CN116355783B - 粘质沙雷氏菌及其应用 - Google Patents

粘质沙雷氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)在制备生物酶添加剂方面的应用，其中，所述粘质沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 20221041。本申请的粘质沙雷氏菌发酵产生的生物酶，可以将许多污渍中的大分子成分分解为小分子，利于表面活性剂作用，提高去污力；且无毒环保，对人体无害，可应用于婴幼儿衣物、内衣裤及餐具的洗涤；其性价比高、来源广泛、环境友好，可以为洗涤行业发展提供一个良好的思路。

Description

粘质沙雷氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种细菌，特别地涉及一种粘质沙雷氏菌及其应用。
背景技术
在日常生活中，衣物及餐具的洗涤是一个无法避开的问题，虽然随着社会的进步，己经可以利用机器代替人力进行衣物及餐具洗涤，但是洗涤过程中的洗涤剂选择仍然是个问题。
洗涤剂中的主要成分是表面活性剂，表面活性剂同时具有亲水基和疏水基，在洗涤过程中，多个表面活性剂分子包裹衣物及餐具上的污渍，疏水基与污渍结合，而亲水基与水分子结合，从而形成一个胶束团，再经过机械摩擦运动，将胶束团从衣物上除去，达到净洗的效果。
但是这个过程中存在一个不足，那就是表面活性剂可以很容易的和小分子物质形成胶束团，但是对于大分子的污渍力有不逮，需要添加更多的表面活性剂，这势必会对环境造成更坏的影响。
另外，为去除大分子而添加大量表面活性剂后，漂洗过程中难以完全使其去除。当洗涤对象为婴幼儿衣物、内衣裤及餐具等敏感物品时，大量表面活性剂的残留势必会损害接触其的人类的身体健康。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)在制备生物酶添加剂方面的应用，其中，所述粘质沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20221041。
一种生物酶添加剂，其来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵液、或者粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵液清液、或者粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)发酵液中的蛋白酶，其中，所述粘质沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20221041。
如上所述的生物酶添加剂，进一步包括：辅料；所述辅料包括：水和/或Pbs缓冲液。
一种洗涤剂，包括如上任一所述的生物酶添加剂。
如上所述的洗涤剂，其中，蛋白酶的含量为400-1000U/mL。
如上所述的生物酶添加剂作为洗涤剂的生物酶添加剂方面的用途。
如上所述的用途，所述洗涤剂为普通衣物洗涤剂、或者婴幼儿专用洗涤剂、或者内衣裤专用洗涤剂。
如上所述的用途，所述洗涤剂为餐具洗涤剂。
一种如上所述的生物酶添加剂的制备方法，包括：发酵粘质沙雷氏菌，获得发酵液；分离发酵液中的蛋白酶，或者包含所述蛋白酶的清液。
如上所述的方法，其中，发酵温度为25-40℃；发酵时间为24-60h。
本申请具有以下有益技术效果
1.粘质沙雷氏菌对环境和人体健康无害，在普通LB培养基上即可生长，易培养，生长周期短，因此可在短时间内大量制备生物酶碱，具有成本低，效益高的特点。
2.粘质沙雷氏菌的发酵液中的生物酶易获得。且酶作为一种天然的生物制剂，在自然环境中没有污染，而且够自然降解，对于环境没有污染。
3.可将粘质沙雷氏菌改造成底盘微生物细胞，成为可以大量生产生物酶的微生物细胞工厂。
本申请的粘质沙雷氏菌发酵产生的生物酶，可以将许多污渍中的大分子成分分解为小分子，利于表面活性剂作用，提高去污力；且无毒环保，对人体无害，可应用于婴幼儿衣物、内衣裤及餐具的洗涤；其性价比高、来源广泛、环境友好，可以为洗涤行业发展提供一个良好的思路。
附图说明
下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
图1是根据本发明的一个实施例的对从土壤中分离的产碱性蛋白酶菌的鉴定；其中，图1是用16S引物对基因组DNA进行特异性扩增所获得PCR产物的凝胶电泳分离图谱；
图2是根据本发明的一个实施例的通过序列比对后获得细菌的系统进化树；通过序列比对分析，鉴定所获取的细菌是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；以及
图3是根据本发明的一个实施例粘质沙雷氏菌的发酵液中获得的碱性蛋白酶的去污效果实验。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑的改变。
本申请中涉及的术语具有以下含义：
本申请所说的“粘质沙雷氏菌”又称灵杆菌，是一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中，并广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。
在本申请中，粘质沙雷氏菌分离自海南红树林土壤，为本实验室自行分离、保藏。在本申请中，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20221041。
本申请所说的“发酵液”是指菌经发酵后产生的具有发酵产物的液体，在本申请中，发酵液由粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵产生的具有生物酶活性的液体。在一些实施例中，粘质沙雷氏菌发酵液为粘质沙雷氏菌经25-40℃，24-60h培养所得OD600为6.0-4.0时的发酵液。在一个实施例中，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵液为粘质沙雷氏菌以200ml菌液(初始OD约为0.02OD600/ml)/500ml LB培养基的装液量，在30℃下以150r/min转速培养约48h得到的发酵产物。本领域技术人员应当了解，此处菌液体积及LB培养基的装液量为根据实验条件设置，并不对本申请做任何限制。发酵结束后，离心去除沉淀，收集发酵上清液，然后用滤膜过滤，即得到无菌的发酵滤液。在一个实施例中，滤膜的直径为0.15-0.4μm；进一步地，滤膜的直径为0.22μm。本领域技术人员应当了解，其直径可以过滤菌液，进一步将细菌与发酵上清液分离的滤膜均可以用以过滤菌液。
本申请所说的“生物酶”为粘质沙雷氏菌经发酵后产生的生物酶。在一些实施例中，生物酶为粘质沙雷氏菌发酵后产生的碱性蛋白酶。当将其与蛋白质接触时，可将蛋白质分解。在一些实施例中，生物酶是通过发酵液离心、硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析所得的碱性蛋白酶。
本申请所说的“生物酶添加剂”中可以仅包括上述生物酶，也可以是包括上述生物酶的发酵液，或者包括上述生物酶的发酵液的清液。在一些实施例中，生物酶添加剂中包括上述生物酶及辅料，所述辅料进一步为水和/或Pbs缓冲液。因此生物酶添加剂可以用于洗涤剂的添加剂，用以增强洗涤剂的去除蛋白质类污渍的能力。在一些实施例中，生物酶
本申请所说的“污渍”为以蛋白质作为主要成分的污渍，如分泌物、汗渍、奶渍、血渍、口水、鼻涕、痰液、呕吐物、尿渍、粪便、脓血、性腺排泄物、蛋液、油污等。
本申请所述的“洗涤剂”可以为衣物洗涤剂、餐具洗涤剂等，其内添加上述生物酶添加剂。在一些实施例中，在洗涤剂中添加生物酶添加剂后，洗涤剂中蛋白酶的含量为400-1000U/mL。在一些实施例中，在洗涤剂中添加生物酶添加剂后，洗涤剂中蛋白酶的含量为700U/mL。
本申请所说的“硫酸铵沉淀”是指用不同浓度硫酸铵溶液对蛋白质进行沉淀和分离的技术，常用于分离免疫球蛋白。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
本申请所说的“16S引物鉴定细菌”是指运用PCR及序列比对等方法，确定待测细菌的种类。
本申请所说的“16S rDNA”是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。
细菌中包括三种核糖体RNA，分别为5S、16S和23S rRNA。其中，5S rRNA虽易分析，但核苷酸数量太少，仅几十个核苷酸组成，导致遗传信息不足而不能用于分类研究；23SrRNA则因其分子量太大，所含有的核苷酸数量几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难而不选择其进行分类研究。通常将16S rRNA用于细菌分类研究。
首先，16S rRNA普遍存在于原核生物(真核生物中其同源分子是18S rRNA)中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16SrRNA的相对分子量大小适中，约2kb个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
16S rRNA的编码基因是16S rDNA，直接从细菌中提取16S rRNA很困难，且提取的RNA易降解，不易保存等，因而通常利用16S rDNA鉴定细菌的种类。
本申请所述的“OD值”或“OD600”具有相同的含义，均为optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收的光密度。测量细菌培养液在600nm处的吸光值用OD600表示，可以测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以600nm处的光密度值可以用于表示菌体细胞密度，其中，吸光值正比于培养液中的细菌的浓度。
本申请所述“LB培养基”，L、B即为Luria-Bertani的缩写。LB培养基是一种常用的细菌培养基，是一种半合成培养基，其成分包括：酵母提取物、蛋白胨、琼脂、水、氯化钠等。
早在1913年时德国专利就提出在洗涤剂中加入含胰蛋白酶的动物胰脏分泌液，并率先提出了加酶洗涤剂的概念。1963年，荷兰制出一种性质良好的酶制剂，加入洗涤剂中制成加酶洗涤剂。酶能把组织上的蛋白质分解成可溶性氨基酸，这样蛋白质污垢十分容易被洗掉。随着洗衣液配方技术的发展，无论是洗衣粉或是洗衣液，生物酶制剂逐步成为配方中不可缺少的助洗剂。
自从碱性蛋白酶在猪的胰脏中被发现以来，由于其广泛的用途开始被人们所关注。然而早期通过大量宰杀牲畜获得碱性蛋白酶产量过低且成本巨大，直到1945年瑞士的Dr Jaag等发现了微生物碱性蛋白酶后，才使碱性蛋白酶大规模生产成为可能，微生物由于其广泛的生物化学多样性和对遗传操作的特异性是酶的优异来源。微生物发酵的蛋白酶比从植物和动物中提取的蛋白酶性能上更优质，因为它们具有生物技术应用所需的几乎全部特征。
生物酶制剂来源天然，属于纯生物制剂，虽然其市场售价较高，但是其在洗衣液配方中的添加量少，只需要很少量就可以实现良好的去污效果。相比于表面活性剂，其性价比更高。而且生物酶制剂的来源比较广泛，均来源于大自然，这样在生产和制造的过程中就不会产生环境问题，也就是说该产品属于环境友好型的绿色产品。因此，在液体洗涤剂中加入生物酶已经成了热门研究方向，为解决该行业发展问题提供了一个良好的思路。
本申请中，使粘质沙雷氏菌发酵，收集发酵液。获得发酵液中的生物酶，即蛋白酶；或者含有该生物酶的发酵液清液。进一步将其用于洗涤剂的添加剂。
以下将通过实施例对本申请技术方案详细描述。
实施例1，土壤菌株的分离、纯化
根据本申请的一个实施例，可以从可能存在碱性蛋白酶生产菌的任何土壤中分离、纯化细菌，检测其产酶特性。根据本申请的一个实施例，取海南近海贝类养殖基地土壤，并对其中的细菌分离、纯化。
1.制备土壤稀释液。称取适量的土壤。此处所说土壤为提前从海南近海贝类养殖基地取回的可能含有碱性蛋白酶生产菌的土壤。根据本申请的一个实施例，也可以直接在野外称取土壤。根据本申请的一个实施例，可以称取10g土壤。将称取的土壤放入无菌水中，打碎，后静置30分钟以上，充分析出土壤中的微生物。根据本申请的一个实施例，称取10g土壤，将其混于100mL无菌水中。得到的上清液即为土壤原液。
然后将土壤原液稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍等。根据本申请的一个实施例，按上述方式稀释，即可得到1g、10-1g、10-2g、10-3g、10-4g、10-5g、10-6g等土壤中微生物含量。此步骤便于获得土壤中微生物的单克隆。例如，根据本申请的一个实施例，吸取10mL土壤原液于0号试管中，再从本试管中吸取1mL土壤原液，混合于装有9mL无菌水的1号试管中，充分混合，是以将土壤原液稀释10倍。依次操作，即可得到土壤原液稀释102倍、103倍、104倍、105倍、106倍的溶液。按土壤原液的稀释倍数，将试管分别标号为0，1，2，3，4，5，6。
2.涂板。即，将步骤1中各试管中的微生物，涂布于固体培养基上。根据本申请的一个实施例，从步骤1制作的7个试管中分别吸取溶液，移送至细菌固体培养基表面，并用刮刀、玻璃棒等工具将溶液其涂布均匀。晾晒至培养基表面较干燥，无液体状态后，将培养基封装。根据本申请的一个实施例，可利用封口膜封装。根据本申请的一个实施例，根据实验及统计的需求，可以将每个稀释度的溶液涂布于多个固体培养基表面。例如将每个稀释度的溶液均涂布于3个固体培养基表面。
3.微生物培养。将涂布细菌的固体培养基放置于合适环境中，待长出可见单克隆菌落后，取出。根据本申请的一个实施例，可以将细菌放置30摄氏度恒温环境中培养，如30摄氏度恒温箱，水浴等，培养12小时以上。也可以将细菌放置在28摄氏度环境中培养，如28摄氏度恒温箱，水浴等，培养48小时以上。
4.计数及菌落描述。计算每个固体培养基表面菌落个数，观察其菌落形态特征，并记录结果。例如，0号试管中为直接吸取的10mL土壤原液，将其涂覆于固体培养基上，培养得到的菌落数目即为1g土壤中细菌数；1号试管中液体为将0号试管中溶液稀释10倍得到的，所以将其涂覆于固体培养基上，培养得到的菌落数目即为0.1g土壤中细菌数，其他试管以此类推。
5.平板划线分离。将上述步骤中得到的菌落划线分离，置于适合温度重新培养。如此操作，不仅可以将单克隆菌种分离，还可以对单克隆菌种扩繁和保存，且利于后续测序、分类试验。
6.菌种保存和鉴定。
实施例2，鉴定菌株种类
根据本申请的一个实施例，可以用16S通用引物对菌株种类进行初步鉴定。根据本申请的一个实施例，可以直接将菌株作为底物进行菌种鉴定，也可以先提取基因组DNA，将基因组DNA作为底物进行菌种鉴定。根据本申请的一个实施例，使用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的细菌基因组DNA含量、品质。
1.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增。根据本申请的一个实施例，可自行设计鉴定菌株种类的PCR引物。根据本申请的一个实施例，也可以选择常用的细菌鉴定通用引物进行PCR扩增。根据本申请的一个实施例，选用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，其中27F和1492R的DNA序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
根据选取的不同DNA聚合酶，选择适合的PCR反应体系以及反应条件。本申请不限定任何种类DNA聚合酶的使用，也不限定使用同一种DNA聚合酶后PCR反应体系与反应条件。例如，选用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增时，可参考如表1所列的反应体系：
表1.PCR体系表(12μL)
PCR的反应条件为：首先进行预变性，条件为94℃、5min，然后进入循环程序，每个循环程序是94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，进行30个循环，最后72℃保温7min。
根据本申请的一个实施例，使用琼脂糖凝胶电泳检测以提取的基因组DNA为模板经16S通用引物进行PCR后得到的DNA片段的含量与品质。图1为根据本申请的一个实施例为根据所提取的细菌基因组DNA为模板经16S通用引物进行PCR后得到的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。3组实验均得到条带单一、浓度符合后续测序鉴定需求的PCR产物。
2.菌株种类鉴定。根据本申请的一个实施例，可以对上述实验得到的PCR产物测序处理。将得到的测序结果与现有菌种序列进行比对，最终得到所鉴定菌株的种类。例如，将测序得到的结果输入至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast，即可得到所鉴定菌株种类。图2是根据本申请的一个实施例的采用16S引物对所分离的菌株进行PCR扩增获得16S rDNA，并通过序列比对后获得的系统进化树，鉴定得到的菌是粘质沙雷氏菌。根据图2中所示的系统进化树，可以很清晰的看出本申请的粘质沙雷氏菌与其他种属的进化关系。
实施例3，碱性蛋白酶的去污能力测试
将100％棉布裁剪成几个完全相同的7×7cm的布片，分别滴1mL新鲜蛋黄液和动物血液，使其完全自然风干。将染色的棉织物置于含有100mL洗涤剂(a、b、c、d、e)的烧杯中，在40℃下浸泡15min。然后模拟洗涤条件，在30℃下，120r/min洗涤10min。用清水冲洗三次。在室温下晾干，将处理前后的白色棉布片拍照对比。洗涤剂a:水/洗涤剂b:商业洗涤剂/洗涤剂c:商业洗涤剂(高温处理)/
洗涤剂d:商用洗涤剂+酶/洗涤剂e:商业洗涤剂(高温处理)+酶。
图3是根据本申请的一个实施例的粘质沙雷氏菌的发酵液中获得的碱性蛋白酶的去污效果实验。在商业洗涤剂中添加碱性蛋白酶(d)，对血渍、蛋黄都有很好的去除效果；将商业洗涤剂中原有的酶添加剂高温失活，添加本研究纯化的碱性蛋白酶(e)仍得到了良好的去污效果；而单独使用商业洗涤剂(b)时，仍有明显的血迹污渍未去除。碱性蛋白酶与商业洗涤剂的联合使用，可以明显去除血渍和蛋黄污渍。上述结果表明本研究中纯化的酶可能用于洗涤剂配方中的生物酶添加剂。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

Claims (10)

1.粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)在制备生物酶添加剂方面的应用，其中，所述粘质沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 20221041。
2.一种生物酶添加剂，其来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵液、或者粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵液清液、或者粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵液中的蛋白酶，其中，所述粘质沙雷氏菌于2022年7月6日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC M 20221041。
3.根据权利要求2所述的生物酶添加剂，进一步包括：辅料；所述辅料包括：水和/或Pbs缓冲液。
4.一种洗涤剂，包括如权利要求2-3任一所述的生物酶添加剂。
5.根据权利要求4所述的洗涤剂，其中，蛋白酶的含量为400-1000U/mL。
6.如权利要求2所述的生物酶添加剂作为洗涤剂的生物酶添加剂方面的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，所述洗涤剂为普通衣物洗涤剂、或者婴幼儿专用洗涤剂、或者内衣裤专用洗涤剂。
8.根据权利要求6所述的用途，所述洗涤剂为餐具洗涤剂。
9.一种如权利要求2所述的生物酶添加剂的制备方法，包括：
发酵粘质沙雷氏菌，获得发酵液；
分离发酵液中的蛋白酶，或者包含所述蛋白酶的清液。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，发酵温度为25-40℃；发酵时间为24-60h。
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