CN109666594A - 一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，提供了一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法。经宏基因组高通量测序表明酿酒酵母和蒿草假丝酵母是山西老陈醋发酵过程中的优势酵母菌，从中筛选出一株高产醇的酿酒酵母CGMCC 15729和高产酯的蒿草假丝酵母CGMCC 16913，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。将其制备成的复配直投式发酵剂，强化应用在山西老陈醋生产中，得到的新淋醋中总酯含量为5.64g/100mL，总酸含量为5.74g/100mL，比对照组提高了90.54%、52.66%，还丰富了挥发性香气的谱图及含量。

Description

一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化 生产山西老陈醋的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法。
背景技术
传统山西老陈醋是以大曲为发酵剂，高粱为主要原料，经糖化、酒精发酵、醋酸发酵、熏醅、淋醋及陈酿等单元操作酿造而成。其中影响陈醋发酵最关键的是所采用大曲的质量，陈醋大曲中的各种霉菌、酵母菌、细菌经过长期自然适应、驯化，形成了一个彼此共存、顺序生长和代谢互补的稳定微生物群落。酵母菌是这个复杂稳定的微生物群落的关键菌种，直接影响山西老陈醋酒精发酵阶段的产酒率、原料利用率及最终成品醋的口感和风味。由于目前受制曲条件和贮存环境的影响，常常造成不同批次、不同贮存时间大曲质量的不稳定性，尤其酵母菌种类和数量的差异较大，从而影响老陈醋的产量与质量。因此一些山西老陈醋企业人为添加安琪酵母，用以提高老陈醋的生产效率。
近年来，一些研究学者开展了有关食醋优良酵母筛选工作。山西大学梁丽绒从老陈醋大曲中筛选出性状优良的土著酿酒、生香酵母菌功能菌株，构建了酿酒、生香酵母菌共培养体系，以3%的共培养物加入到传统山西老陈醋的酿酒过程中，主要生产指标较传统工艺有显著提高，其乙醇产量提高14%，糖醇转化率提高18.6%，乙酸乙酯的含量提高了1倍。周礼红从水果蔬菜的发酵醅中筛选出具有浓郁香蕉香味的酵母菌，将其应用于醋的发酵，发酵结束，醋味中带有愉悦的果香味。吕汶洋从鲜果发酵得到的新鲜葡萄酒中分离出一株酒精转化率高、耐酸能力强的巴氏毕赤酵母，将其应用于葡萄醋的生产，能克服现有葡萄醋生产过程中原料受季节影响限制的缺点，并可以缩短发酵周期，减少生产成本，得到高醋酸度，低酒精含量的优质葡萄醋，既保持了葡萄的营养成分，又具有醋的功效，整个酿造过程无需添加其他添加剂。
综上所述，目前关于食醋生产中强化的酵母菌种存在以下问题：（1）有的并非土著酵母菌，与传统食醋生产中固有的土著酵母菌的适应性、共生性、代谢机制不清楚；（2）不确定所采用的强化酵母菌株是否是传统食醋生产固有土著酵母中的优势菌株；（3）对所采用的强化酵母菌株的发酵、产醇、产香、耐受等具体特性并不十分了解；（4）强化的往往是单一酵母菌种，而研究表明混菌发酵才能达到更好的代谢互补，提高产醇、产香及对不良环境耐受的能力。
发明内容
本发明提供了一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法。
本发明的技术方案如下：一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，所述山西老陈醋优良土著酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保藏日期：2018年5月7日，保藏编号：CGMCC 15729；蒿草假丝酵母（Candida humilis）保藏日期：2018年12月10日，保藏编号：CGMCC 16913，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述土著高产醇酿酒酵母CGMCC 15729和产香蒿草假丝酵母CGMCC 16913的筛选方法为：采集山西老陈醋生产车间老陈醋酒精发酵第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，采用宏基因组高通量测序技术明确山西老陈醋发酵过程中优势酵母菌种类基础研究数据上，采用传统菌种分离手段，从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出的1株产醇高的酿酒酵母CGMCC 15729和1株产酯高的蒿草假丝酵母CGMCC 16913，产醇量分别为7.0%和5.1%，产酯量分别为6.33 g/100mL和10.70 g/100mL，并且这2株菌均可耐受pH=4的酸、45℃的高温、10%的初始酒精度和250g/L的初始糖度。
所述优良土著酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913的筛选方法具体步骤如下：
（1）采用宏基因组高通量测序技术明确酵母菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：分别采集某山西老陈醋生产车间老陈醋酒精发酵(AF)第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵(AAF)第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，进行宏基因组提取，真菌ITS1区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用PDA培养基对山西老陈醋发酵过程中酵母菌的数量变化进行了测定。结果显示酿酒酵母和蒿草假丝酵母均为山西老陈醋发酵过程中的优势酵母菌。
（2）优良土著高产醇和产香酵母菌的分离、筛选：对山西老陈醋发酵过程中所采的酒醪和醋醅样品中共分离出的100株酵母菌进行产醇、产酯能力、发酵性能及酒精度、酸、初始糖度、温度的耐受性的测定；并采用HPLC和GC-MS法对优良菌株的有机酸和挥发性香气成分的种类的含量进行了系统测定。最终筛选出的酵母菌421和酵母菌1608，产醇量分别为7.0%和5.1%，产酯量分别为6.33 g/100mL和10.70 g/100mL，并且这2株菌均可耐受pH=4的酸、45℃的高温、10%的初始酒精度和250g/L的初始糖度。
（3）优良酵母菌421和酵母菌1608的鉴定：对酵母菌421和酵母菌1608进行形态学和ITS测序鉴定，采用的引物为：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），经鉴定分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和蒿草假丝酵母（Candida humilis）。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为：CGMCC 15729、CGMCC 16913。
酿酒酵母CGMCC 15729和蒿草假丝酵母CGMCC 16913复配直投式发酵剂的具体制备方法为：将活化后的酿酒酵母CGMCC 15729和蒿草假丝酵母CGMCC 16913按3%的接种量分别接入PDA液体培养基中，30℃静置培养24h后，菌体浓度分别达108cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩上述菌株发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3v:v混合，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913干粉按质量比1:1混合即为复配直投式发酵剂，其活菌数为1010cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
将复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中的具体方法为：
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水进行润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的复配直投式发酵剂（1g复配直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，30℃活化30min后备用），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。
采用复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，得到的新淋醋中总酯含量为5.64g/100mL，总酸含量为5.74g/100mL，比对照组提高了90.54%、52.66%，挥发性香气的含量明显提高。
本发明主要是从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母，并将其制备成复配直投式发酵剂应用在传统食醋生产中，对于提高陈醋的营养生理功能和丰富风味具有重要意义。
附图说明
图1为采用宏基因组高通量测序技术测定山西老陈醋发酵过程中酵母菌属水平的动态变化；
图2为采用宏基因组高通量测序技术测定山西老陈醋发酵过程中酵母菌种水平的动态变化；
图3为山西老陈醋发酵过程中酵母菌数量的变化；
图4为筛选出的优良酵母菌421和酵母菌1608酒精、温度、高糖的耐受性；
图5为筛选出的优良酵母菌421和酵母菌1608不同种类有机酸的耐受性；
图6为优良酿酒酵母CGMCC 15729和蒿草假丝酵母CGMCC 16913的菌落形态和细胞形态图；图中A为酿酒酵母CGMCC 15729的菌落形态图；a为酿酒酵母CGMCC 15729在1000×下的细胞形态图；B为蒿草假丝酵母CGMCC 16913的菌落形态图；b为蒿草假丝酵母CGMCC 16913在1000×下的细胞形态图。
图7为优良酿酒酵母CGMCC 15729和蒿草假丝酵母CGMCC 16913的16SrDNA系统发育树图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：采用采用宏基因组高通量测序技术测定酵母菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：
分别采集某山西老陈醋生产车间老陈醋酒精发酵(AF)第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵(AAF)第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，进行宏基因组提取，真菌ITS1区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用PDA培养基对山西老陈醋发酵过程中酵母菌的数量变化进行了测定。
上述的宏基因组提取方法为：取3g样品置-20℃预冷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉状后移至2 mL离心管；加入2mL抽提缓冲液 (1g/100mL的CTAB、2g/100mL的PVPP、8.78g/100mL的NaCl、3.73g/100mL的EDTA-Na、1.21g/100mL的 Tris、0.1mol/L的磷酸缓冲液)，37℃，200r/min条件下充分混匀30min；加入200µL 10g/100mL的SDS，65℃水浴2h，12000r/min，低温离心15min，取上清，冷却至4℃；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(V/V/V=25:24:1)，12000r/min，低温离心20min，取上清，重复3-4次，直至中间蛋白层消失；加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(V/V=24:1)，12000r/min，低温离心15min，取上清；加入0.7倍体积的异丙醇，-20℃沉淀4h，12000r/min，低温离心 15min，取沉淀；用预冷的70%乙醇充分漂洗沉淀，置于室温待乙醇挥发完全后， 溶于80µLddH2O中；加入5µL 1mg/mL RNase A，37°C水浴20min。提取的DNA用微量紫外可见光分光光度计NanoDrop 2000进行检测， OD 260/280nm 值维持在1.8-2.0范围内，表明DNA质量合格，可送至深圳华大基因进行测序。
上述的真菌ITS1区DNA片段扩增所用的引物为：ITS1F ： 5’-CTTGGTCATTTAGAGG
AAGTAA-3’和 ITS1R ：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’，扩增片段长度为200bp。
高通量测序结果见图1，结果显示山西老陈醋整个发酵过程中，酿酒酵母属、假丝酵母属为主要的酵母菌属，在酒精发酵中分别占总酵母菌的37.95%和42.16%，在醋酸发酵中分别占总酵母菌的15.12%和24.57%，并且酿酒酵母属中最主要的是酿酒酵母（69%），假丝酵母属中最主要的是蒿草假丝酵母（84%）。另外，采用PDA培养基对山西老陈醋整个发酵过程中的酵母菌进行计数，结果显示，酵母菌总数在整个陈醋发酵过程中都保持在107 cfu/g以上，醋酸发酵末期减少至105 cfu/g，证明其是陈醋发酵过程中的主要细菌（见图2）。
上述采用的PDA固体培养基的制备方法为：马铃薯200 g，去皮切块，加蒸馏水1000mL，煮沸20 min后纱布过滤，滤液中加葡萄糖20.0 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氢钾2.0g ，硫酸镁1.0g，琼脂20.0g，补足蒸馏水至1000 mL，高压121℃灭菌20min。
实施例2：高产醇和高产酯酵母菌的筛选
（1）高产醇酵母菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离得到的100株酵母菌，采用蒸馏法进行产醇性能的测定。最终筛选出2株产醇性能高的酵母菌，其中酵母菌421产醇最高，为7.0%；其次是酵母菌1608的产醇量为5.1%。
菌株产醇性能的具体测定方法为：将活化后的酵母菌按2%的接种量接入高粱汁培养基中，于30℃静置培养，发酵第1天进行有氧发酵，便于酵母菌的繁殖，之后用8层纱布和保鲜膜包裹进行无氧发酵，将糖类转化为二氧化碳和酒精。通过观察液体培养基产气泡的情况，培养5天后，待糖度不再变化，取100mL样液于蒸馏瓶中，加入50mL蒸馏水，再加入数粒玻璃珠，蒸馏出100mL液体于量筒中，用擦干的酒精计读出示数，再查温度与浓度换算表，换算到20℃下的酒精度。
上述高粱汁培养基的制备方法为：将高粱200g粉碎至四至六瓣，加4倍的水润料4h后在温度为85‒90℃下糊化1h，期间不断搅拌，加入0.5g高温淀粉酶（70000U）于100℃蒸煮60min至不粘手无生心停火，冷却至室温过滤得滤液于121℃灭菌20min备用。
（2）高产酯酵母菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离得到的100株酵母菌，采用氢氧化钠皂化法进行产酯性能的测定。最终筛选出2株产酯性能高的酵母菌，其中酵母菌1608的产酯量最高，为10.70 g/100mL，酵母菌421产酯量为6.33 g/100mL。
菌株产酯性能的具体测定方法为：将活化后的酵母菌按2%的接种量接入高粱汁培养基中，于30℃静置培养，发酵第1天进行有氧发酵，便于酵母菌的繁殖，之后用8层纱布和保鲜膜包裹进行无氧发酵，将糖类转化为二氧化碳和酒精。吸取10mL发酵5d后的试样溶液量取90mL蒸馏水定容；吸取20mL样品稀释液置于200mL烧杯中，加入60mL蒸馏水，用0.05mol/L的NaOH标液滴定，以pH8.2为终点；将上述样液倒入250mL的锥形瓶中，再准确加入以0.1mol/L氢氧化钠标准溶液20mL，摇匀，装上冷凝管，于沸水浴上回流0.5 h，取下，冷却至室温。然后，用盐酸标准溶液进行反滴定，以pH8.2为终点，记录消耗盐酸标准溶液的体积，从而计算出总酯含量。
（3）高产醇酵母菌421和高产酯酵母菌1608的耐受性：对高产醇、高产酯的酵母菌421和酵母菌1608进行酒精度、酸、初始糖度、温度的耐受性测定，酵母菌421和酵母菌1608均可耐受45℃的高温、10%的初始酒精度、250g/L的初始糖度（见图3）和pH=4的酸（见图4）。
高产醇酵母菌421和高产酯酵母菌1608耐受性能的具体测定方法为：将活化的酵母菌按2%接种量分别接种到不同酒精浓度（10%，12%）、不同初始糖度（200g/L、250g/L）和不同pH梯度（3、4）有机酸（乳酸、醋酸、丁酸、己酸）的PDA液体培养基中，分别于（30℃、45℃）静置培养24h后，测OD 600nm 菌体浓度，比较菌株的耐受性。
（4）高产醇酵母菌421和高产酯酵母菌1608的发酵性能：对高产醇和高产酯的酵母菌421和酵母菌1608进行发酵性能的测定（采用蒸馏法测定其产醇量，氢氧化钠皂化法测定其产酯量，斐林法测定其含糖量）。酵母菌421的糖利用率为80%、乙醇得率为0.45g/g、乙醇生产速率为2.30g/L/h；酵母菌1608的糖利用率为79%、乙醇得率为0.39g/g、乙醇生产速率为2.19g/L/h（见表1）。
表1：优良酵母菌421和酵母菌1608的发酵性能测定结果
高产醇和高产酯酵母菌含糖量的具体测定方法为：将活化后的酵母菌按2%的接种量接入高粱汁培养基中，于30℃静置培养，发酵第1天进行有氧发酵，便于酵母菌的繁殖，之后用8层纱布和保鲜膜包裹进行无氧发酵，将糖类转化为二氧化碳和酒精。通过观察液体培养基产气泡的情况，培养5天后，待糖度不再变化，吸取斐林试剂甲、乙液，各5 mL，置入250 mL三角瓶中，准确加入1 mL样品稀释液，加20 mL蒸馏水，振荡均匀，溶液呈蓝色，将锥形瓶于电炉上加热使溶液在2 min内沸腾，沸腾30 s后，匀速用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，溶液呈浅黄色。记录共消耗0.1%标准葡萄糖溶液的毫升数，从而计算出含糖量。
（5）高产醇酵母菌421和高产酯酵母菌1608有机酸及挥发性香气成分的测定：将活化后的酵母菌按2%的接种量接入高粱汁培养基中，于30℃静置培养，发酵第1天进行有氧发酵，便于酵母菌的繁殖，之后用8层纱布和保鲜膜包裹进行无氧发酵，将糖类转化为二氧化碳和酒精。通过观察液体培养基产气泡的情况，培养5天后，待糖度不再变化，取菌株发酵液备用。采用HPLC法和GC-MS法分别对其进行有机酸和挥发性香气成分的测定。
上述HPLC和GC-MS的具体测定方法如下：
HPLC法测定有机酸含量：取上述培养5天的样品5g，用超纯水定容至50mL，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统UItimate3000；色谱柱C18 4.6×150mm，5μm；流动相20mmol/L NaH2PO4，pH=2.7；进样量20μL；流动速度0.8mL/min；检测器UV210nm；柱温：室温。
GC-MS法测定挥发性香气成分：采用顶空固相微萃取对上述培养5天的样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70eV，扫描质量范围41‒500amu。
酵母菌有机酸测定结果如表2所示，酵母菌421和酵母菌1608有机酸含量分别达到0.6097g/L和0.4568g/L，其中有机酸中的草酸含量最高，都达到0.18g/L以上（表2）。
表2：优良酵母菌421和酵母菌1608的有机酸测定结果
酵母菌挥发性香气成分测定结果如表3所示，酵母菌421共检测出43种挥发性香气成分（酯类12种、醇类11种、酸类1种、酮类4种、其他15种），其中酯类总含量为8.8984g/L、醇类总含量为7.8509g/L、酸类总含量为0.1329g/L、醛类总含量为0.0319g/L。酵母菌1608共检测出42种挥发性香气成分（酯类13种、醇类10种、酸类2种、酮类4种、醛类2类、其他11种），其中酯类总含量为3.8237g/L、醇类总含量为2.3623g/L、酸类总含量为0.3580g/L、醛类总含量为0.0327g/L。酵母菌421和酵母菌1608的酯类总含量均达到3.8g/L以上，其中乙酸乙酯含量最高。
表3：优良酵母菌421和酵母菌1608的挥发性香气成分的测定结果
实施例3：高产醇酵母菌421和高产酯酵母菌1608的鉴定、保藏
形态学鉴定：用接种环挑取目标菌株少许后在PDA平板培养基上进行划线，分离出单菌落，将培养基上生长的菌落拍照，进行记录，然后通过镜检，观察其细胞形态特征。目标菌株在PDA培养基上的菌落以及细胞形态见图5，酵母菌421在PDA培养基上的菌落呈规则圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，光滑，有光泽，表面隆起，菌落直径为1.5mm；光学显微镜下观察其细胞形态，细胞形态呈椭圆状。酵母菌1608在PDA培养基上的菌落呈规则圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，光滑，无光泽，表面不隆起，菌落直径为2.0mm；光学显微镜下观察其细胞形态，细胞形态呈椭圆状。
ITS测序：对酵母菌421和酵母菌1608进行ITS测序，引物为：5’-CTTGGTCATTTAG
AGGAAGTAA-3’和 ITS1R ：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’，采用BLAST软件经同源性比较，结果表明2株菌分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和蒿草假丝酵母（Candida humilis），并构建系统进化树，见图6。并将其保藏在普通工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 15729、CGMCC 16913。
实施例4：复配直投式发酵剂的制备
将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913按照3%的接种量分别接入到PDA液体培养基，30℃静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v），通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913干粉按质量比1:1混合即为复配直投式发酵剂。
上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，水分含量为≤5%。制备的酵母菌复配直投式发酵剂，活菌数为1010cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
实施例5：复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋酿造过程
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（pH、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度）（结果见表4），有机酸（结果见表5）及挥发性香气成分（结果见表6）。
实施例6：以实施例5为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入0.8%的复配直投式发酵剂（1g复配直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，30℃活化30min后备用），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐进行酒精发酵8‒10天。
采用复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酯、氨基氮等理化含量以及有机酸和挥发性香气含量。实施例6得到的新淋醋中总酯含量为5.64g/100mL，总酸含量为5.74g/100mL，比对照组提高了90.54%、52.66%（表4）；有机酸总含量由29.8663 g/L提高为35.1514 g/L（表5）；挥发性香气成分共检测出41种（酯类18种、醇类5种、酸类3种、醛类6种、酮类5种、酚类1种、其他3种），酯类总含量为5.57g/100mL、醇类总含量为1.04g/100mL、酸类总含量为4.62g/100mL、醛类总含量为17.31g/100mL；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.83g/100mL）、具有白兰地香气的辛酸乙酯（0.45g/100mL）、具有柔和甜润玫瑰香的苯乙醇（0.38g/100mL），他们构成了山西老陈醋的独特风味，使得陈醋酸不涩口，酸绵幽香（表6）。
表4：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中理化指标的测定结果
表5：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中有机酸的测定结果
表6：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中挥发性香气成分的测定结果
上述山西老陈醋的pH测定用pH计直接测定；山西老陈醋的总酸参照GBT 5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的还原糖、总酯参照GBT19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照GB 18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照GBT5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。

Claims (9)

1.一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：所述土著高产醇酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保藏日期：2018年5月7日，保藏编号：CGMCC 15729；蒿草假丝酵母（Candida humilis），保藏日期：2018年12月10日，保藏编号：CGMCC 16913，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：所述土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母的筛选方法为：采集山西老陈醋生产车间老陈醋酒精发酵第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，采用宏基因组高通量测序技术明确山西老陈醋发酵过程中优势酵母菌种类基础研究数据上，采用传统菌种分离手段，从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出的1株产醇高的酿酒酵母CGMCC 15729和1株产酯高的蒿草假丝酵母CGMCC 16913，产醇量分别为7.0%和5.1%，产酯量分别为6.33 g/100mL和10.70 g/100mL，并且这2株菌均可耐受pH=4的酸、45℃的高温、10%的初始酒精度和250g/L的初始糖度。
3.根据权利要求2所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）采用宏基因组高通量测序技术明确酵母菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：分别采集山西老陈醋生产车间老陈醋酒精发酵第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，进行宏基因组提取，真菌ITS1区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用PDA培养基对山西老陈醋发酵过程中酵母菌的数量变化进行了测定；
（2）优良酵母菌的分离、筛选：对山西老陈醋发酵过程中所采的酒醪和醋醅样品中共分离出的100株酵母菌进行产醇、产酯能力、发酵性能的测定；并采用HPLC和GC-MS法对优良菌株的有机酸和挥发性香气成分的种类的含量进行了系统测定，以及进行酒精度、酸、初始糖度、温度的耐受性进行测定；
（3）优良酵母菌的鉴定：对优良目标菌株进行形态学和ITS测序鉴定，采用的引物为：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，经鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和蒿草假丝酵母（Candida humilis）。
4.根据权利要求1所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：所述土著高产醇酿酒酵母CGMCC 15729和蒿草假丝酵母CGMCC 16913制备成复配直投式发酵剂应用在山西老陈醋的生产中。
5.根据权利要求4所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：所述复配直投式发酵剂的具体制备方法为：将活化后的酿酒酵母CGMCC 15729和蒿草假丝酵母CGMCC 16913按3%的接种量分别接入PDA液体
培养基中，30℃静置培养24h后，菌体浓度分别达108cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩上述菌株发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3v:v混合，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将酿酒酵母CGMCC 15729、蒿草假丝酵母CGMCC 16913干粉按质量比1:1混合即为复配直投式发酵剂，其活菌数为1010cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
6.根据权利要求5所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：所制备的复配直投式发酵剂在山西老陈醋强化生产的具体应用方法为：
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水进行润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，再加入高粱重量0.8%的已经活化处理好的复配直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋。
7.根据权利要求6所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：新淋醋中总酯含量为5.64g/100mL，总酸含量为5.74g/100mL，比对照组提高了90.54%、52.66%，挥发性香气的含量明显提高。
8.根据权利要求6所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。
9.根据权利要求5所述的一种利用优良土著高产醇酿酒酵母和产香蒿草假丝酵母强化生产山西老陈醋的方法，其特征在于：所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
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