EP1456232A2 - Gene die für membransynthese- und membrantransport-proteine codieren - Google Patents

Gene die für membransynthese- und membrantransport-proteine codieren

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Publication number
EP1456232A2
EP1456232A2 EP02781299A EP02781299A EP1456232A2 EP 1456232 A2 EP1456232 A2 EP 1456232A2 EP 02781299 A EP02781299 A EP 02781299A EP 02781299 A EP02781299 A EP 02781299A EP 1456232 A2 EP1456232 A2 EP 1456232A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
mct
nucleic acid
cell
molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP02781299A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oskar Zelder
Markus Pompejus
Hartwig Schröder
Burkhard Kröger
Corinna Klopprogge
Gregor Haberhauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paik Kwang Industrial Co Ltd
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1456232A2 publication Critical patent/EP1456232A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • Certain products and by-products of naturally occurring metabolic processes in cells are used in many industries, including the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries.
  • These molecules collectively referred to as “fine chemicals", include organic acids, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleotides and nucleosides, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins and cofactors and enzymes. They are best produced by growing large-scale bacteria that are designed to produce and secrete large quantities of one or more molecules.
  • a particularly suitable organism for this purpose is Corynebacterium glutamic m, a gram-positive, non-pathogenic bacterium. Through strain selection, a number of mutant strains have been developed that produce a range of desirable compounds. However, selecting strains that are improved in the production of a particular molecule is a time consuming and difficult process.
  • This invention provides novel nucleic acid molecules that can be used to identify or classify CoryneJbacterium glutamicum or related types of bacteria.
  • C. glutamicum is a gram-positive, aerobic bacterium (eg. In the overflow of crude oil) in the industry for the large scale production of a variety of fine chemicals, and also for the degradation of hydrocarbons and for the oxidation of terpenoids overall ⁇ meinhin used becomes.
  • the nucleic acid molecules can therefore be used to identify microorganisms that can be used for the production of fine chemicals, for example by fermentation processes.
  • glutamicum itself is not pathogenic, but it is related to other Corynebacterium species, such as Corynebacterium diphtheriae (the causative agent of diphtheria), which are important pathogens in humans. The ability to identify the presence of Corynebacterium species can therefore also be of significant clinical importance, for example in diagnostic applications.
  • These nucleic acid molecules can also serve as reference points for mapping the C. glutamicum genome or organisms related to genomes.
  • These "new nucleic acid molecules encode proteins which are referred to here as membrane construction and membrane transport (MCT) proteins.
  • MCT proteins can, for example, perform a function which is involved in the metabolism (eg biosynthesis or degradation) of 5 compounds which are necessary for membrane biosynthesis, or support the membrane transport of one or more compounds into or out of the cell due to the availability of cloning vectors for use in Cor . y22ejbacfce.rium glutamicum, as disclosed, for example, in Sinskey et
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of this organism in order to make it better and more efficient as a producer of one or more fine chemicals.
  • the improved production or efficiency of the production of a fine chemical can be attributed to a direct
  • MCT proteins which are involved in the export of the fine chemical molecules from the cell, can have a greater number or higher activity, so that larger
  • MCT proteins which are involved in the import of the nutrients necessary for the biosynthesis of one or more fine chemicals (e.g. phosphate, sulfate, nitrogen compounds, etc.),
  • fatty acids and lipids are themselves desirable fine chemicals; by optimizing the activity or increasing the number of one or more MCT proteins according to the invention which are involved in the biosynthesis of these compounds, or by impairing the activity of one or more MCT proteins which are involved in the degradation of these compounds, the yield, production and / or efficiency of the production of fatty acids and lipid molecules from C. glutamicum can be increased.
  • the mutagenesis of one or more MCT genes according to the invention can also produce MCT proteins with modified activities which indirectly impair the production of one or more desired fine chemicals from C. glutamicum. For example.
  • MCT proteins according to the invention which are involved in the export of waste products, have a greater number or higher activity, so that the normal metabolic waste of the cell (possibly in higher quantity due to the overproduction of the desired fine chemical) is efficiently exported before it contains the nucleotides and Can damage proteins in the cell (which would decrease cell viability) or interact with the fine chemical biosynthetic pathways (which would decrease the yield, production or efficiency of production of a desired fine chemical).
  • the relatively large intracellular amounts of the desired fine chemical can even be toxic to the cell. For example, increasing the number of transporters that can export these compounds from the cell can increase the viability of the cell in culture, which in turn causes that a larger number of cells in the culture produce the desired fine chemical.
  • the MCT proteins according to the invention can also be manipulated in such a way that the relative amounts of the different lipid and fatty acid molecules are produced. This can have a significant impact on the lipid composition of the cell membrane. Since each type of lipid has different physical properties, changing the lipid composition of a membrane can significantly change the membrane fluidity. Changes in the membrane fluidity can influence the transport of the molecules across the membrane as well as the integrity of the cell, each of which has a considerable effect on the production of fine chemicals from C. glutamicum in large-scale fermenter cultures.
  • the invention provides new nucleic acid molecules which encode proteins which are referred to here as MCT proteins and are involved, for example, in the metabolism of compounds which are necessary for the construction of the cell membranes in C. glutamicum, or in the transport of molecules across these membranes .
  • MCT protein is involved in the metabolism of compounds which are necessary for the construction of the cell membranes in C. glutamicum, or in the transport of molecules across these membranes. Examples of these proteins include those encoded by the genes shown in Table 1.
  • isolated nucleic acid molecules for example cDNAs
  • isolated nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence which encodes an MCT protein or biologically active sections thereof, and also nucleic acid fragments which can be used as primers or hybridization are suitable for the detection or amplification of MCT-coding nucleic acid (for example DNA or mRNA).
  • the isolated nucleic acid molecule comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A or the coding region or a complement thereof from one of these nucleotide sequences.
  • the isolated nucleic acid molecule encodes one of the amino acid sequences listed in Appendix B.
  • the preferred MCT proteins according to the invention likewise preferably have at least one of the MCT activities described here.
  • nucleic acid sequences of the sequence listing together with the sequence changes at the respective position described in Table 1 are defined as Appendix A.
  • polypeptide sequences of the sequence listing are defined as Appendix B together with the sequence changes at the respective position described in Table 1.
  • the isolated nucleic acid molecule is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence from Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule.
  • the isolated nucleic acid more preferably encodes a naturally occurring C. glufcarnicum MCT protein or a biologically active portion thereof.
  • Another aspect of the invention relates to vectors, for example recombinant expression vectors which contain the nucleic acid molecules according to the invention, and host cells into which these vectors have been introduced.
  • a host cell is used to produce an MCT protein, which is grown in a suitable medium.
  • the MCT protein can then be isolated from the medium or the host cell.
  • Another aspect of the invention relates to a genetically modified microorganism in which an MCT gene has been introduced or modified.
  • the genome of the microorganism has been changed by introducing at least one nucleic acid molecule according to the invention which encodes the mutated MCT sequence as a transgene.
  • an endogenous MCT gene in the genome of the microorganism has been changed, for example functionally disrupted, by homologous recombination with an altered MCT gene.
  • the microorganism belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, with Corynebacterium glutamicum in particular is preferred.
  • the microorganism is also used to produce a desired compound, such as an amino acid, particularly preferably lysine.
  • host cells that have more than one of the nucleic acid molecules described in Appendix A.
  • Such host cells can be produced in various ways known to those skilled in the art. For example, they can be transfected by vectors which carry several of the nucleic acid molecules according to the invention. However, it is also possible to introduce one nucleic acid molecule according to the invention into the host cell with one vector and therefore to use several vectors either simultaneously or in a staggered manner. Host cells can thus be constructed which carry numerous up to several hundred of the nucleic acid sequences according to the invention. Such an accumulation can often achieve superadditive effects on the host cell with regard to fine chemical productivity.
  • an isolated MCT protein or a section for example a biologically active section thereof.
  • the isolated MCT protein or its section can be involved in the metabolism of compounds which are necessary for the construction of the cell membranes in C. glutamicum or in the transport of molecules across the membranes.
  • the isolated MCT protein or a section thereof is sufficiently homologous to an amino acid sequence from Appendix B so that the protein or its section continues to participate in the metabolism of compounds which are necessary for the construction of the cell membranes in C. glutamicum, or can be involved in the transport of molecules across the membranes.
  • the invention also relates to an isolated MCT protein preparation.
  • the MCT protein comprises an amino acid sequence from Appendix B.
  • the invention relates to an isolated full-length protein which essentially forms a complete amino acid sequence from Appendix B (which is encoded by an open reading frame in Appendix A) is homologous.
  • the MCT polypeptide or a biologically active portion thereof can be operably linked to a non-MCT polypeptide to form a fusion protein.
  • this fusion protein has a different activity than the MCT protein alone and, in other preferred embodiments, results in increased yields, increased production and / or Efficiency of producing a desired fine chemical from C. glutamicum.
  • the integration of this fusion protein into a host cell modulates the production of a desired compound from the cell in particularly preferred embodiments.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a fine chemical.
  • the method provides for the cultivation of a cell which contains a vector which brings about the expression of an MCT nucleic acid molecule according to the invention, so that a fine chemical is produced.
  • this method also comprises the step of obtaining a cell which contains such a vector, the cell being transfected with a vector which brings about the expression of an MCT nucleic acid.
  • this method also comprises the step in which the fine chemical is obtained from the culture.
  • the cell belongs to the genus Corynebacterium or BreviJbacfcerium.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the production of a molecule from a microorganism. These methods involve contacting the cell with a substance that modulates MCT protein activity or MCT nucleic acid expression so that a cell-associated activity changes compared to the same activity in the absence of the substance.
  • the cell is modulated with respect to one or more C. glutamicum metabolic pathways for cell membrane components or with regard to the transport of compounds across the membranes, so that the yields or the production rate of a desired fine chemical are improved by this microorganism.
  • the substance that modulates the MCT protein activity stimulates, for example, the MCT protein activity or the MCT nucleic acid expression.
  • substances that stimulate MCT protein activity or MCT nucleic acid expression include small molecules, active MCT proteins, and nucleic acids that encode MCT proteins and have been introduced into the cell.
  • substances that inhibit MCT activity or expression include small molecules and antisense MCT nucleic acid molecules.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the yields of a desired compound from a cell, comprising introducing into a cell a MCT wild-type or mutant gene which either remains on a separate plasmid or is integrated into the genome of the host cell.
  • the integration into the genome can take place randomly or by homologous recombination, so that the native gene can be recognized by the integrated copy. is set, which causes the production of the desired compound from the cell to be modulated.
  • these yields are increased.
  • the chemical is a fine chemical, which in an especially preferred embodiment is an amino acid. In a particularly preferred embodiment, this amino acid is L-lysine.
  • the present invention provides MCT nucleic acid and protein molecules which can be involved in the metabolism of compounds necessary for the construction of the cell membranes in C. glutamicum or in the transport of molecules across the membranes.
  • the molecules of the invention can be used in the modulation of the production of fine chemicals from microorganisms, such as C. glutamicum, either directly (e.g. where the overexpression or optimization of a fatty acid biosynthetic protein has a direct effect on the yield, production and / or efficiency of production of the Fatty acid of modified C.
  • glutamicum or by an indirect effect which nevertheless causes an increase in the yield, production and / or efficiency in the production of the desired compound (for example where the modulation of the metabolism of the cell membrane components changes in the yield, production and / or efficiency of production or composition of the cell membrane, which in turn affects the production of one or more fine chemicals).
  • the modulation of the metabolism of the cell membrane components changes in the yield, production and / or efficiency of production or composition of the cell membrane, which in turn affects the production of one or more fine chemicals.
  • fine chemical is known in the art and includes molecules that are produced by an organism and have applications in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, and cosmetic industries.
  • These compounds include organic acids, such as tartaric acid, itaconic acid and diamino-pimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides (as described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., ed. VCH: Weinheim and the citations contained therein), lipids, saturated and unsaturated fatty acids (e.g.
  • arachidonic acid arachidonic acid
  • diols e.g. propanediol and butanediol
  • Carbohydrates e.g. hyaluronic acid and trehalose
  • aromatic compounds e.g. aromatic amines, vanillin and indigo
  • vitamins and cofactors such as described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for normal cell functions.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 types, serve as structural units for proteins in which they are linked to one another via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) are usually not found in proteins (see Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)).
  • the amino acids can be in the D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins.
  • Biosynthetic and degradation pathways of each of the 20 proteinogenic amino acids are well characterized in both prokaryotic and eukaryotic cells (see, for example, Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pp. 578-590 (1988)).
  • essential amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • amino acids are identified by simple biosynthetic pathways converted into the remaining 11 "non-essential” amino acids (alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine).
  • Higher animals have the ability to synthesize some of these amino acids, but the essential amino acids must be ingested in order for normal protein synthesis to take place.
  • Lysine is not an important amino acid only for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • Glutamate is most commonly used as a flavor additive (monosodium glutamate, MSG) and widely used in the food industry, as well as aspartate, phenylalanine, glycine and cysteine.
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetic industries. Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widespread feed additives (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim).
  • amino acids can also be used as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan and others, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 are suitable substances.
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate, in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentosephosphate pathway, erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate in a 9-step biosynthetic pathway that differs only in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step process.
  • Tyrosine can also be produced from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is formed from oxa acetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each converted aspartate.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids the amount of which exceeds the cell's protein biosynthesis requirements, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediates are provided for the main metabolic pathways of the cell (for an overview see Stryer, L., Biochemistry, 3rd ed. Chapter 21 "Amino Acid
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and must therefore absorb them, although they are easily synthesized by other organisms such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds also have a significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and the industrial applications of these compounds, see, for example, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and encompasses nutrients which are required by an organism for normal function, but which cannot be synthesized by this organism itself.
  • the group of vitamins can include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds necessary for normal enzyme activity to occur are. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic.
  • nutraceutical encompasses food additives which are harmful to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (eg polyunsaturated fatty acids).
  • Thiamine (vitamin Bi) is formed by chemical coupling of pyrimidine and thiazole units.
  • Riboflavin (vitamin B) is synthesized from guanosine 5 'triphosphate (GTP) and ribose 5' phosphate. Riboflavin in turn is used to synthesize flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • the family of compounds commonly referred to as "Vitamin B6" e.g. pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal 5 'phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Vitamin B6 e.g. pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal 5 'phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Panthothenate (antothenic acid, R- (+) -N- (2,4-dihydroxy-3,3,3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanine) can be produced either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the final steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ß-alanine and pantoic acid.
  • the enzymes responsible for the biosynthesis steps for the conversion into pantoic acid, into ⁇ -alanine and for the condensation into pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis takes place over 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal-5'-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), Pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • Lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it becomes part of the pyruvate dehydrogenase complex and the OC-ketoglutarate dehydrogenase complex.
  • the folates are a group of substances that are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methylpterine.
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B ⁇
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B ⁇ is sufficiently complex that it has not been fully characterized, but a large part of the enzymes and substrates involved is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, which are also known as "nia ⁇ in”.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • nucleotide includes the basic structural units of the nucleic acid molecules, which comprise a nitrogenous base, a pentose sugar (for RNA the sugar is ribose, for DNA the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside encompasses molecules which serve as precursors of nucleotides but which, in contrast to the nucleotides, do not contain a phosphoric acid unit exhibit.
  • RNA and DNA synthesis By inhibiting the biosynthesis of these molecules or their mobilization to form nucleic acid molecules, it is possible to inhibit RNA and DNA synthesis; if this activity is specifically inhibited in carcinogenic cells, the ability of tumor cells to divide and replicate can be inhibited.
  • AMP energy stores
  • FAD and NAD coenzymes
  • the purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other possible uses: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (e.g. thiamine, S-adenosyl methionine, folate or riboflavin), as energy sources for the cell (e.g. ATP or GTP) and for chemicals themselves, are commonly used as flavor enhancers (e.g. IMP or GMP) or for many medical applications (see e.g. Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., ed VCH: Weinheim, pp. 561-612)
  • Enzymes which are involved in the purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly used as targets against chemicals for crop protection, including fungicides, herbicides and Insecticides are being developed.
  • the purine nucleotides are removed via a series of steps via the intermediate compound inosine 5 'phosphate (IMP) from Ri- synthesized bose-5-phosphate, which leads to the production of guanosine 5 'monophosphate (GMP) or adenosine 5' monophosphate (AMP), from which the triphosphate forms used as nucleotides can be easily prepared.
  • IMP inosine 5 'phosphate
  • GMP guanosine 5 'monophosphate
  • AMP adenosine 5' monophosphate
  • Pyrimidine biosynthesis takes place via the formation of uridine 5 'monophosphate (UMP) from ribose 5-phosphate. UMP in turn is converted into cytidine 5 'triphosphate (CTP).
  • the deoxy forms of all nucleotides are produced in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules that are linked via an ⁇ , ⁇ -l, 1 bond. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen food and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, e.g., Nishimoto et al., (1998) US Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindguist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, CLA and Panek, AD Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; and Shiosaka, MJ Japan 172 (1997) 97-102). Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and is naturally released into the surrounding medium from which it can be obtained by methods known in the art.
  • the cell membranes serve a number of functions in a cell. First of all, a membrane differentiates the cell content from the environment, so that the cell maintains integrity. The membranes also serve as barriers so that dangerous or undesired connections cannot flow in and desired connections cannot flow out.
  • cell membranes are inherently impermeable to the not facilitated diffusion of hydrophilic compounds such as proteins, water molecules and ions: a double layer of lipid molecules in which the polar head groups protrude outwards (out of the cell or into the cell interior) and the non-polar tails protrude to the middle of the double layer and form a hydrophobic core (for a general overview of the structure and function of the membrane see Gennis, RB (1989) Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg).
  • This barrier allows that the cells contain a relatively higher concentration of desired compounds and a relatively lower concentration of undesired compounds than the surrounding medium, since the diffusion of these compounds through the membrane is efficiently blocked.
  • the membrane also provides an effective barrier against the import of desired molecules and the export of waste molecules.
  • the cell membranes contain many types of transporter proteins that can facilitate the transmembrane transport of various types of compounds: pores or channels and transporters.
  • the former are integral membrane proteins, sometimes protein complexes, that form a regulated opening through the membrane.
  • This regulation or "gating" is usually specific to those to be transported through the pore or channel, so that these transmembrane constructs are specific to a specific class of substrates; For example, a potassium channel is constructed in such a way that only ions with a charge and size similar to potassium can pass through.
  • Channel and pore proteins have certain hydrophobic and hydrophilic domains so that the hydrophobic portion of the protein can attach to the interior of the membrane, whereas the hydrophilic portion defines the interior of the channel, providing a protected hydrophilic environment through which the selected hydrophilic Molecule can arrive.
  • Many such pores / channels are known in the art, including those for potassium, calcium, sodium and chloride ions.
  • This pore and channel mediated system is limited to very small molecules, such as ions, since pores or channels that are large enough to allow complete proteins to pass through by facilitating diffusion would not be able to pass through smaller molecules prevent.
  • the transport of molecules through this process is sometimes referred to as "facilitated diffusion” because the driving force of a concentration gradient is required for the transport to take place.
  • Permeases also facilitate the easier diffusion of larger molecules, such as glucose or other sugars, into the cell if the concentration of these molecules is greater on one side of the membrane than on the other (also referred to as "uniport").
  • these integral proteins (which often have 6 to 14 membrane-spanning ⁇ -helices) do not form open channels through the membrane, but they do bind to the target molecule on the membrane surface and then undergo a conformational change, so that the target molecule is released on the opposite side of the membrane.
  • lipid molecules The synthesis of membranes is a well characterized process involving many components, the most important of which are the lipid molecules. Lipid synthesis can be divided into two parts: the synthesis of fatty acids and their binding to sn-glycerol-3-phosphate and the addition or modification of a polar head group. Usual lipids found in bacterial membranes used include phospholipids, glycolipids, sphingolipids and phosphoglycerides. Fatty acid synthesis begins with the conversion of acetyl-CoA into malonyl-CoA by acetyl-CoA-carboxylase or in acetyl-ACP by acetyl transacylase.
  • CFA cyclopropane fatty acids
  • the present invention is based, at least in part, on the discovery of new molecules, which are referred to here as MCT nucleic acid and protein molecules and control the production of cell membranes in C. glutamicum and effect the movement of molecules across these membranes.
  • the MCT molecules are involved in the metabolism of compounds which are involved in the construction of the cell membranes in C. glutamicum or in the transport of the molecules across these membranes.
  • the activity of the MCT molecules according to the invention for regulating the production of membrane components has an effect on the production of a desired fine chemical by this organism.
  • the activity of the modulated MCT molecules is modulated such that the C.
  • glutamicum Metabolic pathways that are regulated by the MCT proteins according to the invention, are modulated with regard to yield, production and / or production efficiency and are modified with regard to the efficiency of the transport of the compounds through the membranes, which increases the yield, production and / or efficiency of the Production of a desired fine chemical modulated either directly or indirectly by C. glutamicum.
  • MCT protein or “MCT polypeptide” encompasses proteins that are involved in the metabolism of compounds that are essential for the construction of
  • MCT proteins include those encoded by the MCT genes listed in Table 1 and Appendix A.
  • MCT gene or “MCT nucleic acid sequence” encompass nucleic acid sequences which encode an MCT protein which consists of a coding region and corresponding untranslated 5 'and 3' sequence regions. Examples of MCT genes are listed in Table 1.
  • production or “productivity” are known in the art and include the concentration of the fermentation product (for example the desired fine chemical which is formed within a defined period of time and a defined fermentation volume (for example kg product per hour per 1)
  • concentration of the fermentation product for example the desired fine chemical which is formed within a defined period of time and a defined fermentation volume (for example kg product per hour per 1)
  • production efficiency encompasses the time it takes to achieve a certain production quantity (for example how long it takes the cell to set up a certain throughput rate of a fine chemical).
  • yield or “product / carbon yield”. is known in the art and encompasses the efficiency of converting the carbon source to the product (ie, the fine chemical), for example, usually expressed as kg product per kg carbon source.
  • Increasing the yield or production of the compound will increase the amount of molecules or molecules recovered suitable obtained molecules of this compound in a certain Culture volume increased over a fixed period.
  • biosynthesis or “biosynthetic pathway” are known in the art and encompass the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediate compounds, for example in a multi-step or highly regulated process.
  • degradation or “degradation path” are known in the art and include the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), e.g. in a multi-step or highly regulated Process.
  • metabolism is known in the art and encompasses all of the biochemical reactions that take place in an organism. The metabolism of a particular compound (e.g. the metabolism of an amino acid, such as Gly- a) then includes all biosynthesis, modification and degradation pathways of this compound in the cell.
  • the MCT molecules according to the invention are capable of modulating the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism, such as C. glutamicum.
  • a desired molecule such as a fine chemical
  • C. glutamicum stai ⁇ x which contains such a modified protein.
  • MCT proteins that are involved in the import of the nutrients that are necessary for the biosynthesis of one or more fine chemicals can accordingly be present in greater numbers or with higher activity, so that these precursor, cofactor or intermediate compounds are present in the cell in higher concentrations.
  • fatty acids and lipids are themselves desirable fine chemicals; by optimizing the activity or increasing the number of one or more MCT proteins according to the invention, which are involved in the biosynthesis of these compounds, or by influencing the activity of one or more MCT proteins, which are involved in the degradation of these compounds to increase the yield, production and / or efficiency of the production of fatty acid and lipid molecules from C. glutamicum.
  • the mutagenesis of one or more genes according to the invention can also produce MCT proteins with modified activities which influence the production of one or more fine chemicals from C. glutamicum.
  • MCT proteins according to the invention which are involved in the export of waste products, can be present in greater number or higher activity, so that the normal metabolic waste of the cell (possibly in higher quantity due to overproduction of the desired fine chemical) can be exported efficiently before being nucleotides and Damage proteins within the cell (which reduces cell viability) or interact with other fine chemical pathways (which reduces the yield, production or efficiency of production of the desired fine chemical).
  • the relatively large intracellular amounts of the desired fine chemical per se can be toxic to the cell.
  • the MCT proteins according to the invention can be manipulated in such a way that the relative amounts of different lipid and fatty acid molecules are produced. This can have a significant impact on the lipid composition of the cell membrane. Since each type of lipid has different physical properties, changing the lipid composition of a membrane can significantly change the membrane fluidity. Changes in membrane fluidity can affect the transport of molecules across the membrane as well as cell integrity, each of which has a significant impact on the production of fine chemicals from C. glutamicum in large-scale fermenter cultures.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be produced from these nucleic acid sequences by conventional methods using the changes described in Table 1.
  • the MCT protein according to the invention or a biologically active section or fragments thereof can be involved in the metabolism of compounds which are necessary for the construction of the cell membranes in C. glutamicum or in the transport of molecules across these membranes, or one or more of the molecules in Activities listed in Table 1.
  • nucleic acid molecule which encode MCT polypeptides or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which are sufficient for use as hybridization probes or primers for identifying or amplifying MCT-coding nucleic acids (for example MCT-DNA).
  • nucleic acid molecule is intended to encompass DNA molecules (eg cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (eg mRNA) as well as DNA or RNA analogs that are generated by means of nucleotide analogs.
  • This term also includes the untranslated sequence located at the 3 'and 5' end of the coding gene region: at least about 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least about 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' end of the coding gene region.
  • the nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably a double-stranded DNA.
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • An "isolated" nucleic acid preferably has no sequences that naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (for example, sequences that are located on the 5 'or
  • the isolated MCT nucleic acid molecule can contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, or 0.1 kb of the nucleotide sequences that naturally comprise the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the Flank the cell from which the nucleic acid originates (for example a C. glutamicum cell).
  • An "isolated" nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule can also be substantially free of any other cellular material or culture medium if it is produced by recombinant techniques, or of chemical precursors or other chemicals if it is chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from Appendix A or a section thereof, can be produced by means of standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • a C. glutamicur ⁇ -MCT cDNA can be isolated from a C. glufcamicum bank by using a complete sequence from Appendix A or a section thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch , EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd to 1st Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence from Annex A or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been prepared on the basis of this sequence (for example a nucleic acid molecule comprising a complete sequence can be used Appendix A, or a portion thereof, can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers made from this same sequence from Appendix A).
  • mRNA can be isolated from normal endothelial cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al.
  • cDNA can be converted using reverse transcriptase (for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Louis, FL).
  • reverse transcriptase for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for amplification via polymerase chain reaction can be created on the basis of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • a nucleic acid according to the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to an MCT nucleotide sequence can be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises a nucleic acid molecule which is complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A or a portion thereof, which is a nucleic acid molecule which is sufficiently complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A that it can hybridize to one of the sequences given in Appendix A, creating a stable duplex.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a portion thereof which comprises an amino acid sequence which is sufficiently homologous to an amino acid sequence of Appendix B that the protein or a portion thereof further participates in the metabolism of compounds which are essential for the construction of the cell membranes in C. glutamicum are necessary, or may be involved in the transport of the molecules across these membranes.
  • the term "sufficiently homologous" refers to proteins or portions thereof whose amino acid sequences have a minimal number of identical or equivalent amino acid residues (e.g., an amino acid residue with a side chain similar to an amino acid residue in one of the sequences of Appendix B) to an ami - Show nos acid sequence from Appendix B, so that the protein or a portion thereof can also be involved in the metabolism of compounds which are necessary for the construction of the cell membranes in C. glutamicum, or in the transport of the molecules across these membranes. Protein components of these pathways for membrane components or membrane transport systems, as described here, can play a role in the production and secretion of one or more fine chemicals. Examples of these Activities are also described here.
  • the "function of an MCT protein” relates either directly or indirectly to the yield, production and / or efficiency of the production of one or more fine chemicals. Table 1 shows examples of MCT protein activities.
  • Sections of proteins which are encoded by the MCT nucleic acid according to the invention are preferably biologically active sections of one of the MCT proteins.
  • the term “biologically active section of an MCT protein”, as used here, is intended to include a section, for example a domain or a motif, of an MCT protein which is involved in the metabolism of compounds which are essential for the structure of the cell membranes in C. glutamicum are necessary, or may be involved in the transport of molecules across these membranes, or has an activity given in Table 1.
  • a test of the enzymatic activity can be carried out be performed. These test methods, as described in detail in Example 8 of the example part, are familiar to the person skilled in the art.
  • nucleotide sequence of Appendix A which leads to a change in the amino acid sequence of the encoded MCT protein without affecting the functionality of the MCT protein.
  • nucleotide substitutions which lead to amino acid substitutions at "non-essential" amino acid residues can be prepared in a sequence from Appendix A.
  • a "non-essential" amino acid residue can be modified in a wild-type sequence from one of the MCT proteins (Appendix B) without changing the activity of the MCT protein, whereas an "essential" amino acid residue is required for the MCT protein activity.
  • other amino acid residues for example non-conserved or only semi-preserved amino acid residues in the domain with MCT activity
  • An isolated nucleic acid molecule that encodes an MCT protein that is homologous to a protein sequence from Appendix B can be prepared by introducing one or more nucleotide substitutions,
  • additions or deletions are generated in a nucleotide sequence from Appendix A, so that one or more amino acid substances ttions, additions or deletions are introduced into the encoded protein.
  • the mutations can be introduced into one of the sequences from Appendix A by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • Conservative amino acid substitutions are preferably introduced on one or more of the predicted non-essential amino acid residues.
  • the amino acid residue is replaced by an amino acid residue with a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art.
  • amino acids with basic side chains eg lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains eg aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • polar side chains e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains e.g. threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • a predicted non-essential amino acid residue in an MCT protein is thus preferably replaced by another amino acid residue of the same side chain family.
  • the mutations can alternatively be introduced randomly over all or part of the MCT coding sequence, for example by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be examined for the MCT activity described here in order to identify mutants, that maintain MCT activity.
  • the encoded protein can be expressed recombinantly, and the activity of the protein can be determined, for example, using the tests described here (see Example 8 of the example part).
  • vectors that contain a nucleic acid that encode an MCT protein (or a portion thereof).
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which is a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (for example bacterial vectors with a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • Other vectors e.g.
  • non- episomal mammalian vectors are integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are called "expression vectors".
  • expression vectors usually the expression vectors used in recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and vector can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other expression vector forms, such as viral vectors (for example replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses), which perform similar functions.
  • the recombinant expression vector according to the invention comprises a nucleic acid according to the invention in a form which is suitable for the expression of the nucleic acid in a host cell, which means that the recombinant expression vectors one or more regulatory sequences, selected on the basis of the host cells to be used for expression, the is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • “operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible (for example in an in vitro transcription / Translation system - or in a host cell if the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to encompass promoters, enhancers and other expression control elements (for example polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells. The person skilled in the art is aware that the design of an expression vector can depend on factors such as the choice of the host cell to be transformed, the extent of expression of the desired protein, etc.
  • the expression vectors according to the invention can be introduced into the host cells, so that proteins or peptides are thereby obtained , including fusion proteins or peptides that are encoded by the nucleic acids as described herein (e.g., MCT proteins, mutant forms of MCT proteins, fusion proteins, etc.).
  • the recombinant expression vectors according to the invention can be designed for the expression of MCT proteins in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • MCT genes can be found in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells (with Baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA et al.
  • Proteins are usually expressed in prokaryotes using vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Fusion vectors contribute a number of amino acids to a protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein. These fusion vectors usually have three functions: 1) to increase the expression of recombinant protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein; and 3) supporting the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification.
  • a proteolytic cleavage site is often introduced at the junction of the fusion unit and the recombinant protein, so that the recombinant protein can be separated from the fusion unit after the fusion protein has been purified.
  • These enzymes and their corresponding recognition sequences include factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which Glutathione-S-Transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A to the recombinant target protein is fused.
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • the coding sequence of the MCT protein is cloned into a pGEX expression vector so that a vector is generated which encodes a fusion protein comprising from the N-terminus to the C-terminus, GST - thrombin cleavage site - X protein.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography using glutathione-agarose resin.
  • the recombinant MCT protein that is not fused to GST can be obtained by cle
  • Suitable inducible non-fusion expression vectors from E. coli include pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pETIld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89).
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pETlld vector is based on the transcription from a T7-gnl0-lac fusion promoter, which is mediated by a coexpressed viral RNA polymerase (T7 gnl). This viral polymerase is supplied by the BL 21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ prophage which harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • One strategy to maximize the expression of the recombinant protein is to express the protein in a bacterium whose ability to proteolytically cleave the recombinant protein is impaired (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128).
  • Another strategy is to change the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be inserted into an expression vector, so that the individual codons for each amino acid are those which are preferably used in a bacterium selected for expression, such as C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). This change in the nucleic acid sequences according to the invention is carried out by standard DNA synthesis techniques.
  • the MCT protein expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943 ), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi, suitable include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, JF Peberdy et al., ed. , Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • the MCT proteins according to the invention can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the MCT proteins according to the invention can be expressed in single-cell plant cells (such as algae) or in plant cells of higher plants (for example spermatophytes such as crops).
  • plant expression vectors include those which are described in detail in: Bekker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • a nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells with a mammalian expression vector.
  • mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187-195).
  • the control functions of the expression vector are often provided by viral regulatory elements. Commonly used promoters come, for example, from Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus and Simian Virus 40.
  • suitable expression systems for prokaryotic and eukaryotic cells see chapters 16 and 17 from Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
  • the recombinant mammalian expression vector can preferably bring about the expression of the nucleic acid in a specific cell type (for example, tissue-specific regulatory elements are used for the expression of the nucleic acid).
  • tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • suitable tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-specific promoters (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), in particular promoters of T cell receptors
  • pancreatic-specific promoters e.g. neurofilament promoter; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477
  • pancreatic-specific promoters e.g. milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166
  • mammary-specific promoters 10 e.g. milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166.
  • Development-regulated promoters are also included, for example the mouse hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the ⁇ -fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:15 537-546).
  • the invention also provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule according to the invention which is cloned into the expression vector in the antisense direction.
  • the DNA molecule is operatively linked to a regulatory sequence such that expression (by transcription of the DNA-.Molecule) of an RNA molecule, which is antisense to the MCT mRNA, is possible.
  • Regulatory sequences can be selected that are functional to an antisense rich
  • cloned nucleic acid are bound and which control the continuous expression of the antisense RNA molecule in a variety of cell types, for example.
  • Viral promoters and / or enhancers or regulatory sequences can be selected which are constitutive, tissue-specific or cell-type-specific expression
  • the antisense expression vector can be in the form of a recombinant plasmid, phagemid or attenuated virus in which antisense nucleic acids are produced under the control of a highly effective regulatory region whose activity is determined by the cell type, the vector is introduced into the •. 5
  • a highly effective regulatory region whose activity is determined by the cell type, the vector is introduced into the •. 5
  • a further aspect of the invention relates to the host cells into which a recombinant expression vector according to the invention has been introduced.
  • the terms "host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably here. It goes without saying that these terms refer not only to a specific target cell, but also to the descendants or potential descendants of this cell. Because determined in successive generations due to mutation or environmental influences Modifications can occur, these offspring are not necessarily identical to the parental cell, but are still included in the scope of the term as used here.
  • a host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • an MCT protein can be expressed in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells, yeast or mammalian cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells).
  • suitable host cells are known to the person skilled in the art.
  • Microorganisms which are related to Corynebacterium glutamicum and which can be suitably used as host cells for the nucleic acid and protein molecules according to the invention are listed in Table 3.
  • vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • transformation and “transfection”, “conjugation” and “transduction” as used herein are intended to encompass a variety of methods known in the art for introducing foreign nucleic acid (e.g. DNA) into a host cell, including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection or electroporation. Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals.
  • a gene that encodes a selectable marker (eg resistance to antibiotics) is usually introduced into the host cells together with the gene of interest.
  • selectable markers include those that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate.
  • a nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding an MCT protein, or can be introduced on a separate vector.
  • a vector which contains at least a section of an MCT gene into which a deletion, addition or substitution has been introduced in order to change the MCT gene, for example to functionally disrupt it.
  • This MCT gene is preferably a Corynebacterium glutamicum MCT gene, however a homologue from a related bacterium or even from a mammalian, yeast or insect source can be used.
  • the vector is designed in such a way that the endogenous MCT gene is functionally disrupted when homologous recombination occurs (ie no longer encodes a functional protein, also referred to as a "knockout" vector).
  • the vector can alternatively be designed in such a way that the endogenous MCT gene is mutated or otherwise altered in the case of homologous recombination, but still codes the functional protein (for example the upstream regulatory region can be altered in such a way that the expression of the endogenous MCT protein is thereby effected is changed.).
  • the modified portion of the MCT gene is flanked in the homologous recombination vector at its 5 'and 3' ends by additional nucleic acid of the MCT gene, which is a homologous recombination between the exogenous MCT gene carried by the vector and one endogenous MCT gene in a microorganism.
  • the additional flanking MCT nucleic acid is long enough for successful homologous recombination with the endogenous gene.
  • the vector usually contains several kilobase flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) (see, for example, Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vectors).
  • the vector is introduced into a microorganism (eg, by electroporation), and cells in which the introduced MCT gene is homologously recombined with the endogenous MCT gene are selected using methods known in the art.
  • recombinant microorganisms can be produced which contain selected systems which allow regulated expression of the introduced gene.
  • the inclusion of an MCT gene in a vector under the control of the lac operon enables e.g. expression of the MCT gene only in the presence of IPTG.
  • a host cell according to the invention such as a prokaryotic or eukaryotic host cell in culture, can be used for the production (ie expression) of an MCT protein.
  • the invention also provides methods of producing MCT proteins using the host cells of the invention.
  • the method comprises growing the invention host cell (into which a recombinant expression vector encoding an MCT protein has been introduced, or into whose genome a gene encoding a wild-type or altered MCT protein has been introduced) in a suitable medium until the MCT Protein has been produced.
  • the method comprises isolating the MCT proteins from the medium or the host cell.
  • the nucleic acid molecules, proteins, protein homologs, fusion proteins, primers, vectors and host cells described here can be used in one or more of the following methods: identification of C. glutamicum and related organisms, mapping of genomes of organisms related to C glutamicum are of interest, identification and localization of C. glufcamicum sequences, evolution studies, determination of MCT protein areas which are necessary for the function, modulation of the activity of an MCT protein; Modulating the activity of an MCT path; and modulating the cellular production of a desired compound, such as a fine chemical.
  • the MCT nucleic acid molecules according to the invention have a multitude of uses. They can initially be used to identify an organism as Corynebacterium glutamicum or close relatives thereof.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of C. glutamicum genes.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of C. glutamicum genes.
  • Corynebacterium glutamicum itself is not pathogenic, but it is related to pathogenic species such as Corynebacterium diptheriae. The detection of such an organism is of significant clinical importance.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can serve as markers for specific regions of the genome. This is useful not only when mapping the genome, but also for functional studies of C. glufca icum proteins.
  • the C. glutamicum genome can be cleaved, for example, and the fragments incubated with the DNA-binding protein.
  • Those that bind the protein can additionally with the nucleic acid molecules according to the invention, pre- preferably probed with easily detectable markings; the binding of such a nucleic acid molecule to the genome fragment enables the fragment to be located on the genomic map of C.
  • nucleic acid molecules according to the invention can also be sufficiently homologous to the sequences of related species so that these nucleic acid molecules can serve as markers for the construction of a genomic map in related bacteria, such as Brevijbacfcerium lactofermentum.
  • the MCT nucleic acid molecules according to the invention are also suitable for evolution and protein structure studies.
  • the metabolic and transport processes in which the molecules according to the invention are involved are used in many prokaryotic and eukaryotic cells;
  • the degree of evolutionary kinship of the organisms can be determined. Accordingly, such a comparison enables the determination of which sequence regions are conserved and which are not, which can be helpful in determining those regions of the protein which are essential for the enzyme function.
  • This type of determination is valuable for protein technology studies and can give an indication of which protein can tolerate mutagenesis without losing its function.
  • MCT nucleic acid molecules can bring about the production of MCT proteins with functional differences from the wild-type MCT proteins. These proteins can be improved in their efficiency or activity, can be present in the cell in larger numbers than usual, or can be weakened in their efficiency or activity.
  • the efficient overproduction of one or more fine chemicals requires increased amounts of cofactors, precursor molecules and intermediates for the appropriate biosynthetic pathways.
  • transporter proteins involved in the import of nutrients such as carbon sources (ie sugars), nitrogen sources (ie amino acids, ammonium salts), phosphates and sulfur, the production of a fine chemical can be reduced improve any nutritional constraints in the biosynthesis process.
  • fatty acids and lipids are themselves desirable fine chemicals; by optimizing the activity or by increasing the number of one or more MCT proteins according to the invention which are involved in the biosynthesis of these compounds, or by influencing the activity of one or more MCT proteins which are involved in the degradation of these compounds, can increase the yield, production and / or efficiency of the production of fatty acid and lipid molecules from C. glutamicum.
  • the genetic manipulation of one or more MCT genes according to the invention can likewise produce MCT proteins with modified activities which indirectly influence the production of one or more desired fine chemicals from C. glutamicum.
  • the normal biochemical metabolic processes for example, produce a large number of waste products (e.g. hydrogen peroxide and other reactive oxygen species) that can actively interact with the same metabolic processes (e.g., peroxynitrite nitrates, as is known, tyrosine side chains, whereby some enzymes are inactivated with tyrosine in the active center (Groves, JT (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (2); 226-235). Although these waste products are usually excreted, the C.
  • glutamicum strains used for large-scale fermentative production are used for the overproduction of one or However, several fine chemicals have been optimized and can thus produce more waste products than is usual for a C. glutamicum wild type.
  • MCT proteins according to the invention By optimizing the activity of one or more MCT proteins according to the invention, which are involved in the export of waste molecules, the cell's viability can be improved improve and be an efficient metabolic activity
  • the presence of high intracellular amounts of the desired fine chemical can be toxic to the cell, so increasing the cell's ability to secrete these compounds can improve cell viability.
  • the MCT proteins according to the invention can be manipulated so that the relative amounts of different lipid and fatty acid molecules are changed. This can have a significant impact on the lipid composition of the cell membrane.
  • membrane fluidity can significantly change membrane fluidity. Changes in membrane fluidity can affect the transport of molecules across the membrane, which, as explained above, can modify the export of waste products or the fine chemicals produced or the import of necessary nutrients. These membrane fluidity changes can also significantly affect cell integrity; Cells with relatively weaker membranes are more susceptible to mechanical stress in a large fermenter environment, which can damage or kill the cells.
  • MCT proteins which are involved in the production of fatty acids and lipids for membrane construction, so that the membrane composition of the resulting membrane should be more sensitive to the environmental conditions in the cultures used to produce fine chemicals a larger proportion of C. glutamicum cells survive and multiply. Larger amounts of C. glutamicum cells in a culture should result in greater yields, production or efficiency in the production of the fine chemical from the culture.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can be used to generate C. glutamicum or related bacterial strains which express mutant MCT nucleic acid and protein molecules, so that the yield, production and / or Production efficiency of a desired connection is improved.
  • the desired compound can be a natural product of C. glutamicum which comprises the end products of the biosynthetic pathways and intermediates of naturally occurring metabolic pathways as well as molecules which do not occur naturally in the metabolism of C. glutamicum, but which are derived from a C. gluta- micum strain can be produced.
  • Example 1 Preparation of the entire genomic DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • a culture of Corynebacterium glutamicum was grown overnight at 30 ° C with vigorous shaking in BHI medium (Difco). The cells were harvested by centrifugation, the supernatant was discarded, and the cells were resuspended in 5 ml of buffer I (5% of the original volume of the culture - all stated volumes are calculated for 100 ml of culture volume).
  • buffer I 140.34 g / 1 sucrose, 2.46 g / 1 MgS0 4 • 7 H 2 0, 10 ml / 1 KH 2 P0 4 solution (100 g / l, adjusted to pH with KOH 6.7), 50 ml / 1 Ml2 concentrate (10 g / 1 (NH 4 ) 2 S0, 1 g / 1 NaCl, 2 g / 1 MgS0 • 7 H 2 0, 0.2 g / 1 CaCl 2 , 0.5 g / 1 yeast extract (Difco), 10 ml / 1 trace element mixture (200 mg / 1 FeS0 4 • H0, 10 mg / 1 ZnS0 4 • 7 H 2 0, 3 mg / 1 MnCl 2 • 4 H 2 0, 30 mg / 1 H 3 B0 3 , 20 mg / 1
  • the cell wall was broken down and the protoplasts obtained were harvested by centrifugation.
  • the pellet was washed once with 5 ml of buffer I and once with 5 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8).
  • the pellet was resuspended in 4 ml TE buffer and 0.5 ml SDS solution (10%) and 0.5 ml NaCl solution (5 M) were added.
  • proteinase K at a final concentration of 200 ⁇ g / l, the suspension was incubated at 37 ° C. for about 18 hours.
  • the DNA was purified by extraction with phenol, phenol-chloroform-isoamyl alcohol and chloroform-isoamyl alcohol using standard procedures. Then the DNA was precipitated by adding 1/50 volume of 3 M sodium acetate and 2 volumes of ethanol, followed by incubation for 30 min at -20 ° C and 30 min centrifugation at 12000 rpm in a high-speed centrifuge with an SS34 rotor (Sorvall) , The DNA was dissolved in 1 ml of TE buffer containing 20 ⁇ g / ml RNase A and dialyzed against 1000 ml of TE buffer at 4 ° C. for at least 3 hours. During this time the buffer was exchanged 3 times.
  • Plasmids pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 75: 3737-3741) found particular use; pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmids of the pBS series (pBSSK +, pBSSK- and others; Stratagene, LaJolla, USA) or
  • Cosmids such as SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) or Lorist ⁇ (Gibson, T.J. Rosenthal, A., and Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286.
  • Genomic banks as described in Example 2, were used for DNA sequencing according to standard methods, in particular the chain termination method with ABI377 sequencing machines (see, for example, Fleischman, RD et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science 269; 496-512)
  • the sequencing primers with the following nucleotide sequences were used: 5 '-GGAAACAGTATGACCATG-3' or 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
  • In vivo mutagenesis of Corynebacterium glutamicum can be performed by passing a plasmid (or other vector) DNA through E. coli or other microorganisms (e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae) that maintain the integrity of their genetic information cannot maintain.
  • E. coli or other microorganisms e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae
  • Usual mutator strains show mutations in the genes for the DNA repair system (eg, mutHLS, mutD, mutT, etc., for comparison see Rupp, WD (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, pp. 2277-2294 , ASM: Washington). These strains are known to the person skilled in the art. The use of these strains is, for example, in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 illustrates.
  • Example 5 DNA transfer between Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum
  • Corynebacterium and Breviipa ⁇ fcerium species contain endogenous plasmids (such as pHMl519 or pBLl) that replicate autonomously (for an overview see, for example, Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146).
  • Shuttle vectors for Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum can easily be constructed using standard vectors for E. coli (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel , FM et al.
  • origins of replication are preferably taken from endogenous plasmids isolated from Corynebacterium and Brevijbacfcertium species.
  • transformation markers for these species are genes for kanamycin resistance (such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon) or for chloramphenicol (Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim)
  • kanamycin resistance such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon
  • chloramphenicol Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim
  • glutamicum and which can be used for various purposes, including gene overexpression (see, e.g., Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, JF et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 and Eikmanns, BJ et al. (1992) Gene 102: 93-98).
  • C. glutamicum can be carried out by protoplast transformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), electroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters , 53: 399-303) and, in cases where special vectors are used, can also be achieved by conjugation (as described, for example, in Schaefer, A., et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666).
  • the observations of the activity of a mutant protein in a transformed host cell are based on the fact that the mutant protein is expressed in a similar manner and in a similar amount as the wild-type protein.
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the mutant gene is to carry out a Northern blot (see e.g.
  • RNA can be isolated from CoryneJbacterium glutamicum by various methods known in the art, as described in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • Standard techniques such as Western blot, can be used to determine the presence or the relative amount of protein that is translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York).
  • total cell proteins are extracted, separated by gel electrophoresis, transferred to a matrix, such as nitrocellulose, and incubated with a probe, such as an antibody, which specifically binds to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easy to detect. The presence and amount of label observed indicates the presence and amount of the mutant protein sought in the cell.
  • Example 7 Growth of genetically modified Corynebacterium glutamicum media and growing conditions
  • Corynebacteria are grown in synthetic or natural growth media.
  • a number of different growth media for Corynebakterian are known and easy available (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium ", in: The Procaryotes, Vol. II, Balows, A., et al., Ed. Springer-Verlag).
  • These media consist of one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds such as molasses or other by-products from sugar refining. It can also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible carbon sources are alcohols and organic acids such as methanol, ethanol, acetic acid or lactic acid.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds. Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts, such as NH 4 CI or (NH 4 ) 2 SO 4 , NH 4 OH, nitrates,
  • Urea amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, yeast extracts, meat extracts and others.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus, or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols such as catechol or protocatechuate or organic acids such as citric acid.
  • the media usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts often come from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like. The exact composition of the media connections depends heavily on the respective experiment and is decided individually for each case. Information about media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Ed. PM Rhodes, PF Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like. All media components are sterilized, either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration. The components can be sterilized either together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or can be added continuously or in batches.
  • the growing conditions are defined separately for each experiment.
  • the temperature should be between 15 ° C and 45 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0, and can be maintained by adding buffers to the media.
  • An exemplary buffer for this purpose is a potassium phosphate buffer.
  • Synthetic buffers such as MOPS, HEPES; ACES etc. can be used alternatively or simultaneously.
  • the cultivation pH can also be kept constant during the cultivation by adding NaOH or NH 4 OH. If complex media components, such as yeast extract, are used, the need for additional buffers is reduced, since many complex compounds have a high buffer capacity.
  • the pH value can also be regulated with gaseous ammonia.
  • the incubation period is usually in the range of several hours to several days. This time is selected so that the maximum amount of product accumulates in the broth.
  • the disclosed growth experiments can be carried out in a variety of containers, such as microtiter plates, glass tubes, glass flasks or glass or metal fermenters of different sizes.
  • the microorganisms should be grown in microtiter plates, glass tubes or shake flasks with or without baffles.
  • 100 ml shake flasks are used, which are filled with 10% (by volume) of the required growth medium.
  • the flasks should be shaken on a rotary shaker (amplitude 25 mm) at a speed in the range of 100-300 rpm. Evaporation losses can be reduced by maintaining a humid atmosphere; alternatively, a mathematical correction should be carried out for the evaporation losses.
  • the medium is inoculated to an OD ß oo of 0.5-1.5 using cells grown on agar plates, such as CM plates (10 g / 1 glucose, 2.5 g / 1 NaCl, 2 g / 1 urea, 10 g / 1 polypeptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 meat extract, 22 g / 1 agar pH 6.8 with 2 M NaOH), which have been incubated at 30 ° C.
  • the inoculation of the media is carried out either by introducing a saline solution of C. glutamicum cells from CM plates or by adding a liquid preculture of this bacterium.
  • DNA band shift assays also referred to as gel retardation assays
  • reporter gene assays as described in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 and the references cited therein. Reporter gene test systems are well known and established for use in pro- and eukaryotic cells using enzymes such as beta-galactosidase, green fluorescent protein and several others.
  • membrane transport proteins The activity of membrane transport proteins can be determined according to the techniques as described in Gennis, RB (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 85-137; 199-234; and 270-322.
  • Example 9 Analysis of the influence of mutated protein on the production of the desired product
  • the effect of the genetic modification in C. glutamicum on the production of a desired compound can be determined by growing the modified microorganisms under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cellular Components for the increased production of the desired product (ie an amino acid) is examined.
  • suitable conditions such as those described above
  • Such analysis techniques are well known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p. 89- 90 and pp.
  • the analysis methods include measurements of the amounts of nutrients in the medium (for example sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of ordinary metabolites from biosynthetic pathways and measurements of gases generated during fermentation become. Standard methods for these measurements are in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, PM Rhodes and PF Stanbury, ed. IRL Press, pp. 103-129; 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and the literature references specified therein.
  • Example 10 Purification of the desired product from C. glutamicum culture
  • the desired product can be obtained from C. glutamicum cells or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted by the C. glutamicum cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is kept for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification procedures is subjected to chromatography with an appropriate resin, either with the desired molecule retained on the chromatography resin but not with many contaminants in the sample, or with the contaminants remaining on the resin but not the sample. If necessary, these chromatography steps can be repeated using the same or different chromatography resins.
  • Those skilled in the art are skilled in the selection of the appropriate chromatography resins and the most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by standard techniques in the art. These include high-performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin-layer chromatography, NIRS, enzyme tests or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuremoleküle, deren Verwendung zur Konstruktion von gentechnisch verbesserten Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Aminosäuren mit Hilfe dieser gentechnisch verbesserten Mikroorganismen.

Description

Gene die für Membransynthese- und Membrantransport-Proteine codieren
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich-vorkommenden Stoffwechselprozessen in Zellen werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Co- faktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen von einem oder mehreren Molekülen zu produzieren und sezernieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus ist Corynebacterium glutamic m, ein gram-positives, nicht-patho- genes Bakterium. Über Stammselektion ist eine Reihe von Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt neuartige Nukleinsäure oleküle bereit, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von CoryneJbacterium glutamicum oder verwandten Bakterienarten verwenden lassen. C. glutamicum ist ein gram-positives, aerobes Bakterium, das in der Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von Feinchemikalien, und auch zum Abbau von Kohlenwasserstoffen (bspw. beim Überlaufen von Rohöl) und zur Oxidation von Terpenoiden ge- ■ meinhin verwendet wird. Die Nukleinsäuremoleküle können daher zum Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch Fermentationsverfahren, verwenden lassen. C. glutamicum selbst ist zwar nicht-pa- thogen, jedoch ist es mit anderen Corynebacterium-Arten, wie Co- rynebacterium diphtheriae (dem Erreger der Diphtherie) verwandt, die bedeutende Pathogene beim Menschen sind. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Corynebacterium-Arten zu identifizieren, kann daher auch eine signifikante klinische Bedeutung haben, z.B. bei diagnostischen Anwendungen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zu- dem als Bezugspunkte zur Kartierung des C. glutamicum-Genoms oder von Genomen verwandter Organismen dienen. Diese "heuen Nukleinsäuremoleküle codieren Proteine, die hier als Membrankonstruktions- und Membrantransport- (MCT) -Proteine bezeichnet werden. Diese MCT-Proteine können bspw. eine Funktion ausüben, die am Stoffwechsel (z.B. Biosynthese oder Abbau) von 5 Verbindungen beteiligt ist, die für die Membranbiosynthese notwendig sind, oder den Membrantransport von einer oder mehreren Verbindungen in die Zelle oder aus der Zelle unterstützen. Aufgrund der Verfügbarkeit von Klonierungsvektoren zur Verwendung in Cor.y22ejbacfce.rium glutamicum, wie bspw. offenbart in Sinskey et
10 al., US-Patent Nr. 4 649 119, und Techniken zur genetischen Manipulation von C. glutamicum und den verwandten Brevibacterium-Ar- ten (z.B. actofermentum) Yoshiha a et al., J. Bacteriol. 162 (1985) 591-597; Katsumata et al., J. Bacteriol. 159 (1984) 306-311; und Santamaria et al . J. Gen. Microbiol. 130 (1984)
15 2237-2246) , lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieses Organismus verwenden, um es als Produzenten von einer oder mehreren Feinchemikalien besser und effizienter zu machen. Die verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie kann auf einer direkten
20 Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder auf einer indirekten Wirkung dieser Manipulation beruhen.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung eines erfindungsgemäßen MCT-Proteins die Ausbeute, Produktion und/
25 oder die Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einem C. glutamicum-Stamm, der ein solches verändertes Protein enthält, direkt beeinflussen kann. Diese MCT-Proteine, die am Export der Feinchemikalien-Moleküle aus der Zelle beteiligt sind, können eine größere Anzahl oder höhere Aktivität aufweisen, so daß grö-
30 ßere Mengen dieser Verbindungen in das extrazelluläre Medium se- zerniert werden, aus dem sie leichter gewonnen werden. Diese MCT- Proteine, die am Import der Nährstoffe beteiligt sind, die für die Biosynthese von einer oder mehreren Feinchemikalien (z.B. Phosphat, Sulfat, Stickstoff erbindungen usw.) notwendig sind,
35 können eine größere Anzahl oder höhere Aktivität aufweisen, so daß diese Vorstufen, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen in der Zelle in höherer Konzentration vorliegen. Zudem sind Fettsäuren und Lipide selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimieren der Aktivität oder Vergrößern der Anzahl von einem oder meh- 0 reren erfindungsgemäßen MCT-Proteinen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Beeinträchtigen der Aktivität von einem oder mehreren MCT-Proteinen, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann man die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäuren und Li- 5 pidmolekülen aus C. glutamicum steigern. Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen MCT-Ge- nen kann auch MCT-Proteine mit veränderten Aktivitäten hervorbringen, die die Produktion von einer oder mehreren gewünschten Feinchemikalien aus C. glutamicum indirekt beeinträchtigen. Bspw. können erfindungsgemäße MCT-Proteine, die am Export von Abfallprodukten beteiligt sind, eine größere Zahl oder höhere Aktivität aufweisen, so daß die normalen StoffWechselabfälle der Zelle (aufgrund der Überproduktion der gewünschten Feinchemikalie möglicherweise in höherer Quantität) effizient exportiert werden, bevor sie die Nukleotide und Proteine in der Zelle beschädigen können (was die Lebensfähigkeit der Zelle herabsetzen würde) oder mit den Feinchemikalien-Biosynthesewegen wechselwirken können (was die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalien senken würde) . Die relativ großen in- trazellulären Mengen der gewünschten Feinchemikalie können selbst für die Zelle toxisch sein, bspw. kann man durch Vergrößern der Anzahl an Transportern, die diese Verbindungen aus der Zelle exportieren können, die Lebensfähigkeit der Zelle in Kultur steigern, was wiederum bewirkt, daß eine größere Anzahl Zellen in der Kultur die gewünschte Feinchemikalie produziert. Die erfindungsgemäßen MCT-Proteine können auch so manipuliert werden, daß die relativen Mengen der unterschiedlichen Lipid- und Fettsäuremoleküle produziert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweist, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membran- fluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität können den Transport der Moleküle über die Membran sowie die Integrität der Zelle beeinflussen, was jeweils eine erhebliche Aus- Wirkung auf die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum in großangelegten Fermenterkulturen hat.
Die Erfindung stellt neue Nukleinsäuremoleküle bereit, die Proteine codieren, die hier als MCT-Proteine bezeichnet werden und bspw. am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen beteiligt sind. Das MCT-Pro- tein ist in einer bevorzugten Ausführungsform am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutami- cum nötig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen beteiligt. Beispiele für diese Proteine umfassen solche, die von den in Tabelle 1 angegebenen Genen codiert werden.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich isolierte Nukleinsäu- remoleküle (bspw. cDNAs) , umfassend eine Nukleotidseguenz , die ein MCT-Protein oder biologisch aktive Abschnitte davon codiert, sowie Nukleinsäurefragmente, die sich als Primer oder Hybridisie- rungssonden zum Nachweisen oder zur Amplifikation von MCT-codie- render Nukleinsäure (bspw. DNA oder mRNA) eignen. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das isolierte Nukleinsäure- molekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen oder den codierenden Bereich oder ein Komplement davon von einer dieser Nukleotidsequenzen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang B aufgeführten Aminosäuresequenzen. Die bevorzugten erfindungsgemäßen MCT-Proteine besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen MCT-Aktivitäten.
Als Anhang A werden im folgenden die Nukleinsäuresequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Als Anhang B werden im folgenden die Polypeptidseuenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nu- kleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. Das isolierte Nukleinsäuremolekül entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nu- kleinsäuremolekül. Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker bevorzugt ein natürlich vorkommendes C. glufcarnicum-MCT-Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw. reko binante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, und Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird zur Herstellung eines MCT-Proteins eine Wirtszelle verwendet, die in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das MCT-Protein kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch veränderten Mikroorganismus, bei dem ein MCT-Gen eingebracht oder verändert worden ist. Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer Ausführungsform durch Einbringen mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls verändert worden, das die mutierte MCT- Sequenz als Transgen codiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes MCT-Gen im Genom des Mikroorganismus durch homologe Rekombination mit einem veränderten MCT-Gen verändert, z.B. funktioneil disruptiert, worden. Der Mikroorganismus gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, wobei Corynebacterium glutamicum besonders bevorzugt ist. Der Mikroorganismus wird in einer bevorzugten Ausführungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung, wie einer Aminosäure, besonders bevorzugt Lysin, verwendet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Wirtszellen, die mehr als eine der in Anhang A beschriebenen Nukleinsäuremoleküle besitzen. Solche Wirtszellen lassen sich auf verschiedene dem Fachmann bekannte Wege herstellen. Beispielsweise können sie durch Vektoren, die mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremo- leküle tragen, transfiziert werden. Es ist aber auch möglich mit einem Vektor jeweils ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in die Wirtszelle einzubringen und deshalb mehrere Vektoren entweder gleichzeitig oder zeitlich abgestuft einzusetzen. Es können somit Wirtszellen konstruiert werden, die zahlreiche, bis zu mehreren Hundert der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen tragen. Durch eine solche Akkumulation lassen sich häufig überadditive Effekte auf die Wirtszelle hinsichtlich der Feinchemikalien-Produktivität erzielen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes MCT- Protein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven Abschnitt davon. Das isolierte MCT-Protein oder sein Abschnitt kann in einer bevorzugten Ausführungsform am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über die Membranen beteiligt sein. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte MCT-Protein oder ein Abschnitt davon hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B, so daß das Protein oder sein Abschnitt weiterhin am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über die Membranen beteiligt sein kann.
Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes MCT-Proteinpräparat . Das MCT-Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängen- protein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird) im wesentlichen homolog ist.
Das MCT-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann mit einem Nicht-MCT-Polypeptid funktionsfähig verbunden werden, damit ein Fusionsprotein entsteht. Dieses Fusionsprotein hat bei bevorzugten Ausführungsformen eine andere Aktivität als das MCT-Protein allein und ergibt bei anderen bevorzugten Ausführungsformen erhöhte Ausbeuten, eine erhöhte Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie aus C. glutamicum. Die Integration dieses Fusionsproteins in eine Wirtszelle moduliert bei besonders bevorzugten Ausführungsformen die Produktion einer gewünschten Verbindung von der Zelle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie. Das Verfahren sieht die Anzucht einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression eines erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer MCT- Nukleinsäure bewirkt. Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt, bei dem die Feinchemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder BreviJbacfcerium.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Produktion eines Moleküls aus einem Mikroorganismus . Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz , die die MCT-Proteinaktivität oder die MCT-Nukleinsäure- Expression moduliert, so daß eine zellassoziierte Aktivität verg- liehen mit der gleichen Aktivität bei Fehlen der Substanz verändert wird. Die Zelle wird bei einer bevorzugten Ausführungsform hinsichtlich eines oder mehrerer C. glutamicum-Stoffwechselwege für Zellmembrankomponenten oder hinsichtlich des Transports von Verbindungen über die Membranen moduliert, so daß die Ausbeuten oder die Produktionsrate einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert werden. Die Substanz, die die MCT-Proteinaktivität moduliert, stimuliert bspw. die MCT-Proteinaktivität oder die MCT-Nukleinsäure-Expression. Beispiele von Substanzen, die die MCT-Proteinaktivität oder die MCT-Nukleinsäu- reexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive MCT- Proteine und Nukleinsäuren, die MCT-Proteine codieren und in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele von Substanzen, die die MCT-Aktivi ät oder -Expression hemmen, umfassen kleine Moleküle und Antisense-MCT-Nukleinsäuremoleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines MCT-Wildtyp- oder -Mutantengens in eine Zelle, das entweder auf einem gesonderten Plasmid bleibt oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Die Integration in das Genom kann zufallsgemäß oder durch homologe Rekombination erfolgen, so daß das native Gen durch die integrierte Kopie er- setzt wird, was die Produktion der gewünschten Verbindung aus der zu modulierenden Zelle hervorruft. Diese Ausbeuten sind bei einer bevorzugten Ausführungsform erhöht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Chemikalie eine Feinchemikalie, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Aminosäure ist. Diese Aminosäure ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform L-Lysin.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt MCT-Nukleinsäure- und -Proteinmoleküle bereit, die am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über die Membranen beteiligt sein können. Die erfindungsgemäßen Moleküle lassen sich bei der Modulation der Produktion von Feinchemikalien von Mikroorganismen, wie C. glutamicum, verwenden, und zwar entweder direkt (z.B. wo die Überexpression oder Optimierung eines Fettsäurebiosyntheseproteins eine direkte Auswirkung auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure von modifiziertem C. glutamicum hat) oder durch eine indirekte Auswirkung, die trotzdem einen Anstieg der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der gewünschten Verbindung bewirkt (z.B. wo die Modulation des Metabolismus der Zellmembrankomponenten Verän- derungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder der Zusammensetzung der Zellmembran bewirkt, was wiederum die Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien beeinflußt) . Die erfindungsgemäßen Aspekte werden nachstehend weiter erläutert .
I. Feinchemikalien
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, und Kosmetik-Industrie . Diese Verbindungen umfassen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und Diamino- pimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and re- lated compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten) , Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure) , Diole (bspw. Propandiol und Butandiol) , Kohlenhydrate (bspw. Hya- luronsäure und Trehalose) , aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo) , Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L.
(1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press
(1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
A. Aminosäure-Metabolismus und Verwendungen
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Pep- tidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht- proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Hist- idin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threo- nin, Tryptophan und Valin) , so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese mit der Ernährung aufgenommen wer- den müssen, werden durch einfache Biosyntheseswege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essen- tiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, LandwirtSchafts- und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mononatrium- glutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie ver- wendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Gly- cin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet . Threo- nin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechno- logy Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim) . Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S) -5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533 - 606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zy- klus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt . Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphog- lycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse) , und ergibt nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenket- ten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serin- transhydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und Pentosephosp- hatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt-Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterschei- det. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhy- droxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxa- lacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Aspa- ragin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwand- lung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-l-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die Haupt-Stoffwechsel- wege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid
Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure-Bio- synthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme" , S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
B. Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwendungen
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoff- wechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfs- stoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ull- mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesund- heitsfordernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, An- tioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren) .
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Pro- duktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) .
Thiamin (Vitamin Bi) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B ) wird aus Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) und Ribose-5 ' -phosphat synthetisiert . Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavinmononu- kleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5 ' -phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid) , sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6-methylpyri- di . Panthothenat ( antothensäure, R- (+) -N- (2 , 4-Dihydroxy-3 , 3-di- methyl-l-oxobutyl)-ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-ge- triebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure. Die für die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Ala- nin und zur Kondensation in Pantothensäure erantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5'-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R) -Pantoinsäure, (R) -Pantolacton, (R) -Panthenol (Provitamin B5) , Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich herausge- stellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster- Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des OC-Ketoglutaratdehydro- genasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechselzwischenprodukten Guano- sin-5 ' -triphosphat (GTP) , L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin Bχ ) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin Bχ ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niaσin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinami- dadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin B6, Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin B12 wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vi- tro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
C. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Py- rimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleo- tid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose- Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzerogenen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikations-Fähigkeit von Tumorzellen hemmen. Es gibt zudem' ukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res . Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Trans- act. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin) , als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als GeschmacksVerstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A. , (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612) . Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleo- sides"; Kap. 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York) . Der Purin-Metabolis- mus, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in höheren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw.
Gicht . Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5 ' -phosphat (IMP) aus Ri- bose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guano- sin-5 ' -monophosphat (GMP) oder Adenosin-5 '-monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphat- formen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Py- rimidinbiosynthese erfolgt über die Bildung von Uridin-5 ' -monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat. UMP wiederum wird in Cyti- din-5 ' -triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyribo- seform des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
D. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über α,α-l, 1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für ge- trocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindguist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; und Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102) . Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
II . Membran-Biosvnthese und Transmembran-Transport
Die Zellmembranen dienen in einer Zelle einer Reihe von Funktionen. Zuallererst differenziert eine Membran den Zellinhalt von der Umgebung, so daß die Zelle Integrität erhält. Die Membranen dienen auch als Schranken, damit gefährliche oder ungewünschte Verbindungen nicht einströmen können und gewünschte Verbindungen nicht ausströmen können. Zellmembranen sind aufgrund ihrer Struktur von Natur aus gegenüber der nicht erleichterten Diffusion hy- drophiler Verbindungen, wie Proteine, Wassermolekülen und Ionen undurchlässig: eine Doppelschicht aus Lipidmolekülen, in der die polaren Kopfgruppen nach außen ragen (aus der Zelle heraus bzw. ins Zellinnere hinein) und die unpolaren Schwänze zur Mitte der Doppelschicht ragen und einen hydrophoben Kern bilden (für einen allgemeinen Überblick über die Struktur und Funktion der Membran siehe Gennis, R.B. (1989) Biomembranes , Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg) . Diese Schranke ermöglicht, daß die Zellen eine relativ höhere Konzentration an gewünschten Verbindungen und eine relativ kleinere Konzentration an ungewünschten Verbindungen als das umgebende Medium enthält, da die Diffusion dieser Verbindungen durch die Membran effizient blockiert wird.
Die Membran liefert jedoch auch eine wirksame Schranke gegenüber dem Import von gewünschten Molekülen und dem Export von Abfallmolekülen. Zur Bewältigung dieser Schwierigkeit enthalten die Zell- membranen viele Arten von Transporterproteinen, die den Transmembrantransport verschiedenartiger Verbindungen erleichtern können: Poren oder Kanäle und Transporter. Die ersteren sind integrale Membranproteine, gelegentlich Proteinkomplexe, die eine regulierte Öffnung durch die Membran bilden. Diese Regulation oder dieses "Gating" ist gewöhnlich für die durch die Pore oder den Kanal zu transportierenden spezifisch, so daß diese Transmembran- konstrukte für eine spezifische Klasse von Substraten spezifisch sind; bspw. ist ein Kaliumkanal derart konstruiert, daß nur Ionen mit ähnlicher Ladung und Größe wie Kalium hindurchgelangen kön- nen. Kanal- und Porenproteine haben bestimmte hydrophobe und hydrophile Domänen, so daß sich der hydrophobe Anteil des Proteins an das Innere der Membran anlagern kann, wohingegen der hydrophile Anteil das Innere des Kanals ausmacht, wodurch eine geschützte hydrophile Umgebung bereitgestellt wird, durch die das ausgewählte hydrophile Molekül gelangen kann. Im Fachgebiet sind viele solche Poren/Kanäle bekannt, einschließlich solche für Kalium-, Calcium-, Natrium- und Chloridionen.
Dieses durch Poren und Kanäle vermittelte System ist auf sehr kleine Moleküle, wie Ionen, eingeschränkt, da Poren oder Kanäle, die hinreichend groß sind, daß sie den Durchtritt vollständiger Proteine durch erleichterte Diffusion ermöglichen, auch nicht dazu fähig wären, den Durchtritt kleinerer Moleküle zu verhindern. Der Transport von Molekülen durch durch diesen Prozeß wird gelegentlich als "erleichterte Diffusion" bezeichnet, da die treibende Kraft eines Konzentrationsgradienten erforderlich ist, damit der Transport stattfindet. Permeasen ermöglichen ebenfalls die erleichterte Diffusion größerer Moleküle, wie Glucose oder anderer Zucker, in die Zelle, wenn die Konzentration dieser Mole- küle auf einer Seite der Membran größer ist als auf der anderen (ebenfalls als "Uniport" bezeichnet) . Im Gegensatz zu Poren oder Kanälen bilden diese integralen Proteine (die oft 6 bis 14 membranüberspannende α-Helices aufweisen) keine offenen Kanäle durch die Membran, sie binden jedoch an das Zielmolekül an der Membra- noberfläche und durchlaufen dann eine Konformationsanderung, so daß das Zielmolekül an der entgegengesetzten Seite der Membran freigesetzt wird.
Zellen benötigen jedoch oft den Import oder Export von Molekülen gegen den bestehenden Konzentrationsgradienten ("aktiver Transport"), eine Situation, in der die erleichterte Diffusion nicht stattfinden kann. Es gibt zwei generelle Mechanismen, die von der Zelle für einen solchen Membrantransport verwendet wird; Symport oder Antiport, und energiegekuppelter Transport, wie derjenige, der durch ABC-Transporter vermittelt wird. Symport- und Antiport- systeme koppeln die Bewegung von zwei unterschiedlichen Molekülen über die Membran (über Permeasen mit zwei gesonderten Bindungsstellen für zwei unterschiedliche Moleküle) ; beim Symport werden beide Moleküle in die gleiche Richtung transportiert, wohingegen beim Antiport ein Molekül importiert und das andere Molekül exportiert wird. Dies ist energetisch möglich, da sich eines dieser beiden Moleküle entlang eines Konzentrationsgradienten bewegt, und dieses energetisch günstige Ereignis wird nur durch die gleichzeitige Bewegung einer gewünschten Verbindung gegen den herrschenden Konzentrationsgradienten ermöglicht. Einzelne Moleküle können gegen den Konzentrationsgradienten über die Membran in einem energiegetriebenen Prozeß transportiert werden, wie bspw. bei den ABC-Transportern. Bei diesem System hat das in der Membran lokalisierte Transportprotein eine ATP-bindende Cassette, beim Binden des Zielmoleküls wird ATP in ADP + Pi umgewandelt, und die resultierende freigesetzte Energie wird zum Antreiben der Bewegung des Zielmoleküls zur entgegengesetzten Seite der Membran verwendet, was durch den Transporter erleichtert wird. Für eingehendere Beschreibungen all dieser Transportsysteme, siehe Bam- berg, E. et al . , (1993) "Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes", Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Findlay, J.B.C.
(1991) "Structure and function in membrane transport Systems", Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 804-810; Higgins, C.F. (1992) "ABC transporters from microorganisms to man", Ann. Rev. Cell. Biol. 8: 67-113; Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomebranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 270-322; und Nikaido, H. und Saier, H.
(1992) "Transport proteins in bacteria: common themes in their design", Science 258: 936-942, und die in jeder dieser Zitate enthaltenen Literaturstellen.
Die Synthese von Membranen ist ein gut charakterisierter Prozeß, an dem viele Komponenten beteiligt sind, von denen die wichtigsten die Lipidmoleküle sind. Die Lipidsynthese läßt sich in zwei Teile aufteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat und die Addition oder Modifikation einer polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Bakterienmembranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingoli- pide und Phosphoglyceride . Die Fettsäuresynthese ebginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch Acetyl-CoA-carbo- xylase oder in Acetyl-ACP durch Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl-ACP, das durch eine Reihe von Kondensations-, Re- duktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so daß ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (für Beschreibungen der Fettsäuresynthese siehe F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Sal onella. ASM Press: Washington, D.C. S. 612-636 und die darin angegebenen Literatur- stellen; Lengeier et al. (Hrsg.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York und die darin angegebenen Literaturstellen, und Magnuson, K. et al. (1993) Microbiological Reviews 57: 522-542 und die darin angegebenen Literaturstellen). Die Cy- clopropan-Fettsäuren (CFA) werden durch eine spezifische CFA-Syn- thase mit SAM als Cosubstrat synthetisiert. Verzeigte Fettsäureketten werden aus verzeigten desaminierten Aminosäureketten synthetisiert, so daß verzeigte 2-0xosäuren erhalten werden (s. Lengeier et al. (Hrsg) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York und die darin angegebenen Literaturstellen) . Ein weiterer wesentlicher Schritt bei der Lipidsynthese ist der
Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen bspw. durch Glycerinphosphatacyltransferasen. Die Kombination verschiedener Vorstufenmoleküle und Biosyntheseenzyme bewirkt die Produktion verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine erhebliche Auswirkung auf die Membranzusammensetzung hat.
III. Erfindungsσemäße Elemente und Verfahren
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Ent- deckung von neuen Molekülen, die hier als MCT-Nukleinsäure- und -Protein-Moleküle bezeichnet werden und die Produktion von Zellmembranen in C. glutamicum steuern sowie die Bewegung von Molekülen über diese Membranen bewerkstelligen. Bei einer Ausführungsform sind die MCT-Moleküle am Metabolismus von Verbindungen be- teiligt, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum oder am Transport der Moleküle über diese Membranen beteiligt sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aktivität der erfindungsgemäßen MCT-Moleküle zur Regulation der Produktion von Membrankomponenten eine Auswirkung auf die Produktion einer ge- wünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus . Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der modulierten MCT-Moleküle derart moduliert, daß die C. glutamicum- Stoffwechselwege, die von den erfindungsgemäßen MCT-Proteinen reguliert werden, hinsichtlich Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion moduliert sind sowie hinsichtlich der Effizienz des Transports der Verbindungen durch die Membranen verän- dert sind, was die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten feinchemikalie durch C. glutamicum entweder direkt oder indirekt moduliert.
Der Begriff "MCT-Protein" oder "MCT-Polypeptid" umfaßt Proteine, die am Stoffwechsel von Verbindungen, die für den Aufbau von
Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen beteiligt sind. Beispiele für MCT-Proteine umfassen solche, die von den in Tabelle 1 und Anhang A aufgeführten MCT-Genen codiert werden. Die Ausdrücke "MCT-Gen" oder "MCT-Nukleinsäuresequenz" umfassen Nukleinsäuresequenzen, die ein MCT-Protein codieren, das aus einem codierenden Bereich und entsprechenden untranslatierten 5'- und 3 ' -Se uenzbereichen besteht . Beispiele für MCT-Gene sind in Tabelle 1 aufgelistet . Die Begriffe "Produktion" oder "Produktivität" sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (bspw. der gewünschten Feinchemikalie, die innerhalb einer festgelegten Zeitspanne und eines festgelegten Fermentationsvolumens gebildet werden (bspw. kg Produkt pro Std. pro 1) . Der Begriff "Effizienz der Produktion" umfaßt die Zeit, die zur Erzie- lung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (bspw. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt) . Der Begriff "Ausbeute" oder "Produkt/ Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie) . Dies wird bspw. gewöhnlich ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle . Durch Vergrößern der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgeleg- ten Zeitraum erhöht. Die Begriffe "Biosynthese" oder "Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Die Begriffe "Abbau" oder "Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) , bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Der Begriff "Metabolismus" ist im Fachgebiet be- kannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Metabolismus einer bestimmten Verbindung (z.B. der Metabolismus einer Aminosäure, wie Gly- ein) umfaßt dann sämtliche Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle .
Die erfindungsgemäßen MCT-Moleküle sind in einer anderen Ausfüh- rungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie C. glutamicum, zu modulieren. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung eines erfindungsgemäßen MCT-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Fein- chemikalie aus einem C. glutamicum-Staiαπx, der ein solches verändertes Protein enthält, direkt beeinflussen kann. Diese MCT-Proteine, die am Export der Feinchemikalienmoleküle aus der Zelle beteiligt sind, können in größerer Anzahl vorliegen oder erhöhte Aktivität aufweisen, so daß größere Mengen dieser Verbindungen in das extrazelluläre Medium sezerniert werden, aus dem sie leichter gewonnen werden können. MCT-Proteine, die am Import der Nährstoffe beteiligt sind, die für die Biosynthese von einer oder mehreren Feinchemikalien notwendig sind (bspw. Phosphat, Sulfat, StickstoffVerbindungen, usw. ) können entsprechend in größerer An- zahl oder mit höherer Aktivität zugegen sein, so daß diese Vorstufen-, Cofaktor- oder Zwischenverbindungen in höherer Konzentration in der Zelle vorliegen. Zudem sind Fettsäuren und Lipide selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimieren der Aktivität oder Vergrößern der Anzahl von einem oder mehreren erfin- dungsgemäßen MCT-Proteinen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Beeinflussen der Aktivität von einem oder mehreren MCT-Proteinen, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann man die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus C. glutamicum steigern.
Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Genen kann auch MCT-Proteine mit veränderten Aktivitäten hervorbringen, die die Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien aus C. glutamicum beeinflussen. Erfindungsgemäße MCT-Proteine, die am Export von Abfallprodukten beteiligt sind, können in größerer Anzahl oder höherer Aktivität zugegen sein, so daß die normalen Stoffwechselabfälle der Zelle (aufgrund von Überproduktion der gewünschten Feinchemikalie möglicherweise in höherer Quantität) effizient exportiert werden, bevor sie Nukleotide und Proteine innerhalb der Zelle beschädigen (was die Lebensfähigkeit der Zelle herabsetzt) oder mit anderen Feinchemikalien-Stoffwechselwegen interagieren (was die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion der gewünschten Feinchemikalie herabsetzt) . Die relativ großen intrazellulären Mengen der gewünschten Feinchemikalie können an sich für die Zelle toxisch sein. Durch Vergrößern der Anzahl von Transportern, die zum Export dieser Verbindung aus der Zelle befähigt ist, kann man somit die Lebensfähigkeit der Zelle in Kultur steigern, was wiederum eine größere Zahl an Zellen in Kultur mit sich bringt, die die gewünschte Feinchemikalie produzieren. Die erfindungsgemäßen MCT-Proteine lassen sich der- art manipulieren, daß die relativen Mengen unterschiedlicher Li- pid- und Fettsäuremoleküle produziert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp andere physikalische Eigenschaften aufweist, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Mem- bran die Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität können den Transport von Molekülen über die Membran sowie die Zellintegrität beeinflussen, was jeweils eine erhebliche Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien von C. glutamicum in großangelegten Fermenterkulturen hat.
Als Ausgangspunkt zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nuklein- säuresequenzen eignet sich das Genom eines Corynejbacfcerium gluta- micum-Stammes, der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist.
Von diesen Nukleinsäuresequenzen lassen sich durch die in Tabelle 1 bezeichneten Veränderungen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit üblichen Verfahren herstellen.
Das erfindungsgemäße MCT-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragmente davon können am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen beteiligt sein, oder können eine oder mehrere der in Ta- belle 1 aufgeführten Aktivitäten aufweisen.
In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben:
A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die MCT-Polypeptide oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als Hy- bridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifi- zierung von MCT-codierenden Nukleinsäuren (z.B. MCT-DNA) hinreichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" soll DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5 '-Ende des codierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 '-Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 ' -Endes des codierenden Genbereichs. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppel- strängig sein, ist aber vorzugsweise eine doppelsträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird aus anderen Nukleinsäu- remolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natür- licherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw.
3 '-Ende der Nukleinsäure befinden). In verschiedenen Ausführungsformen kann bspw. das isolierte MCT-Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (bspw. eine C. glutamicum-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, kann überdies im wesentlichen frei von einem anderen zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, bspw. eine Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein Ab- schnitt davon, kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der hier bereitgestellten SequenzInformation hergestellt werden. Bspw. kann eine C. glutamicurπ-MCT-cDNA aus einer C. glufcamicum-Bank isoliert werden, indem eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungs- sonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw. beschrieben in Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2. Auf1. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nu- kleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isoliert werden, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt worden sind) . Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen isolieren (bspw. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfah- ren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) und die cDNA kann mittels reverser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV- Reverse-Transkriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via Polymerasekettereak- tion lassen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidpri ern gemäß PCR-Standard-Amplifikati- onstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer MCT-Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard- Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfin- dungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen komplementäres Nukleinsäuremolekül oder einen Abschnitt davon, wobei es sich um ein Nukleinsäuremolekül handelt, das zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen hinreichend komplementär ist, daß es mit einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex entsteht.
Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt davon weiterhin am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport der Moleküle über diese Membranen beteiligt sein kann. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog" Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste- (bspw. ein Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette- wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) zu einer Ami- nosäuresequenz aus Anhang B aufweisen, so daß das Protein oder ein Abschnitt davon weiterhin am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport der Moleküle über diese Membranen beteiligt sein kann. Proteinbestandteile dieser Stoffwechselwege für Membrankomponenten oder Membrantransportsysteme, wie hier beschrieben, können eine Rolle bei der Produktion und Sekretion von einer oder mehreren Feinchemikalien spielen. Beispiele dieser Ak- tivitäten sind ebenfalls hier beschrieben. Somit betrifft die "Funktion eines MCT-Proteins" entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien. In Tabelle 1 sind Beispiele der MCT-Proteinaktivitäten angegeben.
Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen MCT-Nu- kleinsäure olekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der MCT-Proteine. Der Begriff "biolo- gisch aktiver Abschnitt eines MCT-Proteins", wie er hier verwendet wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne oder ein Motiv, eines MCT-Proteins umfassen, die/das am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Mem- branen beteiligt sein kann, oder eine in Tabelle 1 angegebene Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob ein MCT-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon am Metabolismus von Verbindungen, die für den Aufbau der Zellmembranen in C. glutamicum notwendig sind, oder am Transport von Molekülen über diese Membranen beteiligt sein kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend beschrieben in Beispiel 8 des Beispielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der MCT-Sequenz, die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich ebenfalls dessen bewußt, daß Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur Änderung der Aminosäuresequenz des codierten MCT-Proteins führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit des MCT-Proteins beeinträchtigt wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nichtessentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest läßt sich in einer Wildtypsequenz von einem der MCT-Proteine (Anhang B) verändern, ohne daß die Aktivität des MCT-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die MCT-Proteinaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht-konservierte oder lediglich semikonservierte Aminosäurereste in der Domäne mit MCT-Aktivität) können für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die MCT-Aktivität verändert wird.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein MCT-Protein codiert, das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen,
-additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz aus Anhang A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere Aminosäuresubsti- tutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen aus Anhang A durch Standard-Techniken eingebracht werden, wie stellengerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese. Vor- zugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht . Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin) , sauren Seitenketten (z.B. Aspa- raginsäure, Glutaminsäure) , ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cy- stein) , nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan) , betaverzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäu- rerest in einem MCT-Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der MCT- codierenden Sequenz eingebracht werden, bspw. durch Sättigungsmu- tagenese, und die resultierenden Mutanten können auf die hier beschriebene MCT-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine MCT-Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Pro- teins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel 8 des Beispielteils) bestimmt werden.
B. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein MCT-Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier verwendet betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebun- den ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein vira- ler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirts- zelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (bspw. Bakterienvektoren, mit bakteriellem Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht- episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expressionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden, die Form von Plas- miden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw. re- plikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren) , die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor umfaßt eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Ex- pression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimieren- den Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfaßt. In einem rekombinanten Exprtessionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden" , daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die regulatorische (n) Sequenz (en) gebunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem In-vitro-Tran- skriptions-/Translationssystem- oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) . Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (bspw. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese regulatorischen Sequenzen sind bspw beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -pepti- den, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden, hergestellt werden (bspw. MCT-Proteine, mutierte Formen von MCT-Proteinen, Fusionsproteine, usw.). Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von MCT-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryo- tischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können MCT-Gene in bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit Baculovi- rus-Expressionsvektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al . (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Hrsg, S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen- und vielzelligen Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrohacterium tumefaciens-meάiateά transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep. : 583-586) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, bspw. mit T7-Promotorregulatorischen Sequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Proteins, bei. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekom- binantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreini- gung. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine proteolyti- sσhe Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entspre- chenden Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase .
Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Ziel- protein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die codierende Sequenz des MCT-Proteins in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus, GST - Thrombin- Spaltstelle - X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt werden. Das rekombinante MCT-Protein, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions-Expressionsvek- toren aus E. coli umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301 - 315) und pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89) . Die Zielgenexpression aus dem pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pETlld-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnl0-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten vira- len RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wir sbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128) . Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserierenden Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression ausge- wählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111 - 2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen erfolgt durch Standard-DNA-Synthesetechniken.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der MCT-Proteinexpres- sionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Bal- dari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Hersko- witz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113 - 123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können die erfindungsgemäßen MCT-Proteine in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren ex- primiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al . , (1983) Mol. Cell Biol.. 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen MCT-Proteine in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen) oder in Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie Feldfrüchte) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Bek- ker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobaσterium vectors for plant transformation" , Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einem Säugetier-Expressionsvektor exprimiert .. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt. Gemeinhin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Für weitere geeignete Ex- pressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen, siehe die Kapitel 16 und 17 aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp bewirken (bspw. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nuklein- säure verwendet) . Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Im- munol. 43: 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren
(Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) und Immunglobu- 5 linen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren
(bspw. Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., (1985) Science 230: 912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren 10 (bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166). Entwicklungs- regulierte Promoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox- Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 15 537-546) .
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Anti- sense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. Dies bedeu-
20 tet, daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch Transkription des DNA-.Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur MCT-mRNA antisense ist, möglich ist. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in Antisense-Rich-
25 tung klonierte Nukleinsäure gebunden sind und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder Enhan- cer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die kon- stitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression
30 von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den • 5 der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen, siehe Weintraub, H. et al . , Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
0 Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine be- 5 stimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Bspw. kann ein MCT-Protein in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Ovarzel- len des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Mikroorganismen, die mit Corynebacterium glutamicum verwandt sind und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle 3 aufgeführt .
Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren läßt sich Vektor-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", "Konjugation" und "Transduktion" wie sie hier verwendet werden, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlo- rid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipo- fektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen lassen sich nachlesen in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern.
Für die stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, daß je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfekti- onstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integriert. Zur Identifizierung und Selektion dieser Inte- granten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der ein MCT-Protein codiert, oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z.B. Zellen, die den se- lektierbaren Marker integriert haben, überleben, wohingegen die anderen Zellen sterben) . Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines MCT- Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um das MCT-Gen zu verändern, bspw. funk- tionell zu disrumpieren. Dieses MCT-Gen ist vorzugsweise ein Corynebacterium glutamicum-MCT-Gen, jedoch kann ein Homologon von einem verwandten Bakterium oder sogar von einer Säugetier-, Hefeoder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene MCT-Gen bei homologer Rekombination funktioneil disrumpiert ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert, ebenfalls bezeichnet als "Knockout"-Vektor) . Der Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene MCT-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktioneile Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen MCT-Proteins verändert wird. ) . Der veränderte Abschnitt des MCT-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor an seinem 5'- und 3 '-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des MCT-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen MCT-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen MCT-Gen in einem Mikroorganismus, ermöglicht. Die zusätzliche flankierende MCT-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich enthält der Vektor mehrere Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3 '-Ende) (siehe z.B. Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren) . Der Vektor wird in einen Mikroorganismus (z.B. durch Elektroporation) eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte MCT-Gen mit dem endogenen MCT-Gen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Verfahren selektiert.
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorga- nismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines MCT-Gens in einem Vektor unter der Kontrolle des Lac-Operons ermöglicht z.B. die Expression des MCT-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Diese regulatorischen Systeme sind im Fachgebiet bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) eines MCT-Proteins verwendet werden. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Produktion von MCT-Proteinen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der erfindungs- gemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein MCT-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder verändertes MCT-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis das MCT-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der MCT-Proteine aus dem Medium oder der Wirtszelle.
C. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinho- mologa, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren nachstehenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von C. glutamicum und verwandten Organismen, Kar- tierung von Genomen von Organismen, die mit C glutamicum verwandt sind, Identifikation und Lokalisation von C. glufcamicum-Se- quenzen von Interesse, Evolutionsstudien, Bestimmung von MCT-Pro- teinbereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation der Aktivität eines MCT-Proteins; Modulation der Aktivität eines MCT-Wegs; und Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Corynebacterium glutamicum oder naher Verwandten davon verwendet werden. Sie können zudem zur Identifikation von C. glutamicum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäure- sequenzen einer Reihe von C. glutamicum-Genen bereit. Durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer ein- heitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines C. glutamicum-Gens umfaßt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus zugegen ist. Corynebacterium glutamicum selbst ist zwar nicht pathogen, jedoch ist es mit pathogenen Arten, wie Corynebacterium diptheriae, verwandt. Der Nachweis eines solchen Organismus ist von signifikanter klinischer Bedeutung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren des Genoms, sondern auch für funktioneile Studien von C. glufca icum-Proteinen nützlich. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes C. glutamicum- DNA-bindendes Protein bindet, kann das C. glutamicum-Genom bspw. gespalten werden, und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vor- zugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisation des Fragmentes auf der genomischen Karte von C. glutamicum, und wenn dies mehrmals mit unter- schiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem hinreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Bakterien, wie Brevijbacfcerium lactofermentum, dienen können.
Die erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküle eignen sich ebenfalls für Evolutions- und Proteinstrukturuntersuchungen. Die Stoffwechsel- und Transportprozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden bei einer vielen prokaryoti- schen und eukaryotischen Zellen verwendet; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestim- mung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, welches Protein Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen MCT-Nukleinsäuremoleküle kann die Produktion von MCT-Proteinen mit funktioneilen Unterschieden zu den Wildtyp-MCT-Proteinen bewirken. Diese Proteine können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein, oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivi- tat geschwächt sein.
Es gibt viele Mechanismen, durch die die Veränderung eine erfindungsgemäßen MCT-Moleküls die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien von ei- nem C. glutamicum-Stamm, der ein solches verändertes Protein enthält, direkt beeinflußt. Die Gewinnung der Feinchemikalienverbindungen aus großangelegten C. glufcamicum-Kulturen ist signifikant verbessert, wenn C. glutamicum die gewünschten Verbindungen sezerniert, da diese Verbindungen leicht aus dem Kulturmedium ge- reinigt werden können (im Gegensatz zur Extraktion aus der Masse von C. glutamicu -Zellen) . Durch Vergrößern der Anzahl oder Aktivität von Transportermolekülen, die die Feinchemikalien aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Menge der produzierten Feinchemikalie, die im extrazellulären Medium zugegen ist, zu steigern, wodurch die Ernte und Reinigung erleichtert wird. Zur effizienten Überproduktion von einer oder mehreren Feinchemika- lien sind dagegen erhöhte Mengen von Cofaktoren, Vorstufenmolekülen und Zwischenverbindungen für die geeigneten Biosynthesewege erforderlich. Durch Vergrößern der Anzahl und/oder der Aktivität von Transporterproteinen, die am Import von Nährstoffen, wie Kohlenstoffquellen (d.h. Zuckern) , Stickstoffquellen (d.h. Aminosäu- ren, Ammoniumsalzen) , Phosphaten und Schwefel beteiligt sind, kann man die Produktion einer Feinchemikalie aufgrund der Entfernung von jeglichen Einschränkungen des Nährstoff ngebots bei dem Biosyntheseprozeß verbessern. Zudem sind Fettsäuren und Lipide selbst wünschenswerte Feinchemikalien; durch Optimieren der Akti- vität oder durch Vergrößern der Anzahl von einem oder mehreren erfindungsgemäßen MCT-Proteinen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Beeinflussen der Aktivität von einem oder mehreren MCT-Proteinen, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann man die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmole- küle von C. glutamicum steigern.
Die genetische Manipulation von einem oder mehreren erfindungsgemäßen MCT-Genen kann ebenfalls MCT-Proteine mit veränderten Akti- vitäten hervorbringen, die die Produktion von einer oder mehreren gewünschten Feinchemikalien aus C. glutamicum indirekt beeinflussen. Die normalen biochemischen StoffWechselprozesse bewirken bspw. die Produktion einer Vielzahl von Abfallprodukten (z.B. Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies) die mit den gleichen Stoff echselprozessen aktiv wechselwirken können (bspw. nitriert Peroxynitrit bekanntlich Tyrosin-Seitenketten, wodurch einige Enzyme mit Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert werden (Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2); 226-235) . Diese Abfallprodukte werden zwar üblicherweise ausge- schieden, die zur fermentativen Großproduktion verwendeten C. glutamicum-Stämme werden zur Überproduktion von einer oder mehreren Feinchemikalien jedoch optimiert und können so mehr Abfallprodukte produzieren als für einen C. glutamicum-Wildtyp üblich is . Durch Optimieren der Aktivität von einem oder mehreren er- findungsgemäßen MCT-Proteinen, die am Export von Abfallmolekülen beteiligt sind, kann man die Lebensfähigkeit der Zelle verbessern und eine effiziente metabolische Aktivität beibehalten. Das Vorliegen hoher intrazellulärer Mengen der gewünschten Feinchemikalie kann für die Zelle toxisch sein, so kann man durch Steigern der Fähigkeit der Zelle zur Sekretion dieser Verbindungen die Lebensfähigkeit der Zelle verbessern. Die erfindungsgemäßen MCT-Proteine können manipuliert werden, so daß die relativen Mengen verschiedener Lipid- und Fettsäuremoleküle verändert werden. Dies kann eine erhebliche Auswirkung auf die Lipidzusammensetzung der Zellmembran haben. Da jeder Lipidtyp unterschiedliche physikalische Eigenschaften hat, kann eine Veränderung der Lipidzusammensetzung einer Membran die Membranfluidität signifikant verändern. Änderungen der Membranfluidität können den Transport von Molekülen über die Membran beeinflussen, was wie vorstehend erläutert den Export von Abfallprodukten oder der produzierten Feinchemikalie oder den Import von notwendigen Nährstoffen modifizieren kann. Diese Membranfluiditätsänderungen können ebenfalls die Zellintegrität erheblich beeinflussen; Zellen mit relativ schwächeren Membranen sind in einer Groß-Fermen- terumgebung anfälliger gegenüber mechanischem Streß, was die Zel- len beschädigen oder abtöten kann. Durch Manipulieren von MCT- Proteinen, die an der Produktion von Fettsäuren und Lipiden für den Membranaufbau beteiligt sind, so daß die Membranzusammensetzung der resultierenden Membran gegenüber den in den Kulturen, die zur Produktion von Feinchemikalien verwendet werden, herr- sehenden Umweltbedingungen empfänglicher sind, sollten ein größerer Anteil an C. glutamicum-Zellen überleben und sich vermehren. Größere Mengen an C. glutamicum-Zellen in einer Kultur sollten größere Ausbeuten, Produktion oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie aus der Kultur ergeben.
Die vorstehend genannten Mutagenesestrategien für MCT-Proteine, die erhöhte Ausbeuten einer Feinchemikalie aus C. glutamicum bewirken sollen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen dieser Strategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Durch diese Mechanismen und mit Hilfe der hier offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um C. glutamicum oder verwandte Bakterienstämme, die mutierte MCT-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Die gewünschte Verbindung kann ein natürliches Produkt von C. glutamicum sein, welches die Endprodukte der Biosynthesewege und Zwischenprodukte natürlich vorkommender metabolischer Wege sowie Moleküle umfaßt, die im Metabolismus von C. glutamicum nicht natür- lieh vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen C. gluta- micum-Stamm produziert werden.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung zitierter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffent- lichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1: Präparation der gesamten genomischen DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Eine Kultur von Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wurde über Nacht bei 30°C unter starkem Schütteln in BHI-Medium (Difco) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 5ml Puffer I (5% des Ursprungsvolumens der Kultur - sämtliche angegebenen Volumina sind für 100 ml Kulturvolumen berechnet) resuspendiert. Die Zusammensetzung von Puffer I: 140,34 g/1 Saccharose, 2,46 g/1 MgS04 • 7 H20, 10 ml/1 KH2P04-Lösung (100g/l, mit KOH eingestellt auf pH-Wert 6,7), 50 ml/1 Ml2-Konzentrat (10 g/1 (NH4)2S0 , 1 g/1 NaCl, 2 g/1 MgS0 • 7 H20, 0,2 g/1 CaCl2, 0,5 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) , 10 ml/1 Spurenelemente-Mischung (200 mg/1 FeS04 • H0, 10 mg/1 ZnS04 • 7 H20, 3 mg/1 MnCl2 • 4 H20, 30 mg/1 H3B03, 20 mg/1
CoCl2 • 6 H20, 1 mg/1 NiCl • 6 H20, 3 mg/1 Na2Mo04 • 2 H20, 500 mg/1 Komplexbildner (EDTA oder Citronensäure) , 100 ml/1 Vitamingemisch (0,2 ml/1 Biotin, 0,2 mg/1 Folsäure, 20 mg/1 p-Aminobenzoesäure, 20 mg/1 Riboflavin, 40 mg/1 Ca-Panthothenat, 140 mg/1 Nikotin- säure, 40 mg/1 Pyridoxolhydrochlorid, 200 mg/1 Myoinositol) . Ly- sozym wurde in einer Endkonzentration von 2 , 5 mg/ml zur Suspension gegeben. Nach etwa 4 Std. Inkubation bei 37°C wurde die Zellwand abgebaut, und die erhaltenen Protoplasten wurden durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml Puffer I und einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8) gewaschen. Das Pellet wurde in 4 ml TE-Puffer resuspendiert, und 0,5 ml SDS-Lösung (10%) und 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) wurden zugegeben. Nach Zugabe von Proteinase K in einer Endkonzentration von 200 μg/ l wurde die Suspension etwa 18 Std. bei 37°C inku- biert. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol, Phenol-Chloro- form-Isoamylalkohol und Chloroform-Isoamylalkohol mittels Standard-Verfahren gereinigt. Dann wurde die DNA durch Zugabe von 1/50 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol, anschließender Inkubation für 30 min bei -20°C und 30 min Zentrifugation bei 12000 U/min in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit einem SS34-Rotor (Sorvall) gefällt. Die DNA wurde in 1 ml TE-Puffer gelöst, der 20 μg/ml RNase A enthielt, und für mindestens 3 Std. bei 4°C gegen 1000 ml TE-Puffer dialysiert. Während dieser Zeit wurde der Puffer 3mal ausgetauscht . Zu Aliquots von 0 , 4 ml der dialysierten DNA-Lösung wurden 0,4 ml 2 M LiCl und 0,8 ml Ethanol zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei -20°C wurde die DNA durch Zentrifugation gesammelt (13000 U/min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland) . Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer gelöst. Durch dieses Verfahren hergestellte DNA konnte für alle Zwecke verwendet werden, einschließlich Southern-Blotting oder zur Konstruktion genomischer Banken.
Beispiel 2 : Konstruktion genomischer Corynebacterium glutamicum (ATCC13032)-Banken in Escherichia coli
Ausgehend von DNA, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wi- ley & Sons) Cosmid- und Plasmid-Banken hergestellt.
Es ließ sich jedes Plasmid oder Cosmid einsetzen. Besondere Verwendung fanden die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Acad. Sei. USA, 75: 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe (pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder
Cosmide, wie SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) oder Loristδ (Gibson, T.J. Rosenthal, A. , und Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286.
Beispiel 3 : DNA-Sequenzierung und Computer-Funktionsanalyse
Genomische Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zur DNA- Sequenzierung gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem Kettenabbruchverfahren mit ABI377-Sequenziermaschinen (s. z.B. Flei- schman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd. , Science 269; 496-512) verwendet. Die Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet: 5 ' -GGAAACAGTATGACCATG-3 ' oder 5 ' -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ' .
Beispiel 4 : In-vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) geleitet wird, die die Integrität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten können. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem auf (z.B., mutHLS, mutD, mutT, usw., zum Ver- gleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington) . Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 veranschaulicht.
Beispiel 5 : DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und Corynebac- terium glutamicum
Mehrere Corynebacterium- und Breviipaσfcerium-Arten enthalten endogene Plasmide (wie bspw. pHMl519 oder pBLl) die autonom replizieren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146). Shuttle-Vektoren für Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum lassen sich leicht mittels Standard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al . (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus Corynebacterium glutamicum beigegeben wird. Solche Replikationsursprünge werden vorzugsweise von endogenen Plasmiden entnommen, die aus Corynebacterium- und Brevijbacfcertium-Arten isoliert worden sind. Besondere Verwendung als Transformationsmarker für diese Arten sind Gene für Kanamycin-Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder Tn-903-Transposon stammen) oder für Chloramphenicol (Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim) . Es gibt zahlreiche Beispiele in der Litera- tur zur Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren, die in E. coli und C. glutamicum repliziert werden, und die für verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen- Überexpression (siehe bspw. Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, J.F. et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 und Eikmanns, B.J. et al. (1992) Gene 102: 93-98) .
Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu klonie- ren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum- Stämme einzubringen. Die Transformation von C. glutamicum läßt sich durch Protoplastentransformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), Elektroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) und in Fällen, bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch Konjugation erzielen (wie z.B. beschrieben in Schäfer, A. , et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die Shuttle-Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen, indem Plasmid-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet bekann- ter Standard-Verfahren) präpariert wird und in E. coli transformiert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit Standard-Verfahren erfolgen, jedoch wird vorteilhafterweise ein Mcr-defizien- ter E. coli-Stamm verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19) .
Beispiel 6 : Bestimmung der Expression des mutierten Proteins
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten Proteins in einer transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, daß das mutierte Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge exprimiert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutierten Gens (ein Anzeichen für die RNA-Menge, die für die Translation des Genprodukts verfügbar ist) ist die Durchführung eines Northern-Blots (s, bspw. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) , wobei ein Primer, der so ausgestaltet ist, daß er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden) Markierung versehen wird, so daß - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird' - die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge von mRNA für dieses Gen anzeigt . Diese Information ist ein Nachweis für das Ausmaß der Transkription des mutierten Gens . Gesamt-Zell-RNA läßt sich durch verschiedene Verfahren aus CoryneJbacterium glutamicum isolieren, die im Fachge- biet bekannt sind, wie beschrieben in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge von Protein, das aus dieser mRNA translatiert wird, können Standard- Techniken, wie Western-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York) . Bei diesem Verfahren werden Gesamt-Zellproteine extrahiert, durch Gelelektrophorese getrennt, auf eine Matrix, wie Ni- trocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikör- per, inkubiert, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszierenden oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen läßt. Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutantenproteins in der Zelle an.
Beispiel 7 : Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
Genetisch veränderte Corynebakterien werden in synthetischen oder natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien für Corynebakterian sind bekannt und leicht erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A. , et al., Hrsg. Springer-Verlag). Diese Medien bestehen aus einer oder mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte aus der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzu- geben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und organische Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstof verbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie NH4CI oder (NH4)2Sθ4, NH4OH, Nitrate,
Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Mais- quellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakte, Fleischextrakte und andere.
Anorganische SalzVerbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor-, oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geei- gnete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat oder organische Säuren, wie Citronensäure. Die Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen. Sämtliche Medienkomponenten sind sterilisiert, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert definiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer, wie MOPS, HEPES; ACES usw., können alternativ oder gleichzeitig verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert läßt sich während der Anzucht auch durch Zugabe von NaOH oder NH4OH konstant halten. Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt verwendet, sinkt der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe Verbindun- gen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines Fermenters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch mit gasförmigem Ammoniak reguliert werden.
Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von mehre- ren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt, daß sich die maximale Menge Produkt in der Brühe ansammelt . Die offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von Behältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder Schüttelkolben entweder mit oder ohne Schikanen gezüchtet werden. Vorzugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10% (bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums ge- füllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler (Amplitude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 100-300 U/ min geschüttelt werden. Verdampfungsverluste können durch Aufrechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden; alternativ sollte für die Verdampfungsverluste eine mathematische Kor- rektur durchgeführt werden.
Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollten auch ein unmodifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet werden, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Das Medium wird auf eine ODßoo von 0,5 - 1,5 angeimpft, wobei Zellen verwendet werden, die auf Agarplatten gezüchtet wurden, wie CM-Platten (10 g/1 Glucose, 2,5 g/1 NaCl, 2 g/1 Harnstoff, 10 g/1 Polypepton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 Fleischextrakt, 22 g/1 Agar pH-Wert 6,8 mit 2 M NaOH) , die bei 30°C inkubiert worden sind. Das Animpfen der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung von C. glutamicum-Zellen von CM-Platten oder durch Zugabe einer flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 8 : In-vitro-Analyse der Funktion imitierter Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von En- zymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über Enzyme im Allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Di- xon, M. , und Webb, E.C: (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D-. Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Aufl. Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Berg- meyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift- Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden) . Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann mit Reportergenassays (wie beschrieben in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 und den darin zitierten Literaturstellen) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotischen Zellen etabliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün-Fluoreszenz- Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann gemäß den Techniken, wie beschrieben in Gennis, R.B. (1989) "Po- res, Channels and Transporters", in Biomembranes , Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234; und 270-322, erfolgen. Beispiel 9 : Analyse des Einflusses von mutiertem Protein auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen (wie solchen, die vorstehend beschrieben sind) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. einer Aminosäure) untersucht wird. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzyma- tische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. , et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3 ; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publica- tions) .
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es ebenfalls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt-Produkti- vität des Organismus, die Ausbeute und/oder die Effizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoff uellen, Phosphat und andere Ionen) , Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gewöhnlicher Metabolite aus Biosynthesewe- gen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Mi- crobial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrie- ben. Beispiel 10: Reinigung des gewünschten Produktes aus C. glutami- cum-Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus C. glutamicum-Zellen oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultrabeschallung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den C. glutamicum-Zellen sezerniert, werden die Zel- len durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder wobei die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chro- matographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und der wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes , zu reinigendes Molekül bewandert . Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, die nicht auf das vorhergehende Reinigungsverfahren eingeschränkt sind. Diese sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals , McGraw-Hill : New York (1986) .
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Standard-Techniken des Fachgebiets bestimmt werden. Diese umfas- sen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, DünnschichtChromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al . (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich Routinever- fahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein.
Die Angaben in Tabelle 1 sind folgendermassen zu verstehen:
In Spalte 1"DNA-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "5" in der Spalte "DNA-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 5.
In Spalte 2"AS-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "6" in der Spalte "AS-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 6.
In Spalte 3"Identifikation" wird eine eindeutige interne Bezeich- nung für jede Sequenz aufgeführt.
In Spalte 4 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition der Polypeptidsequenz "AS-ID" in der gleichen Zeile. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen Polypeptidsequenz . Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.
In Spalte 5 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Wildtyp-Stamm.
In Spalte 6 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 7"Funktion" wird die physiologische Funktion der entsprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt. Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Phenylalanin
G Glycin
H His
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin
Tabelle 1
Gene die für Membransynthese- und Membrantransport-Proteine codieren
DNA AS Identifikation: AS AS AS Funktion:
ID: ID: Pos: Wildtyp Mutai
1 2 RXA00149 75 P S METHYL ALONYL-COA MUTASE (EC 5.4.99.2)
413 G E ETHYLMALONYL-COA MUTASE (EC 5.4.99.2)
417 A V METHYLMALONYL-COA MUTASE (EC 5.4.99.2)
3 4 RXA00186 189 G E ACETYL-HYDROLASE (EC 3.1.1.-)
5 6 RXA00203 288 R C RIBOSE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN RBSC
7 8 RXA00228 109 S F TRANSPORTER g 10 RXA00298 143 A T TRANSPORTER
11 12 RXA00345 27 D N MANGANESE-BINDING PERIPLASMIC PROTEIN PRECURSOR
13 14 RXA00354 67 G E Hydrolase (HAD superfamily)
15 16 RXA00368 523 A T IRON(lll)-TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN SFUB
17 18 RXA00378 570 D N Cation transport ATPases
570 D N Cation transport ATPases
19 20 RXA00412 346 G S ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
346 G S ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
21 22 RXA00413 247 D N ABC TRANSPORTER SUBSTRATE BINDING PROTEIN
23 24 RXA00432 495 S N NA(+)-LINKED D-ALANINE GLYCINE PERMEASE
26 RXA00453 243 A T TRANSPORTER
246 G D TRANSPORTER
28 RXA00456 99 A T ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
30 RXA00477 158 S F PHYTOENE DEHYDROGENASE (EC 1.3.-.-)
32 RXA00525 93 P S ABC TRANSPORTER PERMEASE PROTEIN
93 P s ABC TRANSPORTER PERMEASE PROTEIN
208 E K ABC TRANSPORTER PERMEASE PROTEIN
208 E K ABC TRANSPORTER PERMEASE PROTEIN
277 A V ABC TRANSPORTER PERMEASE PROTEIN
277 A V ABC TRANSPORTER PERMEASE PROTEIN
34 RXA00526 58 D N ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
38 RXA00634 452 G D DI-/TRIPEPTIDE TRANSPORTER
40 RXA00654 399 S F INNER MEMBRANE PROTEIN
42 RXA00690 220 D N COBALT TRANSPORT PROTEIN CBIQ
44 RXA00732 453 A V ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
46 RXA00758 398 D N PERIPLASMIC OLIGOPEPTIDE-BINDING PROTEIN PRECURSOR
418 G C PERIPLASMIC OLIGOPEPTIDE-BINDING PROTEIN PRECURSOR
48 RXA00759 129 D N OLIGOPEPTIDE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN OPPB
301 L F OLIGOPEPTIDE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN OPPB
50 RXA00777 35 S L PHOSPHATE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN PSTC
52 RXA00792 52 G D ACYL-COA DEHYDROGENASE (EC 1.3.99.-)
54 RXA00819 170 G D ACYL-COA DEHYDROGENASE (EC 1.3.99.-)
56 RXA00832 53 A V CALCIUM/PROTON ANTIPORTER
53 A V CALCIUM/PROTON ANTIPORTER
58 RXA00880 314 A T LONG-CHAIN-FATTY-ACID— COA LIGASE (EC 6.2.1.3)
60 RXA00931 278 P S ACYL-COA THIOESTERASE II (EC 3.1.2.-)
62 RXA00939 103 A T CADMIUM RESISTANCE PROTEIN
335 A V CADMIUM RESISTANCE PROTEIN
64 RXA00941 27 G D SODIUM-DEPENDENT PHOSPHATE TRANSPORT PROTEIN
134 A V SODIUM-DEPENDENT PHOSPHATE TRANSPORT PROTEIN
66 RXA00980 409 G R CADMIUM RESISTANCE PROTEIN
409 G R CADMIUM RESISTANCE PROTEIN
68 RXA01013 87 G R DIPEPTIDE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN DPPC
70 RXA01070 369 A V PROTON/SODiUM-GLUTAMATE SYMPORT PROTEIN
72 RXA011 2 310 G E SULFATE PERMEASE
1
74 RXA01220 43 C Y AMIDE-UREA TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN
76 RXA01285 250 G E FERRIC ENTEROBACTIN TRANSPORT ATP-BINDING PROTEIN FEPC
250 G E FERRIC ENTEROBACTIN TRANSPORT ATP-BINDING PROTEIN FEPC
78 RXA01298 69 G E TRANSPORTER
69 G E TRANSPORTER
80 RXA01323 143 Q H COPPER UPTAKE ATPASE (EC 3.6.1.-)
144 W C COPPER UPTAKE ATPASE (EC 3.6.1.-)
145 A P COPPER UPTAKE ATPASE (EC 3.6.1.-)
717 P S COPPER UPTAKE ATPASE (EC 3.6.1.-)
82 RXA01338 121 T I CATION-TRANSPORTING ATPASE PACS (EC 3.6.1.-) 121 T I CATION-TRANSPORTING ATPASE PACS (EC 3.6.1.-)
83 84 RXA01339 64 L P TYROSINE-SPECIFIC TRANSPORT PROTEIN
85 86 RXA01425 85 E K 60 KDA INNER MEMBRANE PROTEIN YIDC
87 88 RXA01467 48 T 1 ACYLCARRIER PROTEIN
89 90 RXA01629 3 P s PROLINE/ECTOINE TRANSPORTER
91 92 RXA01667 201 M 1 SODIUM/GLUTAMATE SYMPORT CARRIER PROTEIN
417 G D SODIUM/GLUTAMATE SYMPORT CARRIER PROTEIN
93 94 RXA01677 209 G R THIOLDISULFIDE INTERCHANGE PROTEIN DSBA
95 96 RXA01727 116 G D BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSPORT SYSTEM CARRIER PROTEIN
97 98 RXA01746 146 G E LIPOATE-PROTEIN LIGASE B (EC 6.-.-.-)
99 100 RXA01749 189 A V INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN WITH TRKA DOMAINS
212 P S INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN WITH TRKA DOMAINS
420 A T INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN WITH TRKA DOMAINS
101 102 RXA01822 296 G D TRANSPORTER
103 104 RXA01853 119 E K HYDROXYACYLGLUTATHIONE HYDROLASE (EC 3.1.2.6)
192 P L HYDROXYACYLGLUTATHIONE HYDROLASE (EC 3.1.2.6)
105 106 RXA01936 276 L F MACROLIDE-EFFLUX PROTEIN
107 108 RXA02020 52 A V AROMATIC AMINO ACID TRANSPORT PROTEIN AROP
109 110 RXA02029 37 E K CYCLOPROPANE-FATTY-ACYL-PHOSPHOLIPID SYNTHASE (EC 2.1.1.79)
111 112 RXA02034 193 T 1 DIPEPTIDE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN DPPB
113 114 RXA02035 129 T 1 PERIPLASMIC DIPEPTIDE TRANSPORT PROTEIN PRECURSOR
365 A V PERIPLASMIC DIPEPTIDE TRANSPORT PROTEIN PRECURSOR
115 116 RXA02062 269 T 1 GLYCOSYL TRANSFERASE (EC 2.4.1.-) 269 T 1 GLYCOSYL TRANSFERASE (EC 2.4.1.-)
117 118 RXA02074 341 S N TRANSPORTER
119 120 RXA02095 409 A V ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
914 A V ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
121 122 RXA02119 209 G E TRANSPORTER
241 G D TRANSPORTER
123 124 RXA02128 10 S N SULFATE PERMEASE
125 126 RXA02173 195 A T ACETYL-COENZYME A CARBOXYLASE CARBOXYL TRANSFERASE SUBUNIT BETA (EC 6.4.1.2)
127 128 RXA02220 674 G S CALCIUM-TRANSPORTING ATPASE (EC 3.6.1.38)
129 130 RXA02233 323 A V URACIL PERMEASE
131 132 RXA02309 276 P S OCTAPRENYL-DI PHOSPHATE SYNTHASE (EC 2.5.1.-)
133 134 RXA02335 313 D N acetyl-CoA carboxylase alpha chain (EC 6.4.1.2) / propionyl-CoA carboxylase alpha chain (EC 6.4.1.3)
135 136 RXA02394 127 G E C4-DICARBOXYLATE TRANSPORTER LARGE SUBUNIT
137 138 RXA02395 533 A V TRANSPORTER
139 140 RXA02426 207 A V NA+/H+ ANTI PORTER NHAP
320 S L NA+/H+ ANTIPORTER NHAP
141 142 RXA02447 185 A V GALACTOSE-PROTON SYMPORTER
185 A V GALACTOSE-PROTON SYMPORTER
143 144 RXA02487 362 G S LONG-CHAIN-FATTY-ACID— COA LIGASE (EC 6.2.1.3)
145 146 RXA02512 23 A V LIPID A BIOSYNTHESIS LAUROYL ACYLTRANSFERASE (EC 2.3.1.-)
147 148 RXA02566 287 S F TETRACYCLINE RESISTANCE PROTEIN, CLASS A
149 150 RXA02570 184 R C ABC TRANSPORTER INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
151 152 RXA02613 210 G R TAURINE-BINDING PERIPLASMIC PROTEIN PRECURSOR
153 154 RXA02627 338 E K DTXR/IRON-REGULATED LIPOPROTEIN PRECURSOR
155 156 RXA02676 387 A V HIGH-AFFINITY GLUCONATE TRANSPORTER
157 158 RXA02677 270 G s GLYCEROPHOSPHORYL DIESTER PHOSPHODIESTERASE (EC 3.1.4.46)
159 160 RXA02684 143 D N MEMBRANE-BOUND PROTEIN LYTR
403 E K MEMBRANE-BOUND PROTEIN LYTR
161 162 RXA02718 355 V M FARNESYL PYROPHOSPHATE SYNTHETASE (EC 2.5.1.1 ) I GERANYLTRANSTRANSFERASE (EC 2.5.1.10)
163 164 RXA02767 251 E K TRANSPORTER
165 166 RXA02795 240 L F DIPEPTIDE TRANSPORT ATP-BINDING PROTEIN DPPF
167 168 RXA02922 72 A V DIBENZOTHIOPHENE DESULFURIZATION ENZYME C
169 170 RXA02925 429 A V COPPER-SILVER EFFLUX ATPASE (EC 3.6.1.-)
460 P s COPPER-SILVER EFFLUX ATPASE (EC 3.6.1.-)
171 172 RXA02991 138 P s GLUTAMINE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN GLNP
313 G E GLUTAMINE TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN GLNP
173 174 RXA03129 209 L F TRANSPORTER
175 176 RXA03157 23 A T PHOSPHOPANTETHEINE ADENYLYLTRANSFERASE (EC 2.7.7.3)
177 178 RXA03285 469 D N TRANSPORTER
179 180 RXA03299 359 G D Hypothetical Membrane Spanning Protein
181 182 RXA03376 1484 P S FATTY ACID SYNTHASE (EC 2.3.1.85) [INCLUDES: EC 2.3.1.38; EC 2.3.1.39; EC 2.3.1.41 ; EC 1.1.1.100; EC 4.2.1.61 ; EC 1.3.1.10; EC 3.1.2.14]
183 184 RXA03393 203 A V TRANSPORTER
185 186 RXA03763 47 N S TRANSPORTER
187 188 RXA03864 5 L F Hypothetical Membrane Spanning Protein
189 190 RXA03916 243 S N LIPOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHESIS PROTEIN WZXC
191 192 RXA04102 36 T A PERMEASE
193 194 RXA04164 49 L F TRANSPORTER
195 196 RXA04275 482 L F TRANSPORTER
197 198 RXA04314 69 V I SODIUM-DEPENDENT PHOSPHATE TRANSPORT PROTEIN
199 200 RXA04323 360 S F SODIUM/PROTON ANTIPORTER PROTEIN SHAA I SODIUM/PROTON ANTIPORTER PROTEIN SHAB
575 S F SODIUM/PROTON ANTIPORTER PROTEIN SHAA I SODIUM/PROTON ANTIPORTER PROTEIN SHAB
201 202 RXA04359 171 H Y PUTATIVE TRANSPORT PROTEIN SGAT 311 V I PUTATIVE TRANSPORT PROTEIN SGAT
203 204 RXA04482 310 P S TRANSPORT ATP-BINDING PROTEIN CYDC
312 S F TRANSPORT ATP-BINDING PROTEIN CYDC
205 206 RXA04624 67 A T TRANSPORTER
207 208 RXA07009 345 N F PUTATIVE UNDECAPRENYL-PHOSPHATE ALPHA-N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE (EC 2.4.1 ,
209 210 RXA07010 111 P L PHOSPHONATES TRANSPORT SYSTEM PERMEASE PROTEIN PHNE
211 212 RXA07012 263 A V PEROSAMINE SYNTHETASE PER
213 214 RXA07013 49 R H POTASSIUM CHANNEL BETA SUBUNIT
215 216 RXA07022 127 E K ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN
455 E K ABC TRANSPORTER ATP-BINDING PROTEIN

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül codierend für ein Polypeptid mit der jeweils in Tabellel/Spalte2 in Bezug genommenen
Aminosäuresequenz wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Ta- bellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition eine andere proteinogene Aminosäure codiert als die jeweilige in Ta- bellel/Spalte5 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure.
2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Tabellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition die in Tabellel/Spalteδ in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure codiert.
3. Ein Vektor, der wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 enthält.
4. Eine Wirtszelle, die mit wenigstens einem Vektor nach An- Spruch 3 transfiziert ist.
5. Eine Wirtszelle nach Anspruch 4 wobei die Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls zur Modulation der Produktion einer Feinchemikalie aus besagter Zelle führt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie welches die Kultivierung einer Zelle beinhaltet, die mit wenigstens einen Vektor nach Anspruch 3 transfiziert worden ist, so dass die Feinchemikalie produziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Feinchemikalie eine Aminosäure ist.
8. Verf hren nach Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Lysin ist.
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