CN116536164A - 一株少根根霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株少根根霉菌及其应用，所述少根根霉菌保藏于广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62933，保藏日期为2022年12月12日。本发明提供了一株少根根霉菌MZW‑1025，利用MZW‑1025直接对虎杖进行发酵培养，大大提高了虎杖药材中虎杖苷转化白藜芦醇的转化率，实现白芦藜醇苷的高效转化，转化率高达96.99％以上，为以虎杖苷为底物转化为白藜芦醇的微生物转化方法提供一种新资源途径。

Description

一株少根根霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株少根根霉菌及其应用。
背景技术
白藜芦醇(Resveratrol)是一种非黄酮类多酚有机化合物，是许多植物在受到刺激时所产生的一种抗毒素。早在1924年被发现，又于1940年首次从毛叶藜芦(Veratrumgrandiflorum)的根中分离得到。白藜芦醇又称芪三酚，研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤作用、能降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化，对心脑血管具有很好的保护作用、对免疫系统的调节作用以及抗氧化、抗自由基作用。除此之外，还具有抗病毒、抗衰老、抗变态反应、保肝等作用。
人们对其自然资源进行了广泛的研究，至少在21个科、31个属的72种植物中发现了白藜芦醇。其主要来源于花生、葡萄、虎杖、桑葚等植物。但是，自然界生物中的白藜芦醇含量并不高，所以人们通过各种不同的方法进行转化得到。主要有化学合成法、生物合成法以及生物转化法，其中化学合成法步骤繁琐，而且严重污染环境，所以应用价值不高；生物合成法条件较温和，但所需的一些必需酶价格较贵，成本较高；而微生物转化法通过微生物细胞内的酶系和系统可将复杂的底物进行结构修饰和改造，具有转化专一性强、转化酶表达效率高、副反应少、条件温和、减少环境污染、缩短生产周期和减少合成步骤等优点，成为目前一个研究的热点。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一株少根根霉菌及其应用，所述菌株为少根根霉菌MZW-1025，可实现白芦藜醇苷的高效转化，转化率高达96.99％以上。
本发明还提出一种含有上述菌株的产品。
本发明还提出上述菌株或含有上述菌株的产品的应用。
本发明还提出了一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法。
在本发明的一个方面，提出了一株菌株，所述菌株为少根根霉菌(Rhizopusarrhizus)MZW-1025，保藏于广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62933，保藏日期为2022年12月12日。
在本发明的一些实施方式中，所述少根根霉菌MZW-1025分离自虎杖生长土壤中。
在本发明的一些实施方式中，所述菌株具有如SEQ ID NO：1所示的ITS序列。
在本发明的第二方面，提出了一种产品，包括(1)～(3)中至少的一种：
(1)上述菌株；
(2)含有上述菌株的菌剂；
(3)含有上述菌株的发酵产物。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为食品、药品或化妆品。
在本发明的第三方面，提出了上述少根根霉菌MZW-1025或上述产品的应用，所述应用为在制备白藜芦醇中的应用。
在本发明的第四方面，提出了一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法，所述方法包括以下步骤：将所述菌株加入虎杖进行发酵培养。
在本发明的一些实施方式中，所述菌株的接种量为5％-15％。
在本发明的一些实施方式中，所述虎杖的含量为30％-50％。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养采用的培养基为PDB液体培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养的条件为25-35℃，120-200rpm振荡培养3-7d。
在本发明的一些实施方式中，还包括将发酵培养得到的发酵产物进行灭菌的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述灭菌的方式采用高压蒸汽灭菌。
在本发明的一些实施方式中，所述高压蒸汽灭菌的条件为120-130℃，灭菌20-40min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤还包括将灭菌得到的产物进行干燥的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥为在60-100℃进行烘干。
在本发明的一些实施方式中，还包括将发酵培养得到的发酵产物采用体积浓度为90％～95％的乙醇进行超声提取的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述超声采用超声细胞破碎仪进行。
在本发明的一些实施方式中，所述超声的时间为20-35min。
根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提供了一株少根根霉菌MZW-1025，利用MZW-1025直接对虎杖进行发酵培养，大大提高了虎杖药材中虎杖苷转化白藜芦醇的转化率，实现白芦藜醇苷的高效转化，转化率高达96.99％以上，为以虎杖苷为底物转化为白藜芦醇的微生物转化方法提供一种新资源途径。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的MZW-1025菌株菌落形态图；
图2为本发明实施例1中的MZW-1025菌株菌落形态图；
图3为本发明实施例1中的镜检结果图；
图4为本发明实施例1中的MZW-1025在验证培养基上培养5d后转化产物液相色谱图；
图5为本发明实施例1中的MZW-1025在验证培养基上培养5d的结果图；
图6为本发明实施例2中的白藜芦醇含量测定结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1少根根霉菌MZW-1025菌株的获得
1、少根根霉菌MZW-1025菌株的分离
采用土壤平板法分离虎杖生长土壤中菌落：称取种植虎杖的土壤0.5-1.5mg，移入灭菌的培养皿中，涂平，然后倒入冷却至45℃左右的PDA培养基，摇匀后培养，或将土壤直接加在冷却后的初筛培养基(按照质量百分比加3％-15％虎杖粉(本实施例为8％)，余下比例加水，在高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min,进行一个粗提取，经过抽滤得到粗提产物滤液，滤液中含有一定比例的虎杖苷和白藜芦醇。以此滤液作为溶剂，加入1.2％-2％(本实施例为1.5％)的琼脂、2％-10％(本实施例为5％)的离子缓冲液(离子缓冲液的制备方法如下：依次加入KH2PO4 10g，MgSO4 5g，(NH4)2SO4 10g，加热溶解，定容至100mL备用)，得到初筛培养基。高压蒸汽灭菌121℃，20min备用)表面培养。标记土样来源、涂布量及日期，将其置于智能光照培养箱中，20-35℃(20-35℃均可，本实施例选用30℃)培养1-5天(均可，本实施例培养3天)，隔天就要观察，看初筛培养基上是否有菌落长出来。
采用点接法纯化菌：初筛培养基长出菌落后就要尽快挑出，用镊子挑取初筛培养基中长出的菌落，接种到PDA培养基中，经过多次接种，直至长出均一的单个菌落为止，初筛得到3株菌种。
目的菌复筛：将初筛得到的三株菌接种到复筛培养基(按照质量百分比加1％-15％(本实施例为5％)虎杖粉，2％-10％(本实施例为5％)的离子缓冲液，余下比例加水，得到复筛用的液体发酵培养基，高压蒸汽灭菌121℃，20min)中，25-35℃(均可，本实施例选用30℃)，120-200rpm/min(均可，本实施例选用160rpm/min)振荡培养3-7天(均可，本实施例培养5天)，发酵液高压蒸汽灭菌121℃灭20min，经过抽滤得到粗提产物滤液，滤液用95％乙醇醇沉(滤液与95％乙醇的添加质量比为1-2：1均可，本实施例为1:1)，8000r/min离心3min，通过高效液相色谱检测，观察发酵液中虎杖苷和白藜芦醇的含量变化，以相同处理方法不接种菌的培养物为空白对照，若色谱图中虎杖苷含量明显减少，白藜芦醇含量明显增加，则证明该菌对虎杖苷具有转化作用，筛选得到本申请方案的对虎杖苷转化得到白藜芦醇效率高的少根根霉菌MZW-1025菌株。
2、少根根霉菌MZW-1025菌株的鉴定
(1)培养特性、镜检及形态学特征
将分离得到的少根根霉菌MZW-1025菌株接种于PDA培养基上，25-30℃(本实施例选用30℃)下培养2-5(本实施例培养3天)后，菌落长满直径90mm的培养皿，该菌株菌落生长较快；絮状；菌落初为白色，老熟后灰黑色；菌落表面有大量细密的孢囊头。孢囊梗单生，囊梗顶端弯曲；孢子囊球形，表面有微刺；囊轴球形，表面光滑；孢囊孢子球形，有棱角及条纹。假根不发达，有时无假根。较多厚垣孢子，形状为球形、柱形。形态如图1-2所示，孢子的镜检形态如图3所示。
(2)ITS区序列鉴定
将纯化得到的菌种送至广州艾基生物技术有限公司进行测序鉴定，将测序得到的结果，于NCBI数据库上对得到的序列进行Blast序列分析，最后确定MZW-1025菌株为少根根霉菌，同源性分值为99.30％。
经过上述鉴定结果，确定MZW-1025菌株名称为少根根霉菌，其分类命名为少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)，该菌株已于2022年12月12日保藏于广东省科学院微生物研究所(简称:GDMCC，地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号为GDMCCNo：62933。
少根根霉菌MZW-1025菌株的ITS区序列如下所示：
GCGCCTTACCTTAGTTTCCTCTGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGCACCCTTCATAATAACCTAGAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAACACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCTATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAACCCACACATAACATTTGTTTATGTGGTAATGGGTCGCATCGCTGTTTTATTACAGTGAGCACCTAAATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAGGAATATTACGCTGGTCTCAGGATCTTTTTCTTTGGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAATCCAGCAACTTTCAACTATGATCTGAAGTCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGC(SEQ IDNO:1)。
3、少根根霉菌MZW-1025对白芦藜醇苷转化的验证实验
将菌株MZW-1025接种到验证培养基，以虎杖苷(0.1％-0.5％，本实施例为0.2％)作为唯一碳源，加入3％(2％-10％均可)无机盐缓冲盐缓冲液(无机盐缓冲盐缓冲液制备方法如下：依次加入KH2PO4 10g，MgSO4 5g，(NH4)2SO4 10g，加热溶解，定容至100mL备用)，25-35℃(均可，本实施例选用30℃)，120-200rpm/min(均可，本实施例选用160rpm/min)振荡培养3-7天(均可，本实施例培养5天)，发酵液高压蒸汽灭菌121℃灭20min，经过抽滤得到粗提产物滤液，滤液用95％乙醇醇沉，离心，通过高效液相色谱检测，检测结果的出峰图同图4一致，发酵液转化培养3天和5天如图5所示，5天时虎杖苷基本完全转化，转换率可达99％以上。
实施例2少根根霉菌MZW-1025对白芦藜醇苷转化能力的检测
1、发酵培养
用菌袋配制固态发酵培养基，按照质量百分比为40％(30％～50％均可)加虎杖粉，余下比例加水，得到发酵培养基，高压蒸汽灭菌121℃灭30min备用。待培养基冷却，将PDB液体培养的MZW-1025种子液按照接种量占培养基的10％(5％-15％均可)的接种量接种，智能光照培养箱中30℃(20-35℃均可)培养10天(7-15天均可)。目前发酵培养基规格为1-3kg，培养体积可增大，可使用发酵罐进行发酵培养，目前菌袋培养的优点在于，可定期翻动揉搓，增加菌与培养基接触，使其充分转化，得到发酵转换产物。
2、发酵转化产物处理
灭菌：待转化培养完成，将发酵转换产物高压蒸汽灭菌121℃灭30min。
烘干：经60-100℃烘箱烘焙，得到干燥转化虎杖粗粉。
粉碎：将烘干得到的转化虎杖粗粉进一步粉碎，装袋保存。
3、转化产物检测
样品预处理：称取步骤2得到的干燥转化虎杖粗粉，3倍(2-5倍均可)体积95％乙醇超声(采用细胞破碎仪超声)，工作时间：30min；间隔时间：5s，过滤得到转化粗提产物，稀释15倍(10-20倍均可)上样。
标准品处理：标准品处理：精密称取白藜芦醇标准品25mg，用95％乙醇超声溶解，并定容到50ml容量瓶，得到浓度为500ppm的标准液，以此用容量瓶稀释得到200ppm、100ppm、50ppm、10ppm系列梯度浓度对照品。虎杖苷标准品用相同方法处理，待上样。数据制成标准曲线。
检测条件：检测波长为306nm，柱温为25-35℃，流动相为10％甲醇水和乙腈，流速为0.8-1mL/min，进样量为15μL(10-20μL均可)，等度洗脱。
转化率＝(转化前虎杖苷含量-转化后虎杖苷含量)/转化前虎杖苷含量×100％。
检测结果如图6所示，从图中可以看出，菌株MZW-1025转化虎杖中的虎杖苷为白藜芦醇的转化率为96.99％以上。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一株菌株，所述菌株为少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)MZW-1025，保藏于广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62933，保藏日期为2022年12月12日。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有如SEQ ID NO：1所示的ITS序列。
3.一种产品，其特征在于，包括(1)～(3)中至少的一种：
(1)权利要求1所述的菌株；
(2)含有权利要求1所述的菌株的菌剂；
(3)含有权利要求1所述的菌株的发酵产物。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或化妆品。
5.权利要求1或2所述的菌株或权利要求3或4所述的产品在制备白藜芦醇中的应用。
6.一种从虎杖中提取白藜芦醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求1或2所述的菌株加入虎杖进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述菌株的接种量为5％-15％。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述虎杖的含量为30％-50％。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为25-35℃，120-200rpm振荡培养3-7d。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括将发酵培养得到的发酵产物采用体积浓度为90％～95％的乙醇进行超声提取的步骤。
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