DE10021832A1 - Neue für das cma-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das cma-Gen kodierende NukleotidsequenzenInfo
- Publication number
- DE10021832A1 DE10021832A1 DE10021832A DE10021832A DE10021832A1 DE 10021832 A1 DE10021832 A1 DE 10021832A1 DE 10021832 A DE10021832 A DE 10021832A DE 10021832 A DE10021832 A DE 10021832A DE 10021832 A1 DE10021832 A1 DE 10021832A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- gene
- polynucleotide
- sequence
- amino acid
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
Abstract
Die Erfindung betrifft ein gentechnisch modifiziertes coryneformes Bakterium, dessen cma-Gen verstärkt ist, sowie ein isoliertes Polynukleotid, das für die Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase aus coryneformen Bakterien kodiert, wie auch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verstärkung des cma-Gens in den Bakterien und die Verwendung des Polynukleotids als Primer oder Hybridisierungssonde.
Description
Gegenstand der Erfindung sind gentechnisch veränderte
coryneforme Bakterien, für die Cyclopropan-Mycolsäure-
Synthase kodierende Nukleotidsequenzen, sowie Verfähren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-
Lysin und L-Glutamat, unter Verwendung von coryneformen
Bakterien, in denen das cma-Gen, das die Cyclopropan-
Mycolsäure-Synthase kodiert, verstärkt wird.
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, finden in
der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie, insbesondere aber in der
Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rühren
und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der
Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der
Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch
z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das
Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für
regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren
wie z. B. L-Lysin oder L-Glutamat produzieren.
Seit einigen Jahren werden außerdem Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von
Aminosäure-produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene
amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-
Produktion untersucht. Übersichtsartikel hierzu findet man
unter anderem bei Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in:
Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon
(Eds., Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142),
Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids
6: 261-272 (1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in
Biotechnology 15, 73-103 (1995)) und Sahm et al. (Annuals
of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Hilfsmittel
zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein gentechnisch
verändertes coryneformes Bakterium, dessen Gen cma, das für
die Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase kodiert, verstärkt ist.
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, finden in
der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und insbesondere in der Tierernährung
Anwendung. Es besteht daher ein allgemeines Interesse
daran, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung von
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat,
bereitzustellen.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin bzw. L-Glutamat oder
Glutamat erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen,
sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid
oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein gentechnisch verändertes
coryneformes Bakterium, in dem dessen Gen cma, das die
Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase kodiert, verstärkt ist.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden.
Die Verstärkung kann mit Hilfe verschiedener Manipulationen
der Bakterienzelle erreicht werden.
Zur Erzielung einer Verstärkung, insbesondere einer
Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene
erhöht werden, man kann einen starken Promotor verwenden,
oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise
wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des
Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare
Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im
Verlaufe der fermentativen L-Lysin- bzw. L-Glutamat-
Produktion zu steigern. Es kann auch ein Gen verwendet
werden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen
Aktivität kodiert. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der
Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression
verbessert. Außerdem wird durch Verhinderung des Abbaus des
Enzyms ebenfalls die Enzymaktivität insgesamt erhöht.
Gegebenenfalls können diese Maßnahmen auch beliebig
kombiniert werden.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin
und L-Glutamat, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und
Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer
Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt
für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind die zum Beispiel
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% homolog ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% homolog ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c).
"Homolog" im Rahmen der vorliegenden Anmeldung ist eine
Polynukleotidsequenz zu der erfindungsgemäßen Sequenz dann,
wenn sie in ihrer Basenzusammensetzung und -sequenz
wenigstens zu 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders
bevorzugt wenigstens 90% mit der erfindungsgemäßen Sequenz
übereinstimmt. Unter einem "homologen Protein" sollen gemäß
der vorliegenden Erfindung Proteine verstanden werden, die
eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit der
Aminosäuresequenz, die durch das Gen cma (SEQ ID Nr. 1)
kodiert wird zu wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80%,
besonders bevorzugt wenigstens 90% übereinstimmen, wobei
"übereinstimmen" so zu verstehen ist, daß die sich
entsprechenden Aminosäuren entweder identisch sind, oder es
sich um zueinander homologe Aminosäuren handelt. Als
"homologe Aminosäuren" werden solche bezeichnet, die sich
in ihren Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich Ladung,
Hydrophobizität, sterischen Eigenschaften usw. entsprechen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein wie oben
beschriebenes Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um
eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Mutationen in (i), die zu derselben oder einer homologen Aminosäure führen.
Weitere Gegenstände sind
ein replizierbares Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 umfaßt, oder aus ihr besteht,
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 umfaßt, oder aus ihr besteht,
ein Vektor, enthaltend die für das cma-Gen kodierende DNA- Sequenz von C. glutamicum, enthalten in dem Vektor (Plasmid) pJC1cma, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer DSM 13248,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das cma-Gen verstärkt wird.
ein replizierbares Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 umfaßt, oder aus ihr besteht,
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 umfaßt, oder aus ihr besteht,
ein Vektor, enthaltend die für das cma-Gen kodierende DNA- Sequenz von C. glutamicum, enthalten in dem Vektor (Plasmid) pJC1cma, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer DSM 13248,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das cma-Gen verstärkt wird.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die
das vollständige Gen mit der Polynukleotidsequenz
entsprechend SEQ ID No. 1 oder Fragmente davon enthalten,
und die durch Screening mittels Hybridisierung einer
entsprechenden Genbank mit einer Sonde, die die Sequenz des
genannten Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein
Fragment davon enthält, und Isolierung der genannten DNA-
Sequenz erhältlich sind.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind auch als
Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um
cDNA in voller Länge zu isolieren, die für die Cyclopropan-
Mycolsäure-Synthase kodiert und solche cDNA oder Gene zu
isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der mit der Sequenz
des Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase-Gens aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind außerdem
geeignet als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
zur Herstellung von DNA, die für Cyclopropan-Mycolsäure-
Synthasen kodiert.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
können mehr als 30, bevorzugt bis zu 30, besonders
bevorzugt bis zu 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15
aufeinanderfolgende Nukleotide enthalten. Geeignet sind
ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40
oder 50 Nukleotiden.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydesoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid
gemäß SEQ ID No. 2 ein, insbesondere solche mit der
biologischen Aktivität der Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase
und auch solche, die zu wenigstens 70% homolog sind mit
dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, bevorzugt zu wenigstens
80% und besonders bevorzugt solche, die wenigstens 90% bis
95% Homologie mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und
die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-
Lysin und L-Glutamat, unter Verwendung von coryneformen
Bakterien, die insbesondere bereits eine Aminosäure
produzieren, und in denen die für das cma-Gen kodierenden
Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert
werden.
In der vorliegenden Erfindung wird erstmals das für die
Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase kodierende cma-Gen von C. gluta
micum gezeigt.
Zur Isolierung des cma-Gens oder auch anderer Gene von C. gluta
micum wurde zunächst eine Genbank dieses
Mikroorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von
Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das
Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland,
1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die
des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell
50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et
al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996)
beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Zur Herstellung einer
Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide
wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979))
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet
werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-
Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind.
Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant
et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe
von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können
anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung
geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert
werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of
America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.
Auf diese Weise wurde die neue für das Gen cma kodierende
DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No. 1
Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Außerdem
wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben
beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des
entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die
sich ergebende Aminosäuresequenz des cma-Genproduktes
dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind außerdem konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Außerdem ist bekannt,
daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins
dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder diese
sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der
Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of
Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences
3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology
6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die
sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1
oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der
Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der
Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern hergestellt
werden, die sich aus SEQ ID NO. 1 ergeben. Derartige
Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von
mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-
Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait:
Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press,
Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham; PCR (Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte
festgestellt werden, daß coryneforme Bakterien nach
Verstärkung des cma-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, produzieren.
Die betrachteten Gene oder Genkonstrukte können entweder in
Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder
im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ
kann außerdem eine Überexpression der betreffenden Gene
durch Veränderung der Medienzusammensetzung und
Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und
Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen
Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei
Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei
Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung
WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24
(1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891,
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides
(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in
bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Beispielhaft wurde das erfindungsgemäße cma-Gen mit Hilfe
von Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen
Bakterien repliziert und exprimiert werden. Zahlreiche
bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al.,
Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554),
pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1
(Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere
Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160),
oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS
Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891)
beruhen, können in gleicher Weise verwendet
werden.
Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das cma-Gen
überexprimiert werden kann, ist pJC1cma (Fig. 1), welches
auf dem E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor pJC1 (Cremer
et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480)
basiert und die für das cma-Gen kodierende DNA-Sequenz
von Corynebacterium glutamicum enthält. Es ist in den
Stämmen ATCC 13032/pJC1cma und DSM5715/pJC1cma enthalten.
Außerdem eignen sich solche Plasmidvektoren, mit Hilfe
derer man das Verfahren der Genamplifikation durch
Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es
beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur
Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons
beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt
(typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum
replizieren kann. Als Vektoren kommen bespielsweise pSUP301
(Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob
oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)),
pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO
(Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84;
US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen,
Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of
Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf
et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in
Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen
enthält, wird anschließend durch Konjugation oder
Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum
überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise
bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur
Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al.
(Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362
(1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,
343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination
mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der
resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden
Gens.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, vorteilhaft sein,
neben dem cma-Gen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen
Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des
Zitronensäure-Zyklus oder des Aminosäure-Exports zu
verstärken oder zu überexprimieren.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA- Gen (EP-B 0 197 335), oder
- - das für die Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase kodierende dapE-Gen, oder
- - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224, 317-324), oder
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-19831609), oder
- - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), oder
- - das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen (DE-A-195 48 222)
verstärkt, insbesondere überexprimiert oder amplifiziert
werden.
Weiter kann beispielsweise für die Herstellung von L-
Glutamat gleichzeitig eines oder mehrere Gene, ausgewählt
aus der Gruppe
- - das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdh-Gen (DE 199 07 347.3) und/oder
- - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (Peters-Wendisch et al. (1998), Microbiology 144: 915-927)
verstärkt, insbesondere überexprimiert oder amplifiziert
werden.
Außerdem kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft
sein, neben der Verstärkung des cma-Gens gleichzeitig
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen (DE 199 50 409.1, DSM 13047) und/oder
- - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi- Gen (US 09/396,478, DSM 12969)
abzuschwächen.
Weiter kann es für die Produktion von L-Glutamat
vorteilhaft sein, neben der Verstärkung des cma-Gens
gleichzeitig
- - das für die α-Ketoglutarat-Dehydrogenase kodierende odhA-Gen (WO 9534672 A1 951221*), oder
- - das für das DtsR1-Protein kodierende dtsR1-Gen (WO 952324 A1 950831*), oder
- - das für das DtsR2-Protein kodierende dtsR2-Gen (WO 9902692A A1 990121*)
abzuschwächen.
Außerdem kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, vorteilhaft sein,
neben der Überexpression des cma-Gens unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino
Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.),
Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch
von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und
Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff
haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die
Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung
verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß außerdem Salze von Metallen enthalten
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an
Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Lysin oder L-Glutamat kann durch
Anionenaustauschchromatographie mit anschließender
Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et
al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pJC1cma als DSM13248
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-
Glutamat.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung:
ORF2,rep: Plasmidkodierter Replikationsursprung C. glutamicum (von pHM1519)
cma: cma (Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase) Gen aus C. glutamicum ATCC13032
Kan: Kanamycin-Resistenzgen
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
XmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XmaI
BglII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BglII
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
ORF2,rep: Plasmidkodierter Replikationsursprung C. glutamicum (von pHM1519)
cma: cma (Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase) Gen aus C. glutamicum ATCC13032
Kan: Kanamycin-Resistenzgen
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
XmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XmaI
BglII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BglII
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Kode no. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Kode no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Kode no. 251301) wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Kode no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit Shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem
Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Kode no. 27-0868-04)
gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA
wurde mit der behandelten ATCC 13032-DNA gemischt und der
Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Kode no. 27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene,
La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing
Extract, Kode no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion
des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Research 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM
MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin
ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektiert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung
der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp
mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021,
Qiagen, Hilden, Germany). Die DNA des Sequenziervektors
pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen,
Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04)
gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde
anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
87: 4645-4649) mittels Elektroporation transformiert (Tauch
et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-
Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin
ausplattiert. Die Plasmidpräparation der rekombinanten
Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200,
Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte
nach der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al.
(1977, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et
al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der
"RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE
Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt,
Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische
Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in
einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1)
(Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI
Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402),
gegen die non-redundant Datenbank des "National
Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD,
USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein
offenes Leseraster von 1353 Basenpaaren, welches als cma-
Gen bezeichnet wurde. Das cma-Gen kodiert für ein Protein
von 451 Aminosäuren.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pJC1cma als DSM 13248
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)
beschrieben isoliert. Mit Hilfe der
Polymerasekettenreaktion wurde ein DNA Fragment
amplifiziert, das das cma Gen trägt. Dazu wurden die
folgenden Primer verwendet:
5'-TGC TCT AGA AAA GCA GGT GGG AAA TGG GAC AGT-3'
5'-TGC TCT AGA TGG CAG AGC TAG GCG GAC ATA AAT-3'
5'-TGC TCT AGA AAA GCA GGT GGG AAA TGG GAC AGT-3'
5'-TGC TCT AGA TGG CAG AGC TAG GCG GAC ATA AAT-3'
Beide Oligonukleotide tragen die Sequenz für die
Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms XbaI (unterstrichene
Nukleotide). Die dargestellten Primer wurden von der Firma
MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und
damit nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al., (PCR
protocol. A guide to methods and applications, 1990,
Academic Press) die PCR Reaktion durchgeführt. Die Primer
ermöglichen die Amplifizierung eines 1653 bp großen DNA-
Fragmentes, welches das cma Gen aus Corynebacterium
glutamicum trägt.
Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die
Isolierung des PCR-Fragmentes aus dem Agarosegel mit dem
QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen,
Hilden, Germany).
Das auf diese Weise gewonnene PCR Fragment wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI vollständig gespalten. Das ca. 1659 bp
große cma Fragment wurde aus dem Agarosegel mit dem
QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen,
Hilden, Germany) isoliert.
Als Vektor wurde der E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor
pJC1 (Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics
220: 478-480) verwendet. Dieses Plasmid wurde ebenfalls
mit dem Restriktionsenzym XbaI vollständig gespalten und
anschließend mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250)
dephosphoryliert.
Das auf diese Weise gewonnene cma-Fragment wurde mit dem
vorbereiteten Vektor pJC1 gemischt und der Ansatz mit T4-
DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Kode no. 27-0870-04)
behandelt. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm
DH5α (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I.
IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert.
Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch
Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach
Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante
Einzelklone selektiert. Plasmid DNA wurde aus einer
Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product
No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten, um
das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese
zu überprüfen. Das erhaltene Plasmid wurde pJC1cma genannt.
Die Stämme DSM5715 und ATCC13032 wurden mit dem Plasmid
pJC1cma unter Anwendung der von Liebl et al., (FEMS
Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)) beschriebenen
Elektroporationsmethode transformiert. Die Selektion der
Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l
Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l
Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und
18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert
worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.
Plasmid DNA wurde aus je einer Transformante nach den
üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten, um das Plasmid
durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese zu
überprüfen. Die erhaltenen Stämme wurden DSM5715/pJC1cma
und ATCC13032/pJC1cma genannt.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pJC1cma als DSM13248
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm
ATCC13032/pJC1cma wurde in einem zur Produktion von
Glutamat geeigneten Nährmedium kultiviert und der
Glutamatgehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin
(50 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml
Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII (2,5 g/l NaCl, 10 g/l
Bacto-Pepton, 10 g/l Bacto-Yeast Extract, pH7,4, 20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert) verwendet. Diesem wurde
Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16
Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert.
Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so
daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Für
die Hauptkultur wurde das Medium CgXII verwendet.
Der Stamm ATCC13032/pJC1cma wurde nach Vorkultivierung in
Medium CgIII (Keilhauer et al. 1993, Journal of
Bacteriology 175: 5595-5603), im Produktionsmedium CgXII
(Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603)
kultiviert. Es wurden 4% Glukose und 50 mg/l
Kanamycinsulfat zugesetzt.
Zur Induktion der Glutamatbildung wurde 20 g Tween 60 (P-1629,
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) plus 80 ml
Wasser gemischt und autoklaviert. Etwa 4 Stunden nach dem
Animpfen, wurde 75 µl dieser Tween-Lösung zu der Kultur
gegeben und die Kultivierung wurde fortgeführt.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l)
zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80%
Luftfeuchte.
Nach 48 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Glutamatmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm
DSM5715/pJC1cma wurde in einem zur Produktion von Lysin
geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im
Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin
(50 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml
Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII (2,5 g/l NaCl, 10 g/l
Bacto-Pepton, 10 g/l Bacto-Yeast Extract, pH7,4, 20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert) verwendet. Diesem wurde
Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16
Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert.
Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so
daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Für
die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.
CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/l |
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) | 20 g/l |
Glucose(getrennt autoklaviert) | 50 g/l |
(NH4)2SO4 | 25 g/l |
KH2PO4 | 0,1 g/l |
MgSO4.7 H2O | 1,0 g/l |
CaCl2.2 H2O | 10 mg/l |
FeSO4.7 H2O | 0 mg/l |
MnSO4.H2O | 5,0 mg/l |
Biotin (sterilfiltriert) | 0,3 mg/l |
Thiamin.HCl (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
L-Leucin | 0,1 g/l |
CaCO3 | 25 g/l |
CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf
pH7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 µg/ml)
zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und
80% Luftfeuchte.
Nach 24 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Claims (19)
1. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium,
dadurch gekennzeichnet, daß dessen Gen cma, das für
die Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase kodiert, verstärkt
ist.
2. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangs-
Bakterium (Wildtyp) ausgewählt ist aus der Gruppe
Corynebacterium glutamicum (ATCC13032),
Corynebacterium acetoglutamicum (ATCC15806),
Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC13870),
Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539),
Corynebacterium melassecola (ATCC17965),
Brevibacterium flavum (ATCC14067), Brevibacterium
lactofermentum (ATCC13869) und Brevibacterium
divaricatum (ATCC14020), oder ausgewählt ist aus der
Gruppe Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708, Brevibacterium
lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
und Corynebacterium glutamicum DSM5715.
3. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Verstärkung des cma-Gens durch Überexpression des
Gens, insbesondere durch Erhöhung der Kopienzahl des
Gens, durch Auswahl eines starken Promotors oder einer
Regulationsregion oberhalb des Leserasters, durch
Mutation des Promotors, der Regulationsregion oder der
Ribosomenbindungsstelle, durch Einbau einer geeigneten
Expressionskassette oberhalb des Strukturgens oder
durch Einbau von induzierbaren Promotoren, durch die
Verlängerung der Lebensdauer der entsprechenden mRNA,
durch einen verminderten Abbau der exprimierten
Proteine, oder durch die Kombination mehrerer dieser
Möglichkeiten erfolgt.
4. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der Stamm mit einem Plasmidvektor transformiert
ist und der Plasmidvektor die für das cma-Gen
kodierende Nukleotidsequenz trägt.
5. Gentechnisch verändertes coryneformes Bakterium nach
einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß es genotypisch dem Stamm Corynebacterium
glutamicum DSM 13248 entspricht.
6. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% homolog ist zu einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 umfaßt, oder aus dieser besteht,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu mindestens 70% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c).
7. Polynukleotid gemäß Anspruch 6,
wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien
replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
8. Polynukleotid gemäß Anspruch 6,
wobei das Polynukleotid eine RNA ist.
9. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 7,
enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz(i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Mutationen in (i), die zu homologen Aminosäuren führen.
10. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 7, 8 oder 9, das
für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz
SEQ ID No. 2 hat, umfaßt.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-
Aminosäuren,
dadurch gekennzeichnet,
daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest das cma-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert ist,
- b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
- c) Isolieren von der L-Aminosäure.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5
einsetzt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß zusätzlich weitere Gene, die ein Protein des
Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure
kodieren, in den Bakterien verstärkt sind.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß Stoffwechselwege, die die Bildung der gewünschten
Aminosäure verringern, in den Bakterien zumindest
teilweise ausgeschaltet sind.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei der hergestellten Aminosäure um L-
Lysin oder L-Glutamat handelt.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß man für die Herstellung von Lysin oder Glutamat
Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig eines
oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- a) das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen,
- b) das Gen für die Succinyldiaminopimelat- Desuccinylase kodierende dapE-Gen,
- c) das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen,
- d) das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen,
- e) das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen,
- f) das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen,
- g) das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen,
- h) das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,
- i) das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen,
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß für die Herstellung von L-Lysin Bakterien
fermentiert werden, in denen gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- a) das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
- b) das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen
18. Verwendung von Polynukleotidsequenzen oder Teilen
davon gemäß Anspruch 6 als Primer zur Herstellung der
DNA von Genen, die für Cyclopropan-Mycolsäure-Synthase
kodieren, durch die Polymerase-Kettenreaktion.
19. Verwendung von Polynukleotidsequenzen gemäß Anspruch 6
als Hybridisierungssonden zur Isolierung von cDNA oder
Genen, die eine hohe Homologie mit der Sequenz des
cma-Gens aufweisen.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10021832A DE10021832A1 (de) | 2000-05-04 | 2000-05-04 | Neue für das cma-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
AT01929487T ATE295422T1 (de) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | Für das cma-gen codierende nukleotidsequenzen |
PCT/EP2001/003703 WO2001083764A2 (en) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | Nucleotide sequences which code for the cma gene |
AU2001256245A AU2001256245A1 (en) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | New nucleotide sequences which code for the cma gene |
DE60110779T DE60110779D1 (de) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | Für das cma-gen codierende nukleotidsequenzen |
EP01929487A EP1278860B1 (de) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | Für das cma-gen codierende nukleotidsequenzen |
KR1020027014798A KR20020097250A (ko) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | cma 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 |
US09/845,248 US6638753B2 (en) | 2000-05-04 | 2001-05-01 | Nucleotide sequences which code for the cma gene |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10021832A DE10021832A1 (de) | 2000-05-04 | 2000-05-04 | Neue für das cma-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10021832A1 true DE10021832A1 (de) | 2001-11-08 |
Family
ID=7640838
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10021832A Withdrawn DE10021832A1 (de) | 2000-05-04 | 2000-05-04 | Neue für das cma-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
DE60110779T Expired - Lifetime DE60110779D1 (de) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | Für das cma-gen codierende nukleotidsequenzen |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE60110779T Expired - Lifetime DE60110779D1 (de) | 2000-05-04 | 2001-03-31 | Für das cma-gen codierende nukleotidsequenzen |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1278860B1 (de) |
KR (1) | KR20020097250A (de) |
AT (1) | ATE295422T1 (de) |
AU (1) | AU2001256245A1 (de) |
DE (2) | DE10021832A1 (de) |
WO (1) | WO2001083764A2 (de) |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1050356B (it) * | 1969-03-11 | 1981-03-10 | Ajinomoto Kk | Procedimento per produrre acido l. grutammico mediante fermentazione |
DE4130867A1 (de) * | 1991-09-17 | 1993-03-18 | Degussa | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeuren |
JP3716427B2 (ja) * | 1994-06-14 | 2005-11-16 | 味の素株式会社 | α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 |
TR200607443T2 (tr) * | 1999-06-25 | 2007-10-22 | Basf Aktiengesellschaft | Membran sentezi ve membran nakli dahilinde corynebacterium glutamicum kodlayan proteinler |
JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
2000
- 2000-05-04 DE DE10021832A patent/DE10021832A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-03-31 KR KR1020027014798A patent/KR20020097250A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-03-31 DE DE60110779T patent/DE60110779D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-31 WO PCT/EP2001/003703 patent/WO2001083764A2/en active IP Right Grant
- 2001-03-31 AT AT01929487T patent/ATE295422T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-03-31 AU AU2001256245A patent/AU2001256245A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-31 EP EP01929487A patent/EP1278860B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE295422T1 (de) | 2005-05-15 |
DE60110779D1 (de) | 2005-06-16 |
EP1278860B1 (de) | 2005-05-11 |
WO2001083764A2 (en) | 2001-11-08 |
AU2001256245A1 (en) | 2001-11-12 |
WO2001083764A3 (en) | 2002-04-04 |
EP1278860A2 (de) | 2003-01-29 |
KR20020097250A (ko) | 2002-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1111062B1 (de) | Für das zwa1-Gen codierende Nukleotidsequenzen | |
DE60022612T3 (de) | Tal gen nukleotidsequenzen | |
EP1090998A1 (de) | Für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen | |
EP1136559B1 (de) | Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin | |
EP1106684A1 (de) | Polynukleotidsequenzen aus Corynebacterium glutamicum, die Succinatdehydrogenase-Untereinheiten (sdhA, sdhB, sdhC) kodierenden | |
DE10162387A1 (de) | Für das rpoB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE10044681A1 (de) | Neue für das lldD2-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE60127116T2 (de) | Für das glbo-gen kodierende nukleotidsequenzen aus corynebacterium glutamicum | |
DE10045496A1 (de) | Neue für das ptsi-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
EP1118666A2 (de) | Für das ptsH-Gen codierende Nukleotidsequenzen aus Corynebacterium glutamicum | |
DE10162386A1 (de) | Für das rpsL-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
EP1106622A2 (de) | Neue für das pfkA-Gen codierende Nukleotidsequenzen | |
EP1106694A1 (de) | Für das glk-Gen codierende Nukleotidsequenzen | |
DE10055869A1 (de) | Neue für das nadA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
EP1103613A1 (de) | Für das pfk-Gen codierende Nukleotidsequenzen | |
DE10023400A1 (de) | Neue für das acp-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE10032173A1 (de) | Neue für das plsC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE10021828A1 (de) | Neue für das cdsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE10055870A1 (de) | Neue für das nadC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE10046625A1 (de) | Neue für das ndkA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
EP1104812A1 (de) | Für das gpm-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE60120724T2 (de) | Rekombinante coryneformbakterie die glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase -2 überexprimieren , und verfahren zur herstellung von l-lysine | |
DE60127972T2 (de) | Nukleotidsequenzen die für das dep34-gen kodieren | |
DE10032174A1 (de) | Neue für das gpsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen | |
DE10021831A1 (de) | Neue für das fadD15-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |