KR20180060902A - 음식물 쓰레기 분해용 혼합균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법 - Google Patents
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Abstract
음식물 쓰레기 처리용 혼합 균주는 Bacillus amyloliquefaciens, Acinetobacter baumannii, Enterobacter hormaechei, Saccharomycopsis fibuligera, Raoultella ornithinolytica 및 Serratia marcescens의 균주로 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제 및 리파아제 효소활성을 가지며 음식물쓰레기 분해 활성이 우수하고, 성장 온도범위가 2 내지 50℃이고, 염농도 3%까지 생육 가능하다.
Description
본 발명은 음식물쓰레기 처리기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 온도, pH 및 염분 범위에서 성장이 빠르고, 셀룰로오스, 아밀로오스, 단백질 및 지방에 대한 분해율이 더 높은 음식물 쓰레기 분해용 혼합균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법에 관한 것이다.
국내 음식물 쓰레기는 수분 함량과 유기물 함량이 80%이상으로 매우 높고, 염도가 높아서 저장, 수거 및 운송 과정에서 쉽게 부패하여 악취와 침출수 등의 심미적 악영향으로 주거단지 내에서 쾌적성 저해 요인으로 작용하고 있다.
따라서, 발생원에서부터 원천적으로 음식물 쓰레기의 적정 처리에 대한 효과적 기술 개발 필요성이 증대되고 있으며, 공동주택에서 발생하는 음식물 쓰레기는 발생량, 성상이 거의 일정하여 생물학적 처리 후 활용이 용이하여 유용한 에너지 자원으로 기대되고 있다.
또한, 국내외 폐기물 처리 및 자원화 시설들은 감량화/자원화 방식으로 주로 대형·집중형 형태로 운영되고 있으나 다양한 기술적·사회적·경제적 한계를 내포하고 있다. 음식물 종량제 추진 등 다양한 정책이 추진되고 있으나 자원순환 인식 및 실천부족으로 효과는 미미한 수준이다.
음식물 쓰레기는 발열량이 낮고 수분 함량이 높아 소각 처리에 부적합해 과거 상당량을 매립에 의존하였으나 악취 및 침출수 등에 의한 2차 오염과 쓰레기 매립지의 사용 단축 등의 문제로 2005년부터 음식물 매립이 전면 금지되었다.
또한, 런던 협약으로 인해 2013년부터 폐기물의 해양 투기가 전면 금지됨에 따라 음식물 쓰레기 처리를 위한 새로운 방법의 개발이 크게 요구된다.
음식물 쓰레기를 효율적으로 처리하면서 2차 오염의 발생을 최소화할 수 있는 방법으로 미생물을 이용한 소멸화 방식이 있다.
이러한 미생물을 이용한 소멸화 처리 방법은 투입된 음식물을 호기적 조건 및 적합한 공정 하에 짧은 시간 내에 발효시킴으로써 음식물 폐기물의 양을 크게 감소시키고 기존 처리 방법의 문제로 지적된 2차 환경 오염도 최소화하여 현재 음식물 쓰레기 처리를 위한 가장 합리적인 대안이라 할 수 있다.
이러한 미생물을 이용한 소멸화 처리 방법은 생물학적 환경이 적절하게 조절된 장치 내에서 미생물의 대사 활동에 의해 음식물 쓰레기의 유기물을 물과 탄산가스로 분해하여 대기 중으로 휘발시키는 처리공정을 갖는다.
호기적 조건을 확보한 상태의 적절한 공정 조건 하에서, 발효조 내에 음식물을 연속적으로 투입하여 음식물 내의 수분(70~85%)을 증발시키고 유기물 성분(약 12~13%)이 장치 밖으로 배출되어 지속적으로 질량의 증가가 거의 없게 유지된다.
현재 국내에서 음식물 쓰레기 처리 방식에 이용되는 미생물로는 세균인 바실러스류(Bacillus), 방선균류(Actinomycetes), 슈도모나스류(Pseudomonas), 곰팡이인 페니실리움(Penicillium), 리조푸스(Rhizopus), 효모인 피치아(Pichia) 등이 있다. 이들 미생물은 음식물 소멸 능력 및 탈취력이 우수하다고 판단되어 이용된 미생물이다.
그러나 이들 미생물의 물질분해능력이 충분하지 않으며, 단독으로 사용할 경우 음식물 쓰레기 소멸장치내의 환경변화에 따른 접종균주의 사멸, 투입하지 않은 미생물의 우점 등에 의하여 처리효율이 감소하고 악취가 발생하는 등의 문제점이 있는 것으로 밝혀졌다.
예를 들어, 방선균류는 탄수화물, 섬유소 등 탄소성 물질의 분해 능력이 높고, 땅 냄새를 주는 지오스민(geosmin)과 같은 화합물을 생성하여(Parker, 2001) 음식물 쓰레기 처리시 악취를 저감할 수 있지만 반면에 번식 속도가 느려 접종한 미생물이 쉽게 유실되고 단백질 성분의 분해 능력이 비교적 낮아 암모니아성 및 황화수소성 악취를 유발할 가능성이 높다는 단점이 있다.
따라서, 다양한 미생물을 포함하는 혼합균주를 사용할 경우, 이러한 한 가지 미생물의 단점을 상호 보완하고 음식물 쓰레기 처리의 효율을 향상시킬 수 있을 것이다.
음식물 쓰레기 처리를 위한 단일 미생물 사용의 문제점을 해결하기 위해 대한민국 특허 제10-1161670호에서 음식물 쓰레기 처리용 혼합균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법을 제안하였다. 그러나 이러한 혼합균주 역시 바실러스류(Bacillus)에 포함되는 세균으로 2종만 포함되어 있으며 음식물 쓰레기 처리시 환경인 높은 온도와 염분도, 낮은 pH에서 미생물의 성장과 활성이 부족한 문제점이 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 다양한 온도, pH 및 염분 범위에서 성장이 빠르고, 셀룰로오스, 아밀로오스, 단백질 및 지방에 대한 분해율이 더 높은 음식물 쓰레기 분해용 혼합균주 및 이를 이용한 음식물 쓰레기 처리 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따른 음식물 쓰레기 분해용 혼합균주는,
바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)(기탁번호 KCTC18541P), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)(기탁번호 KCTC18542P), 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei)(기탁번호 KCTC18543P), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera)(기탁번호 KCTC18544P), 라오울텔라 오르니티놀리티카(Raoultella ornithinolytica)(기탁번호 KCTC18545P) 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(기탁번호 KCTC18546P)의 균주로 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제 및 리파아제 효소활성을 가지며 음식물쓰레기 분해 활성이 우수하고, 성장 온도범위가 30℃이고, 염농도 5%까지 생육 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 특징에 따른 음식물 쓰레기를 처리하는 방법은,
바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)(기탁번호 KCTC18541P), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)(기탁번호 KCTC18542P), 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei)(기탁번호 KCTC18543P), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera)(기탁번호 KCTC18544P), 라오울텔라 오르니티놀리티카(Raoultella ornithinolytica)(기탁번호 KCTC18545P) 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(기탁번호 KCTC18546P)의 혼합균주를 사용하는 것을 특징으로 한다.
전술한 구성에 의하여, 본 발명은 생육가능한 온도 및 pH 범위가 매우 넓고, 탄수화물, 단백질, 섬유소, 지방질 모두를 분해하는 효소의 생산력 및 활성도가 높아서 음식물 쓰레기의 소멸화 정도가 매우 높은 효과가 있다.
본 발명은 음식물의 용해성 부분 및 비용해성 부분 모두에 대하여 분해력이 우수하고, 고염분 농도하에서도 생육이 가능하며, 음식물로부터 발생하는 취기의 억제력이 우수하며, 내열성, 내산성, 내염기성이어서 우리나라 음식물을 발효 소멸시키는데 매우 유용한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 내염성 평가에서 배양 모습을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 내열성 평가에서 배양 모습을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 내열성 평가에서 배양 모습을 나타낸 도면이다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
(1) 미생물의 분리 및 선별
내염성이 우수하고 고온에서 서식할 수 있는 음식물 쓰레기의 분해가 가능한 균주를 분리하기 위하여 일반가정과 상가에서 발생하는 음식물 쓰레기와 누룩으로부터 시료를 채취한다.
채취한 시료 10g을 각각 멸균된 증류수에서 3시간 동안 침지시킨 후 nutrient agar(0.3% beef extract, 0.5% peptone, 1.5% agar) 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양한다.
24시간 후 배지에 나타난 colony의 크기와 형태에 따라 서로 다른 colony를 선발하여 각각 nutrient agar 배지에 옮겨 배양하여 균주를 분리한다.
[표 1] 및 [표 2]에 도시된 바와 같이, 균주 분리를 위하여 1인가구(원룸, 고시원 등)와 다인가구(아파트, 주택 등), 상가에서 발생하는 음식물 쓰레기와 4종류의 누룩(개량누룩, 진주곡자, 송학곡자, 산성누룩)에서 시료를 채취하였다. 음식물 쓰레기로부터 45균주, 누룩으로부터 72균주를 분리 배양하였다.
(2) 미생물의 동정
선택된 세균의 16S rRNA 염기서열 분석을 한 다음 이 결과를 NCBI의 BLAST와 비교한 결과, 각각 Bacillus amyloliquefaciens(99% 일치), Acinetobacter baumannii(99% 일치), Enterobacter hormaechei(99% 일치), Saccharomycopsis fibuligera(99% 일치), Raoultella ornithinolytica(99% 일치), Serratia marcescens(99% 일치)로 확인되었다.
본 발명자들은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)의 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 2월 6일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18541P를 부여받았다.
본 발명자들은 본 발명의 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)의 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 2월 6일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18542P를 부여받았다.
본 발명자들은 본 발명의 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei)의 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 2월 6일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18543P를 부여받았다.
본 발명자들은 본 발명의 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera)의 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 2월 6일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18544P를 부여받았다.
본 발명자들은 본 발명의 라오울텔라 오르니티놀리티카(Raoultella ornithinolytica)의 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 2월 6일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18545P를 부여받았다.
본 발명자들은 본 발명의 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)의 균주를 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 2월 6일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18546P를 부여받았다.
본 발명의 혼합균주는 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제 및 리파아제 효소활성을 가지며 음식물쓰레기 분해 활성이 우수하고, 성장 온도범위가 30℃이고, 염농도 5%까지 생육 가능한 음식물 쓰레기 처리용 균주이다.
상기 혼합균주는 생존온도가 10℃~50℃, 염분 25%이하, pH범위 3.0~11.0를 적용할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 내염성, 내열성, 효소 활성을 평가한다.
(3) 혼합균주의 내염성 평가
혼합균주의 내염성을 측정하기 위하여 염분의 농도를 달리한 배지에서의 균주의 성장을 확인하였다. Nutrient agar 배지 제조 시 NaCl을 0%, 3%, 5% 농도로 첨가하였다. 미리 액체배지에서 배양한 균주 배양액 10μl을 염분 농도를 달리한 배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. colony의 크기와 선명도를 기준으로 내염성을 확인한다.
도 1, [표 3] 및 [표 4]에 도시된 바와 같이, 위의 실험 방법으로 0%, 3%, 5%의 염도에서 혼합균주의 성장 가능성을 확인하였다. 우리나라 음식에 포함되는 염분 농도는 대체로 3% 이하로 그 이상의 농도에서 성장 가능하다면 음식물 쓰레기 분해 균주로 활용이 가능하다고 판단한다.
누룩에서 분리한 74균주 중 3%의 염도에서 63균주, 5%의 염도에서 58균주가 배양 가능하였다. 음식물 쓰레기에서 분리한 45균주 중 3%의 염도에서 모든 균주가 5%의 염도에서 41균주가 배양 가능하다.
(3) 혼합균주의 내열성 평가
분리된 균주의 내열성을 측정하기 위하여 30℃, 40℃, 50℃에서의 균주의 성장도를 확인한다. 미리 액체 배지에서 배양한 균주 배양액 10μl을 nutrient agar 배지에 접종한 후 각각의 온도에서 24시간 동안 배양한다. colony의 크기와 선명도를 기준으로 내열성을 확인한다.
도 2, [표 5] 및 [표 6]에 도시된 바와 같이, 위의 실험 방법으로 30℃, 40℃, 50℃의 온도에서 분리 균주의 성장 가능성을 확인하였다. 각각의 온도에서 분리 균주를 배양한 결과, 누룩에서 분리한 74균주 중 40℃에 58균주, 50℃에서 32균주가 배양 가능하다. 음식물 쓰레기에서 분리한 45균주 중 40℃에 40균주, 50℃에서 2균주가 배양 가능하다.
(4) 혼합균주의 효소 활성 평가
분리된 균주의 물질 분해능을 측정하기 위하여 amylase, cellulase, lipase, protease 활성을 조사한다.
본 발명은 효소 활성이 높은 균주를 선별하기 위해 paper disc 방법을 이용하며, 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질 성분이 포함된 고체 선별배지를 사용한다.
Amylase 활성 확인은 starch agar(0.3% beef extract, 1% soluble starch, 1.2% agar) 배지에 8 mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 20 ㎕씩 분주하여 30℃에서 24시간 배양한 뒤 lugol solution으로 염색하고 분해능을 억제환(clear zone)의 직경으로 조사한다.
Cellulase 활성 확인을 위하여 1% CMC가 포함된 nutrient agar 배지에 8 mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 20 ㎕씩 분주하여 30℃에서 24시간 배양 후, 0.1% congo red로 30분간 염색하고 1N NaCl로 세척한 뒤 나타난 억제환의 직경으로 조사한다.
Lipase 활성은 1% tween 80이 포함된 sierra lipolytic agar(1% peptone, 0.5% sodium chloride, 0.5% calcium chloride, 1.5% agar) 배지에 8 mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 20 ㎕씩 분주하여 30℃에서 24시간 배양하여 분해능을 억제환의 직경으로 조사한다.
Protease 활성은 1% skim milk를 첨가한 nutrient agar 배지에 8 mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 20 ㎕씩 분주하여 30℃에서 24시간 반응하여 분해능을 억제환의 직경으로 조사한다.
분리된 균주 중 효소 활성이 있는 균주를 선별하기 위해 paper disc 방법을 이용하였고, 배양 후 나타나는 disc 주위의 억제환 크기를 측정하여 20 mm 이하는 +, 20~30 mm는 ++, 30 mm 이상은 +++로 표시한다.
누룩에서 분리한 72균주 중 amylase 활성을 보이는 분리균주 4종, cellulase 활성을 보이는 분리균주 1종, lipase 활성을 보이는 분리균주 8종, protease 활성을 보이는 분리균주를 17종을 확보한다.
[표 7] 및 [표 8]에 도시된 바와 같이, 음식물 쓰레기에서 분리한 45균주 중에서는 amylase 활성을 보이는 분리균주 3종, cellulase 활성을 보이는 분리균주 2종, lipase 활성을 보이는 분리균주 3종, protease 활성을 보이는 분리균주가 8종으로 나타난다.
두 가지 이상의 효소 활성을 가지는 균주 JIF16003, JIF16016, JIF16026, JIF16040, JIF16045, JIF16209, JIF16238, JIF16241을 선발하였다.
(5) 선발 균주의 효소활성 재평가
누룩과 음식물 쓰레기에서 분리된 균주 중 두 가지 이상의 효소 활성을 가지는 균주 JIF16003, JIF16016, JIF16026, JIF16040, JIF16045, JIF16209, JIF16238, JIF16241을 선발하였다.
8균주를 5ml nutrient broth에서 계대 배양하고, 500ml nutrient broth에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 이용하여 이전과 같은 방법으로 효소활성을 조사하였다. 억제환의 크기는 이전 실험과 차이가 있었지만 대량배양 후에도 효소활성 특성이 변하지 않는 것을 볼 수 있다.
전술한 [표 9]에서 동정 균주명은 다음과 같다.
JIF16003은 Bacillus amyloliquefaciens, JIF16016은 Acinetobacter baumannii, JIF16026은 Enterobacter hormaechei, JIF16040은 Saccharomycopsis fibuligera, JIF16045은 Enterobacter hormaechei, JIF16209은 Raoultella ornithinolytica, JIF16238은 Serratia marcescens, JIF16241은 Raoultella ornithinolytica이다.
동정 결과, JIF16026, JIF16045와 같은 균주이며, JIF16209, JIF16241이 같은 균주이다.
Bacillus amyloliquefaciens는 제한요소 BamH1의 원천인 Bacillus속에 속한 균의 한 종으로 항생제 물질인 단백질 barnase를 합성한다.
단백질 barnase는 널리 연구된 RNA 가수분해 효소로 이것의 억제제인 barstar와 매우 단단한 복합체를 형성하고 Bacillus anthracis에 선택적으로 활성을 띠는 항생물질인 plantazolicin와도 복합체를 형성하는 특징을 가진다.
Acinetobacter baumannii는 면역계가 많이 약해진 사람에게 감염시키는 기회감염성 병원균일 수가 있고 병원에서 파생된 감염으로 점차 그 중요성이 높아지고 있다.
Species는 Enterobacter hormaechei, Family는 Enterobacteriaceae, Genus는 Enterobacter라 한다.
Enterobacter는 Enterobacteriaceae과에 속하는 균으로 보통 그람음성, 통성혐기성, 막대모양, 비 포자 형성 세균이다. 이 균의 몇몇 strain들은 병원성이고 면역력이 약해진 숙주에게 감염을 일으킨다.
Species는 Raoultella ornithinolytica, Family는 Enterobacteriaceae, Genus는 Raoultella라 한다.
Raoultella는 그람음성, oxidase 음성, 호기성, 비 운동성, 통성 혐기성 특징을 가진다.
Species는 Serratia marcescens, Genus는 Serratia라 한다.
Serratia는 Enterobacteriaceae과 그람음성, 통성혐기성, 막대모양 세균이다. 이 속의 가장 흔한 종인 S. marcescens는 일반적으로 병원균이고 병원 감염을 일으킨다. 그러나 희귀한 strain인 S.plymuthica, S. liquefaciens, S. rubidaea, and S. odoriferae는 감염을 통해서 질병을 발생시켜왔다. 이 속의 구성원들은 특징적으로 붉은 색소를 생산하고 prodigiosin을 생산한다. 그리고 이들의 세 가지 효소(DNase, lipase, and gelatinase)의 생산이라는 특이성에 의해 Enterobacteriaceae과의 다른 구성원들과 구별될 수 있다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18541P
수탁일자 : 20170206
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수탁번호 : KCTC18546P
수탁일자 : 20170206
이상에서 설명한 본 발명의 실시예는 장치 및/또는 방법을 통해서만 구현이 되는 것은 아니며, 본 발명의 실시예의 구성에 대응하는 기능을 실현하기 위한 프로그램, 그 프로그램이 기록된 기록 매체 등을 통해 구현될 수도 있으며, 이러한 구현은 앞서 설명한 실시예의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가라면 쉽게 구현할 수 있는 것이다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (3)
- 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)(기탁번호 KCTC18541P), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)(기탁번호 KCTC18542P), 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei)(기탁번호 KCTC18543P), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera)(기탁번호 KCTC18544P), 라오울텔라 오르니티놀리티카(Raoultella ornithinolytica)(기탁번호 KCTC18545P) 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(기탁번호 KCTC18546P)의 균주로 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제 및 리파아제 효소활성을 가지며 음식물쓰레기 분해 활성이 우수하고, 성장 온도범위가 30℃이고, 염농도 5%까지 생육 가능한 음식물 쓰레기 처리용 혼합균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 생존온도가 10℃~50℃, 염분 25%이하, pH범위 3.0~11.0인 것을 특징으로 하는 혼합균주. - 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)(기탁번호 KCTC18541P), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)(기탁번호 KCTC18542P), 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei)(기탁번호 KCTC18543P), 사카로마이콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera)(기탁번호 KCTC18544P), 라오울텔라 오르니티놀리티카(Raoultella ornithinolytica)(기탁번호 KCTC18545P) 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(기탁번호 KCTC18546P)의 혼합균주를 사용하여 음식물 쓰레기를 처리하는 방법.
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