CN117343871A - 一种鲍氏不动杆菌、酯化液及在黄水处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲍氏不动杆菌、酯化液及在黄水处理中的应用，涉及酿酒技术领域，该鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，命名为鲍氏不动杆菌D‑W，于2023年08月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M 20231418。本发明所述菌株具有较高的酯化力以及耐酸、乙醇的能力，具有应用于处理黄水的潜力。本发明菌株应用于黄水酯化体系中，能够高效地合成己酸乙酯并且一定程度上能降低乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量，达到了黄水资源化利用。本发明还提供了该鲍氏不动杆菌在黄水处理中的应用和酯化液以及处理黄水的方法。
Description
技术领域
本发明涉及酿酒技术领域，具体涉及一种鲍氏不动杆菌、酯化液及在黄水处理中的应用。
背景技术
浓香型白酒以其浓郁的香味和甘甜的口感，深受广大消费者的青睐，占据白酒市场份额的70％左右。在浓香型白酒中，酯类物质大约占芳香成分的60％，其中己酸乙酯占主体成分，是浓香型白酒的关键香气成分，其含量的高低会直接影响浓香型白酒的品质。酯类物质的合成主要是由酯化反应来实现的，它的本质就是酸和醇发生反应，然后脱水形成酯，而且这个过程需要酯化酶的参与才能完成。在传统的酿造发酵过程中，己酸乙酯生成的周期长，产量低，通常不能达到高品质浓香型白酒的要求。因此，如何提高己酸乙酯的含量是浓香型白酒生产的技术难题。
在浓香型白酒生产过程中产酯化酶的菌株主要包括霉菌、酵母和细菌，其中霉菌和酵母是白酒酿造过程中起到酯化作用的的主要菌株，而对于细菌报道相对较少，但其作用也不容忽视。因此，筛选出高产己酸乙酯的细菌菌株，对于提高浓香型白酒中己酸乙酯的含量具有重要的应用前景。
黄水是我国传统固体酿酒工艺的副产品，其主要成分为淀粉，还原糖，蛋白质，微生物和有机酸、醇、酯、醛等，具有高有机酸、高营养的特点，若未经处理直接将黄水排出，不仅对环境造成了污染，而且还造成了巨大的资源浪费。目前可采用微生物酶制剂与黄水制备成酯化液，再利用串蒸工艺增加酒体中香味物质的含量，提高白酒的品质。
因此，筛选出能够在黄水中实现高效率生产己酸乙酯的细菌菌株，并对黄浆废水进行治理，具有重要的理论和现实意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种鲍氏不动杆菌、酯化液及在黄水处理中的应用，该鲍氏不动杆菌D-W具有较高的酯化力以及耐酸、乙醇的能力。应用于黄水酯化体系中，能够高效地合成己酸乙酯并且一定程度上能降低乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量，达到了黄水资源化利用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，命名为鲍氏不动杆菌D-W，于2023年2023年08月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M20231418。
上述鲍氏不动杆菌在黄水处理中的应用。
上述鲍氏不动杆菌在产己酸乙酯中的应用。
一种酯化液，包括上述鲍氏不动杆菌的发酵曲粉、混合酸、乙醇和水；鲍氏不动杆菌的发酵曲粉、混合酸、乙醇和水质量体积比为4-6g：1-3mL：20-30mL：70-80mL。
进一步，混合酸包括己酸、乙酸、乳酸和丁酸，其体积比为1-3:1-3:1-3:1-3。
进一步，鲍氏不动杆菌的发酵曲粉通过以下方法制备得到：将鲍氏不动杆菌按4-6mL/20-40g的比例接种到基础发酵培养基中，在33-37℃温度下培养6-8d，干燥，得鲍氏不动杆菌的发酵曲粉。
进一步，基础发酵培养基包括以下组分：麸皮和蒸馏水，其质量体积比为20-40g：15-30mL。
上述酯化液的制备方法，包括以下步骤：
将鲍氏不动杆菌的发酵曲粉、混合酸、乙醇和水混合，在32-36℃温度下酯化4-6d。
一种处理黄水的方法，将黄水、乙醇、己酸和鲍氏不动杆菌的发酵曲粉混合，在33-37℃温度下恒温培养6-8d。
进一步，黄水、乙醇、己酸和鲍氏不动杆菌的发酵曲粉质量体积比为4-6g：85-90mL:10-15mL:1-3mL；且黄水pH值为4.5。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选出的高产己酸乙酯的菌株-鲍氏不动杆菌D-W，且首次报道该菌种具有合成己酸乙酯的能力；该菌所产的酯化酶能高效合成己酸乙酯，并且对于其他酯类的合成效率低，在混合酸酯化中专一性强。
2、还能将鲍氏不动杆菌D-W应用于处理黄水，在黄水中进行酯化得到酯化液，增加酯化液中己酸乙酯的含量，具有增香的潜力。
3、本发明不仅丰富了产己酸乙酯细菌的种类，还能够利用黄水产酯，达到了废物利用的目的。
附图说明
图1为筛选出的各菌株酶活测定结果；
图2为筛选出的各菌株酯化力测定结果；
图3为鲍氏不动杆菌的革兰氏染色图片；
图4为鲍氏不动杆菌的系统发育树；
图5为不同pH对鲍氏不动杆菌的影响；
图6为不同酒精浓度对鲍氏不动杆菌的影响；
图7为黄水色谱分析图；
图8为黄水酯化液酯化力测定结果；
图9为黄水酯化液色谱分析。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1鲍氏不动杆菌D-W的筛选
鲍氏不动杆菌的筛选过程包括菌株的初筛和复筛，具体过程如下：
(1)准确称取25g宜宾市某酒厂酿酒后的经过破碎的大曲、糟醅、丢糟，分别加入到含有250mL已灭菌的富集培养基的锥形瓶中，放入37℃恒温摇床(180rpm)富集培养24h；
(2)从大曲、糟醅、丢糟的富集液中分别取1mL上清液并加入9mL无菌生理盐水，摇匀，配置成10-1稀释液，再分别稀释成10-2-10-9的稀释液，各取100μL涂布于选择培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养24h；
(3)从选择培养基上挑选12株透明圈较大的菌株，在平板上划线分离至纯种，将筛选得到的菌株编号并保藏于50％的甘油管中，置-80℃冰箱中保存；
(4)将初筛获得的菌株进行活化，取50mL菌液(12000r/min，4℃)离心10min收集上清即为粗酶液；对粗酶液进行酶活测定，结果如图1所示。
由图1可知，经测定得到D-W、D-Y、D-2、D-H、Z-8、Z-2这六株菌的酶活较高。
(5)将D-W、D-Y、D-2、D-H、Z-8、Z-2这六株菌株进行活化，取5mL种子液接入基础发酵培养基中，30℃静置培养7d，将培养好的曲料放入40℃烘箱中烘干或者置于阳光下晒干，用研钵把干燥好的曲粉磨碎，保存备用；
(6)取1.5mL己酸，加入25mL乙醇，摇匀后，再加入纯水75mL，振荡摇匀，再分别加入D-W、D-Y、D-2、D-H、Z-8、Z-2这六株菌的发酵曲粉5g，振荡摇匀，用封口膜扎紧，放入35℃恒温箱保温酯化100h，制作出酯化液。
(7)具体操作方法见QB/T 4257-2011，根据以下公式计算样品酯化力：
式中，A-样品酯化力，mg/g·100h；c1-氢氧化钠标准浓度，mol/L；V1-加热回流时消耗氢氧化钠的体积，mL；c2-硫酸标准溶液浓度，mol/L；V2-滴定时消耗硫酸的体积，mL；m-绝干样品质量，g；50/100-从100mL中取50mL馏出液测定；144-己酸乙酯换算系数。
(8)酯化力测定结果如图2所示。
由图2可知，经测定得到D-W、Z-2、D-2菌株的酯化力最高。
综上所述，结合酶活和酯化力测定结果，发现菌株D-W的酶活最高可达到(16.79±0.03)U/mL：酯化力最高，为(45.37±0.33)mg/g·100h，显著高于其他所筛菌株，因此，可以初步确定D-W菌株为本研究的目的菌株。
其中，所述富集培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
选择培养基配方为：酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，三丁酸甘油酯0.4％，20g/L的琼脂，pH 7.0-7.2。
基础发酵培养基配方为：麸皮30g，蒸馏水30mL。
实施例2气相色谱检测实施例1筛选出的六株菌四大酯的合成能力
检测过程如下：
(1)酯化液制备：分别吸取0.375mL己酸、0.375mL乙酸、0.375mL乳酸以及0.375mL丁酸于250mL锥形瓶，加入25mL无水乙醇、75mL蒸馏水，充分混匀；再称取5g绝干样品加到锥形瓶中，摇匀后，用封口膜封住，置于35℃恒温培养箱保温酯化100h，同时做空白实验。
(2)根据QB/T 4257-2011进行蒸馏操作，得到馏出液。
(3)取940μL馏出液，再加60μL内标物进行GC分析。
(4)将酯化液进行气相色谱检测菌株产己酸乙酯的能力。
气相色谱条件：
DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；载气为氦气(99.999％)，恒定流量为1mL/min，进样方式为不分流，进样口温度250℃；升温程序：起始温度40℃保持3min，以5℃/min升温至230℃，保持7min。进样量：1μL。
气相色谱分析结果如表1所示。
表1六株菌的酯化液的气相色谱分析结果(mg/L)
| 菌株 | 乙酸乙酯 | 丁酸乙酯 | 己酸乙酯 | 乳酸乙酯 |
| 空白 | 424.23±0.06 | 196.45±0.06 | 133.13±0.07 | 73.53±0.07 |
| D-W | 81.63±0.12*** | 160.15±0.12*** | 778.18±0.13*** | 80.04±0.06*** |
| Z-8 | 96.30±0.10*** | 66.66±0.05*** | 54.41±0.06*** | —— |
| Z-2 | 74.16±0.11*** | 66.74±0.07*** | 82.01±0.08*** | —— |
| D-H | 69.73±0.04*** | 44.16±0.08*** | 11.54±0.08*** | —— |
| D-Y | 70.42±0.05*** | 45.84±0.06*** | 16.27±0.01*** | —— |
| D-2 | 72.83±0.05*** | 81.43±0.06*** | 295.07±0.04*** | 56.12±0.05*** |
注：**表示与空白组差异极其显著(P<0.001)
由表1可知，菌株D-W合成己酸乙酯能力最强，合成量高达(778.18±0.13)mg/L，其合成能力显著高于其他五株菌，且在混合酸酯化专一性强。因此，基本确定该菌株为本研究的目的菌株。
实施例3鲍氏不动杆菌的鉴定
鉴定过程如下：
(1)对菌株D-W进行形态学观察；菌株D-W在LB固体培养基上于37℃培养24h后，菌落表面光滑湿润，边缘整齐，微微凸起，菌落为乳白色的圆形小点。在光学显微镜下观察，多为球杆状。
(2)按照触酶实验步骤，挑取单菌，结果显示触酶实验阳性。
(3)按照革兰氏染色步骤，挑取经分离纯化后的单菌落，染色结果如图3所示。
由图3可知，菌株D-W为革兰氏阴性菌。
(4)对菌株D-W进行分子生物学鉴定；提取完菌株DNA后，进行PCR扩增：利用细菌通用引物(上游引物27F：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'和下游引物1492R：5'GGTTACCTTGTTACGACTT3')进行序列扩增，DNA琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果显示条带清晰完整。
(5)PCR产物经测序后，将测序结果在NCBI数据库中进行序列比对，菌株D-W与Acinetobacter baumannii ATCC 19606同源性为99％，利用MEGA 7中的“N-J比邻法”构建系统发育进化树，如图4所示。
由图4可知，菌株D-W与鲍曼不动杆菌有较高的亲缘关系。
综合菌株形态学观察和分子学鉴定等结果，可以得出菌株D-W被鉴定为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
实施例4鲍氏不动杆菌的菌株特性
检测过程如下：
(1)将斜面保藏的复筛菌株接种于LB液体培养基中，于37℃摇床活化培养24h(180rpm)；从种子液中取1mL菌液接种于另一瓶LB液体培养基中，37℃摇床(180rpm)培养2h左右，这时培养基中的OD600nm＝0.6-0.8。
(2)乙醇耐受性测定：在LB液体培养基的基础上，加入0％、1％-13％的无水乙醇，按10％的接种量接种于上述培养基中，于37℃摇床(180rpm)培养24h；以不接菌的相应培养基调零，在600nm波长处测吸光度，结果如图5所示。
由图5可知，可以看出菌株高可耐浓度为7％的酒精。
(3)耐酸性测定：在LB液体培养基的基础上，将培养基pH从1、2调至9，按10％的接种量接种于上述培养基中，于37℃摇床(180rpm)培养24h。以不接菌的相应培养基调零，在600nm波长处测吸光度，结果如图6所示。
由图6可知，可以看出菌株最低可在pH 4的培养基中生长。
结合上述菌株特性研究可以看出，本发明的鲍曼不动杆菌D-W具有较强的耐酸、耐乙醇的能力，具有应用于处理黄水的潜力。
实施例5
一种处理黄水的方法，包括以下步骤：
(1)黄水分析：取某酒厂正常发酵的新鲜黄水，静置一周后除去上层悬浮物及下层沉淀物，对经以上处理的黄水进行总酯、总酸、酒精度、pH的测定和气相色谱-质谱分析；总酯、总酸、酒精度、pH的测定结果见表2所示，气相色谱-质谱分析结果见表3和图7所示，
表2黄水常规分析表
表3黄水主要微量成分含量
| 物质 | 浓度(mg/L) |
| 草氨酸乙酯 | 16.47±0.04 |
| 乙酸乙酯 | 104.25±0.03 |
| 己酸乙酯 | 22.04±0.03 |
| 乳酸乙酯 | 930.58±0.12 |
| L-乳酸 | 23126.76±5.24 |
| 乙酸 | 4502.56±1.23 |
| 丁酸 | 1328.83±1.13 |
| 己酸 | 5525.86±2.34 |
| (R)-1,2-丙二醇 | 1333.57±1.02 |
| 甘油 | 15399.10±4.23 |
| 乙醇 | 22507.37±5.67 |
| 丙醇 | 71.29±0.07 |
| 正丁醇 | 112.24±0.12 |
| 正戊醇 | 16.29±0.02 |
| 丙酮醇 | 18.72±0.05 |
| 正己醇 | 71.98±0.11 |
| (2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇 | 491.47±0.32 |
| 2,3-丁二醇 | 440.51±0.27 |
| 丙二醇 | 2279.99±1.34 |
| 1,3-丙二醇 | 105.97±0.39 |
| 苯乙醇 | 129.89±0.26 |
| 1,6-脱水吡喃葡萄糖 | 20.87±0.08 |
| 二羟基顺丁烯二酸 | 19.66±0.03 |
由表2-3和图7可知，可以看出黄水中总酯、总酸含量很高，且主要含有的酯类物质为乳酸乙酯。
(2)酯化力测定
反应基础液配制：量取10mL乙醇于锥形瓶中，加入1mL己酸和90mL黄水(pH调至4.0)。在反应基础液中加入经处理的复筛菌株绝干样品5g，在35℃恒温培养箱中酯化7天后，对黄水酯化液进行酯化力测定及主要微量成分色谱分析。参照QB/T 4257-2011对酯化液进行操作，酯化力测定结果如图8所示。
由图8可知，鲍氏不动杆菌D-W菌株的酯化力较空白组有显著提高。
(3)GC-MS分析：取940μL馏出液，再加60μL内标物进行GC-MS分析。
气相色谱-质谱(GC-MS)条件：GC条件：DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；载气为氦气(99.999％)，恒定流量为1mL/min，进样方式为不分流，进样口温度250℃；升温程序：起始温度40℃保持3min，以5℃/min升温至230℃，保持7min。MS条件：离子源口温度250℃；升温程序：起始温度40℃保持3min，以5℃/min升温至230℃，保持7min，(EI)温度230℃，电子能量70eV；质量扫描范围m/z 35-350。进样量：1μL。
GC-MS结果见表4和图9。
表4酯化液中主要微量成分含量
由表4和图9可知，鲍氏不动杆菌D-W菌株具有高产己酸乙酯的能力，己酸乙酯从49.21mg/L增加至649.26mg/L。乳酸乙酯、丁酸乙酯也有不同程度的下降，说明鲍曼不动杆菌可能有“增己降乳”、“增己降乙”的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，其特征在于，命名为鲍氏不动杆菌D-W，于2023年08月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M 20231418。
2.权利要求1所述的鲍氏不动杆菌在黄水处理中的应用。
3.权利要求1所述的鲍氏不动杆菌在产己酸乙酯中的应用。
4.一种酯化液，其特征在于，包括权利要求1所述的鲍氏不动杆菌的发酵曲粉、混合酸、乙醇和水；所述鲍氏不动杆菌的发酵曲粉、混合酸、乙醇和水质量体积比为4-6g：1-3mL：20-30mL：70-80mL。
5.如权利要求4所述的酯化液，其特征在于，所述混合酸包括己酸、乙酸、乳酸和丁酸，其体积比为1-3:1-3:1-3:1-3。
6.如权利要求4所述的酯化液，其特征在于，所述鲍氏不动杆菌的发酵曲粉通过以下方法制备得到：将所述鲍氏不动杆菌按4-6mL/20-40g的比例接种到基础发酵培养基中，在33-37℃温度下培养6-8d，干燥，得鲍氏不动杆菌的发酵曲粉。
7.如权利要求6所述的酯化液，其特征在于，所述基础发酵培养基包括以下组分：麸皮和蒸馏水，其质量体积比为20-40g：15-30mL。
8.权利要求4-7任一项所述的酯化液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将鲍氏不动杆菌的发酵曲粉、混合酸、乙醇和水混合，在32-36℃温度下酯化4-6d。
9.一种处理黄水的方法，其特征在于，将黄水、乙醇、己酸和权利要求1所述的鲍氏不动杆菌的发酵曲粉混合，在33-37℃温度下恒温培养6-8d。
10.如权利要求9所述的处理黄水的方法，其特征在于，所述黄水、乙醇、己酸和鲍氏不动杆菌的发酵曲粉质量体积比为4-6g：85-90mL:10-15mL:1-3mL；且黄水pH值为4.5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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