발명의 핵산 분자, 바람직하게는 용이하게 검출할 수 있는 표지로 탐침할 수 있다. 이와 같은 게놈 단편에 대한 핵산 분자의 결합으로 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 맵에 단편의 위치를 정할 수 있으며, 상이한 효소로 여러번 수행하는 경우 단백질이 결합하는 핵산 서열을 신속하고 용이하게 결정한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자는 연관된 종의 서열과 충분한 상동성을 가질 수 있어 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum)과 같은 연관된 박테리아의 게놈 맵을 작성하기 위한 마커로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 MCT 핵산 분자는 진화 및 단백질 구조 연구에 유용하다. 본 발명의 분자가 관여하는 대사 및 에너지 유리 과정은 매우 다양한 원핵 및 진핵 박테리아에 의해 이용된다. 다른 생물체와 유사한 효소를 코딩하는 핵산 분자 서열과 본 발명의 핵산 분자의 서열을 비교함으로써 생물체의 진화 연관성을 평가할 수 있다. 유사하게, 이러한 비교로 서열 영역의 보존 여부를 평가할 수 있으며,이러한 보존 영역은 효소 기능에 필수적인 단백질 영역을 결정하는데 도움이 될 수 있다. 이러한 결정 방법은 단백질 공학에 유용하며, 단백질 기능의 손실없이 유발된 돌연변이에 내성을 가질 수 있는 지를 나타낼 수 있다.

본 발명의 MCT 핵산 분자의 조작으로 야생형 MCT 단백질과는 상이한 기능을 갖는 MCT 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 단백질은 효율 또는 활성이 향상될 수 있으며, 정상 세포보다 과량으로 존재할 수 있거나 효율 또는 활성이 감소될 수 있다.

본 발명은 단백질 자체 또는 MCT 단백질의 기질 또는 결합 파트너와 상호작용시키거나 본 발명의 MCT 핵산 분자의 전사 또는 번역을 조절함으로써 MCT 단백질의 활성을 조절하는 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 본 발명의 1종 이상의 MCT 단백질을 발현하는 생물체를 1종 이상의 시험 화합물과 접촉시켜 MCT 단백질의 활성 또는 발현수준에 대한 각각의 시험 화합물의 효과를 평가한다.

본 발명의 MCT 단백질의 변형에 의해 상기 변형된 단백질을 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 정밀 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율에 직접적으로 영향을 줄 수 있는 여러 기작이 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 대규모 배양으로부터 정밀 화학물질 화합물의 회수는 코리네박테리움 글루타미쿰이 목적 화합물들을 분비하는 경우 상당히 향상되는데, 이는 이 화합물이 배양 배지로부터 (코리네박테리움 글루타미쿰 세포의 집단으로부터 추출한 것과는 반대로) 쉽게 정제될 수 있기 때문이다. 세포로부터 정밀 화학물질을 배출하는 운반체분자의 수 또는 활성을 증가시킴으로써, 세포외 배지 중에 존재하는 생산된 정밀 화학물질의 양을 증가시키고, 따라서 더 쉽게 수획 및 정제할 수 있다. 반대로, 1종 이상의 정밀 화학물질을 효과적으로 과다생산하기 위해서는, 보조인자, 전구체 분자, 및 적절한 생합성 경로를 위한 중간체 화합물의 양을 증가시키는 것이 필요하다. 따라서, 탄소 공급원(즉, 당), 질소 공급원(즉, 아미노산, 암모늄 염), 포스페이트, 및 황 등의 영양분의 유입에 관여하는 운반체 단백질의 수 및(또는) 활성을 증가시킴으로써, 생합성 과정에서 임의 영양분 공급의 제한의 철폐로 인해, 정밀 화학물질의 생산을 증가시킬 수 있다. 또한, 지방산 및 지질은, 이러한 화합물의 생합성에 관여하는 본 발명의 1종 이상의 MCT 단백질의 활성을 최적화하거나 그의 수를 증가시킴으로써 또는 이러한 화합물의 분해에 관여하는 1종 이상의 MCT 단백질의 활성을 감소시킴으로써, 그 자체로 바람직한 정밀 화학물질이며, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 지방산 및 지질 분자의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 MCT 유전자의 조작은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 하나 이상의 목적하는 정밀 화학물질의 생산에 간접적으로 영향을 주는 변형된 활성을 갖는 MCT 단백질을 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, 정상적인 생화학적 대사 과정은 이 동일한 대사 과정을 활성적으로 방해할 수 있는 다양한 폐 생성물(예를 들어, 과산화수소 및 기타 반응성 산소 종)을 생성시킨다(예를 들어, 페록시니트리트는 티로신 측쇄를 질소화함으로써 활성 부위내에 티로신을 갖는 몇몇 효소를 실활화하는 것으로 알려져 있다(Groves,J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol.3(2):226-235)). 이러한 폐 생성물은 통상적으로 배출되며, 대규모 발효 생산에 이용되는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 하나 이상의 정밀 화학물질의 과다생산을 위해 최적화됨으로써 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰에서 통상적으로 생산되는 것보다 더 많은 폐 생성물을 생산할 수 있다. 폐 생성물 분자의 배출에 관여하는 하나 이상의 본 발명의 MCT 분자의 활성을 최적화함으로써, 세포의 생존율을 향상시키고 효과적인 대사 활성을 유지할 수 있다. 또한, 세포내에서 높은 수준으로 존재하는 목적 정밀 화학물질은 실제로 세포에 독성을 띨 수 있어서, 이러한 화합물을 분비하는 세포의 활성을 증가시킴으로써 세포의 생존율을 향상시킬 수 있다.

또한, 적절한 양의 여러 지질 및 지방산 분자가 생산되도록 본 발명의 MCT 단백질을을 조작할 수 있다. 이는 세포막의 지질 조성에 상당한 영향을 줄 수 있다. 각 지질 타입은 다른 물리적 특성을 가질 수 있기 때문에, 막 지질 조성의 변화는 막의 유동성을 상당히 변화시킬 수 있다. 막 유동성의 변화는 막을 통한 분자의 운반에 영향을 줄 수 있으며, 이는, 상기에서 설명한 바와 같이, 폐 생성물 또는 생성된 정밀 화학물질의 유출 또는 필수 영양분의 유입을 변화시킬 수 있다. 이러한 막 유동성의 변화는 세포의 일체성에 상당한 영향을 줄 수도 있으며, 비교적 약한 막을 갖는 세포는 대규모 발효기 환경에서 세포를 손상시키거나 사멸시킬 수 있는 기계적 응력에 대해 보다 치명적이게 된다. 생성된 막이 정밀 화학물질을 생산하는데 이용되는 배양물에 존재하는 환경 조건에 대해 보다 적합하도록 막 구성을 위한 지방산 및 지질의 생산에 관여하는 MCT 단백질을 조작함으로써, 더 높은비율이 코리네박테리움 글루타미쿰이 생존하고 증식하게 된다. 배양물 중 더 많은 수의 코리네박테리움 글루타미쿰은 배양물로부터 정밀 화학물질의 수율, 생산 또는 생산 효율을 더 크게 증가시킨다.

MCT 단백질이 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 정밀 화학물질의 수율을 증가시키기 위한 상기한 돌연변이 유발 방법은 한정적이지 않으며, 이러한 방법의 변형은 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 방법의 이용, 본원에 개시된 기작의 포함, 본 발명의 핵산 및 단백질 분자를 돌연변이된 MCT 핵산 및 단백질 분자를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 연관 균주의 제조에 이용하여 목적하는 화합물의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 향상시킨다. 상기 목적하는 화합물은 생합성 경로의 최종 산물 및 천연 대사 경로의 중간체뿐 아니라 코리네박테리움 글루타미쿰 대사에서는 본래 일어나지 않으나 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 의해 생산되는 분자를 포함한 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 생산되는 모든 산물이 될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되나, 이에 한정되는 것으로 해석해서는 안된다. 본원에 인용된 모든 참고 문헌, 특허 출원, 특허, 공개된 특허 출원의 모든 내용, 표 및 서열 목록은 참고문헌에 포함된다.

실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 전체 게놈 DNA의 프렙

BHI 배지 (Difco 제품) 중의 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032) 배양물을 30℃에서 격렬히 진탕시키면서 밤새 성장시켰다. 원심분리하여 세포를 회수하여 상층액은 버리고, 세포를 5 ml 완충액-I (배양물 처음 부피의 5％에 해당함-나타낸 모든 부피는 배양 부피 100 ml에 대해 계산한 값임) 중에 재현탁했다. 완충액-I의 조성은 다음과 같았다: 140.34 g/L 수크로스, 2.46 g/L MgS0₄×7 H₂O, 10 ml/L KH₂PO₄용액 (100 g/L, KOH를 사용하여 pH 6.7로 조정), 50 ml/L M12 농축물 (10 g/L (NH₄)₂SO₄, 1 g/L NaCl, 2 g/L MgSO₄×7 H₂O, 0.2 g/L CaCl₂, 0.5 g/L 효모 추출물 (Difco 제품), 10 ml/L 미량 원소 혼합물 (200 mg/L FeSO₄×H₂O, 10 mg/L ZnSO₄×7 H₂O, 3 mg/L MnCl₂×4 H₂O, 30 mg/L H₃BO₃, 20 mg/L CoCl₂×6 H₂O, 1 mg/L NiCl₂×6 H₂O, 3 mg/L Na₂MoO₄×2 H₂O, 500 mg/L 착화제 (EDTA 또는 시트르산), 100 ml/L 비타민 혼합물 (0.2 mg/L 비오틴, 0.2 mg/L 엽산, 20 mg/L p-아미노 벤조산, 20 mg/L 리보플라빈, 40 mg/L ca-판토테네이트, 140 mg/L 니코틴산, 40 mg/L 피리독솔 히드로클로라이드, 200 mg/L 미오-이노시톨). 상기 현탁액에 리소짐을 최종 농도 2.5 mg/ml로 첨가했다. 37℃에서 대략 4 시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 세포벽을 파괴하고 원심분리하여, 원형질체를 수거했다. 펠렛을 5 ml 완충액-I으로 1 회 세척하고, 5 ml TE-완충액 (10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8)으로 1 회 세척했다. 펠렛을 4 ml TE-완충액 중에 재현탁하고, 0.5 ml SDS 용액 (10％) 및 0.5 ml NaCl 용액 (5 M)을 첨가했다. 프로테이나제 K를 최종 농도 200 ㎍/ml로 첨가한 다음, 상기 현탁액을 37℃에서 약 18 시간 동안 인큐베이션시켰다. 표준 방법을 이용하여, 페놀, 페놀-클로로포름-이소아밀알콜 및 클로로포름-이소아밀알콜로 추출하여 DNA를 정제했다. 그 다음, 1/50 부피의 3 M 아세트산 나트륨 및 2 배 부피의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킨 후, -20℃에서 30 분 동안 인큐베이션시키고, SS34 회전자 (Sorvall 제품)를 사용한 고속 원심분리기로 12,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리했다. 상기 DNA를 20 ㎍/ml RNaseA를 함유한 1 ml TE-완충액 중에 용해시키고, 4℃에서 3 시간 이상 동안 1000 ml TE-완충액 중에 투석했다. 투석 동안, 상기 완충액을 3 회 갈아주었다. 투석된 DNA 용액을 0.4 ml씩 분취하여, 0.4 ml 2 M LiCl 및 0.8 ml 에탄올을 첨가했다. -20℃에서 30 분 동안 인큐베이션시킨 다음, 원심분리 (13,000 rpm, 독일 하나우 헤래우스 소재의 Biofuge Fresco 제품)하여 DNA를 수집했다. DNA 펠렛을 TE-완충액 중에 용해했다. 이 방법으로 프렙된 DNA를 서던 블럿팅 또는 게놈 라이브러리 제작 등의 모든 목적에 이용했다.

실시예 2: 대장균에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 라이브러리 제작

실시예 1에 기재한 바와 같이 프렙된 DNA를 사용하여, 공지되고 수립된 방법 (예를 들면, 문헌 [Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons] 참조)에따라 코스미드 및 플라스미드 라이브러리를 제작했다.

임의의 플라스미드 또는 코스미드를 사용할 수 있었다. 특히, 플라스미드 pBR322 (문헌 [Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741]); pACYC177 (문헌 [Change ＆ Cohen (1978) J. Bacteriol 134:1141-1156]), pBS 계열의 플라스미드 (pBSSK+, pBSSK- 등; 문헌 [Stratagene, LaJolla, USA]), 또는 SuperCos I (문헌 [Stratagene, LaJolla, USA]) 또는 Lorist6 (문헌 [Gibson, T.J., Rosenthal A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53:283-286]) 등의 코스미드를 사용했다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 유전자 라이브러리는 플라스미드 pSL 109 (문헌 [Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4:256-263])를 사용하여 제작할 수 있다.

실시예 3: DNA 서열분석 및 컴퓨터를 이용한 기능 분석

실시예 2에 기재한 바와 같은 게놈 라이브러리를 사용하여, 표준 방법에 따른 DNA 서열분석, 특히 ABI377 서열분석기를 사용한 쇄 종결 방법 (예를 들면, 문헌 [Fleischman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science, 269:496-512)에 의한 DNA 서열분석을 수행했다. 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열분석 프라이머를 사용했다: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' (서열 677) 또는 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (서열 678).

실시예 4: 생체내 돌연변이유발법

코리네박테리움 글루타미쿰의 생체내 돌연변이유발법은 완전한 유전 정보 유지 능력이 손상된 대장균 또는 다른 미생물 (예를 들면, 바실루스 종 (Bacillus spp.) 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모)에 플라스미드 (또는 다른 벡터) DNA를 계대접종하여 수행할 수 있다. 전형적인 돌연변이유발 균주는 DNA 복구 시스템에 관한 유전자 (예를 들면, mutHLS, mutD, mutT 등; 참고를 위해서는, 문헌 [Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in:Escherichia coliandSalmonella, p.2277-2294, ASM: Washington]을 참조한다)에 돌연변이가 있다. 이러한 균주들은 당업자에게 공지되어 있다. 이런 균주의 사용법은 예를 들어, 문헌 [Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34]에 설명되어 있다.

실시예 5: 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰 사이의 DNA 전달

여러 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종은 자율적으로 복제되는 내인성 플라스미드 (예를 들면, pHM1519 또는 pBL1 등)를 함유하고 있다 (이에 관해 살펴보기 위해서는, 예를 들어 문헌 [Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146]을 참조한다). 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 셔틀 벡터는 코리네박테리움 글루타미쿰을 위한 복제 기점 및 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 적당한 마커를 첨가한, 대장균에 사용하는 표준 벡터 (문헌 [Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons])를 사용하여 쉽게 제작할 수 있다. 상기 복제 기점은 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종에서단리한 내인성 플라스미드로부터 얻는 것이 바람직하다. 특히, 상기 종에 관한 형질전환 마커로 사용하는 유전자는 카나마이신 내성 유전자 (예를 들면, Tn5 또는 Tn903 트란스포손 등에서 유래) 또는 클로람페니콜 내성 유전자 (문헌 [Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim])이다. 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰 모두에서 복제되고, 유전자 과다발현 등을 포함하는 여러 목적에 사용할 수 있는 매우 다양한 셔틀 벡터의 제작법에 관한 수많은 문헌이 있다 (참고를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162:591-597], 문헌 [Martin J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146] 및 문헌 [Eikmanns, B.J. et al. (1991) Gene, 102:93-98]을 참조한다).

표준 방법을 사용하여, 관심 유전자를 상기 기재된 셔틀 벡터들 중 하나에 클로닝하고 이러한 하이브리드 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환은 원형질체 형질전환법 (문헌 [Kastsumata, R. et al. (1984) J. Bacteriol. 159:306-311]), 전기천공법 (문헌 [Liebl, E. et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53:399-303]) 및 특정 벡터가 사용되는 경우에는 접합법 (예를 들면, 문헌 [Schaefer, A et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1663-1666]에 기재된 바와 같음)에 의해서도 달성될 수 있다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 플라스미드 DNA를 프렙 (당업계에 공지된 표준 방법을 사용)하고, 이것을 대장균으로 형질전환시켜 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 셔틀 벡터를 대장균에 전달할 수도 있다. 이러한 형질전환 단계는 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있지만, NM522 (문헌 [Gough ＆ Murray (1983) J. Mol. Biol. 166:1-19]) 등과 같은 Mcr-결핍 대장균 균주를 사용하는 것이 유리하다.

pCGl (문헌 [미국 특허 제4,617,267호]) 또는 이의 단편, 및 경우에 따라 TN903으로부터의 카나마이신 내성 유전자 (문헌 [Grindley, N.D. and Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (12):7176-7180])를 포함하는 플라스미드를 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 유전자를 과다발현시킬 수 있다. 또한, 플라스미드 pSL 109 (문헌 [Lee, H.-S. and A.J.Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4:256-263])를 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 유전자를 과다발현시킬 수 있다.

복제성 플라스미드를 사용하는 것 이외에도, 유전자 과다발현은 게놈으로의 통합으로 달성될 수도 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 다른 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 종에서의 게놈 통합은 게놈 영역(들)과의 상동성 재조합, 제한 엔도뉴클레아제 매개 통합 (REMI) (예를 들어 문헌 [독일 특허 제19823834호] 참조), 또는 트란스포손을 사용하는 등의 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 위치 지정 방법 (예를 들면, 상동성 재조합) 또는 무작위 사건에 기초한 방법 (예를 들면, 트란스포손 돌연변이유발법 또는 REMI)을 사용한 서열의 변형, 삽입, 또는 결실에 의해 조절 영역 (예를 들면, 프로모터, 억제자, 및(또는) 인핸서)을 변형하여 관심 유전자의 활성을 조정할 수도 있다. 또한, 전사 종결자로 기능하는 핵산 서열을 본 발명의 유전자 하나 이상의 코딩 영역 3'에 삽입할 수도 있다; 이러한 종결자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌 [Winnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology. VCH: Weinheim]에 기재되어 있다.

실시예 6: 돌연변이 단백질의 발현 평가

돌연변이된 단백질이 형질전환된 숙주 세포에서 그 단백질의 활성을 관찰한 결과, 상기 돌연변이 단백질이 야생형 단백질과 유사한 방식 및 유사한 양으로 발현된다는 사실을 알아냈다. 돌연변이 유전자의 전사 수준 (유전자 산물로의 번역에 이용가능한 mRNA 양에 관한 지표)을 확인하는 유용한 방법은 노던 블럿팅 (참고를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York]을 참조한다)을 수행하는 것인데, 이는 생물 배양물의 전체 RNA를 추출하여 겔상에서 전개시키고, 이를 안정한 매트릭스로 전달한 후, 관심 유전자에 결합하도록 고안하여 검출가능한 태그 (통상적으로 방사성 또는 화학발광성 태그)로 표지한 프라이머와 인큐베이션시켜, 상기 프로브의 결합 및 그 결합량이 상기 관심 유전자의 mRNA 존재 여부 및 양을 또한 지시하는 방법이다. 이러한 정보는 돌연변이 유전자의 전사 정도에 관한 증거가 된다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포내 전체 RNA는 예를 들면, 문헌 [Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326]에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 여러 방법들을 이용하여 프렙할 수 있다.

이 mRNA로부터 번역된 단백질의 존재 여부 또는 그 상대량을 평가하기 위해서는, 웨스턴 블럿팅과 같은 표준 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York]을 참조한다). 이 방법에서, 세포내 전체 단백질을 추출하고, 겔 전기영동법으로 분리한 후, 이를 니트로셀룰로스 등과 같은 매트릭스로 전달하여, 원하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 등의 프로브와 인큐베이션시킨다. 통상적으로, 이 프로브는 쉽게 검출될 수 있는 화학발광성 또는 비색성 표지로 태그된 것이다. 관찰된 표지의 존재 여부 및 양은 그 세포 내에서 원하는 돌연변이 단백질의 존재 여부 및 양을 지시한다.

실시예 7: 유전적으로 변형된 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장-배지 및 배양 조건

유전적으로 변형된 코리네박테리아를 합성 또는 천연 성장 배지에서 배양한다. 코리네박테리아의 수많은 상이한 성장 배지는 당업계에 공지되어 있으며, 또한 쉽게 이용가능하다 (문헌 [Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32:205-210], 문헌 [von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16], 문헌 [독일 특허 제4,120,867호], 문헌 [Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag]). 상기 배지는 1 종 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 미량 원소로 구성된다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류, 또는 다당류 등의 당이다. 예를 들면, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 녹말 또는 셀룰로스가 매우 훌륭한 탄소 공급원으로 기능한다. 또한, 당 정제시 생성되는 당밀 또는 기타 부산물 등과 같은 복합 화합물 등을 통해 당을 배지에 공급할 수도 있다. 또한, 상이한 탄소 공급원들의 혼합물을 공급하는 것도 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 락트산 등의 알콜 및 유기산이다. 질소 공급원은 통상적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이러한 화합물을 함유하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 또는 NH₄Cl 또는 (NH₄)₂SO₄, NH₄0H 등의 암모니아염, 질산염, 우레아, 아미노산 또는 옥수수 침유 (steep liquor), 대두 가루, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등의 복합 질소 공급원 등이 있다.

배지에 포함될 수 있는 무기 염 화합물로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염산염, 인산염, 또는 황산염 등이 있다. 킬레이트 화합물을 배지에 첨가하여 금속 이온을 용액 상태로 유지할 수 있다. 특히 유용한 킬레이트 화합물로는 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트 등의 디히드록시페놀, 또는 시트르산 등의 유기산 등이 있다. 또한, 통상적으로 배지에는 비타민 또는 성장 촉진제 등의 다른 성장 요소가 포함되어 있고, 이들의 예로는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토페네이트 및 피리독신 등이 있다. 성장 요소 및 염은 흔히 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침유 등과 같은 복합 배지 성분에서 생긴다. 배지 화합물의 정확한 조성은 이후의 실험에 따라 크게 달라지고, 각각의 특정 경우마다 따로 결정된다. 배지의 최적화에 관한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (eds. P.M. Rhodes, P.F.Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 찾을 수 있다. 또한, 스탠다드 1 (Merck 제품) 또는 BHI (곡물 속 침출물, DIFCO 제품) 등과 같이 제조 회사로부터의 성장배지 중에서 선택할 수도 있다.

모든 배지 성분들을 열처리 (1.5 bar 및 121℃에서 20 분) 또는 멸균 여과로 멸균시킨다. 이 성분들을 한꺼번에 멸균하거나, 필요에 따라 따로따로 멸균할 수 있다. 모든 배지 성분들은 배양 초기부터 존재하거나, 경우에 따라 연속적으로 또는 배치식으로 (batchwise) 첨가될 수 있다.

배양 조건은 각 실험마다 따로 정의된다. 온도는 15℃와 45℃ 사이의 범위여야 한다. 온도는 일정하게 유지하거나 실험하는 동안 변경할 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 약 7.0이어야 하며, 배지에 완충액을 첨가하여 유지시킬 수 있다. 이러한 목적으로 사용할 수 있는 완충액의 예로는 인산 칼륨 완충액 등이 있다. MOPS, HEPES, ACES 등과 같은 합성 완충액을 대안적으로 사용하거나 동시에 사용할 수 있다. 또한, 배양하는 동안 NaOH 또는 NH₄OH를 첨가하여 배양물의 pH를 일정하게 유지시킬 수도 있다. 효모 추출물 등의 복합 배지 성분이 사용되는 경우, 많은 복합 화합물들은 완충 성능이 높기 때문에, 추가의 완충액에 대한 요구를 감소시킬 수 있다. 미생물 배양에 발효기를 사용하는 경우, pH는 암모니아 기체를 사용하여 제어할 수도 있다.

인큐베이션 시간 범위는 통상적으로 수 시간 내지 수 일이다. 이 시간은 브로스 (broth)에 축적되는 생성물의 양이 최대가 되도록 선택한다. 개시한 배양 실험을 상이한 크기의 마이크로타이터 플레이트, 유리관, 유리 플라스크 또는 유리 또는 금속 발효기 등의 다양한 용기에서 수행할 수 있다. 수많은 클론을 스크리닝하기 위해서는, 미생물을 배플 (baffle)이 있거나 없는 마이크로타이터 플레이트, 유리관 또는 진탕 플라스크에서 배양해야 한다. 요구되는 성장 배지를 100 ml 진탕 플라스크에 10％ (부피비) 채워 사용하는 것이 바람직하다. 이 플라스크들은 속도 범위 100-300 rpm의 회전 진탕기 상에서 진탕 (진폭 25 mm)되어야 한다. 증발에 의한 손실량은 대기를 습하게 유지함으로써 감소될 수 있다; 별법으로, 증발에 의한 손실량을 정확하게 보정해야 한다.

유전적으로 변형된 클론을 시험하는 경우, 비변형된 대조 클론 또는 임의의 인서트가 없는 기본 플라스미드를 함유하는 대조 클론도 시험해야 한다. 30℃에서 인큐베이션한 CM 플레이트 (10 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaCl, 2 g/L 우레아, 10 g/L 폴리펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L 육류 추출물, 22 g/L 아가, 2 M NaOH을 사용하여 pH 6.8로 조정) 등과 같은 아가 플레이트 상의 세포를 OD₆₀₀0.5-1.5이 되도록 배지에 접종한다. 배지 접종은 CM 플레이트로부터의 코리네박테리움 글루타미쿰 세포의 염수 현탁액을 도입하거나, 이 박테리아의 예비배양물을 첨가하여 수행한다.

실시예 8: 돌연변이 단백질의 기능에 관한 시험관내 분석

효소의 활성 및 반응 속도 파라미터의 측정 방법은 당업계에 잘 수립되어 있다. 임의의 주어진 변경된 효소의 활성 측정 실험은 야생형 효소의 비활성(比活性)에 맞추어야 하며, 당업자라면 이를 잘 수행할 수 있다. 효소의 구조, 반응 속도, 원리, 방법, 적용에 관한 구체적인 세부사항 뿐 아니라 효소에 관한 통상적인 개요 및 많은 효소들의 활성 측정 방법의 예를 하기의 참고문헌 등에서 찾을 수 있다: 문헌 [Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York], 문헌 [Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: SanFrancisco], 문헌 [Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford], 문헌 [Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3^rded. Academic Press: New York], 문헌 [Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^nded. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325)], 문헌 [Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^rded., vol.I-XII, Verlag Chemie: Weinheim], 및 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol.A9, "Enzymes". VCH: Weinheim, p.352-363].

DNA에 결합하는 단백질 활성은 DNA 밴드-변위 분석법 (겔 지연 분석법 (gel retardation assays)으로 지칭되기도 함) 등과 같이 잘 수립된 여러 방법들을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 단백질들이 다른 분자들의 발현에 미치는 영향은 리포터 유전자 분석법 (예를 들면, 문헌 [Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14:3895-3904] 및 이 문헌에서 인용한 참고 문헌에 기재된 바와 같음)을 사용하여 측정할 수 있다. β-갈락토시다제 등의 효소, 녹색 형광 단백질 및 기타 여러가지를 사용하는 리포터 유전자 시험 시스템은 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에의 적용에 대해 공지되어 있으며, 잘 수립되어 있다.

막 수송 단백질의 활성 측정은 문헌 [Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, p.85-137, 199-234, 및 270-322]에 기재된 기술 등에 따라 수행될 수 있다.

실시예 9: 원하는 생성물 생산에 대한 돌연변이 단백질의 영향 분석

코리네박테리움 글루타미쿰에서의 유전적 변형이 원하는 화합물 (예를 들면, 아미노산)의 생산에 미치는 영향은 변형된 미생물을 적당한 조건 (예를 들면, 상기 기재한 바와 같음) 하에 배양하고, 원하는 생성물 (즉, 아미노산)의 생성 증가에 관여한 배지 성분 및(또는) 세포내 성분을 분석하여 평가할 수 있다. 이러한 분석 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 분광분석법, 박층크로마토그래피법, 각종 염색법, 효소적 및 미생물학적 방법, 및 고성능 액체 크로마토그래피법 등과 같은 분석용 크로마토그래피법 등이 있다 (예를 들면, 문헌 [Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.A2, p.89-90 및 p.443-613, VCH: Weinheim (1985)], 문헌 [Fallon, A. et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17], 문헌 [Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol.3, Chapter III: "Product recovery and purification", page 469-714, VCH: Weinheim], 문헌 [Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley andSons], 문헌 [Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons], 문헌 [Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim], 및 문헌 [Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications] 참조).

최종 발효 생성물의 측정 뿐 아니라, 중간체 및 부산물 등과 같이 원하는 화합물의 생성에 이용된 대사 경로 중의 다른 성분들의 분석, 전체적인 화합물 생성 효율의 측정 또한 가능하다. 분석 방법으로는 배지 내의 영양분 (예를 들면, 당, 탄화수소, 질소 공급원, 인산염 및 기타 이온) 함량 측정, 생물집단 (biomass)의 조성 및 증식량 측정, 생합성 경로의 공통 대사물질의 생성 분석, 및 발효 동안에 생성된 기체 측정 등이 있다. 이러한 측정을 위한 표준 방법은 문헌 [Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M.Rhodes and P.F.Stanbury, eds., IRL Press, p.103-129, 131-163, 및 165-192 (ISBN:0199635773) 및 이 문헌에서 인용한 참고 문헌]에 약술되어 있다.

실시예 10: 코리네박테리움 글루타미쿰 배양물로부터의 원하는 생성물 정제

당업계에 공지된 각종 방법을 사용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 또는 상기 기재한 배양물의 상층액으로부터 원하는 생성물을 회수할 수 있다. 원하는 생성물이 세포로부터 분비되지 않는 경우, 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 수거하고, 기계적인 힘 또는 초음파 등의 표준 기술로 세포를 용균시킬 수 있다.원심분리로 세포 부스러기를 제거하고, 가용성 단백질을 함유하는 상층액 부분은 남겨 원하는 화합물의 추가의 정제에 사용한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 세포로부터 생성물이 분비되는 경우, 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 제거하고, 상층액 부분은 남겨 추가의 정제에 사용한다.

상기 두 가지 정제 방법 중 임의의 방법에 의한 상층액 부분을 적당한 수지를 사용한 크로마토그래피에 적용하여, 원하는 분자는 크로마토그래피 수지 상에 남지만 샘플 중의 많은 불순물은 남지 않게 하거나, 불순물들은 수지에 남지만 원하는 분자는 남지 않게 한다. 필요에 따라, 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 사용하여 이러한 크로마토그래피 단계를 반복할 수 있다. 당업자라면, 적합한 크로마토그래피 수지를 선택하고 특정 분자의 정제에 대해 가장 효과적으로 이를 적용하는 것에 숙달되어 있을 것이다. 정제된 생성물을 여과법 또는 한외여과법으로 농축시켜, 생성물의 안정성이 최대가 되는 온도에 보관할 수 있다.

당업계에 공지된 정제 방법은 다양하며, 상기 기재한 정제법에 제한되지 않는다. 이러한 정제 기술은 예를 들어 문헌 [Bailey, J.E. ＆ Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)]에 기재되어 있다.

단리된 화합물의 확인 및 순도는 당업계의 표준 기술로 평가될 수 있다. 여기에는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)법, 분광분석법, 염색법, 박층 크로마토그래피법, NIRS, 효소적 분석법, 또는 미생물학적 방법 등이 있다. 상기 분석 방법은 하기 문헌에서 검토된다: 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ.Microbiol. 60:133-140], 문헌 [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32], 문헌 [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70], 문헌 [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol.A27, VCH: Weinheim, p.89-90, p.521-540, p.540547, p.559-566, p.575-581 및 p.581-587], 문헌 [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons], 및 문헌 [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17].

실시예 11: 본 발명의 유전자 서열 분석

서열 비교 및 2 가지 서열 사이의 상동성 (％) 측정은 당업계에 공지된 기술이며, 이는 문헌 [Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68]의 알고리즘을 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77]에서와 같이 변형시킨 알고리즘 등의 수리적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 알고리즘을 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)에 도입한다. 스코어 = 100, 워드렝쓰 (wordlength) = 12의 NBLAST 프로그램으로 BLAST 뉴클레오티드를 검색하여 본 발명의 MCT 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. 스코어 = 50, 워드렝쓰 = 3의 XBLAST 프로그램으로 BLAST 단백질을 검색하여 본 발명의 MCT 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 갭BLAST를 이용하여 비교용 갭 정렬을 얻을 수 있다. 당업자라면, BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용할 때, 분석할 구체적인 서열에 대해 프로그램 (예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 파라미터를 최적화하는 방법을 알 것이다.

서열 비교에 이용되는 수리적 알고리즘의 다른 예로는 문헌 [Meyers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘이 있다. 이 알고리즘을 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)에 도입한다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM 120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12, 및 갭 패널티 4를 사용할 수 있다. 추가의 서열 분석용 알고리즘이 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Torelli and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]에 기재된 ADVANCE 및 ADAM., 및 문헌 [Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8]에 기재된 FASTA를 포함한다.

또한, 2 개의 아미노산 서열 사이의 상동성 (％) 비교는 Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 중량 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 중량 2, 3, 또는 4를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램을 사용하여 수행할 수도 있다. 2 개의 핵산 서열 사이의 상동성 (％) 비교는 갭 중량 50 및 길이 중량 3 등의 표준 파라미터로 GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다.

당업계에 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 유전자 서열과 젠뱅크 (Genbank)의 유전자 서열을 비교 분석했다 (예를 들면, 문헌 [Bexevanis and Ouellette, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis ofGenes and Proteins. John Wiley and Sons: New York] 참조). 본 발명의 유전자 서열과 젠뱅크의 유전자 서열을 3-단계 방법으로 비교했다. 제1단계에서, 본 발명의 서열 각각을 젠뱅크의 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 분석 (예를 들면, 국소 정렬 분석)하고, 추가의 분석을 위해 상위 500 개의 히트 (hit)를 남겨 두었다. 그 다음에, 상기 500 히트에 대해 FASTA 검색 (예를 들면, 서열 중 한정된 영역을 정렬하는, 조합된 국소 및 전반적 정렬 분석)을 수행했다. 이어서, GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램을 사용하여 (표준 파라미터 사용), 본 발명의 각 유전자 서열을 상위 3 개의 FASTA 히트 각각에 전반적으로 정렬했다. 정확한 결과를 얻기 위해서, 젠뱅크에서 선별한 서열들의 길이를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 해당 서열의 길이에 맞춰 조정했다. 상기 분석 결과를 표 4에 기재했다. 이렇게 얻은 데이타는 GAP (전반적) 분석 단독만을 수행하여 본 발명의 각 유전자를 젠뱅크의 참고 서열 각각과 비교하여 얻은 데이터와 동일하였으나, 상기 데이타베이스 - 광범위한 GAP (전반적) 분석과 비교할 때, 필요한 컴퓨터 이용 시간은 훨씬 감소했다. 본 발명의 서열 중 정렬이 되지 않은 것은 표 4에서 정렬 정보가 없는 컷오프 (cutoff) 값으로 나타냈다. 또한, 당업자라면, 표 4에서 GAP 정렬 상동성 (％)을 "상동성 (％) (GAP)"란 표제 하에 유럽식 숫자 포맷으로 열거하였으며, 여기서, ','는 소수점을 의미한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 이 단(段)에서 "40,345"란 값은 "40.345％"를 뜻한다.

실시예 12: DNA 미세배열체의 제작 및 시행

본 발명의 서열은 DNA 미세배열체 (microarray) (DNA 배열체 (array)의 고안, 방법, 및 용도는 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Schena, M. et al. (1995) Science 270:467-470], 문헌 [Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367], 문헌 [DeSaizieu, A. et al. (1998) Nature Biotechnology 16:45-48], 및 문헌 [DeRisi, J.L. et al. (1997) Science 278:680-686)] 등에 기재되어 있음)의 제작 및 적용에 추가로 이용될 수 있다.

DNA 미세배열체는 니트로셀룰로스, 나일론, 유리, 실리콘, 또는 기타 물질로 구성된 고체 또는 유연한 지지체이다. 핵산 분자들은 이 표면에 순차적인 방식으로 부착될 수 있다. 적절하게 표지한 후, 다른 핵산 또는 핵산 혼합물을 상기 고정된 핵산 분자에 혼성화시킬 수 있고, 상기 표지를 이용하여 한정된 영역에서 혼성화된 분자들의 개별적 신호 강도를 모니터링하고 측정할 수 있다. 이 방법을 이용하면, 적용한 핵산 샘플 또는 혼합물 중의 모든 핵산 또는 선택된 핵산의 상대량 또는 절대량을 동시에 정량할 수 있다. 그러므로, DNA 미세배열체는 대량의 (6800 개 이상) 핵산 발현의 동시 분석을 가능케한다 (예를 들면, 문헌 [Schena, M. (1996) BioEssays 18 (5):427-431] 참조).

본 발명의 서열은 중합효소 연쇄 반응 등의 핵산 증폭 반응으로 1 종 이상의 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 한정된 영역을 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 고안에 이용될 수 있다. 5' 또는 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 적절한 링커 (linker)의 선택 및 고안으로 PCR 산물을 상기 기재한 (또한, 예를 들어 문헌 [Schena, M. et al. (1995) Science 270:467-470]에도 기재되어 있음) 지지체 매질의 표면에 공유결합으로 부착할 수 있다.

또한, 핵산 미세배열체는 문헌 [Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367]에 기재된 바와 같이, 계내 올리고뉴클레오티드 합성법으로 제작될 수도 있다. 사진석판법 (photolithographic method)에 따라, 정확히 한정된 영역의 매트릭스를 빛에 노출시킨다. 이로써, 빛에 불안정한 보호기가 활성화되어 뉴클레오티드 첨가가 일어나지만, 빛이 차폐된 영역에는 어떠한 변형도 일어나지 않는다. 그 후의 보호 및 광 활성화 사이클에 의해 한정된 위치에서 상이한 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 본 발명의 유전자의 작은 한정 영역을 미세배열체 상에서의 고상 올리고뉴클레오티드 합성법으로 합성할 수 있다.

샘플 또는 뉴클레오티드 혼합물에 존재하는 본 발명의 핵산 분자는 미세배열체와 혼성화할 수 있다. 이러한 핵산 분자들은 표준 방법에 따라 표지될 수 있다. 간략하게, 동위원소 또는 형광 표지한 뉴클레오티드를 예를 들어, 역전사 동안 또는 DNA 합성 동안 혼입하여 핵산 분자 (예를 들면, mRNA 분자 또는 DNA 분자)를 표지한다. 표지된 핵산을 미세배열체에 혼성화하는 방법은 문헌 (예를 들어, 문헌 [Schena, M. et al. (1995) 상기 문헌], 문헌 [Wodicka, L. et al. (1997), 상기 문헌] 및 문헌 [DeSaizieu A. et al. (1998), 상기 문헌])에 기재되어 있다. 혼성화된 분자의 검출 및 정량화 방법은 혼입된 특정 표지에 따라 달라진다. 방사성 표지는 예를 들어, 문헌 [Schena, M. et al. (1995) 상기 문헌]에 기재된 방법으로 검출할 수 있고, 형광 표지는 예를 들어, 문헌 [Shalon et al. (1996) Genome Research 6:639-645]의 방법으로 검출할 수 있다.

상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 서열을 DNA 미세배열체 기술에 적용하면상이한 균주의 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 다른 코리네박테리아를 비교 분석할 수 있다. 예를 들어, 개개의 전사체 프로필에 기초한 균주들 사이의 변이체 연구 및 병원성, 생산성 및 스트레스 내성 등과 같은 특정 및(또는) 원하는 균주 특성에 중요한 유전자의 확인은 핵산 배열법으로 용이해진다. 또한, 핵산 배열 기술을 사용하여, 발효 반응 과정 동안 본 발명의 유전자 발현 프로필을 비교할 수 있다.

실시예 13: 세포내 단백질 집단의 동력학(動力學) 분석 (프로테오믹스)

본 발명의 유전자, 조성물, 및 방법을 '프로테오믹스 (proteomics)'라 지칭되는, 단백질 집단의 상호작용 및 동력학 연구에 적용할 수 있다. 관심 단백질 집단에는 코리네박테리움 글루타미쿰의 전체 단백질 집단 (예를 들면, 다른 생물의 단백질 집단과의 비교시), 특정 환경 조건 또는 대사 조건 (예를 들면, 발효동안, 고온 또는 저온에서, 또는 높은 pH 또는 낮은 pH) 하에서 활성인 단백질 집단, 또는 성장 및 발생의 특정 시기 동안 활성인 단백질 집단 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

겔 전기영동법 등의 각종 공지된 기술로 단백질 집단을 분석할 수 있다. 세포내 단백질은 용균 또는 추출 등으로 얻을 수 있고, 다양한 전기영동 기술을 사용하여 서로 분리해낼 수 있다. 소듐 도데실 술페이트 (sodium dodecyl sulfate) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)은 단백질들을 주로 이들의 분자량에 따라 분리한다. 등전점 포커싱 (isoelectric focusing) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (IEF-PAGE)은 단백질들을 그들의 등전점에 따라 분리한다 (아미노산 서열 뿐 아니라 그 단백질의 번역후 변형체도 분리해냄을 의미함). 또한, 더욱 바람직한 단백질 분석법은 2D-겔 전기영동법으로 공지된, IEF-PAGE 및 SDS-PAGE 둘다의 연속 병행법이다 (예를 들면, 문헌 [Hermann et al. (1998) Electrophoresis 19:3217-3221], 문헌 [Fountoulakis et al. (1998) Electrophoresis 19:1193-1202], 문헌 [Langen et al. (1997) Electrophoresis 18:1184-1192], 문헌 [Antelmann et al. (1997) Electrophoresis 18:1451-1463]에 기재되어 있음). 또한, 모세관 겔 전기영동법 등과 같이 당업계에 공지된 다른 분리 기술을 이용하여 단백질을 분리할 수도 있다.

이러한 방법으로 분리된 단백질을 염색 또는 표지 등의 표준 기술로 가시화할 수 있다. 적당한 염색약은 당업계에 공지되어 있으며, 쿠마시 브릴리안트 블루, 실버 염색약, 또는 시프로 루비 (Sypro Ruby) (Molecular Probes 제품) 등과 같은 형광 염료 등이 있다. 방사성 표지된 아미노산 또는 기타의 단백질 전구체 (예를 들면,³⁵S-메티오닌,³⁵S-시스테인,¹⁴C-표지된 아미노산,¹⁵N-아미노산,¹⁵NO₃또는¹⁵NH₄ ⁺또는¹³C-표지된 아미노산)를 코리네박테리움 글루타미쿰 배지에 포함시키면, 세포로부터의 단백질을 분리해내기 전에 이들을 표지할 수 있다. 유사하게, 형광 표지를 이용할 수 있다. 이렇게 표지된 단백질을 상기 기재한 기술에 따라 추출, 단리 및 분리할 수 있다.

상기 기술로 가시화된 단백질은 사용된 염료 또는 표지의 양을 측정하여 더욱 분석될 수 있다. 주어진 단백질의 양은 광학적 방법 등을 이용하여 정량적으로 측정할 수 있고, 동일 겔 또는 다른 겔 중의 다른 단백질 양과 비교할 수 있다. 광학적 비교법, 분광법, 이미지 스캐닝 및 겔 분석, 또는 사진용 필름 및 스크린의 사용 등을 통해 겔 상의 단백질을 비교할 수 있다. 상기 기술들은 당업계에 공지되어 있다.

임의의 주어진 단백질이 무엇인지 결정하기 위해, 직접적인 서열분석법 또는 다른 표준 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, N- 및(또는) C-말단 아미노산 서열분석법 (예를 들면, 에드만 분해법) 및 질량 분광분석법 (특히, MALDI 또는 ESI 기술 (예를 들면, 문헌 [Langen et al. (1997) Electrophoresis 18:1184-1192] 참조))을 이용할 수 있다. 이러한 기술들을 사용하여, 본원에서 제공되는 단백질 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰 단백질 확인에 사용할 수 있다.

상기 방법으로 얻은 정보를 사용하여 각종 생물학적 조건 (예를 들면, 상이한 생물, 발효 시점, 배지 조건, 또는 서로간의 상이한 환경 (biotope))으로부터의 상이한 샘플들 사이에서 단백질 존재 여부, 활성 또는 변형의 양상들을 비교할 수 있다. 상기 실험 단독으로 또는 다른 기술들과 병행하여 얻어진 데이타는 주어진 상태 (예를 들면, 대사 상태)에서 각종 생물의 반응 비교, 정밀 화학물질을 생성하는 균주의 생산성 증가, 또는 정밀 화학물질의 생성 효율 증가 등 여러가지 목적을 위해 적용할 수 있다.

등가법

당업자라면, 일상적인 실험 방법 뿐 아니라 본원에 기재한 본 발명의 특정실시양태와 등가인 많은 실험 방법들을 알고 있거나, 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 동등한 방법들은 하기의 청구항에 포함될 것이다.

Claims (38)

1. 표 1에 기재된 F-표시 유전자로 구성된 핵산 분자는 제외한, 당 대사 및 산화적 인산화 (MCT) 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)으로부터 단리된 핵산 분자, 또는 그의 일부.
2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자가 정밀 화학물질의 생산에 관련되는 MCT 단백질을 코딩하는 것인 단리된 핵산 분자.
3. 표 1에 기재된 F-표시 유전자로 구성된 핵산 분자는 제외한, 서열목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 군에서 선택된 단리된 코리네박테리움 글루타미쿰 핵산 분자, 또는 그의 일부.
4. 표 1에 기재된 F-표시 유전자로 구성된 핵산 분자는 제외한, 서열목록에서 짝수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
5. 표 1에 기재된 F-표시 유전자로 구성된 핵산 분자는 제외한, 서열목록에서 짝수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 아미노산 서열 군에서 선택된 폴리펩티드의 자연 발생 대립유전자 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
6. 표 1에 기재된 F-표시 유전자로 구성되는 핵산 분자는 제외한, 서열목록의 홀수 번호에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 50％ 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 또는 그의 일부.
7. 표 1에 기재된 F-표시 유전자로 구성된 핵산 분자는 제외한, 서열목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 뉴클레오티드 15개 이상으로 된 단편을 포함하는 단리된 핵산 분자.
8. 엄격 조건하에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 혼성화되는 단리된 핵산 분자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 그의 일부, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
11. 제10항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
12. 제11항의 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
13. 제12항에 있어서, 상기 세포가 미생물인 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 상기 세포가 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 포함되는 것인 숙주 세포.
15. 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자의 발현으로 인해 상기 세포로부터의 정밀 화학물질의 생산이 조절되는 숙주 세포.
16. 제15항에 있어서, 상기 정밀 화학물질이 유기산, 단백질생성 및 비-단백질생성 아미노산, 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 지질, 포화 지방산, 불포화 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민, 보조인자, 폴리케티드 및 효소로 구성된 군에서 선택된 것인 숙주 세포.
17. 적절한 배양 배지에서 제12항의 숙주 세포를 배양함으로써 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 생산 방법.
18. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 단리된 MCT 폴리펩티드, 또는 그의 일부.
19. 제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 정밀 화학물질의 생산에 관련되는 것인 폴리펩티드.
20. 표 1에 기재된 F-표시 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제외한, 서열목록에서 짝수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
21. 표 1에 기재된 F-표시 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제외한, 서열목록에서 짝수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함하는 단리된 폴리펩티드, 또는 그의 일부.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 아미노산 서열을 추가로 포함하는 단리된 폴리펩티드.
23. 표 1에 기재된 F-표시 핵산 분자로 구성된 핵산 분자는 제외한, 서열목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 군에서 선택된 핵산과 50％ 이상의 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드.
24. 표 1에 기재된 F-표시 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 제외한, 서열목록에서 짝수 서열 번호로 기재된 서열들로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 50％ 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
25. 제12항의 벡터를 함유하는 세포가 정밀 화학물질을 생산하도록 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는, 정밀 화학물질의 생산 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 배양물로부터 정밀 화학물질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 제11항의 벡터로 상기 세포를 형질감염시켜 세포가 그 벡터를 함유하도록 하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
28. 제25항에 있어서, 상기 세포가 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속에 포함되는 것인 방법.
29. 제25항에 있어서, 상기 세포가 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 헤르쿨리스 (Corynebacterium herculis), 코리네박테리움 릴리움 (Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum),코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토필룸 (Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 후지오켄세 (Corynebacterium fujiokense), 코리네박테리움 니트릴로필루스 (Corynebacterium nitrilophilus), 브레비박테리움 암모니아게네스 (Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 부타니쿰 (Brevibacterium butanicum), 브레비박테리움 디바리카툼 (Brevibacterium divaricatum), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 헤알리이 (Brevibacterium healii), 브레비박테리움 케토글루타미쿰 (Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 케토소레덕툼 (Brevibacterium ketosoreductum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 리넨스 (Brevibacterium linens), 브레비박테리움 파라피놀리티쿰 (Brevibacterium paraffinolyticum), 및 표 3에 기재된 균주들로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
30. 제25항에 있어서, 상기 벡터로부터의 핵산 분자 발현으로 인해 상기 정밀 화학물질의 생산이 조절되는 방법.
31. 제25항에 있어서, 상기 정밀 화학물질이 유기산, 단백질 생성 및 비-단백질생성 아미노산, 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 지질, 포화 지방산, 불포화 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민, 보조인자, 폴리케티드 및 효소로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
32. 제25항에 있어서, 상기 정밀 화학물질이 아미노산인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 아미노산이 리신, 글루타메이트, 글루타민, 알라닌, 아스파르테이트, 글리신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 시스테인, 발린, 루이신, 이소루이신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
34. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함시킴으로써 게놈 DNA가 변경된 세포를 배양하는 것을 포함하는, 정밀 화학물질의 생산 방법.
35. 대상체에서 표 1에 기재된 F-표시 유전자 또는 그에 의해 코딩되는 서열은 제외한 서열목록의 서열 1 내지 782 중 하나 이상의 존재 여부를 검출하여, 대상체에서의 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae)의 존재 여부 또는 활성을 진단하는 것을 포함하는, 대상체에서의 코리네박테리움 디프테리아의 존재 여부 또는 활성의 진단 방법.
36. 서열목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 핵산 분자들로 구성된 군에서 선택된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 핵산 분자가 파괴된 것인 숙주 세포.
37. 서열목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 서열로부터의 핵산 변형체 하나 이상을 포함하여 서열목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 핵산 분자들로 구성된 군에서 선택된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
38. 서열목록에서 홀수 서열 번호로 기재된 핵산 분자들로 구성된 군에서 선택된 핵산 분자를 포함하고, 상기 핵산 분자의 조절 영역이 야생형 조절 영역에 대해 변형된 것인 숙주 세포.