CN117925427A - 一株产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株及其应用 - Google Patents

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刘建忠
季光明
胡芳
徐健
卢志超
程润喜
黄霜
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Abstract

本发明提供一株产β‑苯乙醇的毕赤酵母菌株及其应用，属于微生物发酵技术领域。该毕赤酵母菌株命名为J2，已于2023年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20232413。该毕赤酵母菌株J2能耐受酒糟环境，在酒糟中能快速生长并生产β‑苯乙醇，在酒糟中发酵后能提高酒糟的蛋白质含量，增加酒糟饲料的香味，提高酒糟饲料的适口性和营养价值。

Description

一株产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体而言，涉及一株产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株及其应用。
背景技术
酒糟是酿酒过程中产生的副产品，主要由酒精、酵母细胞、酒糟蛋白等组成。酒糟富含高蛋白、低脂肪、低糖、多种维生素和微量元素等营养成分，具有潜在的高附加值。在食品、饲料、生物制品等多个领域具有广泛的应用前景，酒糟的开发和利用有利于减少酿酒行业的废弃物排放，促进资源的循环利用和环保可持续发展。
β-苯乙醇，常温下为无色粘稠液体，具有清甜的玫瑰花香味，存在于苹果、杏仁、香蕉、桃子、梨子、草莓、可可、蜂蜜等天然食物中；溶于水和甘油，可混溶于醇、醚。其主要用以配置蜂蜜、面包、桃子和浆果类等食物的食用香精，广泛作为调配香皂和化妆品的香精。β-苯乙醇是一种酒类中常见的芳香化合物，其分子式为C8H10O，是构成豉香型白酒和米香型白酒独特风味的关键成分之一。
酒糟直接作为饲料使用，其含有的酒精可以使家畜安静地进行反刍，但是酒精含量高会使家畜出现中毒现象。而且酒糟中还含有谷物类纤维，例如稻壳，所占比例能达到湿重的20％，这些谷物纤维不易消化，会造成家畜有消化不良的反应。因此，酒糟需要发酵后才能作为饲料使用。但是，酒糟发酵生产的饲料有不良气味影响饲料适口性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株高产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株。该毕赤酵母菌株能耐受酒糟环境，在酒糟中能快速生长并生产β-苯乙醇，在酒糟中发酵后能提高酒糟的蛋白质含量，增加酒糟饲料的香味，提高酒糟饲料的适口性。
具体地，该毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)命名为J2，已于2023年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 20232413。
在优选的实施方案中，所述毕赤酵母菌株的18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明中提供的毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2能够用于制备成微生物制剂。该毕赤酵母菌株J2及包含其的微生物制剂均可用于制备β-苯乙醇的方法中，还可用于制备含有β-苯乙醇的酒糟饲料。
将毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2用于制备含有β-苯乙醇的酒糟饲料的方法包括以下步骤：
S1、在无菌条件下，挑取毕赤酵母菌株J2转接于活化培养基中，于20～35℃培养24～48h，得到活化培养液；
S2、在无菌条件下，将步骤S1中得到的活化培养液接种于种子培养基中，于20～35℃培养12～24h，得到毕赤酵母种子液；
S3、将水分含量为45wt％～50wt％的酒糟与酒糟发酵辅料混合，向得到的混合物中接种所述毕赤酵母种子液，于20～35℃下恒温发酵2～4天；发酵结束后，将发酵产物烘干至含水量为10wt％～11wt％，得到所述酒糟饲料。
在优选的实施方案中，步骤S1中所述活化培养基的主要成分为：每1000mL蒸馏水中包含1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH＝3.0～7.0。
在进一步优选的实施方案中，步骤S1中所述活化培养基的pH＝5.5～6.5。
在进一步优选的实施方案中，步骤S1中的培养温度为28～32℃。
在优选的实施方案中，步骤S2中所述种子培养基的主要成分为：每1000mL蒸馏水中包含1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH＝3.0～7.0。
在进一步优选的实施方案中，步骤S2中所述种子培养基的pH＝5.5～6.5。
在进一步优选的实施方案中，步骤S2中的培养温度为28～32℃。
在优选的实施方案中，步骤S3中所述酒糟发酵辅料的质量占所述酒糟的干基质量的5～10％，所述酒糟发酵辅料为麸皮、豆粕、膨化玉米粉、大豆蛋白中至少一种。
在优选的实施方案中，步骤S3中所述毕赤酵母种子液的接种量为0.2～0.3亿CFU/g酒糟干基。
在进一步优选的实施方案中，步骤S3中的培养温度为28～32℃。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的毕赤酵母菌株J2能耐受酒糟环境，在酒糟中能快速生长并生产β-苯乙醇。该毕赤酵母菌株J2在酒糟中发酵2天就能使酵母菌数量达到14.2×108CFU/g酒糟干基，在YPD液体培养基中发酵24h就能使β-苯乙醇的含量达到79.32mg/L，增加酒糟饲料的香味，提高酒糟饲料的适口性。此外，该毕赤酵母菌株J2在酒糟中发酵后还能提高酒糟饲料的蛋白质含量，与市售酿酒酵母相比，蛋白质含量提高15％以上，说明该菌株还能提高酒糟饲料的营养价值。
附图说明
图1为实施例1得到的毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2在YPD平板中的菌落形态；
图2为实施例1得到的毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2的细胞显微形态(10×40倍)；
图3为实施例1得到的毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2的进化树；
图4为实施例1得到的毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2在YPD液体培养基中发酵24h的气相色谱-质谱图。
生物保藏说明
毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2于2023年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为“中国湖北省武汉市武汉大学”，保藏编号为“CCTCC NO：M20232413”。
具体实施方式
以下内容结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域技术人员能够充分地理解本发明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分优选的实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下，对以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体条件的方法步骤，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1.1、从酒糟中分离出耐受酒糟环境的菌株
从路德环境科技股份有限公司酒糟堆场的酱香型酒糟中分离出能耐受酒糟环境的菌株，分离方法如下：
准确称取酒糟样品10g放至含玻璃珠的90mL无菌水中，置于恒温(30℃)摇床中30min，分散酒糟样品，用无菌水梯度稀释至10-1～10-4，每个浓度梯度取100μL涂布于YPD培养基平板中，每个浓度梯度涂布3个平板，30℃培养3d，每天挑取菌落至YPD平板纯化，镜检，挑选形态为酵母的菌株。YPD培养基组成为：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，蒸馏水1000mL，pH为6.0。
1.2、酵母菌株的培养特征
将步骤1.1中分离出来的酵母菌株接种至YPD固体培养基，在30℃培养2天，观察菌落形态。如图1所示，菌落呈乳白色，无光泽，菌体凸起，表面有褶皱。YPD固体培养基主要成分：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，蒸馏水1000mL，pH为6.0。
参照图2，在10×40倍显微镜下观察，该菌株呈圆形或椭球形，具有细胞核和未完全分离的芽体。
根据图1的菌落形态和图2的菌体形态，初步判断分离出的菌株为一种毕赤酵母菌。
1.3、菌株的鉴定
取少量步骤1.1中分离出的菌株的菌液，采用柱式法提取菌株的基因组DNA后，用PCR仪对该菌株的18S rDNA进行扩增，扩增片段长为300bp。采用克隆测序法，用3730XL测序仪进行测序，得到该菌株的18S rDNA保守序列(SEQ ID No.1)：acctgcggaaggatcattactgtgaattaacttccacacatgcgtgagcgcacaaaa cacataaaccgtgagtatttctagtcgaaacttgaaaaaaaaatacaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaagagcgcagcgaaatgcgatacctagtgtgaattgcagccatcgtgaatcatcgagttcttgaacgcacattgcgcccgtcggtattccggcgggcatgcctgtctgagcgtcgtttccttcttggaacttttgttaaagaaagatccagagctggccgtgccactggcccggccgaaaagaaacgttgcggacgaagcgaactacatcgggacgctttggccgccgagcgaaaatatatcattgagctcgacctcagatcaggtaggagtacccgctgaacttaagcatatc。在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)美国国立生物技术信息中心核酸数据库中对比，与Pichia manshuricastrain毕赤酵母的一致性达到99％以上，鉴定该菌株为毕赤酵母菌株(Pichiamanshurica)，并命名为J2。该毕赤酵母菌株J2的进化树如图3所示。
其中，PCR扩增的反应体系和条件如表1所示。
表1分离出的菌株的DNA进行PCR扩增时的反应体系和条件
表1中的正向引物(Primer F)的序列为：TCCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQ ID No.2)；反向引物的序列为：TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID No.3)。
实施例2
本实施例研究了毕赤酵母菌株J2的发酵培养代谢产物，具体步骤如下：
(1)、检测样品制备：在YPD固体培养基(主要成分与实施例1的步骤1.2中相同)上挑取一环(接种环直径为2mm)毕赤酵母菌株J2接种于100mL YPD液体发酵培养基(与实施例1的步骤1.1中YPD培养基成分相同)中，培养温度为30℃，摇床转速为180rpm，好氧培养24h，发酵结束后得到发酵菌液，以8000rpm速度离心5min，取上清液。
(2)、挥发性代谢产物检测：
挥发性代谢产物的测定采用液液微萃取-气质联用法。
液液微萃取：取200μL步骤(1)中得到的上清液，加入2mL二氯甲烷，使用涡旋振荡仪充分振荡，静置30min，待溶液分层。将上层发酵液吸出，然后加入过量无水硫酸钠，在-80℃冰箱放置4h除去水分。然后使用0.22μm有机滤膜过滤，每1mL发酵液中加入30μL523.2mg/L的乙酸戊酯内标溶液，装入进样瓶自动进样，检测结果如图4所示。
气相色谱(GC)条件：DB-Wax石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，初始柱温为45℃，保留1.5min，以6℃/min升温至85℃，保持0min，再以4℃/min升温至115℃，保持0min，再以3℃/min升温至190℃，保持0min，再以5℃/min升温至225℃，保持3min，进样口温度260℃，载气为氦气(He)(99.999％)，载气流量为10.7mL/min，分流进样，分流比为10:1，溶剂延迟5min。
质谱(MS)条件：离子源为电子电离源(electron ionization，EI)，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电子能量为70eV，发射电流为34.6μA，倍增器电压为1294V；接口温度为280℃，质量范围为50.00～600.00m/z，对采集到的质谱图根据化合物峰离子对照NEST数据库检索定性。
化合物检索结果与NIST标准谱库进行匹配，相似度达到60％以上确认为目标化合物。以未添加内标溶液的培养液为空白对照组，计算物质含量结果，见表2。
表2毕赤酵母菌株J2发酵液的GC-MS检测结果
序号 出峰时间(min) 名称 含量(mg/L)
1 1.845 2,3-环氧-4,4-二甲基戊烷 1.54
2 2.789 反1,2-二氯乙烯 6.22
3 6.107 异丁醇 7.62
4 7.585 正戊醚 1.44
5 8.588 异戊醇 41.19
6 9.585 正戊醇 4.70
7 9.680 苯乙烯 1.04
8 20.945 2-甲基己酸 0.52
9 25.640 己酸 3.27
10 27.212 β-苯乙醇 79.32
11 36.585 2,4-叔丁基苯酚 3.52
12 39.363 三丁酸甘油酯 16.46
13 43.577 八(乙二醇)-(十二烷基醚) 4.93
从表2中可以看出，实施例1中分离出的毕赤酵母菌株J2发酵所产生的β-苯乙醇含量为79.32mg/L。
实施例3
本实施例提供毕赤酵母菌株J2用于制备酒糟饲料的方法，并验证该菌株在酒糟中的发酵特性。
3.1、酒糟饲料的制备方法：
S1、在无菌条件下，在YPD固体培养基(主要成分与实施例1的步骤1.2中相同)上挑取一环(接种环直径为2mm)毕赤酵母菌株J2转接于无菌活化培养基(主要成分：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，蒸馏水1000mL，pH＝6.0，121℃高压蒸汽灭菌15分钟)，在30±2℃培养36±2h，即为活化培养液。
S2、在无菌条件下，将步骤S1中得到的活化培养基接种于无菌的种子培养基(主要成分：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，蒸馏水1000mL，pH＝6.0，121℃高压蒸汽灭菌15分钟)中，在恒温摇床30±2℃培养12h～24h，获得毕赤酵母种子液。
S3、酒糟饲料制备：将酱香型酒糟水分含量烘至45wt％～50wt％，称取700g酒糟于发酵盒中，加入占酒糟干基质量5％的酒糟发酵辅料(本实施例中为豆粕)，分别接种10mL步骤S2中获得的毕赤酵母种子液(酵母活菌数为6.0～10.0×108CFU/mL)和10mL市售酿酒酵母种子液(采购自安琪酵母股份有限公司，种子液中酵母活菌数为6.0～10.0×108CFU/mL)，在30℃恒温培养箱发酵3天。每天取样稀释涂布，计算发酵后酒糟中的酵母活菌数。发酵完成后，酒糟置于50℃～60℃通风烘干至水分含量10wt％～11wt％，得到酒糟饲料产品。
相同实验条件下做不接种菌种的实验，对比三者的营养性指标。酒糟发酵过程中的酵母活菌数如表3所示，酒糟饲料中的营养性指标检测结果如表4所示。表4中营养指标的检测方法参照GB/T 6435-2014《饲料中水分的测定》、GB/T 6432-2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》、GB/T6434-2006/ISO6865:2000《饲料中粗纤维的含量测定过滤法》、GB/T6438-2007/ISO5984:2002《饲料中粗灰分的测定》、GB/T6433-2006/ISO6492:1999《饲料中粗脂肪的测定》，以及实施例2的检测方法。
甘露聚糖检测参照Q/09211888-1·2-2022附录B，具体检测步骤如下：
P1、制作葡糖糖标准工作曲线
P1-1、称取0.1000g分析纯一水葡萄糖(105℃干燥至恒重)，溶于蒸馏水定容100mL，为1.0mg/mL葡萄糖溶液。
P1-2、分别取葡萄糖工作液0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL于5个50mL容量瓶，将不足2mL的分别补加蒸馏水至2mL，取另一50mL容量瓶加蒸馏水2.0mL作为空白对照。在6个容量瓶中分别加1.5mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)摇匀，沸水浴加热5min取出，立即冷却而后定容至刻度。用1cm比色皿在550nm处比色，以空白对照溶液调零点。作出吸光值为Y，葡萄糖质量(毫克数)为X的回归曲线，即为葡萄糖标准工作曲线。
P2、样品测定
P2-1、称取样品1.5000g，放于250mL烧杯，加85％乙醇50mL，于50℃恒温水浴保温30min并不断搅拌，过滤。再用85％乙醇提取3次，收集除去游离还原糖的残渣样品，105℃下保持30min蒸去残留乙醇。
P2-2、将步骤P2-1中处理好的样品用60mL蒸馏水洗入烧杯，以磁力搅拌器在室温下搅拌2h，溶胀过夜。第二天将处理液以漩涡震荡仪震荡5min后，转移于100mL容量瓶并定容。置于4000r/min下离心20min，取上清液15mL，即得到样品甘露聚糖提取液。
P2-3、分别准确移取1mL上清液于3个50mL比色管中，加入3mol/L硫酸0.5mL，摇匀，沸水浴中具塞密封水解1.5h，取出、冷却。准确加6mol/L氢氧化钠0.5mL，摇匀即得样品甘露聚糖水解液。加1.5mL DNS，摇匀，煮沸5min，取出冷却，定容至50mL。
P2-4、按照步骤P1中的葡萄糖标准工作曲线的制作步骤测定P2-3中的样品的甘露聚糖水解液的吸光值。平行测定三次，在葡萄糖标准工作曲线上找出3个样的平均吸光值所对应的X轴的值T。
P3、计算公式
式中：
ε＝0.9，ε为甘露糖和葡萄糖在甘露聚糖中的残基分子量与甘露聚糖水解后得到的甘露糖和葡萄糖的分子量之比；
T为甘露聚糖水解液比色法测定查葡萄糖标准工作曲线上对应的毫克数；
W为样品重，单位为mg。
表3酒糟发酵过程中的酵母活菌数
表4酒糟饲料的营养性指标检测结果
由表3可知，毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2能够更好的适应酒糟环境快速地生长，在酒糟发酵第二天，毕赤酵母菌数量达14.2×108CFU/g酒糟干基。
由表4可知，毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2能够提高酒糟饲料的蛋白质含量，增加酒糟饲料的营养；同时能提高具有清甜的玫瑰花香味的β-苯乙醇的含量，从而提高酒糟饲料的适口性。
综上所述，毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2在酒糟中能够快速稳定地生长，在酒糟中发酵2天时，毕赤酵母菌数量高达14.2×108CFU/g酒糟干基，说明本发明分离出的毕赤酵母菌株J2能够利用酒糟中的营养物质。该J2菌株在YPD液体培养基中发酵24小时后有明显的玫瑰花香味，气质图谱分析检测出β-苯乙醇含量为79.32mg/L(图4)，说明其具有产β-苯乙醇的能力。
实验发现，该毕赤酵母菌株(Pichia manshurica)J2在YPD液体培养基中于30℃下连续传代培养10代，产β-苯乙醇水平为77.32mg/L～82.32mg/L，且培养特征及形态特征均无明显变化；说明该菌株的生物学稳定性良好。实验还发现，该J2菌株的生长温度为20℃～35℃，最适生长温度为28℃～32℃；生长pH为3.0～7.0，最适生长pH为5.5～6.5。
需要说明的是，发明人在实验过程中已验证，步骤S3中酒糟发酵辅料除了可以是豆粕外，还可以是麸皮、膨化玉米粉、大豆蛋白中任意一种物质，或前述多种物质中至少两种按任意比例的组合物。酒糟发酵辅料的质量为酒糟干基质量的5～10％时，都能得到效果基本相同的酒糟饲料产品。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株命名为J2，已于2023年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20232413。
2.根据权利要求1所述的产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株的18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.包含权利要求1或2所述的产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株的微生物制剂。
4.权利要求1或2所述的产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株在制备β-苯乙醇中的应用。
5.权利要求1或2所述的产β-苯乙醇的毕赤酵母菌株在制备含β-苯乙醇的酒糟饲料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酒糟饲料的制备方法包括以下步骤：
S1、在无菌条件下，挑取毕赤酵母菌株J2转接于活化培养基中，于20～35℃培养24～48h，得到活化培养液；
S2、在无菌条件下，将步骤S1中得到的活化培养液接种于种子培养基中，于20～35℃培养12～24h，得到毕赤酵母种子液；
S3、将水分含量为45wt％～50wt％的酒糟与酒糟发酵辅料混合，向得到的混合物中接种所述毕赤酵母种子液，于20～35℃下恒温发酵2～4天；发酵结束后，将发酵产物烘干至含水量为10wt％～11wt％，得到所述酒糟饲料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤S1中所述活化培养基的主要成分为：每1000mL蒸馏水中包含1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH＝3.0～7.0。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤S2中所述种子培养基的主要成分为：每1000mL蒸馏水中包含1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，pH＝3.0～7.0。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤S3中所述酒糟发酵辅料的质量占所述酒糟的干基质量的5～10％；或/和所述酒糟发酵辅料为麸皮、豆粕、膨化玉米粉、大豆蛋白中至少一种。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤S3中所述毕赤酵母种子液的接种量为0.2～0.3亿CFU/g酒糟干基。
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