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Gene die für Membransynthese- und Membrantransport-Proteine
codieren
Hintergrund der Erfindung
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Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich vorkommenden
Stoffwechselprozessen in Zellen werden in vielen Industriezweigen
verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-,
Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die
gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen
organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene
Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren,
Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und
Cofaktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels
Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um
große Mengen von einem oder mehreren Molekülen zu produzieren und
sezernieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus
ist Corynebacterium glutamicum, ein gram-positives,
nicht-pathogenes Bakterium. Über Stammselektion ist eine Reihe von
Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter
Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich
der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist
jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Zusammenfassung der Erfindung
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Diese Erfindung stellt neuartige Nukleinsäuremoleküle bereit, die
sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Corynebacterium
glutamicum oder verwandten Bakterienarten verwenden lassen. C.
glutamicum ist ein gram-positives, aerobes Bakterium, das in der
Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von
Feinchemikalien, und auch zum Abbau von Kohlenwasserstoffen (bspw.
beim Überlaufen von Rohöl) und zur Oxidation von Terpenoiden
gemeinhin verwendet wird. Die Nukleinsäuremoleküle können daher zum
Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich
zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch
Fermentationsverfahren, verwenden lassen. C. glutamicum selbst ist zwar
nicht-pathogen, jedoch ist, es mit anderen Corynebacterium-Arten, wie
Corynebacterium diphtheriae (dem Erreger der Diphtherie) verwandt,
die bedeutende Pathogene beim Menschen sind. Die Fähigkeit, das
Vorhandensein von Corynebacterium-Arten zu identifizieren, kann
daher auch eine signifikante klinische Bedeutung haben, z. B. bei
diagnostischen Anwendungen. Diese Nukleinsäuremoleküle können
zudem als Bezugspunkte zur Kartierung des C. glutamicum-Genoms oder
von Genomen verwandter Organismen dienen.
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Diese neuen Nukleinsäuremoleküle codieren Proteine, die hier als
Membrankonstruktions- und Membrantransport-(MCT)-Proteine
bezeichnet werden. Diese MCT-Proteine können bspw. eine Funktion
ausüben, die am Stoffwechsel (z. B. Biosynthese oder Abbau) von
Verbindungen beteiligt ist, die für die Membranbiosynthese
notwendig sind, oder den Membrantransport von einer oder mehreren
Verbindungen in die Zelle oder aus der Zelle unterstützen.
Aufgrund der Verfügbarkeit von Klonierungsvektoren zur Verwendung in
Corynebacterium glutamicum, wie bspw. offenbart in Sinskey et
al., US-Patent Nr. 4 649 119, und Techniken zur genetischen
Manipulation von C. glutamicum und den verwandten
Brevibacterium-Arten (z. B. Lactofermentum) Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162
(1985) 591-597; Katsumata et al., J. Bacteriol. 159 (1984)
306-311; und Santamaria et al. J. Gen. Microbiol. 130 (1984)
2237-2246), lassen sich die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremolekille zur genetischen Manipulation dieses Organismus verwenden, um
es als Produzenten von einer oder mehreren Feinchemikalien besser
und effizienter zu machen. Die verbesserte Produktion oder
Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie kann auf einer direkten
Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder auf
einer indirekten Wirkung dieser Manipulation beruhen.
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Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung
eines erfindungsgemäßen MCT-Proteins die Ausbeute, Produktion und/
oder die Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einem
C. glutamicum-Stamm, der ein solches verändertes Protein enthält,
direkt beeinflussen kann. Diese MCT-Proteine, die am Export der
Feinchemikalien-Moleküle aus der Zelle beteiligt sind, können
eine größere Anzahl oder höhere Aktivität aufweisen, so daß
größere Mengen dieser Verbindungen in das extrazelluläre Medium
sezerniert werden, aus dem sie leichter gewonnen werden. Diese MCT-
Proteine, die am Import der Nährstoffe beteiligt sind, die für
die Biosynthese von einer oder mehreren Feinchemikalien (z. B.
Phosphat, Sulfat, Stickstoffverbindungen usw.) notwendig sind,
können eine größere Anzahl oder höhere Aktivität aufweisen, so
daß diese Vorstufen, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen in der
Zelle in höherer Konzentration vorliegen. Zudem sind Fettsäuren
und Lipide selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch
Optimieren der Aktivität oder Vergrößern der Anzahl von einem oder
mehreren erfindungsgemäßen MCT-Proteinen, die an der Biosynthese
dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Beeinträchtigen
der Aktivität von einem oder mehreren MCT-Proteinen, die am Abbau
dieser Verbindungen beteiligt sind, kann man die Ausbeute,
Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäuren und
Lipidmolekülen aus C. glutamicum steigern.
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Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen
MCT-Genen kann auch MCT-Proteine mit veränderten Aktivitäten
hervorbringen, die die Produktion von einer oder mehreren gewünschten
Feinchemikalien aus C. glutamicum indirekt beeinträchtigen. Bspw.
können erfindungsgemäße MCT-Proteine, die am Export von
Abfallprodukten beteiligt sind, eine größere Zahl oder höhere Aktivität
aufweisen, so daß die normalen Stoffwechselabfälle der Zelle
(aufgrund der Überproduktion der gewünschten Feinchemikalie
möglicherweise in höherer Quantität) effizient exportiert werden,
bevor sie die Nukleotide und Proteine in der Zelle beschädigen
können (was die Lebensfähigkeit der Zelle herabsetzen würde) oder
mit den Feinchemikalien-Biosynthesewegen wechselwirken können
(was die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion einer
gewünschten Feinchemikalien senken würde). Die relativ großen
intrazellulären Mengen der gewünschten Feinchemikalie können selbst
für die Zelle toxisch sein, bspw. kann man durch Vergrößern der
Anzahl an Transpottern, die diese Verbindungen aus der Zelle
exportieren können, die Lebensfähigkeit der Zelle in Kultur
steigern, was wiederum bewirkt, daß eine größere Anzahl Zellen in der
Kultur die gewünschte Feinchemikalie produziert. Die
erfindungsgemäßen MCT-Proteine können auch so manipuliert werden, daß die
relativen Mengen der unterschiedlichen Lipid- und
Fettsäuremoleküle produziert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf
die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp
unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweist, kann eine
Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die
Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität
können den Transport der Moleküle über die Membran sowie die
Integrität der Zelle beeinflussen, was jeweils eine erhebliche
Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum
in großangelegten Fermenterkulturen hat.
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Die Erfindung stellt neue Nukleinsäuremoleküle bereit, die
Proteine codieren, die hier als MCT-Proteine bezeichnet werden und
bspw. am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der
Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport
von Molekülen über diese Membranen beteiligt sind. Das
MCT-Protein ist in einer bevorzugten Ausführungsform am Metabolismus von
Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C.
glutamicum nötig sind, oder am Transport von Molekülen über diese
Membranen beteiligt. Beispiele für diese Proteine umfassen solche,
die von den in Tabelle 1 angegebenen Genen codiert werden.
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Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich isolierte
Nukleinsäuremoleküle (bspw. cDNAs), umfassend eine Nukleotidsequenz, die
ein MCT-Protein oder biologisch aktive Abschnitte davon codiert,
sowie Nukleinsäurefragmente, die sich äls Primer oder
Hybridisierungssonden zum Nachweisen oder zur Amplifikation von
MCT-codierender Nukleinsäure (bspw. DNA oder mRNA) eignen. Bei besonders
bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das isolierte
Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen oder
den codierenden Bereich oder ein Komplement davon von einer
dieser Nukleotidsequenzen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen
codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang B
aufgeführten Aminosäuresequenzen. Die bevorzugten
erfindungsgemäßen MCT-Proteine besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine
der hier beschriebenen MCT-Aktivitäten.
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Als Anhang A werden im folgenden die Nukleinsäuresequenzen des
Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen
Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
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Als Anhang B werden im folgenden die Polypeptidsequenzen des
Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen
Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
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Bei einer weiteren Ausführungsform ist das isolierte
Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter
stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine
Nukleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. Das isolierte
Nukleinsäuremolekül entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden
Nukleinsäuremolekül. Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker
bevorzugt ein natürlich vorkommendes C. glutamicum-MCT-Protein oder
einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw.
rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküle enthalten, und Wirtszellen, in die diese
Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird zur
Herstellung eines MCT-Proteins eine Wirtszelle verwendet, die in
einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das MCT-Protein kann dann
aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch
veränderten Mikroorganismus, bei dem ein MCT-Gen eingebracht oder
verändert worden ist. Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer
Ausführungsform durch Einbringen mindestens eines
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls verändert worden, das die mutierte MCT-
Sequenz als Transgen codiert. Bei einer anderen Ausführungsform
ist ein endogenes MCT-Gen im Genom des Mikroorganismus durch
homologe Rekombination mit einem veränderten MCT-Gen verändert,
z. B. funktionell disruptiert, worden. Der Mikroorganismus gehört
bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium
oder Brevibacterium, wobei Corynebacterium glutamicum besonders
bevorzugt ist. Der Mikroorganismus wird in einer bevorzugten
Ausführungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung,
wie einer Aminosäure, besonders bevorzugt Lysin, verwendet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Wirtszellen, die
mehr als eine der in Anhang A beschriebenen Nukleinsäuremoleküle
besitzen. Solche Wirtszellen lassen sich auf verschiedene dem
Fachmann bekannte Wege herstellen. Beispielsweise können sie
durch Vektoren, die mehrere der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküle tragen, transfiziert werden. Es ist aber auch möglich mit
einem Vektor jeweils ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in
die Wirtszelle einzubringen und deshalb mehrere Vektoren entweder
gleichzeitig oder zeitlich abgestuft einzusetzen. Es können somit
Wirtszellen konstruiert werden, die zahlreiche, bis zu mehreren
Hundert der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen tragen.
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Durch eine solche Akkumulation lassen sich häufig überadditive
Effekte auf die Wirtszelle hinsichtlich der
Feinchemikalien-Produktivität erzielen.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes MCT-
Protein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven
Abschnitt davon. Das isolierte MCT-Protein oder sein Abschnitt kann
in einer bevorzugten Ausführungsform am Metabolismus von
Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum
notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über die
Membranen beteiligt sein. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ist das isolierte MCT-Protein oder ein Abschnitt davon
hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B, so daß
das Protein oder sein Abschnitt weiterhin am Metabolismus von
Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C.
glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über die
Membranen beteiligt sein kann.
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Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes MCT-Proteinpräparat.
Das MCT-Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine
Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes
Vollängenprotein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang
B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird)
im wesentlichen homolog ist.
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Das MCT-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon
kann mit einem Nicht-MCT-Polypeptid funktionsfähig verbunden
werden, damit ein Fusionsprotein entsteht. Dieses Fusionsprotein hat
bei bevorzugten Ausführungsformen eine andere Aktivität als das
MCT-Protein allein und ergibt bei anderen bevorzugten
Ausführungsformen erhöhte Ausbeuten, eine erhöhte Produktion und/oder
Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie aus C.
glutamicum. Die Integration dieses Fusionsproteins in eine
Wirtszelle moduliert bei besonders bevorzugten Ausführungsformen die
Produktion einer gewünschten Verbindung von der Zelle.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung einer Feinchemikalie. Das Verfahren sieht die Anzucht
einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression
eines erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß
eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei
einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung
einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle
mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer MCT-
Nukleinsäure bewirkt. Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform zu dem den Schritt, bei dem die
Feinchemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei
einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder
Brevibacterium.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur
Modulation der Produktion eines Moleküls aus einem Mikroorganismus.
Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer
Substanz, die die MCT-Proteinaktivität oder die MCT-Nukleinsäure-
Expression moduliert, so daß eine zellassoziierte Aktivität
verglichen mit der gleichen Aktivität bei Fehlen der Substanz
verändert wird. Die Zelle wird bei einer bevorzugten Ausführungsform
hinsichtlich eines oder mehrerer C. glutamicum-Stoffwechselwege
für Zellmembrankomponenten oder hinsichtlich des Transports von
Verbindungen über die Membranen moduliert, so daß die Ausbeuten
oder die Produktionsrate einer gewünschten Feinchemikalie durch
diesen Mikroorganismus verbessert werden. Die Substanz, die die
MCT-Proteinaktivität moduliert, stimuliert bspw. die
MCT-Proteinaktivität oder die MCT-Nukleinsäure-Expression. Beispiele von
Substanzen, die die MCT-Proteinaktivität oder die
MCT-Nukleinsäureexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive MCT-
Proteine und Nukleinsäuren, die MCT-Proteine codieren und in die
Zelle eingebracht worden sind. Beispiele von Substanzen, die die
MCT-Aktivität oder -Expression hemmen, umfassen kleine Moleküle
und Antisense-MCT-Nukleinsäuremoleküle.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur
Modulation der Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle,
umfassend das Einbringen eines MCT-Wildtyp- oder -Mutantengens in
eine Zelle, das entweder auf einem gesonderten Plasmid bleibt
1 oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Die Integration
in das Genom kann zufallsgemäß oder durch homologe Rekombination
erfolgen, so daß das native Gen durch die integrierte Kopie
ersetzt wird, was die Produktion der gewünschten Verbindung aus der
zu modulierenden Zelle hervorruft. Diese Ausbeuten sind bei einer
bevorzugten Ausführungsform erhöht. Bei einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform ist die Chemikalie eine Feinchemikalie, die
in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Aminosäure
ist. Diese Aminosäure ist in einer besonders bevorzugten
Ausführungsform L-Lysin.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt MCT-Nukleinsäure- und
-Proteinmoleküle bereit, die am Metabolismus von Verbindungen, die für
den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind,
oder am Transport von Molekülen über die Membranen beteiligt sein
können. Die erfindungsgemäßen Moleküle lassen sich bei der
Modulation der Produktion von Feinchemikalien von Mikroorganismen,
wie C. glutamicum, verwenden, und zwar entweder direkt (z. B. wo
die Überexpression oder Optimierung eines
Fettsäurebiosyntheseproteins eine direkte Auswirkung auf die Ausbeute, Produktion
und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure von modifiziertem
C. glutamicum hat) oder durch eine indirekte Auswirkung, die
trotzdem einen Anstieg der Ausbeute, Produktion und/oder
Effizienz der Produktion der gewünschten Verbindung bewirkt (z. B. wo
die Modulation des Metabolismus der Zellmembrankomponenten
Veränderungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der
Produktion oder der Zusammensetzung der Zellmembran bewirkt, was
wiederum die Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien
beeinflußt). Die erfindungsgemäßen Aspekte werden nachstehend
weiter erläutert.
1. Feinchemikalien
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Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und
beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und
in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw.,
jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die
Landwirtschafts-, und Kosmetik-Industrie. Diese Verbindungen
umfassen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und
Diaminopimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene
Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide
(wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and
related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 5, Rehm et al.,
Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten), Lipide,
gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure),
Diole (bspw. Propandiol und Butandiol), Kohlenhydrate (bspw.
Hyaluronsäure und Trehalose), aromatische Verbindungen (bspw.
aromatische Amine, Vanillin und Indigo), Vitamine und Cofaktoren (wie
beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,
Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den
darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A. S., Niki, E. und Packer, L.
(1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the
UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations
in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien,
abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press
(1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in
Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086
und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen
Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter
Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
A. Aminosäure-Metabolismus und Verwendungen
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Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten
sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen
Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet
bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt,
dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über
Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die
nichtproteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind)
gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim
(1985)). Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration
vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind,
den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet.
Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren
sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen
gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3.
Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren
(Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin,
Threonin, Tryptophan und Valin), so bezeichnet, da sie aufgrund der
Komplexität ihrer Biosynthese mit der Ernährung aufgenommen
werden müssen, werden durch einfache Biosyntheseswege in die übrigen
11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin,
Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und
Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige
dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die
essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit
eine normale Proteinsynthese stattfindet.
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Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind
diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat
entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der
Nahrungsmittel-, Fütter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts- und
pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht
nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure,
sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine.
Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv
(Mononatriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie
verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein.
Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der
pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin,
Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der
pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet.
Threonin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete
Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids-technical
production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.)
Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim). Man hat entdeckt, daß
sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese
von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein,
S-Carboxymethyl-L-cystein, (S)-S-Hydroxytryptophan und anderen,
in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S.
57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
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Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die
sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert
worden (für einen Überblick der bakteriellen
Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev.
Biochem. 47 : 533-606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung
von α-Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im
Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils
nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin
erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit
3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse), und ergibt
nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese
Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin
produziert, und zwar die erstere durch. Kondensation von Homocystein
mit Serin, und die letztere durch Übertragung des
Seitenketten-β-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch
Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und
Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und
Pentosephosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem
9-Schritt-Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den
letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat
unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden
Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem
11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch
Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin
herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte
aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus
Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet.
Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch
Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin
gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von
Histidin aus 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat, einem aktivierten
Zucker.
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Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle
übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden
stattdessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die
Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe
Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid
Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist
zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche
Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die
Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und
der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht
daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung
reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure
ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen
Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei
Aminosäure-Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24,
"Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der
Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge
dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
B. Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie
Verwendungen
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Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere
Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren,
diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl
sie leicht durch ändere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert
werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle
an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als
Elektronenträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von
Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem
Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe,
Antioxidantien und Katalysatoren oder andere
Verarbeitungs-Hilfsstoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die
industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. U11-
mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27,
S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im
Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem
Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von
diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe
der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen
umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige
Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig
sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein;
die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise
organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittelzusätze,
die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen,
gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine,
Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z. B. mehrfach
ungesättigte Fettsäuren).
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Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer
Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend
charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,
"Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G.
(1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and
Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E. und
Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health änd Disease"
Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and
Technological Associations in Malaysia and the Society for free
Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in
Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).
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Thiamin (Vitamin B1) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin
und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B2) wird aus
Guanosin-5'-triphosphat (GTP) und Ribose-5'-phosphat
synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von
Flavinmononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die
Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6"
bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5'-phosphat
und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid), sind alle
Derivate der gemeinsamen Struktureinheit
5-Hydroxy-6-methylpyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R-(+
)-N-(2,4-Dihydroxy-3,3-dimethyl-1-oxobutyl)-β-alanin) kann entweder durch chemische
Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten
Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der
ATP-getriebenen Kondensation von β-Alanin und Pantoinsäure. Die für die
Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in
β-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen
Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat
ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte
verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5'-phosphat, Cystein und ATP
sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht
nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von
(R)-Pantoinsäure, (R)-Pantolacton, (R)-Panthenol (Provitamin B5),
Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
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Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA
in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat
mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich
herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster-
Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine
gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und
dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil
des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des
α-Ketoglutaratdehydrogenasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen,
die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L-
Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet
ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend
von den metabolischen Stoffwechselzwischenprodukten
Guanosin-5'-triphosphat (GTP), L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure
ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin B12) und
die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich
durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von
Vitamin B12 ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht
vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein
Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure
(Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als
"Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen
Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP
(Nikotinamidadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
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Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht
größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser
Chemikalien ebenfalls durch großangelegte Anzucht von
Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin B6,
Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin B12 wird aufgrund der Komplexität
seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert.
In-vitro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien
und Zeit und häufig an hohen Kosten.
C. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und
Verwendungen
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Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre
entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von
Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder
"Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der
Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff
"Nukleotid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der
Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose-
Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D-
Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid"
umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die
aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit
aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder
ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es
möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese
Aktivität zielgerichtet bei kanzerogenen Zellen gehemmt, läßt sich die
Teilungs- und Replikations-Fähigkeit von Tumorzellen hemmen. Es
gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden,
jedoch als Energiespeicher (d. h. AMP) oder als Coenzyme (d. h. FAD
und NAD) dienen.
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Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser
Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der
Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw.
Christopherson, R. Z. und Lyons, S. D. (1990) "Potent inhibitors of
de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic
agents", Med. Res. Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an
Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind,
haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die
bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien
verwendet werden können (Smith, J. L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis"
Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc.
Transact. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen,
Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere
Einsatzmöglichkeiten; als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener
Feinchemikalien.(z. B. Thiamin, 5-Adenosyl-methionin, Folate oder
Riboflavin), als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP)
und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als
Geschmacksverstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele
medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides
and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg.
VCH: Weinheim, S. 561-612). Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-,
Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen
auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den
Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und
Insektiziden entwickelt werden.
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Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist
charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon,
J. E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress
in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic
Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and
Nucleosides"; Kap. 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of
Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Der
Purin-Metabolismus, das Objekt intensiver Forschung, ist für das normale
Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in
höheren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw.
Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten
über die Zwischenverbindung Inosin-5'-phosphat (IMP) aus
Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von
Guanosin-5'-monophosphat (GMP) oder Adenosin-5'-monophosphat (AMP)
führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten
Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch
als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele
verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die
Pyrimidinbiosynthese erfolgt über die Bildung von
Uridin-5'-monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat. UMP wiederum wird in
Cytidin-5'-triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher
Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der
Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur
Diphosphat-Desoxyriboseform des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung
können diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
D. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
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Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über
α,α-1,1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich
in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für
getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken
verwendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie,
der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw.
Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M. A.
und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva,
C. L. A. und Panek, A. D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; und
Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102). Trehalose wird durch
Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche
Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im
Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
II. Membran-Biosynthese und Transmembran-Transport
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Die Zellmembranen dienen in einer Zelle einer Reihe von
Funktionen. Zuallererst differenziert eine Membran den Zellinhalt von
der Umgebung, so daß die Zelle Integrität erhält. Die Membranen
dienen auch als Schranken, damit gefährliche oder ungewünschte
Verbindungen nicht einströmen können und gewünschte Verbindungen
nicht ausströmen können. Zellmembranen sind aufgrund ihrer
Struktur von Natur aus gegenüber der nicht erleichterten Diffusion
hydrophiler Verbindungen, wie Proteine, Wassermolekülen und Ionen
undurchlässig: eine Doppelschicht aus Lipidmolekülen, in der die
polaren Kopfgruppen nach außen ragen (aus der Zelle heraus bzw.
ins Zellinnere hinein) und die unpolaren Schwänze zur Mitte der
Doppelschicht ragen und einen hydrophoben Kern bilden (für einen
allgemeinen Überblick über die Struktur und Funktion der Membran
siehe Gennis, R. B. (1989) Biomembranes, Molecular Structure and
Function, Springer: Heidelberg). Diese Schranke ermöglicht, daß
die Zellen eine relativ höhere Konzentration an gewünschten
Verbindungen und eine relativ kleinere Konzentration an
ungewünschten Verbindungen als das umgebende Medium enthält, da die
Diffusion dieser Verbindungen durch die Membran effizient blockiert
wird.
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Die Membran liefert jedoch auch eine wirksame Schranke gegenüber
dem Import von gewünschten Molekülen und dem Export von
Abfallmolekülen. Zur Bewältigung dieser Schwierigkeit enthalten die
Zellmembranen viele Arten von Transporterproteinen, die den
Transmembrantransport verschiedenartiger Verbindungen erleichtern können:
Poren oder Kanäle und Transporter. Die ersteren sind integrale
Membranproteine, gelegentlich Proteinkomplexe, die eine
regulierte Öffnung durch die Membran bilden. Diese Regulation oder
dieses "Gating" ist gewöhnlich für die durch die Pore oder den
Kanal zu transportierenden spezifisch, so daß diese
Transmembrankonstrukte für eine spezifische Klasse von Substraten spezifisch
sind; bspw. ist ein Kaliumkanal derart konstruiert, daß nur Ionen
mit ähnlicher Ladung und Größe wie Kalium hindurchgelangen
können. Kanal- und Porenproteine haben bestimmte hydrophobe und
hydrophile Domänen, so daß sich der hydrophobe Anteil des Proteins
an das Innere der Membran anlagern kann, wohingegen der
hydrophile Anteil das Innere des Kanals ausmacht, wodurch eine
geschützte hydrophile Umgebung bereitgestellt wird, durch die das
ausgewählte hydrophile Molekül gelangen kann. Im Fachgebiet sind
viele solche Poren/Kanäle bekannt, einschließlich solche für
Kalium-, Calcium-, Natrium- und Chloridionen.
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Dieses durch Poren und Kanäle vermittelte System ist auf sehr
kleine Moleküle, wie Ionen, eingeschränkt, da Poren oder Kanäle,
die hinreichend groß sind, daß sie den Durchtritt vollständiger
Proteine durch erleichterte Diffusion ermöglichen, auch nicht
dazu fähig wären, den Durchtritt kleinerer Moleküle zu
verhindern. Der Transport von Molekülen durch diesen Prozeß wird
gelegentlich als "erleichterte Diffusion" bezeichnet, da die
treibende Kraft eines Konzentrationsgradienten erforderlich ist,
damit der Transport stattfindet. Permeasen ermöglichen ebenfalls
die erleichterte Diffusion größerer Moleküle, wie Glucose oder
anderer Zucker, in die Zelle, wenn die Konzentration dieser
Moleküle auf einer Seite der Membran größer ist als auf der anderen
(ebenfalls als "Uniport" bezeichnet). Im Gegensatz zu Poren oder
Kanälen bilden diese integralen Proteine (die oft 6 bis 14
membranüberspannende α-Helices aufweisen) keine offenen Kanäle durch
die Membran, sie binden jedoch an das Zielmolekül an der
Membranoberfläche und durchlaufen dann eine Konformationsänderung, so
daß das Zielmolekül an der entgegengesetzten Seite der Membran
freigesetzt wird.
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Zellen benötigen jedoch oft den Import oder Export von Molekülen
gegen den bestehenden Konzentrationsgradienten ("aktiver
Transport"), eine Situation, in der die erleichterte Diffusion nicht
stattfinden kann. Es gibt zwei generelle Mechanismen, die von der
Zelle für einen solchen Membrantransport verwendet wird; Symport
oder Antiport, und energiegekuppelter Transport, wie derjenige,
der durch ABC-Transporter vermittelt wird. Symport- und
Antiportsysteme koppeln die Bewegung von zwei unterschiedlichen Molekülen
über die Membran (über Permeasen mit zwei gesonderten
Bindungsstellen für zwei unterschiedliche Moleküle); beim Symport werden
beide Moleküle in die gleiche Richtung transportiert, wohingegen
beim Antiport ein Molekül importiert und das andere Molekül
exportiert wird. Dies ist energetisch möglich, da sich eines dieser
beiden Moleküle entlang eines Konzentrationsgradienten bewegt,
und dieses energetisch günstige Ereignis wird nur durch die
gleichzeitige Bewegung einer gewünschten Verbindung gegen den
herrschenden Konzentrationsgradienten ermöglicht. Einzelne
Moleküle können gegen den Konzentrationsgradienten über die Membran
in einem energiegetriebenen Prozeß transportiert werden, wie
bspw. bei den ABC-Transportern. Bei diesem System hat das in der
Membran lokalisierte Transportprotein eine ATP-bindende Cassette,
beim Binden des Zielmoleküls wird ATP in ADP + Pi umgewandelt,
und die resultierende freigesetzte Energie wird zum Antreiben der
Bewegung des Zielmoleküls zur entgegengesetzten Seite der Membran
verwendet, was durch den Transporter erleichtert wird. Für
eingehendere Beschreibungen all dieser Transportsysteme, siehe
Bamberg, E. et al., (1993) "Charge transport of ion pumps on lipid
bilayer membranes", Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Findlay, J. B. C.
(1991) "Structure and function in membrane transport systems",
Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 804-810; Higgins, C. F. (1992) "ABC
transporters from microorganisms to man", Ann. Rev. Cell. Biol.
8: 67-113; Gennis, R. B. (1989) "Pores, Channels and
Transporters", in Biomebranes, Molecular Structure and Function,
Springer: Heidelberg, S. 270-322; und Nikaido, H. und Saier, H.
(1992) "Transport proteins in bacteria: common themes in their
design", Science 258: 936-942, und die in jeder dieser Zitate
enthaltenen Literaturstellen.
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Die Synthese von Membranen ist ein gut charakterisierter Prozeß,
an dem viele Komponenten beteiligt sind, von denen die
wichtigsten die Lipidmoleküle sind. Die Lipidsynthese läßt sich in zwei
Teile aufteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an
sn-Glycerin-3-Phosphat und die Addition oder Modifikation einer
polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Bakterienmembranen
verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide,
Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese ebginnt mit der
Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch
Acetyl-CoA-carboxylase oder in Acetyl-ACP durch Acetyltransacylase. Nach einer
Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle
zusammen Acetoacetyl-ACP, das durch eine Reihe von Kondensations-,
Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so
daß ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten
Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren
aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen
katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff
oder anaerob (für Beschreibungen der Fettsäuresynthese siehe F. C.
Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press:
Washington, D. C. S. 612-636 und die darin angegebenen
Literaturstellen; Lengeler et al. (Hrsg.) (1999) Biology of Procaryotes.
Thieme: Stuttgart, New York und die darin angegebenen
Literaturstellen, und Magnuson, K. et al. (1993) Microbiological Reviews
57 : 522-542 und die darin angegebenen Literaturstellen). Die
Cyclopropan-Fettsäuren (CFA) werden durch eine spezifische
CFA-Synthase mit SAM als Cosubstrat synthetisiert. Verzweigte
Fettsäureketten werden aus verzweigten desaminierten Aminosäureketten
synthetisiert, so daß verzweigte 2-Oxosäuren erhalten werden (s.
Lengeler et al. (Hrsg) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme:
Stuttgart, New York und die darin angegebenen Literaturstellen). Ein
weiterer wesentlicher Schritt bei der Lipidsynthese ist der
Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen bspw. durch
Glycerinphosphatacyltransferasen. Die Kombination verschiedener
Vorstufenmoleküle und Biosyntheseenzyme bewirkt die Produktion
verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine erhebliche Auswirkung
auf die Membranzusammensetzung hat.
III. Erfindungsgemäße Elemente und Verfahren
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Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der
Entdeckung von neuen Molekülen, die hier als MCT-Nukleinsäure- und
-Protein-Moleküle bezeichnet werden und die Produktion von
Zellmembranen in C. glutamicum steuern sowie die Bewegung von
Molekülen über diese Membranen bewerkstelligen. Bei einer
Ausführungsform sind die MCT-Moleküle am Metabolismus von Verbindungen
beteiligt, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum
oder am Transport der Moleküle über diese Membranen beteiligt
sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aktivität der
erfindungsgemäßen MCT-Moleküle zur Regulation der Produktion von
Membrankomponenten eine Auswirkung auf die Produktion einer
gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus. Bei einer
besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der
modulierten MCT-Moleküle derart moduliert, daß die C. glutamicum-
Stoffwechselwege, die von den erfindungsgemäßen MCT-Proteinen
reguliert werden, hinsichtlich Ausbeute, Produktion und/oder
Effizienz der Produktion moduliert sind sowie hinsichtlich der
Effizienz des Transports der Verbindungen durch die Membranen
verändert sind, was die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der
Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch C. glutamicum
entweder direkt oder indirekt moduliert.
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Der Begriff "MCT-Protein" oder "MCT-Polypeptid" umfaßt Proteine,
die am Stoffwechsel von Verbindungen, die für den Aufbau von
Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport
von Molekülen über diese Membranen beteiligt sind. Beispiele für
MCT-Proteine umfassen solche, die von den in Tabelle 1 und Anhang
A aufgeführten MCT-Genen codiert werden. Die Ausdrücke "MCT-Gen"
oder "MCT-Nukleinsäuresequenz" umfassen Nukleinsäuresequenzen,
die ein MCT-Protein codieren, das aus einem codierenden Bereich
und entsprechenden untranslatierten 5'- und 3'-Sequenzbereichen
besteht. Beispiele für MCT-Gene sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Die Begriffe "Produktion" oder "Produktivität" sind im Fachgebiet
bekannt und beinhalten die Konzentration des
Fermentationsproduktes (bspw. der gewünschten Feinchemikalie, die innerhalb einer
festgelegten Zeitspanne und eines festgelegten
Fermentationsvolumens gebildet werden (bspw. kg Produkt pro Std. pro 1). Der
Begriff "Effizienz der Produktion" umfaßt die Zeit, die zur
Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (bspw. wie lange
die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer
Feinchemikalie benötigt). Der Begriff "Ausbeute" oder
"Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die
Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt
(d. h. die Feinchemikalie). Dies wird bspw. gewöhnlich ausgedrückt
als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Vergrößern der
Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der
gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser
Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen
festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe "Biosynthese" oder
"Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer
Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine
Zelle aus Zwischenverbindungen, bspw. in einem Mehrschritt- oder
stark regulierten Prozeß. Die Begriffe "Abbau" oder "Abbauweg"
sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer
Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine
Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger
komplexe Moleküle), bspw. in einem Mehrschritt- oder stark
regulierten Prozeß. Der Begriff "Metabolismus" ist im Fachgebiet
bekannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die
in einem Organismus stattfinden. Der Metabolismus einer
bestimmten Verbindung (z. B. der Metabolismus einer Aminosäure, wie
Glycin) umfaßt dann sämtliche Biosynthese-, Modifikations- und
Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle.
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Die erfindungsgemäßen MCT-Moleküle sind in einer anderen
Ausführungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls,
wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie C.
glutamicum, zu modulieren. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch
die die Veränderung eines erfindungsgemäßen MCT-Proteins die
Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer
Feinchemikalie aus einem C. glutamicum-Stamm, der ein solches
verändertes Protein enthält, direkt beeinflussen kann. Diese
MCT-Proteine, die am Export der Feinchemikalienmoleküle aus der Zelle
beteiligt sind, können in größerer Anzahl vorliegen oder erhöhte
Aktivität aufweisen, so daß größere Mengen dieser Verbindungen in
das extrazelluläre Medium sezerniert werden, aus dem sie leichter
gewonnen werden können. MCT-Proteine, die am Import der
Nährstoffe beteiligt sind, die für die Biosynthese von einer oder
mehreren Feinchemikalien notwendig sind (bspw. Phosphat, Sulfat,
Stickstoffverbindungen, usw.) können entsprechend in größerer
Anzahl oder mit höherer Aktivität zugegen sein, so daß diese
Vorstufen-, Cofaktor- oder Zwischenverbindungen in höherer
Konzentration in der Zelle vorliegen. Zudem sind Fettsäuren und Lipide
selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimieren der
Aktivität oder Vergrößern der Anzahl von einem oder mehreren
erfindungsgemäßen MCT-Proteinen, die an der Biosynthese dieser
Verbindungen beteiligt sind, oder durch Beeinflussen der Aktivität von
einem oder mehreren MCT-Proteinen, die am Abbau dieser
Verbindungen beteiligt sind, kann man die Ausbeute, Produktion und/oder
Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus C.
glutamicum steigern.
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Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Genen
kann auch MCT-Proteine mit veränderten Aktivitäten hervorbringen,
die die Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien aus C.
glutamicum beeinflussen. Erfindungsgemäße MCT-Proteine, die am
Export von Abfallprodukten beteiligt sind, können in größerer
Anzahl oder höherer Aktivität zugegen sein, so daß die normalen
Stoffwechselabfälle der Zelle (aufgrund von Überproduktion der
gewünschten Feinchemikalie möglicherweise in höherer Quantität)
effizient exportiert werden, bevor sie Nukleotide und Proteine
innerhalb der Zelle beschädigen (was die Lebensfähigkeit der
Zelle herabsetzt) oder mit anderen
Feinchemikalien-Stoffwechselwegen interagieren (was die Ausbeute, Produktion oder Effizienz
der Produktion der gewünschten Feinchemikalie herabsetzt). Die
relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten
Feinchemikalie können an sich für die Zelle toxisch sein. Durch Vergrößern
der Anzahl von Transportern, die zum Export dieser Verbindung aus
der Zelle befähigt ist, kann man somit die Lebensfähigkeit der
Zelle in Kultur steigern, was wiederum eine größere Zahl an
Zellen in Kultur mit sich bringt, die die gewünschte Feinchemikalie
produzieren. Die erfindungsgemäßen MCT-Proteine lassen sich
derart manipulieren, daß die relativen Mengen unterschiedlicher
Lipid- und Fettsäuremoleküle produziert werden. Dies kann eine
erhebliche Auswirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran
haben. Da jeder Lipidtyp andere physikalische Eigenschaften
aufweist, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer
Membran die Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der
Membranfluidität können den Transport von Molekülen über die
Membran sowie die Zellintegrität beeinflussen, was jeweils eine
erhebliche Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien von C.
glutamicum in großangelegten Fermenterkulturen hat.
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Als Ausgangspunkt zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen eignet sich das Genom eines Corynebacterium
glutamicum-Stammes, der von der American Type Culture Collection unter
der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist.
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Von diesen Nukleinsäuresequenzen lassen sich durch die in
Tabelle 1 bezeichneten Veränderungen die erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen mit üblichen Verfahren herstellen.
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Das erfindungsgemäße MCT-Protein oder ein biologisch aktiver
Abschnitt oder Fragmente davon können am Metabolismus von
Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum
notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese
Membranen beteiligt sein, oder können eine oder mehrere der in
Tabelle 1 aufgeführten Aktivitäten aufweisen.
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In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte
der Erfindung ausführlicher beschrieben:
A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
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Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle,
die MCT-Polypeptide oder biologisch aktive Abschnitte davon
codieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als
Hybridisierungssoriden oder Primer zur Identifizierung oder
Amplifizierung von MCT-codierenden Nukleinsäuren (z. B. MCT-DNA)
hinreichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" soll DNA-Moleküle (z. B.
cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) sowie DNA-
oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden,
umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5'-Ende
des codierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz:
mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des
5'-Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa 20
Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes des codierenden
Genbereichs. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder
doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise eine doppelsträngige DNA.
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Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird aus anderen
Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der
Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat
vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nukleinsäure in der
genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt,
natürlicherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw.
3'-Ende der Nukleinsäure befinden. In verschiedenen
Ausführungsformen kann bspw. das isolierte MCT-Nukleinsäuremolekül weniger
als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der
Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in
der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt
(bspw. eine C. glutamicum-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes"
Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, kann überdies im
wesentlichen frei von einem anderen zellulären Material oder
Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird,
oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein,
wenn es chemisch synthetisiert wird.
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Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, bspw. eine
Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein
Abschnitt davon, kann mittels molekularbiologischer
Standard-Techniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation
hergestellt werden. Bspw. kann eine C. glutamicum-MCT-cDNA aus einer
C. glutamicum-Bank isoliert werden, indem eine vollständige
Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als
Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw.
beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein
Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang
A oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion
isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser
Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z. B. kann ein
Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A
oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion
isoliert werden, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die
auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt
worden sind). Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen
isolieren (bspw. durch das
Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) und
die cDNA kann mittels reverser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV-
Reserve-Transkriptase erhältlich bei Gibco/BRL. Bethesda MD.
oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America,
Inc., St. Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische
Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via
Polymerasekettereaktion lassen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten
Nukleotidsequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure
kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und
geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß
PCR-Standard-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte
Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch
DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die
einer MCT-Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard-
Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen
DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein
erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A
aufgeführten Nukleotidsequenzen.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein
erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein zu einer der in
Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen komplementäres
Nukleinsäuremolekül oder einen Abschnitt davon, wobei es sich um ein
Nukleinsäuremolekül handelt, das zu einer der in Anhang A gezeigten
Nukleotidsequenzen hinreichend komplementär ist, daß es mit einer
der in Anhang A angegebenen Sequenzen hybridisieren kann, wodurch
ein stabiler Duplex entsteht.
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Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße
Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine
Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer
Aminosäuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt
davon weiterhin am Metabolismus von Verbindungen, die für den
Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am
Transport der Moleküle über diese Membranen beteiligt sein kann.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog"
Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäuresequenzen eine
minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste
(bspw. ein Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein
Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) zu einer
Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweisen, so daß das Protein oder
ein Abschnitt davon weiterhin am Metabolismus von Verbindungen,
die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig
sind, oder am Transport der Moleküle über diese Membranen
beteiligt sein kann. Proteinbestandteile dieser Stoffwechselwege für
Membrankomponenten oder Membrantransportsysteme, wie hier
beschrieben, können eine Rolle bei der Produktion und Sekretion von
einer oder mehreren Feinchemikalien spielen: Beispiele dieser
Aktivitäten sind ebenfalls hier beschrieben. Somit betrifft die
"Funktion eines MCT-Proteins" entweder direkt oder indirekt die
Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von einer
oder mehreren Feinchemikalien. In Tabelle 1 sind Beispiele der
MCT-Proteinaktivitäten angegeben.
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Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen
MCT-Nukleinsäuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch
aktive Abschnitte von einem der MCT-Proteine. Der Begriff
"biologisch aktiver Abschnitt eines MCT-Proteins", wie er hier
verwendet wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne oder ein Motiv,
eines MCT-Proteins umfassen, die/das am Metabolismus von
Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum
notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese
Membranen beteiligt sein kann, oder eine in Tabelle 1 angegebene
Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob ein MCT-Protein oder ein
biologisch aktiver Abschnitt davon am Metabolismus von
Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum
notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen
beteiligt sein kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität
durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend
beschrieben in Beispiel 8 des Beispielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der MCT-Sequenz,
die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich
ebenfalls dessen bewußt, daß Änderungen durch Mutation in eine
Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur
Änderung der Aminosäuresequenz des codierten MCT-Proteins führt,
ohne daß die Funktionsfähigkeit des MCT-Proteins beeinträchtigt
wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an
"nichtessentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen
führen, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein
"nicht-essentieller" Aminosäurerest läßt sich in einer Wildtypsequenz von
einem der MCT-Proteine (Anhang B) verändern, ohne daß die Aktivität
des MCT-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller"
Aminosäurerest für die MCT-Proteinaktivität erforderlich ist.
Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht-konservierte oder
lediglich semikonservierte Aminosäurereste in der Domäne mit
MCT-Aktivität) können für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen
sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die MCT-Aktivität
verändert wird.
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Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein MCT-Protein codiert,
das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch
Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen,
-additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz aus Anhang
A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere
Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein
eingebracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen
aus Anhang A durch Standard-Techniken eingebracht werden, wie
stellengerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese.
Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer
oder mehreren der vorhergesagten nichtessentiellen
Aminosäureresten eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution"
wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer
ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von
Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden.
Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten
(z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B.
Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten
(z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin,
Cystein), nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin,
Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan),
betaverzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und
aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin,
Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller
Aminosäurerest in einem MCT-Protein wird somit vorzugsweise durch einen
anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie
ausgetauscht. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen
alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der
MCTcodierenden Sequenz eingebracht werden, bspw. durch
Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf die hier
beschriebene MCT-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu
identifizieren, die eine MCT-Aktivität beibehalten. Nach der
Mutagenese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte
Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des
Proteins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel
8 des Beispielteils) bestimmt werden.
B. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise
Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein
MCT-Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier
verwendet betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das
eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es
gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre
doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen
DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein
viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom
ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer
Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren
(bspw. Bakterienvektoren, mit bakteriellem Replikationsursprung
und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B.
nichtepisomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle
beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen
mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren
die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden
sind, steuern. Diese Vektoren werden als "Expressionsvektoren"
bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expressionsvektoren, die bei
DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden, die Form von
Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und
"Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am
häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll diese
anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw.
replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte
Viren), die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
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Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor umfaßt eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur
Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet,
daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere
regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur
Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu
exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfaßt. In
einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig
verbunden", daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die
regulatorische(n) Sequenz(en) gebunden ist, daß die Expression
der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem
In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der
Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist). Der Begriff
"regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere
Expressionskontrollelemente (bspw. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese
regulatorischen Sequenzen sind bspw. beschrieben in Goeddel: Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,
San Diego, CA (1990). Regulatorische Sequenzen umfassen solche,
die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen
Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression
der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der
Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines
Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu
transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des
gewünschten Proteins usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren
können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch
Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder
-peptiden, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert
werden, hergestellt werden (bspw. MCT-Proteine, mutierte Formen
von MCT-Proteinen, Fusionsproteine, usw.)
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können
zur Expression von MCT-Proteinen in prokaryotischen oder
eukaryotischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können MCT-Gene in
bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit
Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe - und anderen Pilzzellen (siehe
Romanos, M. A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a
review", Yeast 8: 423-488; von den Hondel, C. A. M. J. J. et al.
(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in:
More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure,
Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel,
C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector
development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Genetics
of Fungi, Peberdy, J. F. et. al., Hrsg, S. 1-28, Cambridge
University Press: Cambridge), Algen- und vielzelligen
Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High
efficiency Agrobacterium-tumefaciens mediated transformation of
Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell
Rep.: 583-586) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete
Wirtszellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression.
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ,
bspw. mit T7-Promotorregulatorischen Sequenzen und T7-Polymerase,
in vitro transkribiert und translatiert werden.
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Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit
Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren
enthalten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen
steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu
einem darin codierten Protein, gewöhnlich am Aminoterminus des
rekombinanten Proteins, bei. Diese Fusionsvektoren haben
gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von
rekombinantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des
rekombinanten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des
rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der
Affinitätsreinigung. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine
proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und
des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des
rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung
des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre
entsprechenden Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und
Enterokinase.
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Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia
Biotech Inc. Smith, D. B. und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40),
pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia,
Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST),
Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante
Zielprotein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die
codierende Sequenz des MCT-Proteins in einen pGEX-Expressionsvektor
kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein
codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus, GST-Thrombin-
Spaltstelle-X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch
Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt
werden. Das rekombinante MCT-Protein, das nicht mit GST fusioniert
ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin
gewonnen werden.
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Beispiele geeigneter induzierbarer
Nicht-Fusions-Expressionsvektoren aus E. coli umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:
301-315) und pET 11d (Studier et al. Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,
Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression aus dem pTrc-
Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase
von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression
aus dem pET11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem
T7-gn10-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten
viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale
Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174
(DE3) von einem residenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7
gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors
birgt.
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Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten
Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium,
dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten
Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien
(1990) 119-128). Eine weitere Strategie ist die Veränderung der
Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu
inserierenden Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure
diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression
ausgewählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et
al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Diese Veränderung
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen erfolgt durch
Standard-DNA-Synthesetechniken.
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Bei einer weiteren Ausführungsform ist der
MCT-Proteinexpressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren
zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSec1
(Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und
Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene
54: 113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego,
CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die
sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen,
eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in:
von den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer
systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied
Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28,
Cambridge University Press: Cambridge.
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Alternativ können die erfindungsgemäßen MCT-Proteine in
Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren
exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von
Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen)
verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol.
Cell Biol. 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers
(1989) Virology 170: 31-39).
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In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen
MCT-Proteine in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen) oder in
Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie
Feldfrüchte) exprimiert werden. Beispiele für
Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in:
Bekker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New
plant binary vectors with selectable markers located proximal to
the left border", Plant Mol. Biol. 20 : 1195-1197; und Bevan, M. W.
(1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation",
Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
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In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße
Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einem
Säugetier-Expressionsvektor exprimiert.. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren
umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman
et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Bei der Verwendung in
Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors
oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt.
Gemeinhin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adenovirus2,
Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Für weitere geeignete
Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen,
siehe die Kapitel 16 und 17 aus Sambrook, J., Fritsch, E. F. und
Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
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Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante
Säugetier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure
vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp bewirken (bspw. werden
gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der
Nukleinsäure verwendet). Gewebespezifische regulatorische Elemente sind
im Fachgebiet bekannt. Nicht einschränkende Beispiele für
geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor
(leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277),
lymphoid-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv.
Immunol. 43: 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren
(Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) und
Immunglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und
Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren
(bspw. Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86:
5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., (1985)
Science 230 : 912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren
(bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und
europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166).
Entwicklungsregulierte Promoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox-
Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249 : 374-379) und der
α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:
537-546).
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Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor
bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in
Antisense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. Dies
bedeutet, daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz
funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch
Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur MCT-mRNA
antisense ist, möglich ist. Es können regulatorische Sequenzen
ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in
Antisense-Richtung klonierte Nukleinsäure gebunden sind und die die
kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von
Zelltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder
Enhancer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die
konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression
von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann
in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten
Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der
Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert
werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den
der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation
der Genexpression mittels Antisense-Genen, siehe Weintraub, H. et
al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis,
Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in
die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor
eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante
Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es
ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine
bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen
Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden
Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte
Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht
unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang
des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
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Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle
sein. Bspw. kann ein MCT-Protein in Bakterienzellen, wie C.
glutamicum, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie
Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert
werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig.
Mikroorganismen, die mit Corynebacterium glutamicum verwandt sind
und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen
Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle
3 aufgeführt.
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Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren
läßt sich Vektor-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen
einbringen, Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion",
"Konjugation" und "Transduktion" wie sie hier verwendet werden,
sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren
zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine
Wirtszelle umfassen, einschließlich Calciumphosphat- oder
Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion,
Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur
Transformation oder Transfektion von Wirtszellen lassen sich nachlesen in
Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen
Labor-Handbüchern.
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Für die stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, daß
je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter
Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr
Genom integriert. Zur Identifizierung und Selektion dieser
Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker
(z. B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen
von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte
selektierbare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen
Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine
Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine
Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie
derjenige, der ein MCT-Protein codiert, oder kann auf einem
gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten
Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können durch
Medikamentenselektion identifiziert werden (z. B. Zellen, die den
selektierbaren Marker integriert haben, überleben, wohingegen die
anderen Zellen sterben).
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Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird
ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines MCT-
Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution
eingebracht worden ist, um das MCT-Gen zu verändern, bspw.
funktionell zu disrumpieren. Dieses MCT-Gen ist vorzugsweise ein
Corynebacterium glutamicum-MCT-Gen, jedoch kann ein Homologon von
einem verwandten Bakterium oder sogar von einer Säugetier-, Hefe-
oder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene
MCT-Gen bei homologer Rekombination funktionell disrumpiert ist
(d. h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert, ebenfalls
bezeichnet als "Knockout"-Vektor). Der Vektor kann alternativ
derart ausgestaltet sein, daß das endogene MCT-Gen bei homologer
Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch
das funktionelle Protein codiert (z. B. kann der stromaufwärts
gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch
die Expression des endogenen MCT-Proteins verändert wird.). Der
veränderte Abschnitt des MCT-Gens ist im homologen
Rekombinationsvektor an seinem 5'- und 3'-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure
des MCT-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen
dem exogenen MCT-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem
endogenen MCT-Gen in einem Mikroorganismus, ermöglicht. Die
zusätzliche flankierende MCT-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche
homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang.
Gewöhnlich enthält der Vektor mehrere Kilobasen flankierende DNA
(sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) (siehe z. B. Thomas, K. R. und
Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503 für eine Beschreibung von
homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in einen
Mikroorganismus (z. B. durch Elektroporation) eingebracht, und Zellen,
in denen das eingebrachte MCT-Gen mit dem endogenen MCT-Gen
homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet
bekannter Verfahren selektiert.
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Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante
Mikroorganismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die
eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen.
Der Einschluß eines MCT-Gens in einem Vektor unter der Kontrolle
des Lac-Operons ermöglicht z. B. die Expression des MCT-Gens nur
in Gegenwart von IPTG. Diese regulatorischen Systeme sind im
Fachgebiet bekannt.
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Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder
eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d. h.
Expression) eines MCT-Proteins verwendet werden. Die Erfindung
stellt zudem Verfahren zur Produktion von MCT-Proteinen unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer
Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der
erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor,
der ein MCT-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in
deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder
verändertes MCT-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis
das MCT-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in
einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der MCT-Proteine aus
dem Medium oder der Wirtszelle.
C. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
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Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine,
Proteinhomologa, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können
in einem oder mehreren nachstehenden Verfahren verwendet werden:
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Identifikation von C. glutamicum und verwandten Organismen,
Kartierung von Genomen von Organismen, die mit C. glutamicum
verwandt sind, Identifikation und Lokalisation von C.
glutamicum-Seguenzen von Interesse, Evolutionsstudien, Bestimmung von
MCT-Proteinbereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation
der Aktivität eines MCT-Proteins; Modulation der Aktivität eines
MCT-Wegs; und Modulation der zellulären Produktion einer
gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die
erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von
Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als
Corynebacterium glutamicum oder naher Verwandten davon verwendet
werden. Sie können zudem zur Identifikation von C. glutamicum
oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von
Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die
Nukleinsäuresequenzen einer Reihe von C. glutamicum-Genen bereit. Durch
Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer
einheitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter
stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines
C. glutamicum-Gens umfaßt, das für diesen Organismus einzigartig
ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus zugegen ist.
Corynebacterium glutamicum selbst ist zwar nicht pathogen, jedoch ist
es mit pathogenen Arten, wie Corynebacterium diptheriae,
verwandt. Der Nachweis eines solchen Organismus ist von
signifikanter klinischer Bedeutung.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können
als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist
nicht nur beim Kartieren des Genoms, sondern auch für
funktionelle Studien von C. glutamicum-Proteinen nützlich. Zur
Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes C. glutamicum-
DNA-bindendes Protein bindet, kann das C. glutamicum-Genom bspw.
gespalten werden, und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein
inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können
zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen,
vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden;
die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das
Genomfragment ermöglicht die Lokalisation des Fragmentes auf der
genomischen Karte von C. glutamicum, und wenn dies mehrmals mit
unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine
rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein
bindet. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem
hinreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß
diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer
genomischen Karte in verwandten Bakterien, wie Brevibacterium
lactofermentum, dienen können.
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Die erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküle eignen sich
ebenfalls für Evolutions- und Proteinstrukturuntersuchungen. Die
Stoffwechsel- und Transportprozesse, an denen die
erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden bei einer vielen
prokaryotischen und eukaryotischen Zellen verwendet; durch Vergleich der
Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen,
die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der
Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden.
Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung,
welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei
der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann,
die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der
Bestimmung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann
einen Hinweis darauf geben, welches Protein Mutagenese tolerieren
kann, ohne die Funktion zu verlieren.
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Die Manipulation der erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküle
kann die Produktion von MCT-Proteinen mit funktionellen
Unterschieden zu den Wildtyp-MCT-Proteinen bewirken. Diese Proteine
können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert
werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle
zugegen sein, oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder
Aktivität geschwächt sein.
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Es gibt viele Mechanismen, durch die die Veränderung eine
erfindungsgemäßen MCT-Moleküls die Ausbeute, Produktion und/oder
Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien von
einem C. glutamicum-Stamm, der ein solches verändertes Protein
enthält, direkt beeinflußt. Die Gewinnung der
Feinchemikalienverbindungen aus großangelegten C. glutamicum-Kulturen ist signifikant
verbessert, wenn C. glutamicum die gewünschten Verbindungen
sezerniert, da diese Verbindungen leicht aus dem Kulturmedium
gereinigt werden können (im Gegensatz zur Extraktion aus der Masse
von C. glutamicum-Zellen). Durch Vergrößern der Anzahl oder
Aktivität von Transportermolekülen, die die Feinchemikalien aus der
Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Menge der
produzierten Feinchemikalie, die im extrazellulären Medium zugegen ist, zu
steigern, wodurch die Ernte und Reinigung erleichtert wird. Zur
effizienten Überproduktion von einer oder mehreren
Feinchemikalien sind dagegen erhöhte Mengen von Cofaktoren,
Vorstufenmolekülen und Zwischenverbindungen für die geeigneten Biosynthesewege
erforderlich. Durch Vergrößern der Anzahl und/oder der Aktivität
von Transporterproteinen, die am Import von Nährstoffen, wie
Kohlenstoffquellen (d. h. Zuckern), Stickstoffquellen (d. h.
Aminosäuren, Ammoniumsalzen), Phosphaten und Schwefel beteiligt sind,
kann man die Produktion einer Feinchemikalie aufgrund der
Entfernung von jeglichen Einschränkungen des Nährstoffangebots bei dem
Biosyntheseprozeß verbessern. Zudem sind Fettsäuren und Lipide
selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimieren der
Aktivität oder durch Vergrößern der Anzahl von einem oder mehreren
erfindungsgemäßen MCT-Proteinen, die an der Biosynthese dieser
Verbindungen beteiligt sind, oder durch Beeinflussen der
Aktivität von einem oder mehreren MCT-Proteinen, die am Abbau dieser
Verbindungen beteiligt sind, kann man die Ausbeute, Produktion
und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und
Lipidmolekühe von C. glutamicum steigern.
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Die genetische Manipulation von einem oder mehreren
erfindungsgemäßen MCT-Genen kann ebenfalls MCT-Proteine mit veränderten
Aktivitäten hervorbringen, die die Produktion von einer oder mehreren
gewünschten Feinchemikalien aus C. glutamicum indirekt
beeinflussen. Die normalen biochemischen Stoffwechselprozesse bewirken
bspw. die Produktion einer Vielzahl von Abfallprodukten (z. B.
Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies) die mit
den gleichen Stoffwechselprozessen aktiv wechselwirken können
(bspw. nitriert Peroxynitrit bekanntlich Tyrosin-Seitenketten,
wodurch einige Enzyme mit Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert
werden (Groves, J. T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2);
225-235). Diese Abfallprodukte werden zwar üblicherweise
ausgeschieden, die zur fermentativen Großproduktion verwendeten C.
glutamicum-Stämme werden zur Überproduktion von einer oder
mehreren Feinchemikalien jedoch optimiert und können so mehr
Abfallprodukte produzieren als für einen C. glutamicum-Wildtyp üblich
ist. Durch Optimieren der Aktivität von einem oder mehreren
erfindungsgemäßen MCT-Proteinen, die am Export von Abfallmolekülen
beteiligt sind, kann man die Lebensfähigkeit der Zelle verbessern
und eine effiziente metabolische Aktivität beibehalten. Das
Vorliegen hoher intrazellulärer Mengen der gewünschten
Feinchemikalie kann für die Zelle toxisch sein, so kann man durch Steigern
der Fähigkeit der Zelle zur Sekretion dieser Verbindungen die
Lebensfähigkeit der Zelle verbessern.
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Die erfindungsgemäßen MCT-Proteine können manipuliert werden, so
daß die relativen Mengen verschiedener Lipid- und
Fettsäuremoleküle verändert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf
die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp
unterschiedliche physikalische Eigenschaften hat, kann eine
Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die
Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität
können den Transport von Molekülen über die Membran beeinflussen,
was wie vorstehend erläutert den Export von Abfallprodukten oder
der produzierten Feinchemikalie oder den Import von notwendigen
Nährstoffen modifizieren kann. Diese Membranfluiditätsänderungen
können ebenfalls die Zellintegrität erheblich beeinflussen;
Zellen mit relativ schwächeren Membranen sind in einer
Groß-Fermenterumgebung anfälliger gegenüber mechanischem Streß, was die
Zellen beschädigen oder abtöten kann. Durch Manipulieren von MCT-
Proteinen, die an der Produktion von Fettsäuren und Lipiden für
den Membranaufbau beteiligt sind, so daß die
Membranzusammensetzung der resultierenden Membran gegenüber den in den Kulturen,
die zur Produktion von Feinchemikalien verwendet werden,
herrschenden Umweltbedingungen empfänglicher sind, sollten ein
größerer Anteil an C. glutamicum-Zellen überleben und sich vermehren.
Größere Mengen an C. glutamicum-Zellen in einer Kultur sollten
größere Ausbeuten, Produktion oder Effizienz der Produktion der
Feinchemikalie aus der Kultur ergeben.
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Die vorstehend genannten Mutagenesestrategien für MCT-Proteine,
die erhöhte Ausbeuten einer Feinchemikalie aus C. glutamicum
bewirken sollen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen
dieser Strategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Durch diese
Mechanismen und mit Hilfe der hier offenbarten Mechanismen können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet
werden, um C. glutamicum oder verwandte Bakterienstämme, die
mutierte MCT-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu
erzeugen, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der
Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Die
gewünschte Verbindung kann ein natürliches Produkt von C.
glutamicunz sein, welches die Endprodukte der Biosynthesewege und
Zwischenprodukte natürlich vorkommender metabolischer Wege sowie
Moleküle umfaßt, die im Metabolismus von C. glutamicum nicht
natürlich vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen C.
glutamicum-Stamm produziert werden.
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Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter
veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden
sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung
zitierter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und
veröffentlichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme
aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1
Präparation der gesamten genomischen DNA aus
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
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Eine Kultur von Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wurde
über Nacht bei 30°C unter starkem Schütteln in BHI-Medium (Difco)
gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, der
Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 5 ml Puffer I
(5% des Ursprungsvolumens der Kultur - sämtliche angegebenen
Volumina sind für 100 ml Kulturvolumen berechnet) resuspendiert.
Die Zusammensetzung von Puffer I: 140,34 g/l Saccharose, 2,46 g/l
MgSO4.7 H2O, 10 ml/l KH2PO4-Lösung (100 g/l, mit KOH eingestellt
auf pH-Wert 6,7), 50 ml/l M12-Konzentrat (10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l
NaCl, 2 g/l MgSO4.7 H2O, 0,2 g/l CaCl2, 0,5 g/l Hefe-Extrakt
(Difco), 10 ml/l Spurenelemente-Mischung (200 mg/l FeSO4.H2O, 10
mg/l ZnSO4.7 H2O, 3 mg/l MnCl2.4 H2O, 30 mg/l H3BO3, 20 mg/l
CoCl2.6 H2O, 1 mg/l NiCl2.6 H2O, 3 mg/l Na2MoO4.2 H2O, 500 mg/l
Komplexbildner (EDTA oder Citronensäure), 100 ml/l Vitamingemisch
(0,2 ml/l Biotin, 0,2 mg/l Folsäure, 20 mg/l p-Aminobenzoesäure,
20 mg/l Riboflavin, 40 mg/l Ca-Panthothenat, 140 mg/l
Nikotinsäure, 40 mg/l Pyridoxolhydrochlorid, 200 mg/l Myoinositol).
Lysozym wurde in einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml zur Suspen-
Sion gegeben. Nach etwa 4 Std. Inkubation bei 37°C wurde die
Zellwand abgebaut, und die erhaltenen Protoplasten wurden durch
Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml Puffer I
und einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert
8) gewaschen. Das Pellet wurde in 4 ml TE-Puffer resuspendiert,
und 0,5 ml SDS-Lösung (10%) und 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) wurden
zugegeben. Nach Zugabe von Proteinase K in einer Endkonzentration
von 200 µg/ml wurde die Suspension etwa 18 Std. bei 37°C
inkubiert. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol,
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol und Chloroform-Isoamylalkohol mittels
Standard-Verfahren gereinigt. Dann wurde die DNA durch Zugabe von
1/50 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol,
anschließender Inkubation für 30 min bei -20°C und 30 min Zentrifugation
bei 12000 U/min in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit einem
SS34-Rotor (Sorvall) gefällt. Die DNA wurde in 1 ml TE-Puffer
gelöst, der 20 µg/ml RNase A enthielt, und für mindestens 3 Std.
bei 4°C gegen 1000 ml TE-Puffer dialysiert. Während dieser Zeit
wurde der Puffer 3mal ausgetauscht. Zu Aliquots von 0,4 ml der
dialysierten DNA-Lösung wurden 0,4 ml 2 M LiCl und 0,8 ml Ethanol
zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei -20°C wurde die DNA durch
Zentrifugation gesammelt (13000 U/min. Biofuge Fresco, Heraeus,
Hanau, Deutschland). Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer gelöst.
Durch dieses Verfahren hergestellte DNA konnte für alle Zwecke
verwendet werden, einschließlich Southern-Blotting oder zur
Konstruktion genomischer Banken.
Beispiel 2
Konstruktion genomischer Corynebacterium glutamicum
(ATCC13032)-Banken in Escherichia coli
-
Ausgehend von DNA, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben,
wurden gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe
bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M.
et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John
Wiley & Sons) Cosmid- und Plasmid-Banken hergestellt.
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Es ließ sich jedes Plasmid oder Cosmid einsetzen. Besondere
Verwendung fanden die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J. G. (1979) Proc.
Natl Acad. Sci. USA, 75: 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen
(1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe
(pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder
Cosmide, wie SuperCos1 (Stratagene, LaJolla, USA) oder Lorist6
(Gibson, T, J. Rosenthal, A., und Waterson, R. H. (1987) Gene 53:
283-286.
Beispiel 3
DNA-Sequenzierung und Computer -Funktionsanalyse
-
Genomische Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zur DNA-
Sequenzierung gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem
Kettenabbruchverfahren mit ABI377-Sequenziermaschinen (s. z. B.
Fleischman, R. D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and
Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science 269; 496-512)
verwendet. Die Sequenzierprimer mit den folgenden
Nukleotidsequenzen wurden verwendet: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' oder
5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
Beispiel 4
In-vivo-Mutagenese
-
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann
durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch
E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder
Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) geleitet wird, die die
Integrität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten
können. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das
DNA-Reparatursystem auf (z. B., mutHLS, mutD, mutT, usw., zum
Vergleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms in
Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington). Diese
Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme
ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7;
32-34 veranschaulicht.
Beispiel 5
DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und
Corynebacterium glutamicum
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Mehrere Corynebacterium- und Brevibacterium-Arten enthalten
endogene Plasmide (wie bspw. pHM1519 oder pBL1) die autonom
replizieren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J. F. et al. (1987).
Biotechnology 5: 137-146). Shuttle-vektoren für Escherichia coli
und Corynebacterium glutamicum lassen sich leicht mittels
Standard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al.,
(1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) "Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein
Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus
Corynebacterium glutamicum beigegeben wird. Solche Replikationsursprünge
werden vorzugsweise von endogenen Plasmiden entnommen, die aus
Corynebacterium- und Brevibactertium-Arten isoliert worden sind.
Besondere Verwendung als Transformationsmarker für diese Arten
sind Gene für Kanamycin-Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder
Tn-903-Transposon stammen) oder für Chloramphenicol (Winnacker,
E. L. (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene
Technology, VCH, Weinheim). Es gibt zahlreiche Beispiele in der
Literatur zur Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren,
die in E. coli und C. glutamicum repliziert werden, und die für
verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen-
Überexpression (siehe bspw. Yoshihama, M. et al. (1985) J.
Bacteriol. 162: 591-597, Martin, J. F. et al., (1987)
Biotechnology, 5: 137-146 und Eikmanns, B. J. et al. (1992) Gene
102: 93-98).
-
Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse
in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu
klonieren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum-
Stämme einzubringen. Die Transformation von C. glutamicum läßt
sich durch Protoplastentransformation (Kastsumata, R. et al.,
(1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), Elektroporation (Liebl, E. et
al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53 : 399-303) und in Fällen,
bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch
Konjugation erzielen (wie z. B. beschrieben in Schäfer, A., et (1990)
J.. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die
Shuttle-Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen,
indem Plasmid-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet
bekannter Standard-Verfahren) präpariert wird und in E. coli
transformiert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit
Standard-Verfahren erfolgen, jedoch wird vorteilhafterweise ein
Mcr-defizienter E. coli-Stamm verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J.
Mol. Biol. 166: 1-19).
Beispiel 6
Bestimmung der Expression des mutierten Proteins
-
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten Proteins in einer
transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, daß das
mutierte Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge
exprimiert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur
Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutierten Gens (ein
Anzeichen für die mRNA-Menge, die für die Translation des Genprodukts
verfügbar ist) ist die Durchführung eines Northern-Blots (s.
bspw. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular
Biology, Wiley: New York), wobei ein Primer, der so ausgestaltet
ist, daß er an das Gen von Interesse bindet, mit einer
nachweisbaren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden)
Markierung versehen wird, so daß - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur
des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine
stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird
die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen
und auch die Menge von mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese
Information ist ein Nachweis für das Ausmaß der Transkription des
mutierten Gens. Gesamt-Zell-RNA läßt sich durch verschiedene
Verfahren aus Corynebacterium glutamicum isolieren, die im
Fachgebiet bekannt sind, wie beschrieben in Bormann, E. R. et al.,
(1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
-
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge von
Protein, das aus dieser mRNA translatiert wird, können Standard-
Techniken, wie Western-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel
et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley,
New York). Bei diesem Verfahren werden Gesamt-Zellproteine
extrahiert, durch Gelelektrophorese getrennt, auf eine Matrix, wie
Nitrocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem
Antikörper, inkubiert, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet.
Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszierenden oder
kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen
läßt. Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt
das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutantenproteins in der
Zelle an.
Beispiel 7
Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium
glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
-
Genetisch veränderte Corynebakterien werden in synthetischen oder
natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl
unterschiedlicher Wachstumsmedien für Corynebakterien sind bekannt und leicht
erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:
205-210; van der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11:
11-16; Patent DE 41 20 867; Liebl (1992) "The Genus
Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A., et
al., Hrsg. Springer-Verlag). Diese Medien bestehen aus einer oder
mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen
Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte
Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr
gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructose, Mannose,
Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose,
Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über
komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte
aus der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch
vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen
zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und
organische Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure.
Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische
Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen
enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas
oder Ammoniumsalze, wie NH4Cl oder (NH4)2SO4, NH4OH, Nitrate,
Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie
Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakte, Fleischextrakte .
und andere.
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Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein
können, umfassen die Chlorid-, Phosphor-, oder Sulfatsalze von
Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan,
Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben
werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders
geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder
Protocatechuat oder organische Säuren, wie Citronensäure. Die
Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie
Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin,
Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin
gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen
Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und
dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen
hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden Fall
individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung
ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A
Practical Approach" (Hrsg. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press
(1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich
auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck)
oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
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Sämtliche Medienkomponenten sind sterilisiert, entweder durch
Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration.
Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls
getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu
Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder
chargenweise hinzugegeben werden.
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Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert
definiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und
kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert
werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5,
vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu
den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für
diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer,
wie MOPS, HEPES; ACES usw., können alternativ oder gleichzeitig
verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert läßt sich während der
Anzucht auch durch Zugabe von NaOH oder NH4OH konstant halten.
Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt verwendet, sinkt
der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe
Verbindungen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines
Fermenters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch
mit gasförmigem Ammoniak reguliert werden.
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Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von
mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt,
daß sich die maximale Menge Produkt in der Brühe ansammelt. Die
offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von
Behältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder
Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt
werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die
Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder
Schüttelkolben entweder mit oder ohne Schikanen gezüchtet werden.
Vorzugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10%
(bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums
gefüllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler
(Amplitude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von
100-300 U/min geschüttelt werden. Verdampfungsverluste können durch
Aufrechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden;
alternativ sollte für die Verdampfungsverluste eine mathematische
Korrektur durchgeführt werden.
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Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollten auch ein
unmodifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet
werden, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Das Medium wird.
auf eine OD600 von 0,5-1,5 angeimpft, wobei Zellen verwendet
werden, die auf Agarplatten gezüchtet wurden, wie cm-Platten (10
g/l Glucose, 2,5 g/l NaCl, 2 g/l Harnstoff, 10 g/l Polypepton, 5
g/l Hefeextrakt, 5 g/l Fleischextrakt, 22 g/l Agar pH-Wert 6,8
mit 2 M NaOH), die bei 30°C inkubiert worden sind. Das Animpfen
der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung
von C. glutamicum-Zellen von cm-Platten oder durch Zugabe einer
flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 8
In-vitro-Analyse der Funktion mutierter Proteine
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Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von
Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung
der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die
spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was
innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über
Enzyme im Allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die
Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und
Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können
bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden:
Dixon, M., und Webb, E. C: (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht
(1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh
(1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco;
Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology.
Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P. D: Hrsg. (1983) The Enzymes,
3. Aufl. Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994)
Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325);
Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods
of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie:
Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry
(1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
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Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele
gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift-
Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden).
Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle
kann mit Reportergenassays (wie beschrieben in Kolmar, H. et al.,
(1995) EMBO J. 14 : 3895-3904 und den darin zitierten
Literaturstellen) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind
wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotischen Zellen
etabliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün-Fluoreszenz-
Protein und mehrere andere verwendet werden.
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Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann
gemäß den Techniken, wie beschrieben in Gennis, R. B. (1989)
"Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular
Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234;
und 270-322, erfolgen.
Beispiel 9
Analyse des Einflusses von mutiertem Protein auf die
Produktion des gewünschten Produktes
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Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die
Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure)
kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen
unter geeigneten Bedingungen (wie solchen, die vorstehend
beschrieben sind) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären
Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes
(d. h. einer Aminosäure) untersucht wird. Solche Analysetechniken
sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie,
Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art,
enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische
Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw.
Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90
und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987)
"Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993)
Biotechnology, Bd, 3, Kapitel III: "Product recovery and
purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al.
(1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology,
John Wiley and Sons; Kennedy, J. F. und Cabral, J. M. S. (1992)
Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons;
Shaeiwitz, J. A. und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations,
in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3;
Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989)
Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes
Publications).
-
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es
ebenfalls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu
analysieten, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet
werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die
Gesamt-Produktivität des Organismus, die Ausbeute und/oder die Effizienz der
Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren
umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker,
Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere
Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums,
Analyse der Produktion gewöhnlicher Metabolite aus
Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt
werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied
Microbial Physiology; A Practical Approach, P. M. Rhodes und P. F.
Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN:
0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen
beschrieben.
Beispiel 10
Reinigung des gewünschten Produktes aus C.
glutamicum-Kultur
-
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus C. glutamicum-Zellen
oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann
durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen.
Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert,
können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation
geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie
mechanische Kraft oder Ultrabeschallung, lysiert werden. Die
Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die
Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur
weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das
Produkt von den C. glutamicum-Zellen sezerniert, werden die
Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und
die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer
Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das
gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz
zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht,
oder wobei die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die
Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können
nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere
Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der
Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und der wirksamsten
Anwendung für ein bestimmtes, zu reinigendes Molekül bewandert. Das
gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration
konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der
die Stabilität des Produktes maximal ist.
-
Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, die nicht
auf das vorhergehende Reinigungsverfahren eingeschränkt sind.
Diese sind bspw. beschrieben in Bailey, J. E. & Ollis, D. F.
Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York
(1986).
-
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch
Standard-Techniken des Fachgebiets bestimmt werden. Diese
umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC),
spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie,
NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese
Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ.
Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya
11: 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:
67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd.
A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566,
S. 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An
Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons;
Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in:
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd.
17.
Äquivalente
-
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich
Routineverfahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen
spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen
von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein.
-
Die Angaben in Tabelle 1 sind folgendermassen zu verstehen:
In Spalte 1 "DNA-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die
SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "5" in der
Spalte "DNA-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 5.
In Spalte 2 "AS-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID
NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "6" in der Spalte
"AS-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 6.
In Spalte 3 "Identifikation" wird eine eindeutige interne
Bezeichnung für jede Sequenz aufgeführt.
In Spalte 4 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die
Aminosäureposition der Polypeptidsequenz "AS-ID" in der gleichen
Zeile. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die
Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen
Polypeptidsequenz. Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.
In Spalte 5 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die
Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte
4 angegebenen Position beim entsprechenden Wildtyp-Stamm.
In Spalte 6 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die
Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte
4 angegebenen Position beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 7 "Funktion" wird die physiologische Funktion der
entsprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt.
-
Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Phenylalanin
G Glycin
H His
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin