CN111647536B

CN111647536B - 一种耐高温辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法

Info

Publication number: CN111647536B
Application number: CN202010562763.0A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 刘奇; 周海岩; 邹树平; 柯霞; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111647536A

Abstract

本发明公开了一种耐高温辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法。所述耐高温辣椒素降解菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，株号ZJB19163，保藏号为CCTCC NO：M 2020014。本发明保藏号为CCTCC NO：M 2020014的耐高温辣椒素降解菌：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，能够以辣椒素为唯一碳源进行繁殖，能够快速、高效降解辣椒素，降解率能够达到100％，同时该降解菌还能高效降解淀粉和蛋白质；并且，本发明菌株能够耐受较高的温度，可以用于高温处理。

Description

一种耐高温辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种耐高温辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法。

背景技术

餐厨垃圾的传统处理方式一般采用堆肥、填埋、焚烧、固体饲料、粉碎直排等方式，这些处理方式都会对资源、环境造成不同程度的恶劣影响。像堆肥，会占有大量的土地面积，处理周期也较长，并且在堆肥过程中产生的污水、臭水会对周边的环境造成污染，还有长期堆肥会造成土壤的盐碱化；粉碎直排，会污染地下水，造成河水发臭，滋生出细菌、病菌，会造成疾病传播，而且一些油垢会造成管道堵塞，影响人们的正常生活。

好氧降解是在有氧的条件下，利用好氧微生物(主要是好氧细菌)将餐厨垃圾中大分子的有机物分解为小分子物质。在降解过程中，餐厨垃圾中的可溶性有机质透过微生物的细胞壁和细胞膜为微生物所吸收；固体的和胶体的有机物先附着在微生物体外，由生物所分泌的胞外酶分解为可溶性物质，再渗入细胞。微生物通过自身的生命活动——氧化还原和生物合成过程，把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物，并放出生物生长活动所需要的能量，把另一部分有机物转化合成新的细胞物质，使微生物生长繁殖，产生更多的生物体继续产生一系列的生化作用。

高温好氧消化技术，是一种在高温条件下(45℃～65℃)下运行的生物好氧降解技术，它具有相当快的生物降解速度，低细胞产率(产污泥量少)及灭菌的效率较高。且经微生物分解后的残渣是高效的有机生物肥料。高温处理可以加快水分蒸发，减少杂菌污染产生臭气。

辣椒是一种广泛使用的调味剂，其中辣椒素作为其主要活性成分可用做食品添加剂、药品等。辣椒中含有较多的辣椒素类物质，估计有80％～95％的天然辣椒素存在于辣椒中。它们包含4种主要的类似物：辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高二氢辣椒素。其中辣椒素和二氢辣椒素在辣椒素类物质中含量超过91％。

研究表明，辣椒素具有较强的抗菌能力，国内外对辣椒素作为抑菌剂的抑菌种类和抑菌效果进行了广泛的研究；结果表明，辣椒素对大多的微生物都具有抑制作用，如：大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、酵母等，但对霉菌基本没有效果；最低抑菌浓度MIC为30-150μg/L。

辣椒素的酶水解物也引起了人们的极大兴趣，因为它可用于辣椒的还原辛辣或天然风味的生产。辣椒素水解物由香草胺和辣椒酸(8-甲基-6-反式壬烯酸)组成。这些酰胺的脱酰化反应提供了香草胺(4-羟基-3-甲氧基苄胺)，可进一步酶法转化为使用特定微生物或植物氧化酶的香草醛。这两步酶将天然辣椒素转化为香兰素是有吸引力的，因为所获得的产品可归类为天然风味。事实上，美国和欧洲的立法规定，“天然”味物质只能通过从自然来源或酶或微生物过程中提取，这些过程涉及从自然中分离出来的前体。

辣椒作为调味料在我国四川和湖南地区使用较为广泛，尤其是四川火锅中的使用量很大。这也导致了火锅类餐厨垃圾的生物降解造成了影响，因为生物降解的原理就是使用了大量的微生物分解餐厨垃圾，但是辣椒素能够抑制微生物的生长。

所以寻找能够高温条件下降解辣椒素的菌种在含辣椒素的餐厨垃圾的微生物处理方面具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种能够在高温条件下高效降解辣椒素的辣椒素降解菌、该辣椒素降解菌的应用及餐厨垃圾处理方法。

一种耐高温辣椒素降解菌，命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，株号ZJB19163，保藏号为CCTCC NO：M 2020014。

菌株ZJB19163的形态特征：革兰氏阳性嗜热细菌，细胞形态和排列呈杆状、单生，菌落为扁平、边缘不整齐、白色。为兼性厌氧菌。

菌株ZJB19163的生理生化特性：明胶水解试验结果为阴性，淀粉水解试验结果为阳性，柠檬酸盐试验结果为阳性，吲哚试验结果为阴性，硝酸盐还原试验结果为阳性，尿素试验结果为阴性，硫化氢试验结果为阳性，葡萄糖试验产酸不产气。

菌株ZJB19163的分子生物学鉴定结果：通过16S rDNA序列比对，与Bacilluslicheniformis BpZL-4a同源性为99.86％，菌株ZJB19163的16S rDNA序列系统进化树显示菌株ZJB19163和Bacillus licheniformis同源。

本发明又提供了所述耐高温辣椒素降解菌在降解辣椒素类物质中的应用。

本发明又提供了所述耐高温辣椒素降解菌在含辣椒素类物质的餐厨垃圾处理中的应用。

进一步优选的，所述辣椒素类物质具有苯环类和长链脂肪酸。

辣椒素类物质包括辣椒素和辣椒素类似物。进一步优选的，所述辣椒素类物质为以下至少一种：合成辣椒素(N-Vanillylnonanamide)、辣椒碱(Capsaicin)、二氢辣椒碱(Dihydrocasaicin)、降二氢辣椒碱(Nordihydrocapsaicin)、高辣椒碱(Homocapsaicin)、高二氢辣椒碱I(Homodihydrocapsaicin I)、高二氢辣椒碱Ⅱ(HomodihydrocapsaicinⅡ)、壬酞香荚兰胺(Nonoyl vanillylamide)、辛酞香英兰胺(Decoyl vanillylamide)、癸酞香英兰胺(Capryl vanillylamide)。上述辣椒素类物质中，可以分为两大类，一类是辣椒素，包括：合成辣椒素、辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱I、高二氢辣椒碱Ⅱ；另一类是辣椒素类似物，包括：壬酞香荚兰胺、辛酞香英兰胺、癸酞香英兰胺。

本发明还提供了一种含辣椒素类物质的餐厨垃圾处理方法，将所述耐高温辣椒素降解菌接种到含辣椒素类物质的餐厨垃圾中进行发酵处理。含辣椒素类物质的餐厨垃圾中如果辣椒素类物质含量较高，其中辣椒素及其类似物能够抑制微生物生长，所以一般难以使用常规微生物进行降解处理。

优选的，发酵处理温度为45℃～65℃。更优选的，发酵处理温度为45℃～60℃。进一步优选的，发酵处理温度为50℃～60℃。最优选的，发酵处理温度为55℃。

优选的，所述耐高温辣椒素降解菌接种量为：以OD600的吸光度为1.0计，稀释菌液与待处理高辣餐厨垃圾的体积比为1∶40。

优选的，发酵处理时间不少于12h。进一步优选的，发酵处理时间为12～48h。

本发明保藏号为CCTCC NO：M 2020014的耐高温辣椒素降解菌：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，能够以辣椒素为唯一碳源进行繁殖，能够快速、高效降解辣椒素，降解率能够达到100％，同时该降解菌还能高效降解淀粉和蛋白质；并且，本发明菌株能够耐受较高的温度，可以用于高温处理。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163平板菌落图。

图2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树。

图3为温度对ZJB19163降解辣椒素酶活的影响检测结果图。

图4为菌株ZJB19163在辣椒素培养基中的生长曲线和降解曲线。

图5为耐高温辣椒素降解菌ZJB19163的耐盐实验结果图。

图6为添加了耐高温辣椒素降解菌ZJB19163的实验菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率实验结果图。

图7为没有添加耐高温辣椒素降解菌ZJB19163的对照菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率实验结果图。

具体实施方式

实施例1

富集培养基：MOPS powder(MOPS粉末)8.37mM、tricine 0.08mM、NaCl 0.3mM、NH₄Cl 0.05mM、KOH 0.16mM、K₂SO₄ 0.28mM、MgCl₂ 0.53mM、K₂HPO₄2.0mM和60mg/Lcapsaicin。

分离纯化培养基：富集培养基添加20％琼脂粉。

辣椒素降解培养基：10g胰化蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5g NaCl，2g辣椒素(capsaicin)，用蒸馏水定容至1L。

降解菌的筛选与分离：降解菌的筛选采用以辣椒素为唯一碳源，逐渐提高辣椒素浓度的驯化方法。具体操作如下：准确称取1g样品，加入装有9ml无菌水的三角瓶中，恒温摇床中充分震荡30min，制成1∶10浓度的土壤悬浊液。待土粒沉淀后，吸取1ml上清液，移入装有9ml无菌水的试管中，制成10^-2菌悬液，以此类推，制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的菌悬液。选择10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个浓度各100μL，加入到辣椒素选择培养基中，辣椒素浓度按0.1、1、10、100mg·L^-1依次提高梯度驯化与富集降解菌。经过多次转接培养，梯度稀释培养液并涂布于20mg·L^-1辣椒素固体选择培养基上，在37℃恒温培养箱中倒置培养48h。挑取菌落形态不同的单菌落接种至LB固体培养基上，反复划线分离纯化得到纯菌株，菌株经试管斜面富集培养后保存于4℃冰箱中备用。

筛选到1株能够降解辣椒素的降解菌，株号为ZJB19163(ZJB19163来源为市场购买的辣椒表面样本)。

实施例2

降解菌的鉴定：

(1)降解菌形态特征鉴定：

降解菌经LB培养基培养18h后，观察降解菌的菌落形状、大小、颜色、透明度、粘稠度、湿润度、隆起和边缘特征及是否产色素等，菌体染色后用高倍显微镜观察菌体革兰氏染色、鞭毛、荚膜、芽孢等结构。

(2)降解菌生理生化特性测定：

降解菌经LB培养基培养18h后，按照文献进行石蕊、葡萄糖、甲基红反应、V-P试验、吲哚反应、柠檬酸盐、淀粉水解、明胶液化、需氧性、产生H₂S和硝酸盐还原等生理生化试验。

(3)降解菌16S rDNA基因序列的测定及分子系统发育树的构建：

降解菌基因组DNA采用(快速提取盒)试剂盒提取菌株的总DNA，用16S rDNA通用引物27F(正向引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R(反向引物)：5′-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-3′，以分离降解菌的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)：DNA模板1μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，引物(10μmol/L)各1μL，Tap酶(5U/μL)0.5μL，双蒸水37.5μL。扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共30次循环；72℃延伸10min。反应完成后，经1％琼脂糖电泳，检测扩增片段的大小和特异性。PCR产物经琼脂糖电泳检测纯化，送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序并拼接输出全序列，16S rDNA序列与Genebank中已收录的16S rDNA序列进行同源性比对，采用MEGA7进行序列匹配分析，软件使用邻接法(Neighbor-Joiningmethod)构建系统发育树。

试验结果表明：降解菌ZJB19163在LB培养基上呈黄色，凸起，外缘圆整，半透明，表面湿润(图1)；细胞为短杆状，单个排列，一端生鞭毛，革兰氏阳性。降解菌ZJB19163能葡萄糖反应产酸不产气，酪蛋白水解阳性，淀粉水解阳性，甲基红实验阴性，发酵木糖阳性，发酵甘露醇阳性，发酵阿拉伯糖阳性，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，明胶水解阳性、柠檬酸盐试验为阳性。分子鉴定通过引物27F/1492R扩增细菌进行16S rDNA检测鉴定，将测序结果与NCBI比对，再使用比对结果构建发育树(图2)，判定菌株ZJB19163为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年1月6日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2020014。

实施例3

温度对酶活性的影响：将ZJB19163接种到含有2％辣椒素(合成)的培养基试管中，分别在45、50、55、60、65℃温度，150rpm，培养36h，每隔3h取样，测定降解率。

实验结果如图3所示，ZJB19163的辣椒素降解酶活最适温度为55℃，6h的降解率达到了75％。

实施例4

辣椒素降解试验：将辣椒素降解菌ZJB19163接种到含有2g/L天然辣椒碱(Capsaicin)、二氢辣椒碱(Dihydrocapsaicin)或辣椒素(合成)(N-Vanillylnonanamide)的降解培养基中，55℃培养36h，每隔3h取样测定生物量和辣椒素类物质的含量。

辣椒素浓度测定方法：在日立Primaide高效液相色谱法(Hitachi Primaide)上，用1410紫外检测器Hitachi Primaide和5μm粒径ODS(C18)柱(4.6×250mm，J&K)进行了30℃生物转化分析。流动相在70％甲醇中为0.1％乙酸，在30℃下流速为1mL/min。取样体积为10μL，紫外检测波长为280nm。保留时间为10.5min。

生物量测定方法(MTT比色实验)：(1)取发酵好的菌液，用灭好菌的PBS稀释液倍比稀释成10个浓度，分别对不同浓度的菌液做MTT比色实验，同时选择合适的稀释度，做平板菌落计数。(2)用微量吸液器吸取不同浓度的发酵液100μL，分别加入96孔酶标板中，每个样液做5个复孔，同时设阴性对照。(3)用微量吸样器在96孔酶标板中含有样品的各孔分别加入10μL或20μL的MTT应用液，ZJB19163菌株于37℃、恒温培养箱放置20min后取出，向各孔分别加入100μL的DMSO，用全自动酶标仪于570nm处测定OD570值，测量前振动60s。

降解菌ZJB19163的生长曲线和降解曲线的试验结果如图4所述，在3h就进入了对数生长期，并且降解率达到了50％左右；培养12h后降解率都达到了100％。

实施例5

耐盐实验：将ZJB19163接种到含有1、3、5、7、9wt％NaCl的培养基(含2g/L辣椒素)试管中，55℃，150rpm，培养36h，每隔3h取样，所以MTT法测定生物量，吸光度大表示生物量多。

实验结果如图5所示，ZJB19163在5％浓度的NaCl的培养基中生物量最高，说明最适盐浓度为5％。

实施例6

高辣餐厨垃圾降解试验：高辣餐厨垃圾(样品来源于火锅店的餐厨垃圾)辣椒素浓度为2.14g/L。

以本实验室现有不含辣椒素降解菌的餐厨垃圾降解菌剂(专利公开号CN110272834A)为对照菌剂，对照菌剂包含克鲁维毕赤酵母和林生地霉两株菌。然后将耐高温辣椒素降解菌ZJB19163添加到对照菌剂中制备为实验菌剂。

将菌种分别进行摇瓶培养，按等比例混合，菌液稀释到OD 600的吸光度为1.0备用。将200mL高辣餐厨垃圾和两种菌剂各5mL稀释菌液混合添加到500mL摇瓶中，同时制备4个对照，55℃培养间培养48h，每隔3h取样测定辣椒素降解率和蛋白质、淀粉、油脂的降解率。辣椒素浓度使用实施例3中的液相测定，蛋白质含量使用索莱宝公司的考马斯亮蓝试剂盒测定，淀粉含量测定使用索莱宝的淀粉含量检测试剂盒测定。

试验结果：图6为添加了耐高温辣椒素降解菌ZJB19163的实验菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率，图7为没有添加耐高温辣椒素降解菌的对照菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率。实验菌剂处理的餐厨垃圾辣椒素降解菌最先开始繁殖，其他菌种都稍微减少，然后辣椒素被辣椒素降解菌快速降解，同时开始降解了部分蛋白质和淀粉，然后其他菌种开始大量繁殖，最终淀粉、蛋白质的降解较为迅速，辣椒素12h就降解完全，蛋白质和淀粉也在24h后基本降解完全，但是油脂最终的降解率不高；而对照菌剂处理的餐厨垃圾里面的菌种由于辣椒素的抑制作用生物量基本没有增加，因此辣椒素、淀粉和蛋白质基本没有降解。

说明降解菌ZJB19163能够在高辣的环境中有效的降解高辣餐厨垃圾中的辣椒素，解除辣椒素对不耐辣椒素菌种的抑制作用，能够有效改善菌剂对高辣餐厨垃圾的降解效果。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种耐高温辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

gctggctcca aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg gtgtgacggg 60

cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg 120

attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca gatttgtggg 180

attggcttag cctcgcggct tcgctgccct ttgttctgcc cattgtagca cgtgtgtagc 240

ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg 300

gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt 360

gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac 420

tctgcccccg aaggggaagc cctatctcta gggttgtcag aggatgtcaa gacctggtaa 480

ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540

attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgtttgc 600

tgcagcacta aagggcggaa accctctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact 660

accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac 720

cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg 780

tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac cctccccggt 840

tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata 900

attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 960

gctttttggt taggtaccgt caaggtaccg ccctattcga acggtacttg ttcttcccta 1020

acaacagagt tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact 1080

ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1140

gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt ggtgagccgt 1200

tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagct aaaagccacc 1260

ttttataatt gaaccatgcg gttcaatcaa gcatccggta ttagccccgg tttcccggag 1320

ttatcccagt cttacaggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctgacatca 1380

gggagcaagc tcccatcttc cgctcgactg 1410

Claims

1.一种耐高温辣椒素降解菌，其特征在于，命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，株号ZJB19163，保藏号为CCTCC NO：M 2020014。

2.如权利要求1所述耐高温辣椒素降解菌在降解辣椒素类物质中的应用，所述辣椒素类物质为以下至少一种：合成辣椒素、辣椒碱和二氢辣椒碱。

3.如权利要求1所述耐高温辣椒素降解菌在含辣椒素类物质的餐厨垃圾处理中的应用，所述辣椒素类物质为以下至少一种：合成辣椒素、辣椒碱和二氢辣椒碱。

4.一种含辣椒素类物质的餐厨垃圾处理方法，其特征在于，将如权利要求1所述耐高温辣椒素降解菌接种到含辣椒素类物质的餐厨垃圾中进行发酵处理，所述辣椒素类物质为以下至少一种：合成辣椒素、辣椒碱和二氢辣椒碱。

5.如权利要求4所述的餐厨垃圾处理方法，其特征在于，发酵处理温度为45℃～65℃。

6.如权利要求5所述的餐厨垃圾处理方法，其特征在于，发酵处理温度为45℃～60℃。

7.如权利要求4所述的餐厨垃圾处理方法，其特征在于，如权利要求1所述耐高温辣椒素降解菌接种量为：以OD600的吸光度为1.0计，稀释菌液与待处理高辣餐厨垃圾的体积比为1∶40。

8.如权利要求7所述的餐厨垃圾处理方法，其特征在于，发酵处理时间不少于12h。

9.如权利要求7所述的餐厨垃圾处理方法，其特征在于，发酵处理时间为12～48h。