JPH06504207A

JPH06504207A - 好塩好アルカリ微生物

Info

Publication number: JPH06504207A
Application number: JP5508333A
Authority: JP
Inventors: ジョーンズ　ブライアン　エドワード; グラント　ウィリアム　ダンカン
Original assignee: ジェネンコー　インターナショナル　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 1994-05-19
Also published as: DE69230490T2; ES2141718T3; CA2097431A1; FI932903A; KR930703431A; NO309199B1; WO1993009219A1; EP0540127A1; DK0540127T3; AU661873B2; FI932903A0; NO932381L; ATE188246T1; AU2957592A; DE69230490D1; EP0540127B1; NO932381D0; NZ244949A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】好塩好アルカリ微生物本発明は、微生物学の分野に関し、より特定的には、好塩（ｈａｌｏｐｈｉｌｉｃ）　、好アルカリ微生物の分野に関する。

発明の背景好アルカリ微生物は、アルカリｐＨ環境、特に、ｐＨ８を越える場合、及び一般的にはｐｌ（９及びｌＯの間の範囲において最適な増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を示す生物であると定義される。好アルカリ微生物は、１２もの高いｐＨを有する環境下での生存も見られる。偏性好アルカリ微生物は、中性ｐＨにおいては増殖することができない。

好アルカリ微生物は、アンモニア化成、硫酸塩環元または光合成のような生物活性により一時のアルカリ性条件が生じる庭の土壌のような日常の環境下においても見ることができる。多くの種類の好アルカリ生物に非常に富む起源が、ソーダ湖のような自然発生の安定アルカリ環境中に見られる。

好塩細菌は、塩（塩化ナトリウム）の存在下で最適に増殖する細菌であると定義される。微生物は、広範囲の塩濃度上で増殖することがで、きることが多いので、語句「好塩」は、海水（ｃａ、　０．５　Ｍまたは３％）中で見られる濃度より多い最小の要求を育する微生物に対して通常使用される。

高度好塩細菌は、２０％を越えるＮａＣＩ（３〜４モル）において最適に増殖する細菌であると定義される。高度好塩細菌は、過食塩水環境に存在する。最も％Ｃ＞に研究された高度好塩細胞は、Ｈａｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目に属する。Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及ＣＦＮａｔｒｏｎＯｃＯｃｃｕｓ以外の全ての知られたＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉａは、増殖のために少なくとも１２〜１５％塩と、中性に近いｐＨを要求する偏性好塩細菌である。これらの細菌は、生育ＩＩＡｒｃｈａｅａ　（古細菌）の界Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａに属する（ウオーズ、Ｃ０語句「好塩好アルカリ細菌（ｈａｌｏａｌｋａｌｉｐｈｉｌｅ）」は、好塩及び好アルカリの両方である細菌を記述するために最初にソリマン及びトリュッパーによって使用された。　（ソリマン、Ｇ、Ｓ、Ｈ，及びトリュッパー、Ｈ，Ｇ、、　（１９８２）、ｒＺｂｌ、　Ｂａｋｔ、　）ｌｙｇ、　［、Ａｂｔ、　Ｏｒｇ、　Ｊ　Ｃ３、ｐ、３１８〜３２９）。今日まで、そのような細菌はわずかな公知例のみか、界Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａに属する（ティンダル、Ｂ。

Ｊ、及びトリュソバー、Ｈ，Ｇ、、（＋９８６）、ｒＳｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ」、７．２０２〜２１２）。

最も高度の過塩水環境は、微生物学的に最も少ない種類であるか、それても高度好塩細菌の明確な、豊富で複雑な叢を含む。これらの環境は、存在する少ししかないニーバクテリアを含むＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａにより占領されていることが示唆されている（ロドリゲスーノルラ、Ｆ、ｒＨａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉａ」、１巻、（ロトリゲスーハレラ、Ｆ１編集）ＣＲＣプレス、インコーホレイテッド、ポーカラドン、フロリダ（１９８８）、９．３〜３０）。

過塩水でもあり得る天然発生のアルカリ環境の例であるソーダ湖は、世界中のいろいろな場所において見られる。それらは、地質上、地理上及び気候上の環境の組合せによって生じる。それらは、蒸発濃度によって生成される大量の炭酸ナトリウム（またはその塩の複合体）の存在並びに不溶性塩として炭酸塩イオンを除去するＣａ”°及びＭ　ｇ　２−の相当する欠如によって特性化される。

Ｃａ’ゝ及びＭ　ｇ２−の濃度が、炭酸塩の濃度を越えるか、またはそれらか等モルである場合において、塩湖は、ｐＨ６〜８により生成され、そのイオン濃度は、場所の地質に応じて変化する。イスラエルの死海は、二価のカチオン、特にＭ　ｇ２−に富むわずかに酸性（ｐＨ６〜７）の塩水湖の典型的な例である。一方、米国ユタ州グレイトソルトレイクは、Ｍ　ｇ２−枯渇の塩水の例であり、わずかにアルカリ性（ｐＨ７〜８）である。

太陽蒸発油（製塩業者）中の海水から得られた通常の塩の商業的製造は、人工の過塩水環境を生じさせる。製塩業者は、一定範囲の塩分（海水〜過飽和）にわたって優れたモデルシステムを提供し、その化学及び微生物学は、熱心に研究されている（シェイパ−１Ｂ、　ｒＨｙｐｅｒｓａｌｉｎｅ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓＪ　、スブリンガーーベルラーグ、ベルリン／バイデルベルブ、１９８９）。

アフリカのりフトバレーは、かなりの数の、永続性の大塩水域を育する湖を育することにおいて珍しい。リフトバレーのケニアータンザニアの地区は、より薄い湖（例えば、エルメンテイタ、ポゴリア、ナクル等）中の約５％（Ｗ／Ｖ）から、レークマガジ、リトルマガジ（ナシキーエンギダ）及びナトロンの一部における飽和（３０％またはそれ以上）の全塩分の範囲を存する多数のアルカリソーダ湖を含む。これらの湖は、存意量のＣａ”°及びＭｇ”　（はとんどの場合において、検出レベル未満）が全くなく、はとんとの濃縮された湖において９〜１１゜５以上の範囲におけるｐＨ値を有している。

この明らかに苛酷な環境にもかかわらず、ソーダ湖は、多くの原核生物の生息地であり、そのいくつかの種類は、永続的または季節的な最盛期として優位を占めることができる。これらの生物は、好アルカリシアノバクテリアから好塩好アルカリ古細菌までの範囲である。より高い塩分において（高伝導度により特性化される）、好塩好アルカリ古細菌は、優位を占める。さらに、東アフリカのリフトバレー、アメリカ合衆国西部、チベット、中国及びノ１ンガリーにおけるような世界中に広く散らばった場所におけるソーダ湖に存在する共通の種類の好アルカリ生物を見出すことも珍しくない。例えば、ナトロンバクテリアは、中国（ワンプ、Ｄ、及びタング、Ｑｏ、　ｒＲｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｈ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ）中■窒mａｔ。

ｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｏｍ　５ｏｄａ　Ｌａｋｅｓ　ｏｆ　ＣｈｉｎａＪ　、Ｔ、／１７トリ編集、ジャｌクンサイエンティフィックソサイエティーズプレス、東京、（１９８９）、ｐ、６８〜７２）、ソ連（ズビアギンツェバ、１．Ｓ、及びタラサー、Ａ、　Ｌ、　（１９８８）　ｒＭｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ」、１エ、６６４〜６６９）及びアメリカ合衆国西部（モース、Ｓ。

及びティンダル、Ｂ、Ｊ、　（１９８５）、ｒＳｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ　、６．２４７〜２５０）に存在するソーダ湖及び土壌から単離され同定されている。ナトロンバクテリアは、チベット（Ｗ、Ｄ、グランド、未刊行の考察）及びインド（ウパサニ、Ｂ、及びプサイ、Ｓ、　（１９９０）　ｒＡｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｌ　、上５４、ｐ、　５８９〜５９３）に存在するソーダ副生に見出されている。

ソーダ湖及び好アルカリ生物の一般的なより詳しい研究は、グランド、Ｗ、Ｄ、、ムワサ、Ｗ、Ｅ、及びジョーンズ、Ｂ、Ｅ、　（＋　９９０）　ｒＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ＲｅｖｉｅｗｓＪ　、ヱ旦、２５５〜２７０に記載されており、その内容は、参考として本明細書中に採り入れられている。アルカリ性ソーダ湖のリストは、グランド、Ｗ、Ｄ、及びティンダル、Ｂ、　Ｊ、　ｒＭｉｃｒｏｂｅｓ　ｉｎ　Ｅｘｔｒｅｍｅ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、（Ｒ，Ａ、バーバート及Ｏｃ、　Ａ、コツト編集）；アカデミツクプレス、ロンドン（１９８６）、ｐ、２２〜５４）；及びティンダル、Ｂ、Ｊ、、　ｒｌ（ａｌｏｐｈｉｌｉｃＢａｃｔｅｒ＋ａ」、１巻、（Ｆ、　ロドリゲスーバレラ編集）；ＣＲＣブレスインコーポレイテッド、ホーカレイトン、ＦＬ、（１９８８Ｌｐ、３１〜７０の刊行物中に見られ、両者の内容は、参考として本明細書中に採り入れられている。過塩水性環境の詳しい研究は、シェイパ−１Ｂ１、上記ｒＨｙｐｅｒｓａｌｉｎｅ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ　Ｊ中に記載されている。

非塩水性環境から単離された好アルカリ微生物は、ホリコシ、Ｋ、及びアキハ、Ｔ、　ｒＡｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、（スブリンガーーへルラーグ、ベルリン７／ハイデルベルグ／Ｎ、　Ｙ、、１９８２）によっても議論されている。しかしなから、ソーダ湖のような塩水性環境由来の好アルカリ性生物は、その中に論しられていない。アルカリ性、過塩水性環境由来の偏性嫌気性の細菌は、近年、シバ、Ｈ，ｒｓｕｐｅｒｂｕｇｓＪ、（Ｋ、ホリコシ及びＷ、Ｄ、グランド編集）：ジャパンサイエンティフィックソサイエティーズプレス、東京及びスブリンガーーベルラーグ、ベルリン、ハイデルベルグ、Ｎ、　Ｙ、、（１９９１）、９．１９１〜２１１：及びナカツガワ、Ｎ、同書、ｐ、　２１２〜２２０により開示されている。

好アルカリ細菌は、既に消費用製品の製造に対するバイオテクノロジーの応用に衝撃を与えている。好アルカリ微生物によって産生された好アルカリ酵素は、工業的プロセスにおける用途か見出されており、かなりの経済的潜在能力を存している。例えば、これらの酵素は、洗剤組成物及び製革において最近使用されており、食糧、廃棄物処理及び繊維工業における用途の発見か予知されている。さらに、好アルカリ微生物及びそれらの酵素は、生体内変換、特に純粋な鏡像異性体の合成において潜在的に有用である。また本明細書中に記載された多くの微生物は、明るく着色され、天然着色料の製造に対して潜在的に有用である。

発明の概要本発明は、新規な好塩好アルカリ細菌の純粋な培養物を与える。これらの細菌は、そのすべてかアルカリ性の過塩水湖中またはその回りで得られた、土壌、水、堆積物、トロナ（ＮａＨＣＯｓ・ＮａｚＣＯｓ・２　ＬＯ）及びその他の多数の起源から単離されている。これらの好塩好アルカリ細菌は、それらの新規性を確認するために、互いに関して及びその他の知られた好塩好アルカリ細菌に関して、多数の分類学の原理に従って分析されている。さらに、これらの細菌分類単位は、化学分類分析によってさらに区切られる。

本発明は、また、その微生物を含む試料か得られる環境の組成に関するデータ、並びに当業者か容易にそのような環境を配置し本明細書中の下記の方法によって本発明の有機体を単離することができるような有効な単離及び培養のために必要な培地に関するデータを提供する。

本発明の目的は、アルカリ−及び塩−耐性酵素を産生ずる微生物及びそれらの酵素の実質的に純粋な調製物を得るための方法を提供することにある。これらの酵素は、高ｐＨ１塩水性環境においてそれらの機能を発揮することができ、これによりこれらの酵素はそのような極端な条件を要求する用途に特異的に適したものとなる。例えば、アルカリ−及び塩耐性を有する酵素は、洗剤組成物、製革、食物、廃棄物処理及び繊維工業において、並びに、純粋な鏡像異性体の生成のような生体内変換に使用されることができる。

図面の簡単な説明図１．　Ｓ、、係数と非加重平均結合方法により得られたクラスター〔集団、ｃｌｕｓｔｅｒ）（フェノン（ｐｈｅｎｏｎ）　）を示す系統樹図２．ＳＪ係数と非加重平均結合方法によって得られたクラスター（フェノン）を示す系統樹本発明の採取法の詳細な説明数百の細菌株が、アルカリ性、過塩水湖中及びその回りの土壌、水、堆積物、トロナ（ＮａＨＣＯｓ・ＮａｔＣＯｘ・２　）１２０）及びその他の多数の起源の試料から単離されている。これらの試料は、３年間にわたる研究の一部として得られた。単離された細菌は、非光合成生物のニーバクテリア及び古細菌である。

今日まで、はんのわずかな好塩好アルカリ古細菌か充分に特性化されている（表４参照）。

試料は、滅菌プラスチックバッグ中に集めた。試料採取は、全て東アフリカのケニアータンザニアのりフトバレーに存在する、レイクマガジ、リトルマガジ（ナシキーエンギダ）及びナトロンにおいて行った。同様の環境を育するアルカリソーダ湖は、チベット、中国、エジプト及びアメリカ合衆国西部にも見られる。

各採取現場において、ｐＨ１伝導性及び温度のような物理的因子を、現場と試料の物理的外観とともに測定した。試料のいくつかを試料の採取の３６時間以内にその場所で処理したか、はとんとは、採取から数週間後に、現場から離れて試験した。

表１は、単離された種々の株を示す。これらの株は、試料を採取した場所及び試料自体の物理的外観に従って、掲載されている。表２は、試料の抽出時における試料の場所における湖水の化学的分析の例を与える。これらのデータは、以前の分析と一致している（グランド、Ｗ、Ｄ、及びティンダル、Ｂ、　Ｊ、、　ｒＭｉｃｒｏｂｅｓ　ｉｎ　Ｅｘｔｒｅｍｅ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓＪ、（Ｒ，Ａ、　バーバート及びＧ、　Ａ、コツト編集）、アカデミツクプレス、ロンドン、１９８６）。

表３は、多数の分類学的分析（図１）の結果に従って配置される単離された株のリストを示す。さらに、表３は、試料の物理学的性質、特に、温度、伝導性及びアルカリｐＨ１並びに新規の細菌の純粋な培養物を得るために使用される多数の単離培地を与える。これらの培地は、補遺Ａに記載したように文字でコードを付した。

表１．２及び３は、試料採取の場所の環境か特性化できるデータを提供する。

試料の化学及び物理学的分析は、アルカリｐＨの存在並びに、低濃度のＣａ”＋及びＭ　ｇ　！−に結合した異常に高い濃度のＮａ２ＣＯｓの存在を確認する。

ソーダ湖の塩基性環境は、それらのｐＨ及びイオン組成に関して安定であることは知られている。さらに、これらの現場で見られる微生物の固体数は大体において安定のままである。

従って、本発明による細菌か得られ得る環境は、表１〜３に示されるデータから決定され得ると考えられる。

表１表２１９．２２２３８．９＜０．０１０．００８２８．３００．１３３．４９５３．６２４．９２３．８６４９００２７．００５７．０＜０．０１０．００８１４．８８１．８２３．１５１７．４９３．９０１．５０４２６０３７．５７６６．５＜０．０１０．００８１６．９８１．７９２．６５１１．５６４．１２１．５０４４９０４１．３４１１．８９０．０１５０．００ｇ　２．７８０．４６５．４１２．６００．６５０．６９８５１５１．６３１１．８９０．０９７０．Ｂ１６３．５５０．＋５０．５６６．９８１．１２３．５７１＋１０６４．６３６１．＋３０．０１７０．０２９７．５４０．３１　＋、８６１３．＋２２．４３１５．０７２７＋０７０．５２４．６００．０２７０．００４０．９１０．４２０．１８５．０００．２３０．３０３６５８１．２２１１．５１０．１４２０．０２５０．７７１．１８０．３９１４．７８０．６３１．４３８３２９４．５２４３．７３０．０４２０．０２５３．０５４．２１１．４６１．６７２．６７３．００３０４０注・　Ｎａ″″、Ｃ１−及びｃｏ、”−をモル（Ｍ）で示す以外は、カチオン及びアニオンをミリモル（−）で示す。

零ＴＯＮ　＝　全有機チッ素（ｍＭ）＃ＴＡ＝　全アルカリ度（ミリ当量）／Ｌ表３クラスター　株　場　所　ｐｌ　温　度　伝導度　単離場所（”Ｃ）　（ｍｓ／Ｃｍ’）１　３０Ｍ、４　マガジ　１２．５　５５　６０　Ａ１　８７Ｍ、４　マガジ　１２．３　５６　＞１００　Ｂ１　８５Ｍ、４　マガジ　１０．５　３３　８０．４　Ｂ１　８９Ｍ、４　マガジ　１０．５　３０　６０−９０　Ｂ１　８６Ｍ、４ｃＴ７ガシ１２．３　５６　＞１００　Ｂ１　８８Ｍ、４　マガジ　ＮＲＮＲＮＲＢ２　８２Ｍ、４　マガジ　１２　４８　８７　Ｂ２　１００Ｎｔ、４　ナトロン　ＮＲＮＲＮＲＢ２　９８Ｎ＋、４”　ｆトロン１０−１０．５　３５　３５　Ｃ２９９Ｎｔ、４　ナトロン　ＮＲ４５ＮＲＣ２９６ＬＭ、４　リトル７ガノ　ＩＩ　３７　＞１００．　Ｃ２１０２１Ｎｔ、４　ナトロン　ＮＲＮＲＮＲＢ２　１ｏ４Ｎｔ、４　ナトロン１０−１０．５　ＮＲ４５Ｂ３　８３Ｍ、４　マガジ　ＮＲＮＲＮＲＣ３９３ｄＬＭ、４”ｌトルｖｆｆノ　ＮＲＮＲＮＲＢ３　８４Ｍ、４　マガジ　１２　４４　８７．５　Ｂ４　９０Ｍ、４　マガジ　ＮＲＮＲＮＲＢ４　９５ＬＭ、４”１１）ルアｆｆ７　＋１　３７　＞１００　Ｆ４　９７Ｎｔ、４　ナトロン１０−１０．５　３５　３５　Ｃ４１０５１１１ｔ、４　ナトロン　１１　４４　６０−９０　Ｂ４　１０２ｄＮｔ、４　ナトロン　ＮＲＮＲＮＲＢ４　１０１Ｎｔ、４　ナトロン　１１　４０　２６−３６　Ｃ−＋０３Ｎｔ、４　ナトロン　ＮＲＮＲＮＲＢ−３１Ｍ、４　マガジ　１２．５　５５　６０　Ａ−９３１ＬＭ、４　リトル７ガノ　ＮＲＮＲＮＲＥ本　微生物のクラスターは、Ｓ、、／ＵＰＧ！ｉ［Ａを使用する数量分類法の原理による分析によって得られる。（下記説明及び図１を参照）。

ＮＲ＝試験せず単離培地のために与えられる文字コードは補遺Ａを参照する。

試料の処理　好塩好アルカリ細菌の増殖（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）及び単離種々の濃縮及び単離方法を使用した。いくつかの方法は、アルカリ性のｐＨにおいて特定のタイプの酵素活性を示す好塩好アルカリ細菌の濃縮及び単離のために特に設計された。より一般的な性質を存するその他の技術を、種々の好塩好アルカリ細菌の単離のために使用した。場合によっては、副生では一般的な特定の条件（表２）を、細菌の単離のために実験を行う際に考慮に入れた。

新規の好塩好アルカリ細菌の単離のために使用される種々の栄養培地は、培地Ａ〜培地Ｆと称する。使用した種々の培地の組成を補遺Ａ中に示す。

非特異的好塩好アルカリ有機栄養生物細菌の単離のために、ソーダ湖水試料またはその希釈物を、アルカリ性、塩水性の栄養寒天、ｐＨ１０〜ｐＨ１ｏ、５（培地Ａ）上に、縞状のすしとして引いた。より固い粘稠度の泥、堆積物等の試料は、アルカリ性、塩水性の栄養寒天（培地Ａ）上に塗る前に、アルカリ性、塩水性の栄養ブロス（培地Ａ）中に最初に懸濁した。この細菌を加熱したインキュベーター、好ましくは３７°Ｃ中で培養した。場合によっては、細菌コロニーの単離のために、アルカリ性、塩水性の栄養寒天（培地Ａ）上にブロスを広げる前に、試料をアルカリ性、塩水性の栄養ブロス（培地Ａ）中に懸濁し、細菌を好ましくは３７°Ｃにおいて２〜７日間撹拌しなから培養した。

特定のタイプの酵素活性を示す好塩好アルカリ細菌の単離のために、試料を、ラクトアルブミンまたはカゼインのような特異的な基質を含むアルカリ性、塩水性の栄養寒天上に広げた。場合によっては、タンパク質分解活性のような酵素活性を示す細菌の検出用に特異的なアルカリ性、塩水性の栄養寒天上にブロスを広げる前に、試料中の細菌を、培地へのような非特異的アルカリ性、塩水性の栄養ブロス中で、１日または数週間増殖させることができる。

分類学的分析アルカリ性の過塩水副生またはその回りから単離された２５の細菌株を、１５％またはそれ以上のＮａＣ１濃度及びｐＨ１０より高いｐＨにおいて増殖するその能力を基礎として、カテゴリー好塩好アルカリ細菌に割当てた。

この２５の株を１０７の特性に関して試験した。実際的な目的のために、特性を１２３の特性の状態に分割した。結果を、数量分類学の原理を使用して分析した（スニース、Ｐ、　Ｈ，Ａ、ソカール、Ｒ，Ｒ，、ｒＮｕｍｅｒｉｅａｌ　ＴａｘｏｎｏｍｙＪ　、Ｗ、　Ｈ。

フリーマンアンドカンパニー、サンフランシスコ、１９７３）。試験された特性及び試験方法は、補遺Ｂ中に記載した。さらに、補遺Ｃは、とのようにして各特性の状態を分類学の分析に対してコードしたかを記録している。

対照として、５の知られた好塩好アルカリ古細菌を、同じ条件を使用する同じ分析に付した。これらの参照細菌は、唯一利用可能な知られた好塩好アルカリ細菌である。これらの５の知られた参照細菌を表４中に記録するが、知られた種の「タイプ株」は利用可能な場合に使用されてきたことが理解されるであろう。

略語は図１及び図２において使用した通りである。

１　は「タイプ株」を示す。

試験データの分析、分類学的類似への評価１０７の特性からなる表現学的データを、補遺Ｃに示されるような二進法を使用して＋２３の２状態の特性（存在−不在特性）に対してスコアをつけた。適当な場合には（例えＩ謂ａｃ！上での増殖）、及び必要な質的な多状態の特性（例えば、コロニーの色）を、いくつかの相互に排他的な特性状態に小分けする場合には、追加の測定基準を使用した。データは、ｒｌｘｉ」マトリックス（を縦列は類似αを基礎としてグループ分けされるべきｔ細菌株を示し、ｎ横列は単位の特性である）の形式で示した。細菌株の分類学的類似点は、相似係数を使用して評価した（スニース、Ｐ、　Ｈ，Ａ、及びソカール、Ｒ，Ｒ，の上記ｒＮｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ」、＋１．　ｌ　１４〜１８７）。多くの異なる係数か生物学的分類のために使用されているか、はんのわずかなものが、細菌学において常に使用されている。本発明者らは、２つの相関係数（スニース、Ｐ、Ｈ，Ａ、及びソカール、Ｒ，Ｒ，同じ箇所、ｐ１２９以下）、即ち、シンプルマッチング及びジャカード係数を選択して応用している。これらは、細菌学的データの分析に頻繁に応用され、確固とした分類を得る結果となることか示されているので、当業者に広く受入れられている。

コード化されたデータは、英国ライスター大学のＤＥＣＶＡＸコンピューターンスシス上で作動するＴＡＸＰＡＫプログラムパッケージ（サラキン、Ｍ、Ｊ、、ｒＭｅｔｈＱｄｓ　ｉｎ　ＭｉＣｒＯｂｉＯＩＯｇ”／ｊ　中の　ｒＰｒｏｇｒａｎｗｎｅｓ　ｆｏｒ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａ獅п@１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＪ、１９章、（Ｒ，Ｒ，コールウェル及びＲ、グリゴロバ編集）、ｐ。

４５９〜４９４、アカデミツクプレス、ロンドン、１９８７）を使用して分析した。さらに、このデータは、ＩＢＭＰＳ／２デスクトップコンピューター上で作動するＮＴＳＹＳ−ｐｃ　（バージタン１．５０）プログラムパッケージを使用して分析した（ロルフ、Ｆ、　Ｊ、、　ｒＮｕｍｅｒｉｃａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ」、アブライトバイオスタティスティックスインコーポレイテッド及びエグセクターパブリシングリミテッド、セトーケット、ニューヨーへ　１９８８）。

類似のマトリックスを、ＴＡＸＰＡＫ中のＲＴＢＮＳ　１Ｍプログラムを使用するシンプルマツチング係数（Ｓ、、）（スニース、Ｐ、　Ｈ，Ａ、及びソカール、Ｒ９Ｒ１、ｒＮｕｍｅｒｉｃａｌ　ＴａｘｏｎｏｍｙＪ　、ｐ、　１３２　；　Ｗ、　Ｈ，フリーマン及びカンパニー、サンフランシスコ、＋９７３）を使用して全株対に対して構成した。類似マトリックスのクラスター分析は、ＴＡＸＰＡＫ中のＳＭＡＴＣＬＳＴサブルーチンの作動による非加重平均結合方法としても知られている、等差平均（ＵＰＧＭＡ）アルゴリズムを使用する非加重ペアグループ方法を使用して達成された。

クラスター分析の結果は、図１に示される系統樹である。系統樹は細菌株間の類似性のレベルを示している。系統樹は、ＴＡＸＰＡＫ中のＤＥＮＤＧＲプログラムを使用して得られる。

表現掌上のデータは、ＴＡＸＰＡＫ中のＲＴＢＮＳＩＭプログラムを作動することによって、シャツカード係数（Ｓ、）（スニース、Ｐ、　Ｈ，Ａ、及びソカール、Ｒ，Ｒ，、Ｉ’Ｎｕｍｅｒｉｅａｌ　ＴａｘｏｎｏｍｙＪ　、ｐ、　１３１　；　Ｗ、　Ｈ，フリーマンアンドカンパニー、サンフランシスコ、１９７３）を使用して再分析した。その他の系統樹を、ＴＡＸＰＡＫ中のＵＰＧＭＡオプションを有するＳＭＡＴＣＬＳＴ及びＤＥＮＤＧＲサブルーチンを使用して得た。

図１は、アルカリ副生及びその回りから単離された２５の新規な好塩好アルカリ細菌と５の知られた好塩好アルカリ細菌のシンプルマツチング係数及びＵＰＧＭＡアルゴリズムに基づくクラスター分析の結果を示す。

好塩好アルカリ物の４つの天然のクラスターまたはフェノンが、７８．５％相似レベルで生成される。これらの４つのクラスターは、アルカリ湖から単離された２５の新規の好塩好アルカリ細菌の２２を含む。図のレベルの７８．５％の選択は任意であるが、数量分類学の最近の慣行と一致している（オースティン、Ｂ。

及びブリースト、Ｆ、　ｒＭｏｄｅｒｎ　ｈｃｔｅｒｉａｌ　ＴａｘｏｎｏｍｙＪ　、ｐ、　３７　；パンツストランドラインホールド；ウォキンガム、英国（１９８６））。低百分率において図を配置することは、その限定がそのデータによって支持されない明らかに無関係の生物のグループを合わせ得るが、一方、高い百分率は、限定の度合いがより低い多数のクラスターを生成し得る。さらに、最初のデータ、特にコロニーの特性及び抗生物質感受性の検査によって、クラスター１及びクラスター２は、排他的に古細菌を含み、クラスター３及びクラスター４は、ニーバクテリアのみを含むことか示される。この結論は、化学分類の証拠により支持される（下記の説明を参照のこと）。クラスターの群の構成物は、シャツカード係数を使用して得られたクラスターのパターンによってさらに確認される（下記及び図２参照）。

７８．５％のレベルにおいて、２つのクラスター（クラスター３及びクラスター４）は、９の新規に単離された株を示す新規の好塩好アルカリニーバクテリアを排他的に含み、これらは、新規の分類群を示すことができる。この新規の好塩好アルカリ株の３つは、主要なりラスターから外れている。これらの非りラスター株は、１０３Ｎｔ、　４．３１Ｍ、４及び９３１ＬＭ、４であり、それらの相互関係は、限定かより困難で、現在文献記載のない新規のフェノンを示すであろう。

クラスター中の陽性の特性の分布を補遺Ｅに示す。

Ｓ、／ＵＰＧＭＡ法シャツカート係数は、過度の加重か負のマツチングデータに付加されるためにシンプルマツチング係数においてフェノンを検出するために使用されることかできるので、シンプルマツチング係数の有用な付属物である。従って、シャツカード係数は、シンプルマツチング係数の使用により最初に定義されたクラスターの正当性を確認するために有用である。シャツカード係数は、生物化学的に非反応性の生物または増殖か遅い生物の比較において特に有用である（上記のオースチン、Ｂ、及びブリースト、Ｆｌ、ｐ、３７）。　−３，、／ＵＰＧＭＡ法によって得られた４つのクラスターは、ＳＪ／ＵＰＧＭＡ法によって生成された系統樹中で完全に再発見される（図２）。クラスターのパターン中にいくつかの再配置があるか、群の構成物は、両系統樹において同じままである。しかしながら、この場合において、クラスターは、（ニーバクテリア）クラスター３及び４が合わせられる５９％（Ｓｊ）レベル（クラスターｌ　（Ｓｓ、）の定義に要求される最小値）において限定される。これは、これらの２つのクラスターは主にマツチングの負の特性において差異が認められないことを示すことかできるか、両方の元来の系統樹の調査は、より適当な説明はクラスター１の異質性であることを示唆している。株３０Ｍ、４及び８７Ｍ、４は、クラスター１中でサブグループを生成するようである。

表現学的データをＮＴＳＹＳプログラムを使用して調へた場合、全く同じ結果か株のクラスター生成に関して得られた。

代表株の決定Ｓ、、／ＵＰＧＭＡ方法により得られた各個々のクラスターの中心（ｃｅｎけｏｉｄ）を、ＴＡＸＰＡＫ内のＲＧＲＯＵＰＳプログラムを使用して計算した。超空間中に投影された実在の生物を示す点のクラスターの中心は、仮定の平均的生物を示す。中心は、めったに実在の生物を示さない。従って、クラスターの中心からのそれぞれのクラスター構成物のユークリッド距離を、どの生物が仮定の平均的生物に最も近いかを立証するために算出した。中心に最も近い生物を、　「中心タイプ（ｃｅｎｔｒｏｔｙｐｅ）の生物」　（上添文字「ＣＴ」により示す）と命名した。

中心タイプの有機体は、各特定クラスターの必須で識別力のある特性を最も近接に示す「タイプ株ｊとして考えることができる。

好気性、球状細菌。胞子は認められない。

好塩好アルカリ性。２０％ＮａＣ１を含む培地上でｐＨ］ｏにおいて増殖する。

１２〜３０％ＮａＣｌの存在下で増殖する。

アルカリ性、塩水性の栄養−寒天（培地Ａ）上で、約２ｍの直径で、凸面隆起及び全体的な縁部を育するサーモンピンク色の、円形コロニーを生成する。

温度、３０〜４０°ＣにおいてＩ＆適に増殖する。２０″Ｃにおいて増殖するか、４５”Ｃにおいて増殖しない。

ＫＯＨ試験、　陰性アミノペプチダーゼ試験：　陰性オキシダーゼ反応：　陰性カタラーゼ反応：　陽性セラチンの加水分解・　陰性澱粉の加水分解：　陰性増殖は、下記抗生物質により阻害される：ゲンタマイシン、アンピシリン、ペニシリンＧ、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、オレアンドマイシン、ポリミキシン、リファンピシン、ネオマイシン、バンコマイシン及びカナマイシン。増殖は、下記構成物質によって阻害されない：エリスロマイシン、ノボビオシン及びバシトラシン。

化学有機栄養生物：酵母抽出物、ペプトン及びカザミノ酸のような複合培養基上で増殖する。

膜脂質は、株８６Ｍ、４の古細菌の性質を示す、グリセロールジエーテル部分好気性、球状細菌。胞子は認められない。

好塩好アルカリ性。２０％ＮａＣ１を含む培地上でｐｔｔｔｏにおいて増殖する。１２〜３０％のＮａＣ１の存在下で増殖する。

アルカリ性、塩水性の栄養−寒天（培地Ａ）上で、凸面隆起と全体的な縁部を有する１〜２ｍｍの直径の、不透明でもろいピンク色の円形のコロニーを生成する。

温度　３０〜４０°Ｃにおいて最適に増殖する。２０”Ｃにおいて増殖するが、４５°Ｃにおいて増殖しない。

ＫＯＨ試験、　陽性アミノペプチダーゼ試験：　陰性オキシダーゼ反応、　陽性カタラーゼ反応・　陽性セラチンの加水分解：　陽性澱粉の加水分解：　陽性増殖は、下記の構成物質によって阻害される。ゲンタマイシン、アンピシリン、ペニシリンＧ１クロラムフエニコール、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、オレアンドマイシン、ポリミキシン、ネオマイシン、バンコマイシン及びカナマイシン。増殖は、下記抗生物質によって阻害されない、エリスロマイシン、ノボビオシン、リファンピシン及びバシトラシン。

化学有機栄養生物。酵母抽出物、ペプトン及びカザミノ酸のような複合培養基上で増殖する。

株９３ｄＬＭ、４好気性、グラム陰性、桿状細菌。胞子は認められない。

好塩好アルカリ性。２０％のＮａＣｌを含む培地上でｐｔ（１０において増殖する。１５〜３０％ＮａＣｌの存在下で増殖する。

アルカリ性、塩水性の栄養−寒天（培地Ａ）上で、凸面隆起及び全体的な縁部を育する、約１１ｍの直径の不透明で、粘液状の赤色の円形コロニーを生成する。

温度＝３０〜４０“Ｃにおいて増殖する。２０℃において増殖するか、４５℃において増殖しない。

ＫＯＨ試験：　陽性アミノペプチダーゼ試験：　陰性オキシダーゼ反応：　陰性カタラーゼ反応：　陽性セラチンの加水分解：　陽性澱粉の加水分解：　陽性増殖は、下記抗生物質によって阻害される：ストレプトマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシン、ネオマイシン及びカナマイシン。増殖は、下記抗生物質によって阻害されない：ゲンタマイシン、アンピシリン、ペニシリンＧ、エリスロマイシン、ノボビオシン、オレアンドマイシン、リファンピシン、バンコマイシン及びバシトラシン。

化学有機栄養生物。酵母抽出物、ペプトン及びカサミノ酸のような複合培養基上で増殖する。

株９５ＬＭ、４好気性、グラム陰性、桿状細菌。胞子は認められない。

好塩好アルカリｆ”４，２０％ＮａＣＩを含む培地上てｐｉ（１０において増殖する。８〜３０％のＮａＣ］の存在下で増殖する。

アルカリ性、塩水性の栄養−寒天（培地Ａ）上で、凸面隆起及び全体的な縁部を育する、約２ｍｍの直径の不透明で黄色の円形コロニーを生成する。

温度　３０〜４０°Ｃにおいて最適に増殖する。２０°Ｃにおいて増殖するか、４５°Ｃにおいて増殖しない。

ＫＯＨ試験：　陽性アミノペプチダーゼ試験、　陰性オキシダーゼ反応、　陰性カタラーゼ反応−陽性セラチンの加水分解・　陽性澱粉の加水分解：　陰性増殖は、下記抗生物質によって阻害される：ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシン、ネオマイシン及びカナマイシン。増殖は、下記抗生物質によって阻害されない：アンピシリン、ペニシリンＧ、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ノボビオシン、オレアンドマイシン、リファンピシン、バンコマイシン及びバシトラシン。

非りラスター生成株本明細書中で定義された４つのクラスターのＶ、囲に属さない株は、従来知られてもなく文献に記載されてもいない新規の細菌である。１０３ＮＴ、４．３１Ｍ。

４及び９３１ＬＭ、４とコード化されるこれらの株は、好塩好アルカリ細菌のまれな種類を示す。これらの「非クラスター生成」株の説明は、これらの有機体を従来知られた及び文献記載されたその他の全ての細菌から識別することかできるように行われている。

株！　０３Ｎｔ、　４好気性、グラム陰性、桿状細菌。胞子は認められない。

好塩好アルカリで、２０％ＮａＣｌを含む培地上でｐＨ１０において増殖する。

０〜３０％ＮａＣ１の存在下で増殖する。

アルカリ性、塩水性の栄養−寒天（培地Ａ）上で、凸面隆起及び全体的な縁部を育する２〜３ｎｗｎの直径を有する不透明でオレンジ色の円形コロニーを生成する。

温度：３０〜４０℃において最適に増殖する。２０℃において増殖するか、４５ ℃において増殖しない。

ＫＯＨ試験：　陽性アミノペプチダーゼ試験：　陰性オキシダーゼ反応、　陰性カタラーゼ反応：　陽性ゼラチンの加水分解：　陽性澱粉の加水分解：　陽性増殖は、下記の抗生物質によって阻害される：ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、フシジン酸、エリストマイシン、メチシリン、オレアンドマイシン、リファンピシン、バンコマイシン及びバシトラシン。増殖は下記抗生物質によって阻害されない・ニトロフラントイン、アンピシリン、ナリジキシン酸、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、ペニシリンＧ、ノボビオシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシン、ネオマイシン及びカナマイシン。

化学有機栄養生物。酵母抽出物、ペプトン及びカザミノ酸のような複合培養基上で増殖する。増殖は、種々の単糖、アミノ酸及び有機酸により刺激される。

膜脂質は、株１０３Ｎｔ、４のニーバクテリア古細菌の性質を示す脂肪酸エステルをベースとする。

株３１Ｍ、４好気性、グラム陽性、桿状細面。胞子は認められない。

偏性の好塩好アルカリ性で、２０％ＮａＣｌを含む培地上でｐＨ１ｏにおいて増殖する。１５〜３０％ＮａＣｌの存在下で増殖する。１２％ＮａＣ１中で増殖しない。

アルカリ性、塩水性の栄養寒天（培地Ａ）上で、凸面隆起及び全体的な縁部を育する、約１ｎｎ＋直径のクリーム色の円形のコロニーを生成する。

温度、３０〜４０℃において最適に増殖する。２０℃及び４５℃において増殖するが、５０℃において増殖しない。

ＫＯＨ試験：　陰性アミノペプチダーゼ試験・　陰性オキシダーゼ反応；　陰性カタラーゼ反応、　陰性澱粉の加水分解・　陽性増殖は、下記抗生物質によって阻害される：スルファメトキサゾール、トリメトプリム、ポリミキシン、リファンピシン及びバシトラシン。増殖は、下記抗生物質によって阻害されない　ゲンタマイシン、ニトロフラントイン、アンピンリン、ナリジキシン酸、ペニシリンＧ１　クロラムフェニコール、エリスロマイシン、フシジン酸、メチシリン、ノボビオシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン及びオレアンドマイシン。

膜脂質は、株３１Ｍ、４の古細菌の性質を示すグリセロールジエーテル部分を含む。

株９３１ＬＭ、４好気性、ダラム変性、球状細菌。胞子は認められない。

好塩好アルカリ性て、２０％ＮａＣｌを含む培地上でｐＨ１ｏにおいて増殖する。０〜３０％ＮａＣｌの存在下で増殖する。

アルカリ性、塩水性の栄養−寒天（培地Ａ）上で、盛り上がった隆起及び全体的な縁部を育する１〜２ｆｆＩ１１の直径のピンク色の不規則なコロニーを生成する。

ＫＯＨ試験：　陽性オキシダーゼ反応：　陰性澱粉の加水分解：　陽性増殖は、下記抗生物質によって阻害される。ニトロフラントイン及びトリメトプリム。

増殖は、下記抗生物質によっては阻害されない：ゲンタマイシン、アンピシリン、ナリジキシン酸、ペニシリンＧ１　クロラムフェニコール、エリスロマイシン、フシジン酸、メチシリン、ノボビオシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン。

膜脂質は、株９３１ＬＭ、４の古細菌の性質を示すグリセロールジエーテル部分を含む。

クラスターの化学分類法による定義化学分類法は、系統分類学に関する細胞の化学的変形物の研究である。例えば、染色体ＤＮＡ、リポソームＲＮＡ、タンパク質、細胞壁及び膜の分析は、分類学的関係に有用な考察を与えることができ、微生物の分類法を分類するかまたは証明するその他の手段として使用されることができる（グッドフエロウ、Ｍ、及びミニキン、Ｄ、Ｅ、、　ｒｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓＪ、　（グッドフエロウ、Ｍ、及びミニキン、Ｄ、　Ｅ、編集）、アカデミツクプレス、ロンドン及びオーランド、ＦＬ、（１９８５Ｌｐ、ｌ−１５）。

コア脂質の分析今日までに同定されている古細菌の全ての膜脂質を、この微生物群の特定の分類法のマーカーとなると考えられ得る異常な構造上の特徴によって特性化する。

これまでに知られている全ての生存生物は、エステル結合に基づく膜脂質を有しているか、古細菌はエーテル結合に基づく脂質を存している（ドローサ、Ｍ、ら、膜脂質を、細菌から抽出し、ロス、Ｈ，Ｎ、　Ｍ、らにより記載された方法（（＋９８１）、ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪ　、土２３．７５〜８０）により、薄相クロマトグラフィーによって分析した。

本発明の好塩好アルカリ細菌の代表株の分析の結果を表６に示す。これらは、クラスターｌ及び２の株か脂肪酸メチルエステルを欠いているか、古細菌に特徴的なグリセロールジエチル部分を含むことを明らかに示している。クラスター３及びクラスター４の株は、脂肪酸メチルエステルを含むがグリセロールジエチル部分を含まず、ニーバクテリアとしてのそれらの同定を確認する。これらの結果は、さらに、クラスター１及び２とクラスター３及び４の細菌の間の基本的な相違点を強調する。

表６アルカリ−及び塩−耐性の酵素の産生及び用途本発明の好塩好アルカリ微生物は、種々の酵素を産生ずる（補遺り及びＥ参照）。

これらの酵素は、極端に高いｐＨ及び高塩濃度においてそれらの機能を発揮することかでき、これによりこれらの酵素はそのような環境または反応条件においてそのような酵素活性か要求される種々のプロセスにおけるそれらの用途に特異的に適したものとなる。

アルカリ−及び塩−耐性を育する酵素の種々の用途の例としては、洗剤組成物、製茶、食糧処理、廃棄物処理及び繊維工業における用途がある。これらの酵素は、生体内変換、特に純粋な鏡像体の製造に使用されることができる。

好塩好アルカリ微生物は、補遺Ｂに記載された方法を使用して、例えば、脂肪分解性、タンパク質分解性、澱粉分解性またはその他の活性を有するアルカリ−及び塩−耐性の酵素の製造のために容易にスクリーニングされることかできる。

好塩好アルカリ細菌が培養されるブロスは、典型的には、ｌまたはそれ以上の種類の酵素活性を含む。ｌまたは複数の酵素を含むブロスは、例えば遠心分離または濾過により、それから細菌を除去した後、所望のプロセスに直接使用されることかできる。

所望により、培養物の濾液は、透析前または透析後に凍結乾燥により、または限外濾過により濃縮されることかできる。この酵素は、沈殿または濾過により回収されることができる。代替的には、ブロス中に含まれるｌまたは複数の酵素は、所望のプロセスに応用される前に、例えば、クロマトグラフィーにより、またはゲル電気泳動により単離及び精製されることかできる。

これらのアルカリ−及び塩−耐性酵素をコードする遺伝子は、単離され、クローニングされ、適合可能な表現宿主において表現させられ、所望により容易に精製されて所望の工業上の用途に使用されることかでき、野性型の株か十分量の所望の酵素を産生ずることかできないか、または十分に発酵しない高容量の酵素製品の起源を提供することができる。

ｌの具体例において、この酵素調製物は、酵素活性の効力を決定する洗浄試験において使用されることかできる。

好塩好アルカリ細菌由来の酵素調製物は、例えば、タンパク質−１脂質−及び／または澱粉−書育成分で汚染された綿布キレを使用する特別に開発されたミニ− 洗浄試験においてテストされることかできる。洗浄試験の前に、この布キレをアニオン表面活性剤、過ホウ酸ナトリウム及び漂白活性剤（ＴＡＥＤ）を含む溶液により前処理されることかできる。この処理の後に、試験布キレを脱塩流水中ですすぎ、空気乾燥する。この処理の結果、汚れか固定され、その除去がより困難になる。

この洗浄試験は、試験布キレの存在下で、定義された洗剤組成物及び特定量の酵素活性を使用して行うことかできる。洗浄後に、布キレを脱塩流水中ですすぎ、空気乾燥する。試験布キレの反射率を光度計を使用して測定する。

補　遺　Ａネ（固形培地がめられる場合）補　遺　Ａ（続き）補遺Ｂ細菌の懸濁液を、アルカリ性、塩水性の栄養寒天（培地Ａ）上に広げ、３７℃において培養した。コロニーを７〜１４日後に調べた。

細菌の細胞を、適当に増殖するまで、アルカリ性、塩水性の栄養ブロス（寒天なしの培地Ａ）中で培養した。細胞を、遠心分離機中で遠心沈降させ、少量の新鮮な培地中に再懸濁した。１滴の細菌懸濁液を、顕微鏡のスライド上で空気乾燥させた。ダラム染色試験を、対比染色剤としてのサフラニンを使用してデュソールトの変形例（ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＪ　、ヱ且、４８４〜４８５．１９５５）により行った。

４４４〜４４８．１９８１に記載された方法により、アルカリ性、塩水性の栄養寒天（培地Ａ）上で増殖した７〜１４日齢の細菌培養物上で、２０％ＮａＣ１＋１％ＮａｚＣＯｓ中の３％ＫＯＨを使用して行い、２０％ＮａＣ１＋１％ＮａｚＣＯｓのみを含む溶液中の反応と比較した。

本試験は、診断用の試験片Ｂａｃｔｉｄｅｎｔ［Ｆ］アミノペプチダーゼ（Ｅ、メルク、ドイツ国ダームスタット）を使用して行った。３０分以内の黄色を、陽性反応として記録した。

Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、Ｎ１−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンの１％水性溶液て湿潤した濾紙またはオキシダーゼ同定ディスク（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ　フランス国シャボニエルーレーペン）に、アルカリ性、塩水性の栄養寒天由来の若い細菌培養物を塗った。１分間以内の紫色を、陽性反応として記録した。Ｅ、ｃｏｌｉを陰性の対照として使用した。

アルカリ性、塩水性の栄養寒天由来の細菌コロニーを１滴の３％過酸化水素溶液またはｒｌＤ色カタラーゼ」試薬（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）中に懸濁した。放出された酸素の泡を陽性反応として記録した。

木炭−ゼラチンディスク（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕＸ）または「チャーゲルズ」　（オキソイド）を、アルカリ性、塩水性の栄養ブロス（培地Ａ）中で、細菌とともに３７℃においてインキュベートした。黒色の堆積物は陽性反応を示す。

８、特性番号２１及び３９スキムミルク及び澱粉加水分解試験細菌を、５．０　ｇ／　１のスキム粉末またはＩｇ／ｌの澱粉を補ったアルカリ性、塩水性の栄養寒天（培地Ａ）上に接種し、３７℃においてインキュベートした。

他の部分では不透明な寒天における細菌コロニー周辺の透明な領域を陽性反応として記録した。澱粉加水分解のゾーンは、ヨウ素溶液（ルゴール）による染色により確認した。

２つの方法を使用した。

（ａ）細菌株を、０％、４％、８％、１２％、１５％、２０％、２５％または３０％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣ１を含むアルカリ性の栄養寒天（培地Ａ）上で３７°Ｃにおいて培養した。寒天プレートを、７〜１４日後の細菌増殖について調べた。

（ｂ）細菌株を、０％、４％、８％、１２％、１５％、２０％、２５％または３０％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣｌを含むアルカリ性の栄養寒天（培地Ａ）中で、３７° Ｃ（ごおいて培養した。細菌の増殖を、クレットメーター（緑色フィルター）を、使用する光学濃度測定により１４日まで定期的にモニターした。

細菌株を、アルカリ性、塩水性の栄養ブロス（培地Ａ）中に接種し、１０°Ｃ１１５℃、２０°Ｃ１４５℃または５０℃においてインキュベーションした。細菌の増殖を、クレットメーター（緑色フィルター）を使用する光学濃度測定により１４日まて定期的にモニターした。

酵母抽出物、１．０　；　ＫＮＯｓ、１．０　；　ＫＣＩ、　２．　Ｏ；　Ｍｇ５Ｏ，・７８２０．１．　Ｏ；　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２０，０，０００３６；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０，０，０５；　ＮａＣ１，２００，Ｏ；　Ｎａ、ＣＯ，，１８，５、寒天、２０．０からなる最小培地Ｃｇ／Ｉ蒸留水）に、試験対象の炭水化物２．０ｇ／ｌを補い、四角形のペトリ皿中に注いだ。

アルカリ性、塩水性の栄養ブロス（培地Ａ）中の細菌懸濁液１．０ｍｌから、２５点の多重点接種装置を使用して細菌を接種した。寒天プレートを、３７°Ｃにおいて１４日までインキュベートした。炭水化物補給物を含む最小栄養培地上での細菌の増殖と、試験対象の炭水化物を含まない最小培地上での増殖とを比較することによって、結果を記録した。

試験３２〜３８と同じ技術を使用した。

好塩好アルカリ細菌細胞を、アルカリ性、塩水性の栄養ブロス（培地Ａ）中に懸濁すること以外は、製造者の指示に従って使用される商業的に入手可能な試験片Ａ　Ｐ　Ｉ　Ｚ　ＹＭ　（Ａ　Ｐ　Ｉ−ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を利用した。試験片を３７°Ｃにおいて４時間インキュベートした。

１４、特性番号７１〜９１アルカリ性、塩水性の栄養ブロス中の細菌の少量の懸濁液を、アルカリ性、栄養、塩水性寒天（培地Ａ）の表面上に塗り、乾燥させた。商業的に入手可能な抗生物質感受性試験ディスク（オキソイドまたはマストラボラトリーズ、英国マーシーサイト）を、寒天の表面に与えた。細菌を３７℃において１４日まで培養した。抗生物質ディスクの回りの透明なゾーンは、感受性を示し、陽性と記録した。

商業的に入手可能な試験片ＡＴ８３２ＯＮ　（ＡＰＩ−ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ：フランス国うバルムレグロット）を利用した。与えられた基礎培地の瓶へ２０％ＮａＣ１及び１％ＮａｔＣＯｉを含む溶液１．０ｍｌを添加すること以外は、製造者の指示に従ってその試験片を使用した。試験片を３７℃において４８時間インキュベートした。

補　遺　Ｃ数量分類法による分析のための単位試験コロニーの縁部（ｍａｒｇｉｎ）　１２　全体　ｉ　。

細胞の形！！Ｉ　１３　桿状＝１　球状＝ＯＫＯＨ試験　１６　１　０力タラーゼ反応　１９　１　０ゼラチン加水分解　２０　１　０スキムミルク試験　２１　、　１　０補　遺　Ｃ（続き）補　遺　Ｃ（続き）数量分類法による分析のための単位試験補　遺　Ｃ（続き）数量分類法による分析のための単位試験補　遺　Ｄ補　遺　Ｄ（続き）補　遺　Ｄ（続き）株　＃粉加水分解　エステラーゼリパーゼ　リバーセ株　澱粉加水分解　エステラーゼリパーゼ　リパーゼｎ、　ｔ、　＝試験せず培地Ｂ−Ｆ　（補遺Ａ）上で、特性２０（補遺Ｂ）により決定されたタンパク質分解活性特性３９により決定された澱粉加水分解　（補遺Ｂ）特性５４により決定されたエステラーゼリパーゼ活性　（補遺Ｂ）特性５５により決定されたリパーゼ特性　（補遺Ｂ）補　遺　Ｅ補　遺　Ｅ（続き）補　遺　Ｅ（続き）非加重平均結合共表現相関関係・１フＩ！Ｆｉｇｕｒｅ　１非加重平均結合共表現相関関係・υ１ｕＦｉｇｕｒｅ　２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：０１）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．アルカリ耐性及び塩耐性酵素の産生に有用な純粋な細菌培養物であって、細菌が、ａ）下記試験における陽性反応：１）カタラーゼ２）１５％〜２５％ＮａＣｌ中での増殖３）エステラーゼ４）エステラーゼリパーゼ５）ロイシンアリールアミダーゼ６）ノボビオシン７）バチトラシン；ｂ）下記試験に対する陰性反応：１）オキシダーゼ２）４％ＮａＣｌ中での増殖３）アルカリホスファターゼ４）酸ホスファターゼ５）アンピシリン６）ペニシリンＧ７）クロラムフェニコール８）オレアンドマイシン９）バンコマイシンを与える、好気性の好塩好アルカリ細菌からなる前記培養物。
２．好気性の好塩好アルカリ細菌からなる、アルカリ耐性及び塩耐性の酵素の産生に有用な純粋な細菌培養物であって、細菌が、ａ）下記試験における陽性反応：１）ＫＯＨ試験２）１２％〜３０％ＮａＣｌ中での増殖３）エステラーゼ４）エステラーゼリパーゼ５）ロイシンアリールアミダーゼ；ｂ）下記試験における陰性反応：１）０％ＮａＣｌ中での増殖２）アンピシリン３）ペニシリンＧ４）クロラムフェニコール５）オレアンドマイシン６）バンコマイシンを与える前記培養物。
３．好気性の好塩好アルカリ細菌からなる、アルカリ耐性及び塩耐性酵素の産生に有用な純粋な細菌培養物であって、細菌が、ａ）下記試験における陽性反応：１）コロニー、円形、凸面伏、完全（ｅｎｔｉｒｅ）２）ＫＯＨ試験３）カタラーゼ４）１５％〜３０％ＮａＣｌ中での増殖５）２０℃またはそれ以下における増殖６）澱粉加水分解７）エステラーゼ８）エステラーゼリパーゼ９）ロイシンアリールアミダーゼ１０）アンピシリン１１）ペニシリンＧ１２）クロラムフェニコール１３）オレアンドマイシン１４）バンコマイシン１５）バシトラシン；ｂ）下記の試験における陰性反応：１）オキシダーゼ２）０％ＮａＣｌ中での増殖３）アルカリホスファターゼ４）酸ホスファターゼを与える、前記培養物。
４．好気性の好塩好アルカリ細菌からなる、アルカリー耐性及び塩耐性酵素の産生に有用な純粋な細菌培養物であって、細菌が、ａ）下記試験における陽性反応：１）コロニー、円形、凸面伏、完全２）カタラーゼ３）ゼラチン加水分解４）１２％〜３０％ＮａＣｌ中での増殖５）エステラーゼ６）エステラーゼリパーゼ７）ペニシリンＧ８）クロラムフェニコール９）ノボビオシン１０）オレアンドマイシン１１）バシトラシンｂ）下記試験における陰性反応：１）赤色またはピンク色のコロニー２）澱粉加水分解３）アルカリホスファターゼを与える前記培養物。
５．アルカリ耐性及び塩耐性の酵素の産生に有用な純粋な細菌培養物であって、細菌が、下記特徴；ａ）アルカリ性、塩水性の栄養寒天上で、凸面状の隆起及び全体的な縁部を有し、２〜３ｍｍの直径の、不透明でオレンジ色の円形コロニーを生成し、ｂ）２０ ℃（％）において増殖し、ｃ）４５℃では増殖せず、ｄ）ＫＯＨ試験は陽性であり、ｅ）アミノペプチダーゼ試験は陰性であり、ｆ）オキシダーゼ試験は陰性であり、ｇ）カタラーゼ試験は陽性であり、ｈ）０％〜３０％ＮａＣｌの存在下で増殖し、ｉ）ゼラチンの加水分解が陽性であり、ｊ）澱粉の加水分解が陽性であり、ｋ）増殖が下記抗生物質により阻害され：１）ゲンタマイシン２）クロラムフェニコール３）フシジン酸４）エリスロマイシン５）メチシリン６）オレアンドマイシン７）リファンシピン８）バンコマイシン９）バシトラシン１）増殖が下記抗生物質によって障害されず：１）ニトロフラントイン２）アンピシリン３）ナリジキシン酸４）スルファメトキサゾール５）トリメトプリム６）ペニシリンＧ７）ノボビオシン８）ストレプトマイシン９）テトラサイクリン１０）ポリミキシン１１）ネオマイシン１２）カナマイシンｍ）単糖上で増殖し、ｎ）アミノ酸上で増殖し、ｏ）有機酸上で増殖し、ｐ）酵母抽出物及びペプトン上で増殖し、ｑ）脂肪酸エステルをベースとする膜脂質を含むを有する好気性、グラム陰性、桿状の好塩好アルカリ細菌からなる前記培養物。
６．アルカリ耐性及び塩耐性酵素の産生に有用な純粋な細菌培養物であって、細菌が、下記特徴：ａ）アルカリ性、塩水性の栄養寒天上で、凸面伏の隆起及び全体的な縁部を有する１ｍｍより大きい直径のクリーム色の円形コロニーを生成し；ｂ）２０℃において増殖し、ｃ）４５℃において増殖し、ｄ）ＫＯＨ試験は陰性で、ｅ）アミノペプチダーゼ試験は陰性で、ｆ）オキシダーゼ試験は陰性で、ｇ）カタラーゼ試験は陰性で、ｈ）偏性好塩性で、ｉ）１５％〜３０％のＮａＣｌの存在下で増殖し、ｊ）澱粉の加水分解が陽性で、ｋ）増殖が下記抗生物質によって阻害されず：１）ゲンタマイシン２）ニトロフラントイン３）アンピシリン４）ナリジキシン酸、５）ペニシリンＧ６）クロラムフェニコール７）エリスロマイシン８）フシジン酸９）メチシリン１０）ノボビオシン１１）ストレプトマイシン１２）テトラサイクリン１３）オレアンドマイシン１）増殖が下記抗生物質によって阻害され：１）スルファメトキサゾール２）トリメトプリム３）ポリミキシン４）リファンピシン５）バシトラシンｍ）酵母抽出物及びペプトン上で増殖し、ｎ）グリセロールジエーテル部分を有する膜脂質を含むを有する、好気性、グラム陰性、桿状の好塩好アルカリ細菌からなる前記培養物。
７．アルカリ耐性及び塩耐性の酵素の産生に有用な純粋な細菌培養物であって、細菌が、下記特徴：ａ）アルカリ性、塩水性の栄養寒天上で、盛り上がった隆起と全体的な縁部を有する１〜２ｍｍの直径の、ピンク色の不規則なコロニーを生成し：ｂ）ＫＯＨ試験は陽性であり、ｃ）オキシダーゼ試験は陰性であり、ｄ）０％〜３０％のＮａＣｌの存在下で増殖し、ｅ）澱粉の加水分解は陽性であり、ｆ）増殖が、下記抗生物質により阻害され：１）ニトロフラントイン２）トリメトプリムｇ）増殖が下記抗生物質によって阻害されず：１）ゲンタマイシン２）アンピシリン３）ナリジキシン酸４）ペニシリンＧ５）クロラムフェニコール６）エリスロマイシン７）フシジン酸８）メチシリン９）ノボビオシン１０）ストレプトマイシン１１）テトラサイクリンｈ）酵母抽出物及びペプトン上で増殖し、ｉ）グリセロールジエーテル部分を有する膜脂質を含むを有する、好気性、グラム変性、球状の好塩好アルカリ細菌である前記培養物。
８．下記：請求の範囲第１項に記載の細菌を培養培地中で培養し；前記細菌を前記培養培地から分離し；次いで前記培養培地から酵素活性を回収するを含むアルカリー及び塩−耐性酵素の製造方法。
９．下記：請求の範囲第２項の細菌を培養培地中で培養し；前記細菌を培養培地から分離し；次いで前記培養培地から酵素活性を回収するを含むアルカリー及び塩−耐性酵素の製造方法。
１０．下記：請求の範囲第３項の細菌を培養培地中で培養し；前記細菌を前記培養培地から分離し；次いで前記培養培地から酵素活性を回収するを含むアルカリー及び塩−耐性酵素の製造方法。
１１．下記：請求の範囲第４項の細菌を培養培地中で培養し；前記細菌を前記培養培地から分離し；次いで前記培養培地から酵素活性を回収するを含むアルカリー及び塩−耐性酵素の製造方法。
１２．下記：請求の範囲第５項の細菌を培養培地中で培養し：前記細菌を前記培養培地から分離し；次いで前記培養培地から酵素活性を回収するを含むアルカリー及び塩−耐性酵素の製造方法。
１３．下記：請求の範囲第６項の細菌を培養培地中で培養し；前記細菌を前記培養培地から分離し；次いで前記培養培地から酸素活性を回収するを含むアルカリー及び塩−耐性酵素の製造方法。
１４．下記：請求の範囲第７項の細菌を培養培地中で培養し；前記細菌を前記培養培地から分離し；次いで前記培養培地から酵素活性を回収するを含むアルカリー及び塩−耐性酵素の製造方法。
１５．酵素が、蛋白質分解、脂肪分解及び澱粉分解活性からなる群から選択される活性を有する請求の範囲第８項に記載の酵素の実質的に純粋な調製品。
１６．酵素が、蛋白質分解、脂肪分解及び澱粉分解活性からなる群から選択される活性を有する請求の範囲第９項に記載の酵素の実費的に純粋な胆製品。
１７．酸素が、蛋白質分解、脂肪分解及び製粉分解活性からなる群から選択される活性を有する請求の範囲第１０項に記載の酸素の実質的に純粋な調製品。
１８．酵素が、蛋白質分解及び脂肪分解活性からなる群から選択される活性を有する請求の範囲第１１項に記載の酵素の実質的に純粋な調製品。
１９．酵素が、蛋白質分解、脂肪分解及び澱粉分解活性からなる群から選択される活性を有する請求の範囲第１２項に記載の酵素の実質的に純粋な調製品。
２０．酵素が、脂肪分解及び澱粉分解活性からなる群から選択される活性を有する請求の範囲第１３項に記載の酵素の実質的に純粋な調製品。
２１．酵素が、蛋白質分解、脂肪分解及び澱粉分解活性からなる群から選択される活性を有する請求の範囲第１４項に記載の酵素の実質的に純粋な調製品。