CN118109323A - 一种异常威克汉姆酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种异常威克汉姆酵母及其应用，该异常威克汉姆酵母是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.29212的异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU‑D1‑61。通过实验验证，本发明异常威克汉姆酵母菌相对前期发现的异常威克汉姆酵母菌产酒能力高、产酯能力高，发酵力高、糖化力高、液化力高。本发明异常威克汉姆酵母在白酒大曲发酵中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种异常威克汉姆酵母及其应用。
背景技术
生香酵母指在生长、繁殖过程中能产生芳香气味物质的酵母。异常威克汉姆酵母属于生香酵母中的一种，其在发酵食品中应用广泛，例如在白酒发酵产品的生产中，异常威克汉姆酵母对产品形成其独特的风味起着至关重要的作用。
大曲总酯量越高，酒香气越浓郁，白酒风味越好；大曲的发酵力越高、其发酵快速快；大曲的糖化力越高，可溶性淀粉生成葡萄糖能力越强，大曲液化力越高，生成的酒气就越足，出酒的质地才越丰厚。
目前异常威克汉姆酵母的发酵力、糖化力和液化力均有待提升，亟需找到一种发酵力、糖化力和液化力高、产酯能力高的异常威克汉姆酵母植株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异常威克汉姆酵母及其应用。
本发明提供了一种异常威克汉姆酵母，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.29212的异常威克汉姆酵母Wickerhamomycesanomalus SAU-D1-61。
本发明异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-D1-61，于2023年12月5日保藏在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.29212。
本发明还提供了一种异常威克汉姆酵母在白酒大曲发酵中的应用，所述异常威克汉姆酵母是保藏号为CGMCC No.29212异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-D1-61。
本发明还提供了一种酿酒的方法，包括如下步骤：
将原料小麦与异常威克汉姆酵母菌悬液，混合，发酵即可，异常威克汉姆酵母菌悬液与小麦重量比为30-50：50-70，
其中，所述异常威克汉姆酵母是保藏号为CGMCC No.29212异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-D1-61。
进一步地，异常威克汉姆酵母菌悬液与小麦重量比38:62。
进一步地，所述异常威克汉姆酵母菌悬液浓度不低于103CFU/mL。
进一步地，所述异常威克汉姆酵母菌悬液浓度为104～107CFU/mL，优选为104CFU/mL。
进一步地，所述异常威克汉姆酵母菌悬液按照如下方法制备：取异常威克汉姆酵母，用水混匀，即可。
进一步地，步骤(1)所述原料小麦为粉碎小麦，粉碎小麦粒径小于0.850毫米。
步骤步骤(2)中发酵条件为38-50℃相对湿度90-99％孵育4-6天后，55～60℃相对湿度90-99％孵育8-12天后，45～50℃相对湿度70-80％孵育8-12天70-80％，25±5℃孵育8-12天。
进一步地，步骤(2)发酵条件为为42℃相对湿度90-99％孵育5天后，55～60℃相对湿度90-99％孵育10天，45～50℃相对湿度70-80％孵育10天后，25±3℃孵育10天。
实验结果表明，本发明提供了一种新的异常威克汉姆酵母菌菌株，通过实验验证，本发明异常威克汉姆酵母菌相对前期发现的异常威克汉姆酵母菌产酒能力高、产酯能力高，发酵力高、糖化力高、液化力高。本发明异常威克汉姆酵母菌是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.29212的异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-D1-6。本发明异常威克汉姆酵母SAU-D1-61在白酒大曲发酵中具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为SAU-D1-61菌株的单菌落形态
图2为SAU-D1-61菌株的显微形态
图3的SAU-D1-61菌株的系统发育树。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
PDB液体培养基：马铃薯浸出粉6.0g、葡萄糖20.0g，pH自然，溶解于1000mL蒸馏水，121℃灭菌20min；
豆芽汁培养基：10％豆芽汁、0.5％葡萄糖、蒸馏水调配，自然pH，如需固体培养基，再添加2％琼脂，121℃灭菌15min。
YEPD液体培养基：：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，自然pH，然后121℃条件下灭菌20min；
YPD固体培养基：在液体培养基基础上添加2％的琼脂粉；生理盐水配置：0.85％的NaCl。
20Brix高粱培养基：取150g高粱粉于2L烧杯中，加入少量自来水，搅成糊状，再加热水600mL，搅匀，调pH值为加入α-淀粉酶和糖化酶经液化和糖化后取上清液将其糖度调到20°Bx备用
实施例1、本发明异常威克汉姆酵母的分离及鉴定
一、实验方法
(一)分离
(1)酵母的分离纯化
称取10g醋醅样品加入到装有90mL经灭菌处理的0.85％浓度的氯化钠溶液的三角瓶中，28℃恒温震荡培养30min，再10倍梯度依次稀释制得10-2-10-7稀释液，分别吸取不同梯度样品稀释液100uL涂布于无菌培养基上，各稀释度做3个平行，静止30min后将其置于28℃的恒温培养箱倒置培养24h～36h左右(待霉菌菌落比较小时，便于挑取疑似酵母菌单菌落)。挑取典型(比细菌大而厚，湿润，表面光滑，多数不透明，黏稠，菌落颜色多数呈乳白色)酵母菌菌落接入PDB液体培养基中，重复进行3-4次划线分离、纯化，得到酵母菌纯培养物，并对酵母菌纯培养物进行PDB固体培养基保藏及甘油保藏。
(2)酵母菌产酯及发酵能力筛选
①酵母菌初筛：
采用接种环勾取保存于斜面培养基的酵母菌，接种于装有5mL豆芽汁培养基中，混合均匀够，将试管置于28℃的环境下培养72小时。培养完成后，通过嗅闻法初步判断是否产生了酯香味，并淘汰不产香或产香能力弱的菌株。
以基础豆芽汁培养基作为溶剂，配制不同浓度的乙酸乙酯溶液作为阳性参照：0μg/L(无香)、5μg/L(微香)、50μg/L(较香)和100μg/L(香气浓郁)。我们将这些参照结果分别以“-”(无香)、“+”(微香)、“++”(较香)和“+++”(香气浓郁)表示。每种菌都进行了3次平行实验以增加数据的准确性。
实验结果如表1所示：
表1嗅闻初筛结果
②生香酵母菌产酯能力复筛：
在初筛结果的基础上，选取产香能力较强的菌株即嗅闻结果为“++”(较香)和“+++”(香气浓郁)的酵母菌为备选菌株，在28℃下培养酵母菌至菌体密度达到108CFU/mL后在8000r/min的转速下离心10分钟，收集菌体。用无菌生理盐水反复洗涤2～3次后，加入等体积无菌生理盐水重悬菌体。以3％接种量接种于豆芽汁培养基，28℃培养72h后采用室温避光皂化24h法测定发酵液总酯含量(室温避光皂化24h法”是指参照《GB/T19777-2013地理标志产品山西老陈醋》规定的方法)。
实验结果如表2所示：
表2总酯结果
| 菌株编号 | 总酯(g/L) |
| SAU-D1-61 | 2.78 |
| D1-Y15 | 2.12 |
③生香酵母菌产酒能力复筛：
筛选到具有高产酯酵母菌，对其进行发酵能力测定。采用杜氏管产气法初步研究各菌株发酵性能，具体方法如下：将分离所得菌株用YEPD液体培养基活化，以3％的接种量接种于10mL YEPD液体培养基试管中，试管底部装有杜氏管(确保杜氏管内无气泡)，置于28℃恒温培养，每隔12h观察产气情况；
通过发酵高粱汁发酵培养基对起酵快且产气性能好的菌株进一步研究，具体方法如下：从斜面挑取菌株于环岛PDB液体培养基28℃培养48h，获得种子液，以3％的接种量接入装有150ml 20 Brix高粱培养基的发酵栓中，28℃环境下发酵5d，每天称重至发酵结束，测定发酵液酒精度。
酒精度测定方法：按照《GB5009.225-2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》。结果表明菌株SAU-D1-61产气量大于D1-Y15，且发酵终点酒精度达到5％vol，产酒能力强。
实验结果如表3所示
表3产酒能力
| 编号 | 酒精度(％，V/V) |
| SAU-D1-61 | 5.00 |
| D1-Y15 | 4.22 |
综合初筛的检测指标-高产酯、高发酵性能，选择菌株SAU-D1-61为后续功能菌进行鉴定。
(二)菌株鉴定
①形态鉴定：
将筛选所得菌株划线于PDA培养基上，28℃培养72h观察并记录其菌落形态特征；在载玻片中央滴加1滴无菌生理盐水，然后用无菌接种环挑取一环酵母菌单菌落于生理盐水混合均匀，使其分散成云雾状薄层，另取以清洁盖玻片，将一边与菌液接触，以45°角缓慢覆盖菌液(避免留有气泡而影响观察)。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察酵母菌的形态、大小及出芽情况。
高倍镜观察酵母菌的形态、大小及出芽情况结果如图2所示，菌落呈圆形，边缘规整，表面光滑而湿润，黏稠，不透明，白色。
②分子鉴定：
挑取新鲜酵母菌纯培养物于50μL Lysis Buffer A中，95℃加热裂解30min，取上清液作为PCR反应体系的模板，以ITS1(SEQ ID NO.1)：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4(SEQ ID NO.2)：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’为引物，进行PCR扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物浓度符合测序要求后，将得到的PCR产物送至擎科生物技术有限公司测序。将序列与NCBI中已有的ITS序列进行相似性比较分析。选取与供试菌株相似度高的序列，构建系统进化树，直观反映菌株间的亲缘关系。运用MEGA 5.0构建系统发育树。结果如图3所示，菌株SAU-D1-61与异常威克汉姆酵母碱基对同源性99.33％，结合形态学特征，将菌株SAU-D1-61鉴定为异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus，菌株SAU-D1-61已于2023年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No.29212。
以下通过实验例证明本发明菌株SAU-D1-61的有益效果。
实验例1菌株SAU-D1-61实验室模拟大曲发酵。
取菌悬液(保藏号为CGMCC No.29212的异常威克汉姆酵母Wickerhamomycesanomalus SAU-D1-61，菌液浓度为106CFU/mL)，加入无菌水中混匀，形成菌悬液(异常威克汉姆酵母菌SAU-D1-61的菌液浓度为104CFU/mL)；在菌悬液中加入粉碎后的小麦(能通过20目孔筛)，菌悬液与小麦二者的重量比为38:62，混合，压成一个长方体曲块(每块重约4.5kg)，以不接种为对照组；随后，将曲块培养35天，具体培养环境为：42℃相对湿度90-99％孵育5天后，55～60℃相对湿度90-99％孵育10天后，45～50℃相对湿度70-80％孵育10天后，室温(25±3℃)孵育10天。
最终长方体曲块水分10％-14％，均匀取样检测总酯含量，并参考QB/T4257—2011《大曲通用分析方法》检测SAU-D1-61的发酵力、糖化力、液化力。
经测定SAU-D1-61强化的试验组白酒大曲总酯含量为1972μg/kg，而对照组总酯含量为1731μg/kg，且实验组大曲发酵力、糖化力和液化力分别为2.32g/(g·72h)、498mg/(g·h)、1.15g/(g·h)，比对照组分别增加了160％、3.8％和5.9％。
实验结果表明菌株SAU-D1-61显著提高了白酒大曲的酯类物质含量，同时提高了大曲的发酵力、糖化力和液化力。结果表明异常威克汉姆酵母SAU-D1-61在白酒大曲发酵中具有良好的应用前景。
实验结果表明，本发明提供了一种新的异常威克汉姆酵母菌菌株，通过实验验证，本发明异常威克汉姆酵母菌相对前期发现的异常威克汉姆酵母菌产酒能力高、产酯能力高，发酵力高、糖化力高、液化力高。本发明异常威克汉姆酵母菌是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.29212的异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-D1-6。本发明异常威克汉姆酵母SAU-D1-61在白酒大曲发酵中具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种异常威克汉姆酵母，其特征在于：它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.29212的异常威克汉姆酵母Wickerhamomycesanomalus SAU-D1-61。
2.异常威克汉姆酵母在白酒大曲发酵中的应用，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母是保藏号为CGMCC No.29212异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-D1-61。
3.一种酿酒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将原料小麦与异常威克汉姆酵母菌悬液，混合，发酵即可，异常威克汉姆酵母菌悬液与小麦重量比为30-50：50-70，
其中，所述异常威克汉姆酵母是保藏号为CGMCC No.29212异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-D1-61。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：异常威克汉姆酵母菌悬液与小麦重量比38:62。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌悬液浓度不低于103CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌悬液浓度为104～107CFU/mL，优选为104CFU/mL。
7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母菌悬液按照如下方法制备：取异常威克汉姆酵母，用水混匀，即可。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述原料小麦为粉碎小麦，粉碎小麦粒径小于0.850毫米。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(2)中发酵条件为38-50℃相对湿度90-99％孵育4-6天后，55～60℃相对湿度90-99％孵育8-12天后，45～50℃相对湿度70-80％孵育8-12天70-80％，25±5℃孵育8-12天。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(2)发酵条件为为42℃相对湿度90-99％孵育5天后，55～60℃相对湿度90-99％孵育10天，45～50℃相对湿度70-80％孵育10天后，25±3℃孵育10天。
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