CN101805709B - 一株产过氧化氢酶菌株及利用该菌株以柠檬酸为碳源发酵产酶的方法 - Google Patents

一株产过氧化氢酶菌株及利用该菌株以柠檬酸为碳源发酵产酶的方法 Download PDF

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Abstract

一株产过氧化氢酶菌株及利用该菌株以柠檬酸为碳源发酵产酶的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一株高产过氧化氢酶的菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens SYBC08)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 3449。同时还发明了以该菌为出发菌种，经种子培养和以柠檬酸为碳源产酶发酵生产过氧化氢酶的技术，发酵液最高酶活可达20000U/mL以上。所产过氧化氢酶可广泛应用于食品、工业废水处理等领域。

Description

一株产过氧化氢酶菌株及利用该菌株以柠檬酸为碳源发酵产酶的方法
技术领域
本发明利用一株高产过氧化氢酶的粘质沙雷菌株(Serratia marcescens)SYBC08及利用该菌株以柠檬酸为碳源发酵生产过氧化氢酶的方法，所制备的酶能被应用于食品和工业废水处理等方面，属于生物技术领域。 
过氧化氢是一种很强的氧化剂，一直以来应用于食品工业作为杀菌剂和半导体工业作为硅片的洗涤剂。近年来过氧化氢被用于工业废水处理中，其中最常用于含硫、含酚和含氰化物废水的处理，以及气体的洗涤、脱氯等。2006年，过氧化氢全世界的消费量大约220万吨，这是20年前的2倍。但过氧化氢在工业产品和排放物中的残留可能会引起人的身体健康恶化和环境污染。过氧化氢酶(CAT)能有效地催化过氧化氢分解为无毒的水和氧气，并且酶本身没有害。另外在处理工业废水中，H2O2中添加CAT可以促进降解芳环化合物和脂族化合物，H2O2中添加CAT处理生物过滤器，还可提高其对废水脱臭效果。因此极大的刺激了微生物发酵产过氧化氢酶的研究热情。 
过氧化氢酶广泛存在于需氧微生物中，目前国外已经用不同种属的菌株发酵生产过氧化氢酶(见表1)。国内发酵法生产过氧化氢酶所涉及菌株和方法产酶活力低且成本较高。 
表1不同过氧化氢酶菌株发酵产过氧化氢酶的情况 
  时间   国家和科研  单位   菌株   生产规模   酶活力   来源
  2005   阿尔及利  亚，Mentouri  de  Constantine   大学   Aspergillus  phoenicis   摇瓶   102U/ml   Biotechnol.  Agron.Soc.   Environ.
  1991   意大利  Basilicata  大学   Penicillium  variabile(P16)   发酵罐   735.0U/ml   Enzyme Microb.  Technol.，
  1999   印度，中央  食品技术研  究所   Saccharomyces  cereisiae   摇瓶   5616U/L   Process  Biochemistry
  1991   希腊，国家   技术大学   ALTERNARIA   ALTERNATA   摇瓶   546.42U/ml   Biotechnology   Letters
  1999   印度，中央  食品技术研   究所   Saccharomyces  cereisiae   摇瓶   165-2277U/ml   Biotechnology  Techniques
  1997   波兰，工业   微生物部   Aspergillus   niger   摇瓶   194.5U/ML   Appl Microbiol   Biotechnol
  2002   韩国   Micrococcus sp   发酵罐   112BU/ml  
  2008   中国   江南大学   Bacillus  subtilis   WSHDZ-01   发酵罐   3700U/ml   应用环境微生物  学报
  2008   NOVOZYME   黑曲霉基因改性   菌   商品化   50000U/ml  
  2008   Genencor   黑曲霉基因改性   菌   商品化   50000U/ml  
    REYONET   未知   商品化   50000U/ml  
    日本  三棱气化公  司   Thermoascus  aurantiacus   发酵罐   10700U/ml  
  2006   日本  Tsukuba大  学   RHIZOBIUM  MICROORGANISM   摇瓶   ≥10,000U/ml   Japanese   Patent  JP2006304786
  2008   日本  Tsukuba大   学   HIZOBIUM  MICROORGANISM   摇瓶   85176U/ml JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING
 
  1997   波兰，工业   微生物部   Aspergillus niger   摇瓶   194.5U/M   L   Appl Microbiol   Biotechnol
  2008   中国   江南大学   Bacillus subtilis   WSHDZ-01   发酵罐   3700U/ml   应用环境微生物学   报
  2008   NOVOZYM  E   黑曲霉基因改性  菌   商品化   50000U/ml  
  2008   Genencor   黑曲霉基因改性   菌   商品化   50000U/ml  
    REYONET   未知   商品化   50000U/ml  
    日本  三棱气化公  司   Thermoascus  aurantiacus   发酵罐   10700U/ml  
  2006   日本  Tsukuba大   学   RHIZOBIUM  MICROORGANIS   M   摇瓶   ≥10,000U/ml   Japanese Patent  JP2006304786
  2008   日本  Tsukuba大  学   HIZOBIUM  MICROORGANIS  M   摇瓶   85176U/ml JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERIN G
发明内容
本发明的目的是利用一株高产过氧化氢酶的粘质沙雷菌株(Serratiamarcescens)SYBC08及利用该菌株以柠檬酸为碳源发酵生产过氧化氢酶的方法，所制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品工业和工业废水处理等方面，来替代价格昂贵的进口的过氧化氢酶。 
本发明的技术方案：一种高产过氧化氢酶的沙雷氏菌属菌株，其分类命名为粘质沙雷菌(Serratia marcescens)SYBC08，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 3449。 
用CGMCC 3449菌株为出发菌种，经种子培养和利用柠檬酸为碳源发酵产过氧化氢酶；工艺为： 
(1)种子培养 
种子培养基：以质量体积浓度计：2％葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％牛肉膏； 
培养条件：从平板上括取两环菌种于包含50mL培养基的250mL三角瓶中进行培养，pH7.0，温度30℃，转速200r/min，发酵时间12h； 
(2)产酶培养 
产酶培养基：以质量体积浓度计：1％～6％玉米浆粉，1％～6％柠檬酸； 
发酵条件：再以2％-4％的接种量，进行5L发酵罐发酵，pH6.0～8.0，温度 28～36℃，发酵时间24～36h，转速200～600r/min，通气量1.5～2.0L/min/L。 
根据上述条件，在5L发酵罐中进行发酵，发酵液的过氧化氢酶活力最高达20000U/mL以上。 
本发明从不同环境条件下的土壤中筛选出一种高产过氧化氢酶沙雷氏菌属菌株，分类命名为粘质沙雷菌(Serratia marcescens)SYBC08。 
1、本菌株的筛选和菌种鉴定： 
1.1采集大量不同环境条件下的土壤样品，制备成土壤悬浮液，适量加到已经灭菌的LB液体培养基中，静置放于30℃的温箱中24h，加入过氧化氢达到最终浓度分别为100mM和500mM，均处理1小时。再静置培养24h，对培养液进行无菌稀释适当倍数，涂布于平板。挑选单菌落进行斜面保持。 
1.2直接将采集到大量不同环境条件下的土壤样品，用无菌水稀释适当倍数，涂布于LB基平板中。用铂丝挑取单菌落浸入滴有3％过氧化氢的载玻片上，选取起泡明显的菌株进行斜面保存。 
1.3将两种方法筛选到的菌株，用LB培养基，进行液体摇瓶发酵。最终筛选到一株过氧化氢活力相对较高的菌株(图1)，经生理生化(见表2)和电镜(图2.)，16S rDNA序列鉴定(见序列SEQ ID NO：1)并编号确定为粘质沙雷菌SYBC08(Serratia marcescens SYBC08)。 
表2.Serratia marcescens SYBC08生理生化鉴定结果 
  指标   SYBC08   粘质沙雷菌   格氏沙雷菌   深红沙雷菌
  V-P   +   +   d   +
  赖氨酸脱羧酶   +   +   +   d
  精氨酸水解酶   -   -   +   -
  蔗糖   +   +   +   +
  乳糖   -   -   -   +
  山梨醇   +   +   +   -
  木糖   -   -   +   +
  纤维二糖   +   -   -   +
  蜜二糖   -   -   +   +
  鼠李糖   -   -   -   -
  明胶液化   +   +   +   +
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，d表示11％-89％菌株阳性 
2、酶活的测定方法 
3mL反应体系中包括粗酶液0.1mL，0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7.0)2.4mL，0.12mol/L H2O2溶液0.5mL(新鲜配制)。以去离子水替代H2O2溶液作为空白对照，以波长240nm体系下吸光度的下降来衡量过氧化氢的酶促降解速度。每隔10s读取一次吸光度值，一般持续进行1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活，一个标准酶活力(1U)定义为：在最适温度下，每分钟分解1μmolH2O2所需的酶量。 
本发明的有益效果：首先提供了一株高产过氧化氢酶的菌株及用该菌为出发菌株采用液体发酵制备过氧化氢酶的方法。本发明的菌种和发酵产酶方法与其它菌种和制备过氧化氢酶方法相比较，具有酶活力高，发酵时间短和成本低的特点，且所生产出来的过氧化氢酶可广泛使用于食品工业和工业废水处理等方面，并可替代价格昂贵的进口过氧化氢酶，因此本发明的菌种和发酵产酶技术有广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。 
附图表说明 
图1粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SYBC08平板菌落。 
图2粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SYBC08透射电镜形态。 
生物材料样品保藏 
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SYBC08，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年11月16日，保藏编号为CGMCC 3449。 
实施例1 
从斜面上挑取单菌落，划线于LB培养基中，将平板置于30℃培养箱培养24h。从平板上括取两环菌种于包含50mL培养基的250mL三角瓶进行培养。培养条件：pH7.0，培养时间12h，温度30℃，摇瓶转速200r/min，再以2％接种量接种进行发酵罐试验。5L发酵罐进行发酵试验：培养条件为控制pH为8.0，培养时间24h，温度28℃，转速200rpm，通气量2.0L/min/L，发酵液酶活力达19001.13U/mL。种子培养基如上所述。产酶培养基为1％玉米浆粉，1％柠檬酸。 
实施例2 
从斜面上挑取单菌落，划线于LB培养基中，将平板置于30℃培养箱培养24h。从平板上括取两环菌种于包含50mL培养基的250mL三角瓶进行培养。培养条件：pH7.0，培养时间12h，温度30℃，摇瓶转速200r/min，再以3％接种量接种进行发酵罐试验。5L发酵罐进行发酵试验：培养条件为控制pH6.0，培养时间30h，温度36℃，转速600rpm，通气量2.0L/min/L，发酵液酶活力达16001.25U/mL。种子培养基如上所述。产酶培养基为3％玉米浆粉，3％柠檬酸。 
实施例3 
从斜面上挑取单菌落，划线于LB培养基中，将平板置于30℃培养箱培养24h。从平板上括取两环菌种于包含50mL培养基的250mL三角瓶进行培养。培养条件：pH 7，培养时间12h，温度30℃，摇瓶转速200r/min，再以4％接种量接种进行发酵罐试验。5L发酵罐进行发酵试验：发酵条件为控制pH为7.0，培养时间36h，温度32.8℃，转速400rpm，通气量1.5L/min/L，发酵液酶活力达20029.31U/mL。种子培养基如上所述。产酶培养基为6％玉米浆粉，6％柠檬酸。 
序列表 
<210>SEQ ID NO：1 
<211>1533 
<212>DNA 
<213>粘质沙雷菌(Serratia marcesces)SYBC08 
<400>1 
agagttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggct taacacatgc aagtcgagcg      60 
gtagcacagg ggagcttgct ccctgggtga cgagcggcgg acgggtgagt aatgtctggg     120 
aaactgcctg atggaggggg ataactactg gaaacggtag ctaataccgc ataacgtcgc     180 
aagaccaaag agggggacct tcgggcctct tgccatcaga tgtgcccaga tgggattagc     240 
tagtaggtgg ggtaatggct cacctaggcg acgatcccta gctggtctga gaggatgacc     300 
agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt     360 
gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg     420 
taaagcactt tcagcgagga ggaaggtggt gaacttaata cgttcatcaa ttgacgttac     480 
tcgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcaag     540 
cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc acgcaggcgg tttgttaagt cagatgtgaa     600 
atccccgggc tcaacctggg aactgcattt gaaactggca agctagagtc tcgtagaggg     660 
gggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccggtggcga     720 
aggcggcccc ctggacgaag actgacgctc aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat     780 
tagataccct ggtagtccac gctgtaaacg atgtcgattt ggaggttgtg cccttgaggc     840 
gtggcttccg gagctaacgc gttaaatcga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa     900 
actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca     960 
acgcgaagaa ccttacctac tcttgacatc cagagaactt tccagagatg gattggtgcc    1020 
ttcgggaact ctgggacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg    1080 
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat cctttgttgc cagcggttcg gccgggaact    1140 
caaaggagac tgccagtgat aaactggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc    1200 
ccttacgagt agggctacac acgtgctaca atggcatata caaagagaag cgacctcgcg    1260 
agagcaagcg gacctcataa agtatgtcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc    1320 
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtagat cagaatgcta cggtgaatac gttcccgggc    1380 
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag gtagcttaac    1440 
cttcgggagg gcgcttacca ctttgtgatt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtaa    1500 
ccgtagggga acctgcggct ggatcacctc ctt                                 1533 

Claims (2)

1.一株产过氧化氢酶的沙雷氏菌属菌株，其分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SYBC08，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 3449。
2.用权利要求1所述的菌株发酵生产过氧化氢酶的方法，其特征在于用CGMCC 3449菌株为出发菌种，经种子培养和利用柠檬酸为碳源发酵产过氧化氢酶；工艺为：
(1)种子培养
种子培养基：以质量体积浓度计：2％葡萄糖，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％牛肉膏；
培养条件：从平板上括取两环菌种于包含50mL培养基的250mL三角瓶中进行培养，pH 7.0，温度30℃，转速200r/min，培养时间12h；
(2)产酶培养
产酶培养基：以质量体积浓度计：1％～6％玉米浆粉，1％～6％柠檬酸；
发酵条件：再以2％-4％的接种量，进行5L发酵罐发酵，pH 6.0～8.0，温度28～36℃，发酵时间24～36h，转速200～600r/min，通气量1.5～2.0L/min/L。
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钱斯亮，等.热稳定性过氧化氢酶高产菌的筛选、鉴定及酶学性质研究.《西北农业学报》.2008,第17卷(第2期),238－242. *

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