CN112143676B

CN112143676B - 一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌及其产碱性蛋白酶的方法与应用

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Publication number: CN112143676B
Application number: CN202010995597.3A
Authority: CN
Inventors: 石亚伟; 文阳宣; 周桂旭
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2040-09-21
Also published as: CN112143676A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，提供一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌菌株DS5及其产碱性蛋白酶的方法与应用。所述产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌DS5为耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans），于2020年8月17日保藏于广东省微生物菌种保藏管中心，保藏号为：GDMCC No.61148；保藏地址为：广东市先烈中路100号大院59号楼5楼。所述菌种从山西山区农田土壤样品中分离筛选获到。该菌株产碱性蛋白酶，耐盐、耐高温，所产蛋白酶为胞外酶；该菌株发酵过程及培养时间短、产蛋白酶迅速，发酵制备碱性蛋白酶的工艺简单、高效，制备出的蛋白酶具有耐碱和耐高温特性，可被用来作为洗涤添加剂使用，洗涤效果优良。

Description

一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌及其产碱性蛋白酶的方法与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌及其产碱性蛋白酶的方法与应用。该产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌为菌株DS5。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是全球用途最广泛的酶制剂之一，可用于洗涤剂、皮革、食品、酿酒行业，以及纺织、医药品、化妆品等的生产上，蛋白酶按来源分为动物蛋白酶、植物蛋白酶及微生物蛋白酶。蛋白酶也可按照反应时最适pH分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。碱性蛋白酶属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，主要应用于加酶洗涤剂工业，最早在猪的胰脏中发现。1945年瑞士的Jaag等发现了微生物蛋白酶，开启了蛋白酶广泛应用于洗涤剂工业。

目前洗涤剂中添加的枯草杆菌蛋白酶包括Savinase™ (Subtilisin 309)，Subtilisin Novo (BPN′)，Alcalase™ (Subtilisin Carlsberg)，Maxacal™ (NovozymesA/S, Denmark)，BLAP Sb(Henkel, Germany)，和Properase™ (Genecor Int. USA)，它们通常在较高温度和pH条件下能保持稳定，然而，其中大多数蛋白酶在液体洗涤剂存在下稳定性降低，洗涤效率有限。微生物作为蛋白酶来源比植物和动物表现出许多优势，最重要的是生长相对迅速，易于处理，不需要昂贵的培养基，某些具有极端微生物的特性，可通过统计模型优化、可控的自动化生物过程生产所需产品。因此，寻找和筛选能够生产在洗涤剂中稳定的碱性蛋白酶，并在极端条件下保持其高活性和稳定性的替代微生物至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌菌株DS5及其产碱性蛋白酶的方法与应用。

本发明由如下技术方案实现的：一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌，所述产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌DS5为耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans），于2020年8月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No.61148；保藏地址为：广东市先烈中路100号大院59号楼5楼。

利用所述产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法具体步骤如下：

（1）菌株活化：将菌株DS5接种到含有质量浓度为2％(w/v)脱脂奶粉的LB平板培养基上，37℃培养至有透明圈产生；

(2)种子培养：将产生透明圈的单菌落接种于种子培养基中，37℃培养10h，得种子液；

(3)发酵培养：将种子液按体积比为4％的接种量接种于发酵培养基中发酵，装液量为12%，发酵温度为37℃，pH为7.2-7.4，转速为200r/min，发酵12h，得发酵液；

(4)收集蛋白酶：将发酵液在4℃下，转速8000-12000rpm，离心5-10min，取上清液，室温下，边搅拌边向上清液中加入硫酸铵，每升溶液加入硫酸铵472g，使上清液中硫酸铵的饱和度达到70％，充分溶解后4℃静置8-12h，然后13000rpm离心20-30min，取沉淀，用pH为9的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，得到蛋白酶粗提液；将蛋白酶粗提液过Sephadex-G25脱盐柱脱盐，收集有蛋白的部分，使用浓缩管浓缩后经Superdex-75凝胶柱层析得到纯蛋白。

所述种子培基为：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2；37℃，200rpm培养10h；

发酵培养基为：糊精10g、可溶性淀粉20g、酵母提取物10g、氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH为7.2，37℃，200rpm培养12h 。

获得的碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用，所述碱性蛋白酶作为添加剂在洗涤剂中的用途。

所述碱性蛋白酶添加量为：洗衣液固定量为2g/L，其中酶的添加量≤1%。

本发明所述菌种从山西山区农田土壤样品中分离筛选获得。该菌株产碱性蛋白酶，耐盐、耐高温，所产蛋白酶为胞外酶；该菌株发酵过程及培养时间短、产蛋白酶迅速，发酵制备碱性蛋白酶的工艺简单、高效，制备出的蛋白酶具有耐碱和耐高温特性，可被用来作为洗涤添加剂使用，洗涤效果优良。

本发明的菌种保藏日期为2020年8月17日，保藏编号为：GDMCC No.61148；分类命名为：耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans），保藏单位名称为：广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广东市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编5100759。

附图说明

图1为野生菌DS5的水解透明圈；

图2为Bacillus halotolerans的荧光显微镜图

图3为 DS5基因组及16s rRNA基因的提取；

图4为基于16s rRNA基因序列的系统发育树；

图5为菌株DS5生长曲线和产酶曲线图；

图6为菌株DS5产碱性蛋白酶纯化过程检测图；图中：A为Superdex-75凝胶柱层析和酶活曲线；B为检测蛋白酶纯化的SDS-PAGE图；

图7为菌株DS5产碱性蛋白酶酶学性质；图中：A为蛋白酶反应最适温度曲线图；B为蛋白酶反应最适pH检测图；C为蛋白酶的热稳定性图；D为蛋白酶的pH稳定性图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：菌株筛选

从山西省晋中市左权县（北纬37°07′，东经113°37′）山区农田土壤样品中分离筛选菌种。

初筛：称取1g土壤样品置于80℃烘箱保温2h，然后使用无菌水按照10^-1梯度逐级稀释至10^-6，涂布在没有抗性的牛奶平板上，37℃培养12h，产生蛋白酶的菌落周围产生明显的透明圈，挑取透明圈与菌落直径比最大的菌株作为复筛菌株；初筛共富集筛选到80株菌株，分别命名为AS1-AS20、BS1-BS20、CS1-CS20、DS1-DS20。所述牛奶培养基为含有2.0％(w/v)脱脂奶粉的LB培养基。

复筛：将初筛得到的菌株接种于发酵培养基中37℃发酵12h后离心，取上清，测发酵液蛋白酶活性，经过复筛，其中有3株菌株酶活力较高，选取酶活性最高的菌株DS5为发酵菌株，测定结果见表1。所述复筛培养基为：糊精10g，可溶性淀粉20g，酵母提取物10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

酶活力测定：通过使用酪蛋白作为底物进行测活，参照轻工业部颁标准QB-T1803-93（Folin试剂显色法）具体如下：取1mL酶液，40℃水浴预热3 min，再加入1mL1% 酪蛋白溶液，混匀，放入40℃水浴10min，加入2mL浓度为0.4 mol/L的三氯乙酸溶液，转速13000 r/min离心5 min，取1 mL上清液，加入5 mL浓度为0.4 mol/L的碳酸钠溶液，再加入1 mL福林试剂，40℃水浴显色20 min。对照组1mL酶液先加2mL浓度为0.4 mol/L三氯乙酸溶液，再加入1mL1%酪蛋白溶液，其他步骤相同。测定波长为680 nm的吸光度值。1mL酶液1min水解酪蛋白产生1µg酪氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位，以U/mL表示。

表1复筛酶活力测定结果

注：^a实验进行了三次，平均值±标准误差；^b蛋白酶活性是按照福林法测定的。

实施例2：蛋白酶产生菌DS5鉴定

对上述获得的DS5形态特征观察如图1所示，菌落呈乳白色，不透明，粗糙有褶皱，呈圆形。DS5为革兰氏染色为阳性，细胞呈短杆状(0.5-1.0µm×3.0-6.0µm)，单个排列；该菌株在LB培养基表面形成圆形、乳白色、不透明，菌落在脱脂奶粉平板上可产生明显的透明圈。

对该菌株的生理生化鉴定结果表明为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)，生理生化鉴定结果见表2。

表2：耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)生理生化鉴定结果

以上生理生化特征检测方法如下：

a) 革兰氏染色：染剂的配制：

A .结晶紫的混合液：结晶紫溶液：结晶紫乙醇饱和溶液100mL；甲液：结晶紫2.5g，95%乙醇25.0mL；乙液：1%草酸铵溶液；将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成甲液；将草酸铵溶于蒸馏水，配成乙液。两液混合即成。

B .碘液：卢戈碘液：碘化钾2g；碘1g；蒸馏水300mL；先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶解时稍加热，最后补足蒸馏水量。

C .脱色液：（1）95%乙醇或（2）丙酮乙醇溶液100mL：95%乙醇70mL和丙酮30mL；

复染液：番红染色液：2.5%番红O（Safranin O）95%酒精溶液10mL；蒸馏水90mL。

染色步骤：涂片固定；草酸铵结晶紫染1分钟；自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染约1分钟；水洗，用吸水纸吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分；番红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。深紫色为革兰氏染色阳性细菌；红色为革兰氏染色阴性细菌。

b) 糖、醇类发酵反应：

芽孢菌培养基：(NH₄)₂HPO₄ 0.10g，KCl 0.02g，MgSO₄ 0.02g，酵母膏0.02g，琼脂1.50g，糖或醇1.00g，0.04％的溴甲酚紫1.50mL，（0.04％的溴甲酚紫溶液配置：0.04g溴甲酚紫粉末溶于20mL的无水乙醇中，再加入80mL蒸馏水配制而成）蒸馏水100mL。调pH 7.0-7.2，分装试管，培养基高度约为4-5cm，112℃蒸汽灭菌30min。

接种与观察：以10h的幼龄培养物穿刺接种于上述培养基中，37℃培养1，3，5，7d。如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝(紫)则为阴。

c) 运动性-半固体琼脂穿刺法：

培养基制备：LB培养基添加0.4％的琼脂。

接种与观察：用直针穿刺接种试验菌于半固体培养基内，37℃培养。细菌的运动性可用透射光目测。如生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性，为阴性；如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌株有运动性，为阳性。

d) 淀粉水解反应：

培养基：在肉汁胨培养基中加0.2％可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃蒸汽灭菌20min，倒平板备用。（肉汁胨（g/L）：牛肉浸膏3.0g；蛋白胨10.0g；NaCl 5.0g；琼脂18.0g；蒸馏水1000mL；pH7.4-7.6）。卢哥氏碘液：碘1.0g，碘化钾2.0g，蒸馏水300mL。

取新鲜培养物点种于上述平板，37℃培养。培养1天，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性；仍是蓝黑色为阴性。

e) 耐盐性反应：待测菌生长的LB液体培养基，依鉴定需要加入不同浓度的NaCl(3％、5％、7％、10％、20％)，培养基要十分澄清。以10h的幼龄培养物接种于上述培养基中，37℃培养3和7d。与未接种的对照管对比，观察生长情况。生长为阳性，不生长为阴性。

f) 接触酶反应：将24h培养的斜面菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有10％过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。

g) 纤维素水解反应：培养基：蛋白胨水基础培养基：蛋白胨0.50g，NaCl 0.50g，蒸馏水100mL，pH 7.0-7.2；将基础培养基分装试管，在培养基中浸泡一条优质滤纸，121℃灭菌20min。纸条宽度以易于放入试管为宜。纸条长度约5-7cm。测定好氧菌时，应有部分纸条于培养基液面外，测定厌氧菌时，纸条应全浸泡于培养基中。

接种培养基，应有不接种的空白对照。37℃培养1-4周观察。能将滤纸条分解成一团纤维或将滤纸条折断或变薄者为阳性，滤纸条无变化者为阴性。

h) V-P测定反应：培养基：蛋白胨0.50g，葡萄糖0.50g，NaCl 0.50g，蒸馏水100mL，pH 7.0-7.2；每管分装4-5mL，115℃灭菌30min。试剂：肌酸0.3％或原粉，NaOH 40％。

接种试验菌于上述培养液中，每次两个重复，37℃培养2天；取培养液和40％氢氧化钠等量相混。加少许肌酸（约0.5-1mg），10min如培养液出现红色，即为试验阳性反应，不出现红色则为阴性。

i) 硝酸盐还原：培养基：肉汁胨培养基100mL，KNO₃0.10g，pH7.0-7.6，每管分装4-5mL，121℃蒸汽灭菌15-20min。

试剂：

1)格里斯氏试剂：A液，对氨基苯磺酸0.50g，10％的稀醋酸150ml；B液，α-萘胺0.10g，蒸馏水20mL，10％的稀醋酸150mL。

2)二苯胺试剂：二苯胺0.50g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。

将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置37℃培养1，3，5天。每株菌作二个重复，另留两管不接种作对照。

取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒人少许培养1，3，5天的培养液，再各加一滴A液及B液，在对照管中同样加入A液，B液各一滴。

当培养液中滴入A，B液后，溶液如变为粉红色，攻瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。

j) 柠檬酸盐：培养基：NaCl 0.10g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，NH₄H₂PO₄0.05g，柠檬酸钠0.20g，蒸馏水100mL，0.04％酚红液2mL，将以上成分除指示剂外加热溶解，调pH为7.0并加入指示剂。分装试管，121℃蒸汽灭菌15min。37℃培养3-7天。培养基为碱性(指示剂蓝色或桃红色)者为阳性，否则为阴性。

k) 硫化氢产生：培养基：蛋白胨1.00g，NaCl 0.50g，牛肉膏1.00g，半胱氨酸0.05g，蒸馏水100mL，pH7.0-7.4分装试管，每管液层高度4-5cm，112℃灭菌20-30min。

另外将普通滤纸剪成0.5-1cm宽的纸条，长度根据试管与培养基高度而定。用10％的醋酸铅将纸条浸透，然后用烘箱烘干，放于培养皿中灭菌备用。

用新鲜斜面培养物接种培养基。接种后，用无菌镊子夹取一条醋酸铅纸条用棉塞塞紧，使悬挂于管中，下端接近培养基表面，不接触液面，37℃培养。于接种后3，7，14天观察。纸条变黑色者为阳性，不变者为阴性。

16S rDNA序列分析，具体步骤如下：

(1) 基因组DNA的提取：将有透明圈的菌株挑取单菌落，200rpm/min，37℃过夜培养，提基因组使用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB)法：取1.5mL新鲜细菌培养物，13000r/min离心2min收集菌体。去上清液，用0.85% NaCl溶液洗涤两次，加入550μL的1×TE缓冲液，震荡重悬细菌。然后加入40μL 10% SDS和8μL 20mg/mL蛋白酶K混匀，于37℃温育30min，随后，加入100μL 5mol/L NaCl和80μL CTAB溶液混匀，65℃温育10min。再加入8μL 10mg/mL RNaseA，37℃恒温水浴1h，然后酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，离心10000r/min，收集上清液，加入等体积三氯甲烷-异丙醇（体积比24:1）离心收集上清液，加入二倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置30min，10000r/min，离心10min，弃上清，加入70%乙醇500μL混匀10000r/min，离心3min，弃上清将DNA溶于600μL ddH₂O中，4℃保存。

（2）菌株的分子鉴定：提取菌株基因组作为模板，进行PCR扩增，所用引物为细菌16S rRNA基因的通用引物，其序列为：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系见表3，PCR反应条件见表4。扩增产物进行DNA测序。DS5基因组及16S rRNA基因的提取电泳图如图3所示，将测序结果在NCBI中进行Blast确定其种属。

表3：PCR反应体系

表4：PCR反应条件

经鉴定：基于16S rRNA基因序列的系统发育树如图4所示；所得蛋白酶的高产菌株，命名为DS5，属于耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans)。菌株的16srDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例3：蛋白酶产生菌DS5的发酵培养：将筛选所得发酵菌株接种于种子培养基进行培养，再接种于发酵培养基中进行发酵。具体为：将DS5菌种斜面接种于种子培养基中，37℃、200rpm，培养10小时后，将种子液以4％接种量加入到发酵培养基（每升液体培养基含糊精10g、可溶性淀粉20g、酵母提取物10g、氯化钠5g，121℃蒸汽灭菌20min），发酵培养为每3L摇瓶装发酵培养基300mL，培养条件为：37℃，200rpm，发酵培养12小时。

实施例4：蛋白酶的纯化：将发酵液在4℃下，转速8000-12000rpm，离心5-10min，取上清液，室温下，边搅拌边向上清液中缓慢加入硫酸铵，每升溶液加入硫酸铵472克，使上清液中硫酸铵的饱和度达到70％，充分溶解后4℃静置8-12h，然后离心30min，转速13000rpm，取沉淀，用pH9.0的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，得到蛋白酶粗提液。将蛋白酶粗提液上样于Sephadex-G25脱盐柱脱盐，收集有蛋白的部分，使用浓缩管浓缩后经Superdex-75凝胶柱层析得到纯蛋白。

实施例5：酶学性质的测定：分别随时间跟踪测定DS5菌株的碱性蛋白酶活性和核酸含量，菌株DS5生长曲线和产酶曲线如图5所示。分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃进行酶促反应10min，测定蛋白酶活力。蛋白酶反应最适温度如图7A所示，本发明制备的蛋白酶最适反应温度为50℃。

将上述制备的稀释酶液在50℃温度下水浴保温2h，与未被保温的酶活力相比较，测定蛋白酶剩余活力，蛋白酶的热稳定性如图7C所示，在50℃孵育1h时，酶活力能保留90%以上，半衰期为135min。

在最适温度下，pH值5.0-12.0范围内测酶活力，配制pH分别为5.0、6.0、7.0、9.0、10.0、11.0、12.0的缓冲液，分别用缓冲液配不同pH的酪蛋白溶液作为底物，测定蛋白酶活。蛋白酶反应最适pH如图7B所示，本发明制备的蛋白酶最适反应pH为9.0。

将酶液用不同pH的缓冲液稀释，室温保存2h后，测定剩余酶活力。蛋白酶的pH稳定性如图7D所示，蛋白酶在pH 7.0到pH 12.0范围内保持70%以上的活性。

实施例5：洗涤性能评价：为了比较DS5蛋白酶与枯草芽孢杆菌PB92蛋白酶洗衣液的洗涤性能，进行去污力测试。

测试方法：配制硬水，打开去污机加热到30℃左右，将所用污布（采用国标蛋白JB-02污布）剪成直径为6厘米的圆片(一组实验3片)，测每块布的白度值，称量洗涤溶液(洗衣液（广州立白企业集团有限公司生产，产品批号：20201002K203209）固定量为2g/L，酶的添加量≤1%)，将洗缸放到去污机上，用1L硬水将洗涤溶液转移洗缸内，固定洗缸，将搅拌杆固定到去污机上，空搅2分钟左右(搅匀洗涤溶液)，暂停，将污布放入洗缸内，开始20分钟后将污布取出，清洗并甩干，平铺自然晾干，测量洗后白度值，计算去污值及去污比值。测试结果见表5。

表5：去污力测试结果

从表5的数据可以看出，与枯草芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶相比，耐盐芽孢杆菌DS5蛋白酶洗涤剂在国标蛋白的去污力表现明显提升。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施实例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 山西大学

<120> 一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌及其产碱性蛋白酶的方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1508

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga 180

accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt ccttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggta 1508

Claims

1.一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌，其特征在于：所述产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌为耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）DS5，于2020年8月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No.61148；保藏地址为：广东市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.利用权利要求1所述的一株产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）菌株活化：将菌株DS5接种到含有质量浓度为2％w/v 脱脂奶粉的LB平板培养基上，37℃培养至有透明圈产生；

(4)收集蛋白酶：将发酵液在4℃，转速8000-12000rpm，离心5-10min，取上清液，室温下，边搅拌边向上清液中加入硫酸铵，每升溶液加入硫酸铵472g，使上清液中硫酸铵的饱和度达到70％，充分溶解后4℃静置8-12h，然后13000rpm离心20-30min，取沉淀，用pH为9.0的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，得到蛋白酶粗提液；将蛋白酶粗提液经Sephadex-G25脱盐柱脱盐，收集有蛋白的部分，使用浓缩管浓缩后，再经Superdex-75凝胶柱层析纯化得到纯蛋白；

所生产的碱性蛋白酶作为添加剂用在洗涤剂中。

3.根据权利要求2所述的利用产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于：所述种子培基为：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2；37℃，200rpm培养10h；

4.根据权利要求2所述的利用产碱性蛋白酶耐盐芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶添加量为：洗衣液固定量为2g/L，酶的添加量为≤1%。