KR20020097250A

KR20020097250A - ｃｍａ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR20020097250A
Application number: KR1020027014798A
Authority: KR
Inventors: 남푸티리마드하반; 뫼켈베티나; 에겔링로타르; 잠헤르만
Original assignee: 데구사 아게; 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date: 2000-05-04
Filing date: 2001-03-31
Publication date: 2002-12-31
Also published as: AU2001256245A1; DE60110779D1; EP1278860A2; ATE295422T1; WO2001083764A2; DE10021832A1; EP1278860B1; WO2001083764A3

Abstract

본 발명은 cma 유전자가 증폭된 유전적으로 변형된 코리네형 세균, 코리네형 세균으로부터 분리된 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 당해 세균내에서 cma 유전자를 증폭시켜 L-아미노산을 발효적으로 제조하는 방법 및 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서의 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.

Description

ｃｍａ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열{Nucleotide sequences which code for the cma gene}

아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트는 사람 의학, 약제 산업 및 식품 산업에서 사용되나, 특히 동물 사료에서 사용된다.

아미노산은 코리네형 세균의 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 제조되는 것으로 공지되어 있다. 이의 큰 중요성으로 인해, 제조 방법을 개선시키고자 하는 연구가 지속적으로 있어왔다. 방법의 개선은 발효 기술과 관련된 수단, 예를 들어, 교반 및 산소 공급, 또는 예를 들어, 발효 동안의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산 특성에 관련될 수 있다.

돌연변이유발법, 선별법 및 돌연변이 선별법을 사용하여 이러한 미생물의 수행 특성을 개선시킨다. 상기 방식으로, 항대사물질, 예를 들어, 라이신 유사체 S-(2-아미노에틸)시스테인에 대해 내성이거나, 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며 L-아미노산, 예를 들어, L-라이신 또는 L-글루타메이트를 생산하는 균주를 수득한다.

수년 동안, 재조합 DNA 기술 방법은 또한 각각의 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 미치는 효과를 조사함으로써, 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선시키는데 사용되어 왔다. 이와 관련된 개관 논문은 특히 문헌[참조 문헌: Kinoshita("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger(BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling(Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten and Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) and Sahm et al.(Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996))]에서 찾을 수 있다.

본 발명은 유전적으로 변형된 코리네형 세균, 사이클로프로판-미콜산 신타제(cyclopropane-mycolic acid synthase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 cma 유전자가 증폭된 코리네형 세균을 사용하여 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트를 발효적으로 제조하는 방법을 제공한다.

도 1: 플라스미드 pJC1cma의 지도

약어 및 명칭은 다음의 의미를 갖는다:

ORF2, rep: 플라스미드-암호화된 복제 오리진, 씨. 글루타미쿰(pHM1519 유래)

cma: 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 cma(사이클로프로판-미콜산 신타제) 유전자

Kan: 가나마이신 내성 유전자

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

XbaI: 제한 효소 XbaI의 절단 부위

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

PstI: 제한 효소 PstI의 절단 부위

XmaI: 제한 효소 XmaI의 절단 부위

BgII: 제한 효소 BglII의 절단 부위

SphI: 제한 효소 SphI의 절단 부위

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

본 발명은 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트의 개선된 발효적 제조를 위한 신규한 보조제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 목적은 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 cma 유전자가 증폭된 유전적으로 변형된 코리네형 세균에 의해 달성된다.

아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트는 사람 의학, 약제 산업, 식품 산업 및 특히 동물 사료에서 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트의 신규한 개선된 제조방법을 제공하는데 전반적인 관심이 있어 왔다.

L-라이신 또는 라이신 및 L-글루타메이트 또는 글루타메이트가 하기에서 언급될 경우, 이는 염기뿐만 아니라, 염, 예를 들어, 라이신 모노하이드로클로라이드 또는 라이신 설페이트를 또한 의미한다.

본 발명은 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 cma 유전자가 증폭된 유전적으로 변형된 코리네형 세균을 제공한다.

이와 관련하여, 용어 "증폭"은 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물내의 하나 이상의 효소의 세포내 활성이 증가되는 것을 말한다.

증폭은 다양한 세균 세포의 조작에 의해 달성될 수 있다.

증폭, 특히 과발현을 달성하기 위해, 상응하는 유전자의 복제수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 구조 유전자의 상부에 위치하는 조절 영역 또는 리보좀-결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상부에 혼입된 발현 카세트가 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터에 의해, 발효적 L-라이신 또는 L-글루타메이트 생산 동안 발현을 또한 증가시킬 수 있다. 활성이 높은 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용할 수도 있다. 마찬가지로, 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 개선시킨다. 또한, 효소 활성은 효소의 분해를 방지함으로써 전반적으로 증가된다. 임의로, 이러한 수단을 경우에 따라 병용할 수도 있다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트를 생성할 수 있다. 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속 중에서 당해 미생물이 대표적일 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서, L-아미노산을 생산하는 능력에 대해 당해 숙련가에게 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종을 특별히 언급할 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주는, 예를 들어 다음의 공지된 야생형 균주이다:

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870,

코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067,

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및

이로부터 제조된 L-라이신을 생산하는 돌연변이체 또는 균주로서, 예를 들어,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715.

본 발명은 또한

(a) 서열 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

(b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 및

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유하는, 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 적용의 범주에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 염기 조성 및 이의 서열이 본 발명에 따르는 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상 일치되는 경우 본 발명에 따르는 서열과 "상동성"이다. 본 발명에 따라서, "상동성 단백질"은 cma 유전자(서열 1)에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상 일치되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이해되어야 하며, 이때, "일치"는 상응하는 아미노산이 동일하거나 서로 상동성인 아미노산인 것으로 이해된다. 특히 전하, 소수성 또는 입체적 특성 등에 대한 특성이 상응하는 이러한 아미노산이 "상동성 아미노산"으로 지칭된다.

또한, 본 발명은

(i) 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열,

(ii) 유전 코드의 축퇴 범위내에서 서열(i)에 상응하는 하나 이상의 서열 또는

(iii) 서열(i) 또는 서열(ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열 및 임의로

(iv) 동일하거나 상동성인 아미노산을 초래하는, (i)에서 중립 기능의 돌연변이를 포함하는, 바람직하게는 복제가능한 DNA인 상기 기술한 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한

복제할 수 있으며 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드,

서열 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

DSM 13248하에 코리네박테리움 글루타미쿰으로서 기탁된 벡터(플라스미드) pJC1cma내에 함유된, cma 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)의 DNA 서열을 함유하는 벡터 및

당해 벡터를 함유하거나 cma 유전자가 증폭된 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 세균을 제공한다.

본 발명은 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 갖는 완전한 유전자를 함유하고, 상응하는 유전자 라이브러리와 언급한 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오타이드의 서열 또는 이의 단편을 함유하는 프로브의 하이브리드화 및 언급한 DNA 서열의 분리에 의해 스크리닝하여 수득할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은, 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 전장 cDNA를 분리하고, 사이클로프로판-미콜산 신타제 유전자의 서열과 높은 유사성을 나타내는 이러한 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한 RNA, cDNA 및 DNA용 하이브리드화 프로브로서 또한 적합하다.

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 추가로 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 DNA를 제조하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)용 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 이러한 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 30개 이하, 특히 바람직하게는 20개 이하, 매우 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 40개 내지 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 또한 적합하다.

"분리된"은 이의 천연 환경으로부터 분리됨을 의미한다.

일반적으로, "폴리뉴클레오타이드"는 비변형된 RNA 또는 DNA이거나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다.

"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명에 따르는 폴리펩타이드는 서열 2에 따르는 폴리펩타이드, 특히 사이클로프로판-미콜산 신타제의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드, 및 또한 서열 2에 따르는 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상 동일한 폴리펩타이드, 및 서열 2에 따르는 폴리펩타이드와 특히 90 내지 95% 상동성을 나타내며 상기 언급된 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명은, 특히 아미노산을 미리 생산하고, cma 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증폭, 특히 과발현된 코리네형 세균을 사용하는, L-아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트의 발효적 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 cma 유전자가 먼저 설명된다.

씨. 글루타미쿰으로부터의 cma 유전자 또는 기타 유전자를 분리하기 위해, 먼저 이러한 미생물의 라이브러리를 이. 콜라이(E. coli)내에서 작제함으로써 분리한다. 유전자 라이브러리의 작제는 일반적으로 공지된 교과서 및 편람에 기재되어 있다. 예로서는 교과서[참조 문헌: Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 편람[참조 문헌: Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]를 언급할 수 있다. 익히 공지된 유전자 라이브러리는 코하라(Kohara) 등[참조 문헌: Cell 50, 495-508 (1987)]에 의해 λ-벡터내에서 작제된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 유전자 라이브러리이다. 문헌[참조 문헌: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996]에는 코스미드 벡터 SuperCos I[참조 문헌: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164]을 사용하여, 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참조 문헌: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575]내에서 작제된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 문헌[참조: Bormann et al.(Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)]에는 코스미드 pHC79[참조 문헌: Hohn 및 Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]를 사용하는 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 이. 콜라이내의 씨. 글루타미쿰의 라이브러리를 제조하기 위해, pBR322[참조 문헌: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[참조 문헌: Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268]과 같은 플라스미드를 사용할 수 있다. 적합한숙주는 특히 제한 결실되고 재조합 결실된 이. 콜라이 균주이다. 이의 예로는 문헌[참조 문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 기재되어 있는 DH5αmcr 균주가 있다. 이어서, 코스미드를 보조로 하여 클로닝된 긴 DNA 단편을 예를 들어, 문헌[참조: Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977)]에 기재되어 있는 바와 같이 서열화에 적합한 통상의 벡터내로 아클로닝시킨 다음, 서열화시킨다.

서열 1로서 본 발명에 의해 제공되는, cma 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 신규한 DNA 서열은 상기 방식으로 수득한다. 또한, 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 상기 기술한 방법을 사용하여 상기 DNA 서열로부터 유도한다. cma 유전자의 생성물의 생성된 아미노산 서열은 서열 2에 제시한다.

또한, 유전 코드의 축퇴로 인해 서열 1로부터 발생하는 암호화 DNA 서열이 본 발명을 구성한다. 동일한 방식으로, 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열이 본 발명을 구성한다. 단백질내의 아미노산의 보존적 변화, 예를 들어, 글리신의 알라닌으로의 변화 또는 아스파르트산의 글루탐산으로의 변화는, 단백질의 활성에 근본적인 변화를 야기하지 않는, 즉 기능적으로 중립인 "센스 돌연변이"로서 당해 숙련가들에게 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N 및/또는 C 말단의 변화는, 이의 기능을 실질적으로 손상시키지 않거나, 심지어 이를 안정화시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 당해 분야의 숙련가는, 이와 관련된 정보를 특히 문헌[참조: Ben-Bassat et al.(Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)),O'Regan et al.(Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth et al.(Protein Sciences 3:240-247 (1994)), Hochuli et al.(Bio/Technology 6:1321-1325 (1988))]과 공지된 유전학 및 분자 생물학 교과서에서 찾을 수 있다. 상응하는 방식으로 서열 2로부터 발생하는 아미노산 서열이 또한 본 발명을 구성한다.

동일한 방식으로, 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열이 본 발명을 구성한다. 마지막으로, 서열 1로부터 수득된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의해 제조된 DNA 서열이 또한 본 발명을 구성한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

당해 분야의 숙련가는 하이브리드화에 의한 DNA 서열의 동정에 관한 지침을 특히 편람[참조 문헌: "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Firma Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993] 및 문헌[참조 문헌: Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260]에서 찾을 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 DNA 서열의 증폭에 관한 지침을 특히 문헌[참조 문헌: Gait, Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, UK, 1984] 및 편람[참조 문헌: Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach(IRL Press, Oxford, UK, 1984) 및 Newton & Graham, PCR(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾을 수 있다.

본 발명에 대한 연구에서, cma 유전자가 증폭된 경우 코리네형 세균이 개선된 방식으로 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트를 생산한다는 것이 밝혀졌다.

고려되는 유전자 또는 유전자 작제물은 다양한 복제수로 플라스미드내에 존재할 수 있거나 염색체내로 삽입되어 증폭될 수 있다. 대안으로, 해당 유전자의 과발현은 배지의 조성 및 배양 조건을 변형시켜 달성할 수도 있다.

당해 분야의 숙련가는 이와 관련된 지침을 특히 문헌[참조 문헌: Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987), Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988), Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 EPS 0 472 869, 미국 특허 제4,601,893호, Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al.(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), 특허원 제WO 96/15246호, Malumbres et al.(Gene 134, 15-24 (1993)), 일본 공개특허원 JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996))]과 익히 공지된 유전학 및 분자생물학 교과서에서 찾을 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따르는 cma 유전자는 플라스미드를 보조로 하여 과발현시킨다.

적합한 플라스미드는 코리네형 세균내에서 복제되고 발현되는 플라스미드이다. 다수의 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들어, pZ1[참조 문헌: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:549-554], pEKEx1[참조 문헌:Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[참조 문헌: Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)]이 잠재 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1에 기초한다. 기타 플라스미드 벡터, 예를 들어, pCG4[참조 문헌: US-A-4,489,160], pNG2[참조 문헌: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)] 또는 pAG1[참조 문헌: US-A-5,158,891]에 기초하는 플라스미드를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.

cma 유전자의 보조로 과발현시킬 수 있는 플라스미드의 예로는 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pJC1[참조 문헌: Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480]에 기초하며 cma 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 DNA 서열을 함유하는 pJC1cma(도 1)이 있다. 이는 균주 ATCC 13032/pJC1cma 및 DSM 5715/pJC1cma 내에 포함되어 있다.

추가로 적합한 플라스미드 벡터는, hom-thrB 오페론의 복제 및 증폭을 위해, 예를 들어, 문헌[참조: Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 의해 기술된 바와 같이 염색체로의 삽입에 의해 유전자 증폭을 수행하는데 사용되는 플라스미드 벡터이다. 상기 방법에서는, 완전한 유전자를 숙주(전형적으로는 이. 콜라이)내에서 복제할 수 있으나, 씨. 글루타미쿰내에서는 복제할 수 없는 플라스미드 벡터내로 클로닝시킬 수 있다. 고려될 수 있는 벡터로는, 예를 들어, pSUP301[참조 문헌: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[참조 문헌: Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T(제조원: Promega corporation, Madison,WI, USA), pCR2.1-TOPO[참조 문헌: Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5,487,993], PCR^RBlunt[제조원: Invitrogen, Groningen, Netherlands; 참조 문헌: Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541 (1993)] 또는 pEM1[참조 문헌: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]이 있다. 이어서, 증폭될 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환에 의해 목적하는 균주 씨. 글루타미쿰내로 형질전환시킨다. 접합 방법은, 예를 들어, 문헌[참조 문헌: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기재되어 있다. 형질전환 방법은, 예를 들어, 문헌[참조 문헌: Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988), Dunican and Shivnan(Bio/technology 7, 1067-1070 (1989)) 및 Tauch et al.(FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))]에 기재되어 있다. "교차(cross over)" 이벤트를 사용하는 상동성 재조합 후, 생성된 균주는 해당 유전자의 2개 이상의 복사체를 함유한다.

또한, 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트를 제조하기 위해, cma 유전자 이외에, 특정 생합성 경로, 해당과정, 보충 대사, 시트르산 사이클 또는 아미노산 배출 중의 하나 이상의 효소를 증폭 또는 과발현시키는 것이 또한 유리할 수 있다.

따라서, 예를 들어, L-라이신을 생산하기 위해, 다음 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현시키거나 증폭시키는 것이 유리할 수 있다:

·디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자[참조 문헌: EP-B 0 197 335],

·석시닐 디아미노피멜레이트 디석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자,

·피드백(feed back) 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[참조 문헌: Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224, 317-324],

·글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

·트리오스 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

·3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조 문헌: DE-A-19831609],

·말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조 문헌: Molenarr et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)] 또는

· 라이신 배출을 암호화하는 lysE 유전자[참조 문헌: DE-A-195 48 222].

또한, 예를 들어, L-글루타메이트를 생산하기 위해, 다음 유전자로 이루어진그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현 또는 증폭시킬 수 있다:

·글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gdh 유전자[참조 문헌: 독일 특허 제19907347.3호] 및/또는

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조 문헌: Peters-Wendisch et al.(1998), Microbiology 144: 915-927].

cma 유전자의 증폭 이외에, L-라이신을 생산하기 위해, 다음 유전자를 동시에 약독화시키는 것이 유리할 수 있다:

·포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[참조 문헌: DE 199 50 409.1, DSM 13047] 및/또는

·글루코스 6-포스페이트 이소머라아제를 암호화하는 pgi 유전자[참조 문헌: US 09/396,478, DSM 12969].

cma 유전자의 증폭 이외에, L- 글루타메이트를 생산하기 위해 다음 유전자를 동시에 약독화시키는 것이 또한 유리할 수 있다:

·α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 odhA 유전자[참조 문헌: WO 9534672 A1 951221],

·DtsR1 단백질을 암호화하는 dtsR1 유전자[참조 문헌: WO 952324 A1 950831] 또는

·DtsR2 단백질을 암호화하는 dtsR2 유전자[참조 문헌: WO 9902692A A1 990121].

cma 유전자의 과발현 이외에, 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트를 생산하기 위해, 원치않는 부반응을 제거하는 것이 또한 유리할 수 있다[참조 문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms"; Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

아미노산, 특히 L-라이신 생산을 위해, 본 발명에 따라 제조된 미생물을 뱃치 공정(뱃치 배양) 또는 유가 뱃치(유가 공정) 또는 반복 유가 뱃치 공정(반복 유가 공정)을 사용하여 연속적으로 또는 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 키미엘(Chmiel)에 의한 교과서[참조 문헌: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 슈토라스(Storhas)에 의한 교과서[참조 문헌: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기재되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 균조의 요건을 적합한 방식으로 충족시켜야 한다. 다양한 미생물용 배양 배지의 설명은 편람[참조 문헌: "Manual of Methods for General Bacteriology" from the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 포함되어 있다. 탄소원으로서는, 당 및 탄수화물(예: 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스), 오일 및 지방(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테이르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산)을 사용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 유기 질소 함유 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아) 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 사용할 수 있다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인 공급원으로서는, 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 또한 증식에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 포함해야 한다. 마지막으로, 상기 언급된 물질 이외에도 필수 생장 물질, 예를 들어, 아미노산 및 비타민을 사용할 수 있다. 추가로, 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 언급한 출발 물질은 단일 뱃치 형태로 배양물에 첨가할 수 있거나, 배양 동안 적합한 방식으로 공급할 수 있다.

염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적합한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절한다. 예를 들어, 지방산 포리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포를 조절할 수 있다. 적합한 선택적 작용 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가하여 플라스미드 안정성을 유지시킬 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해, 산소 또는 산소 함유 가스 혼합물, 예를 들어, 공기를 배양물내로 도입한다. 배양물의 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이며 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 최대 라이신이 형성될 때까지 배양을 지속한다. 상기 목적은 통상적으로 10시간 내지 16시간 이내에 달성된다.

L-라이신 또는 L-글루타메이트의 분석은 문헌[참조 문헌: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술되어 있는 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화를 사용하여 수행할 수 있다.

다음 미생물은 부다페스트 조약에 따라, 독일 브라운슈바이크에 소재하는 도이췌 잠룽 퓌어 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)]에 기탁하였다:

DSM 13248로서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1cma.

본 발명에 따르는 방법은 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-글루타메이트를 발효적으로 제조하는데 사용된다.

본 발명은 구체적 실시예에 의해 하기에서 보다 상세히 설명한다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 게놈 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

염색체 DNA를 문헌[참조 문헌: Tauch et al., 1995, Plasmid 33:168-179]에 기재되어 있는 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 분리하고 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germnay, 제품명 Sau3AI, 코드 번호 27-0931-02)으로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 새우 알칼리 포스파타제(공급원: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, 제품명 SAP, 코드 번호 1758250)로 탈인산화시킨다. 코스미드 벡터 SuperCos1[참조 문헌:Wahl et al.(1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164; 구입원: Stratagene, La Jolla, USA, 제품명 SuperCos1 Cosmid Vector Kit, 코드 번호 251301]의 DNA를 제한 효소 XbaI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명 XbaI, 코드 번호 27-0948-02)으로 절단하고 또한 새우 알칼리 포스파타제로 탈인산화시킨다. 이어서 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명 BamHI, 코드 번호 27-0868-04)로 절단한다. 이러한 방식으로 처리한 코스미드 DNA를 처리된 ATCC 13032 DNA와 혼합하고, 뱃치를 T4 DNA 리가제(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명: T4 DNA Ligase, 코드 번호 27-0870-04)로 처리한다. 이어서, 연결 혼합물을 기가팩 Ⅱ XL 팩킹 추출물(제조원: Stratagene, La Jolla, USA, 제품명: Gigapack Ⅱ XL Packing Extract, 코드 번호 200217)을 보조로 하여 파지내에서 팩킹시킨다. 이. 콜라이 균주 NM554[참조 문헌: Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575]의 감염을 위해, 세포를 10mM MgSO₄속에 현탁시키고 파지 현탁액의 분취액과 혼합한다. 코스미드 라이브러리를 문헌[참조 문헌: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술되어 있는 바와 같이 감염시키고 역가를 측정하며, 이때 세포는 암피실린 100mg/ℓ를 함유하는 LB 한천[참조 문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]에 도말한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 각각의 재조합 클론을 선별한다.

실시예 2

cma 유전자의 분리 및 서열화

각각의 콜로니의 코스미드 DNA를 제조업자의 지시에 따라서 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep Spin Miniprep Kit; 제품 번호:27160, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germnay, 제품명 Sau3AI, code no. 27-0931-02)으로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 새우 알칼리 포스파타제(공급원: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, 제품명 SAP, 코드 번호 1758250)로 탈인산화시킨다. 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 크기가 1500 내지 2000bp인 코스미드 단편을 QiaExII 겔 추출 키트(제품 번호: 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리한다. 서열화 벡터 pZero-1(제조원: Invitrogen, Groningen, Holland, 제품명: Zero Background Cloning Kit, 제품 번호: K2500-01)을 제한 효소 BamHI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명 BamHI, 코드 번호 27-0868-04)로 절단한다. 코스미드 단편은 문헌[참조 문헌; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기재되어 있는 바와 같이 상기 서열화 벡터 pZero-1내로 연결시키고, DNA 혼합물을 T4 리가제(제조원: Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 배양한다. 이어서, 상기 연결 혼합물을 전기천공[참고문헌: Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7]에 의해 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조 문헌: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649]내로 형질전환시키고, 제오신 50mg/ℓ을 함유하는 LB 한천[참조 문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]에 도말한다. 재조합 클론의 플라스미드는 바이오로봇 9600(Biorobot 9600, 제품 번호:90020, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 제조한다. 서열화는, 짐머만(Zimmermann) 등[참조 문헌: 1990, Nucleic Acids Research, 18:1067]에 따라 변형된 문헌[참조 문헌: Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences. U.S.A., 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결 방법을 사용하여 수행한다. "RR d로다민 종결자 사이클 서열화 키트(RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit; 제조원: PE Applied Biosystems, 제품 번호. 403044, Weiterstadt, Germany)"를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열화 반응의 분석은, "ABI Prism 377" 서열화기(제조원: PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)를 사용하여 "Rotiphoresis NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드" 겔(29:1)(제품 번호. A124.1, 제조원: Roth, Karlsruhe, Germany)에서 수행한다.

이어서, 수득된 미처리된 서열 데이터를 스타덴 프로그램 패키지[참조 문헌: 1986, Acids Research, 14: 217-231] 버전 97-0을 사용하여 처리한다. pZero1 유도체의 각각의 서열을 연속된 배열로 통합시킨다. 컴퓨터 보조된 암호화 범위 분석은 XNIP 프로그램(제조원: Staden; 참조 문헌: 1986, Nucleic acids Rearch, 14:217-231]으로 수행한다. 국립 생명공학 정보 센터[National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 풍부하지 못한 데이터뱅크에 대해, "블래스트 서치 프로그램"(BLAST search program)[참조 문헌: Altschulet al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402]을 사용하여 추가로 분석한다.

수득한 뉴클레오타이드 서열은 서열 1에 제시한다. 뉴클레오타이드 서열의 분석은 cma 유전자로서 지정된 1353개 염기쌍의 개방 판독 프레임을 나타낸다. cma 유전자는 451개 아미노산의 단백질을 암호화한다.

다음 미생물을 부다페스트 조약에 따라, 독일 브라운슈바이크에 소재하는 도이췌 잠룽 퓌어 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)]에 기탁하였다:

DSM 13248로서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1cma.

실시예 3

벡터 pJC1에서 cma 유전자의 클로닝

염색체 DNA를 문헌[참조 문헌: Tauch et al., (1995, Plasmid 33:168-179)]에 기술되어 있는 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 분리한다. cma 유전자를 지니는 DNA 단편을 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 증폭시킨다. 이를 위해 하기 프라이머를 사용한다:

5'-TGCTCT AGAAAA GCA GGT GGG AAA TGG GAC AGT-3'

5'-TGCTCT AGATGG CAG AGC TAG GCG GAC ATA AAT-3'

두 올리고뉴클레오타이드는 제한 효소 XbaI의 절단 부위(밑줄 친 뉴클레오타이드)에 대한 서열을 지닌다. 제시한 프라이머는 MWG 바이오테크사(독일 에버스베그 소재)에 의해 합성되었으며, 이를 사용하여 PCR 반응을 문헌[참조 문헌: Innis et al., PCR protocol. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법으로 수행한다. 증폭될 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 cma 유전자를 지니는 당해 프라이머는 크기가 1653bp인 DNA 단편이 증폭되도록 한다.

겔 전기영동에 의해 분리한 후, PCR 단편을 QiaExII 겔 추출 키트(제품 번호: 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 한천 겔로부터 분리한다.

상기 방식으로 수득한 PCR 단편을 제한 효소 XbaI으로 완전히 절단한다. 크기가 약 1659bp인 cma 단편을 QiaExII 겔 추출 키트(제품 번호: 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 한천 겔로부터 분리한다.

이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pJC1[참조 문헌: Cremer et al, 1990, Molecular and General Genetics 220:478-480]를 당해 벡터로서 사용한다. 상기 플라스미드를 또한 제한 효소 XbaI으로 완전히 절단한 다음, 새우 알칼리 포스파타제(공급원: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, 제품명 SAP, 코드 번호 1758250)로 탈인산화시킨다.

상기 방식으로 수득된 cma 단편을 제조된 pJC1 벡터와 혼합하고, 뱃치를 T4 DNA 리가제(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명: T4 DNA Ligase, 코드 번호 27-0870-04)로 처리한다. 이어서 연결 뱃치를 이. 콜라이 균주DH5α[참조 문헌: Hanahan: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]에서 형질전환시킨다. 형질전환 뱃치를 가나마이신 50mg/ℓ을 함유하는 LB 한천에 도말하여 플라스미드 함유 세포를 선별한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 각각의 재조합 클론을 제조한다. 플라스미드 DNA를 제조업자의 지시에 따라 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(제품 번호:27160, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고, 후속적 아가로스 겔 전기영동에 의해 플라스미드를 확인하기 위해 제한 효소 XbaI으로 절단한다. 수득되는 플라스미드를 pJC1cma로 명명한다.

실시예 4

플라스미드 pJC1cma를 사용한 균주 DSM5715 및 ATCC13032의 형질전환

균주 DSM5715 및 ATCC13032를, 문헌[참조 문헌: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)]에 기술되어 있는 전기천공 방법을 사용하여 플라스미드 pJC1cma로 형질전환시킨다. 형질전환체 선별은 가나마이신 25mg/ℓ가 보충된, 뇌-심장 융합 배양액 18.5g/ℓ, 소르비톨 0.5M, 박토-트립톤 5g/ℓ, 박토-효모 추출물 2.5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ 및 박토-한천 18g/ℓ로 이루어진 LBHIS 한천에서 수행한다. 33℃에서 2일 동안 배양한다.

플라스미드 DNA를 각 경우에 통상의 방법[참조 문헌: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927]을 사용하여 하나의 형질전환체로부터 분리하고, 플라스미드를 후속적 겔 전기영동에 의해 확인하기 위해, 제한 엔도뉴클레아제 BamHI로 절단한다. 수득되는 균주를 DSM5717/pJC1cma 및 ATCC13032/pJC1cma으로 명명한다.

*DSM 13248로서의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM 5715/pJC1cma

실시예 5

균주 ATCC13032/pJC1cma를 사용한 L-글루타메이트의 제조

실시예 4에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC13032/pJC1cma를 글루타메이트의 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상청액 중의 글루타메이트 함량을 측정한다.

이를 위해, 균주를 먼저 상응하는 항생제를 함유하는 한천 플레이트(가나마이신(50mg/ℓ)을 함유하는 뇌/심장 한천)에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 한천 플레이트로 배양물부터 출발하여, 예비배양물을 접종한다(100㎖들이 원뿔형 플라스크내의 배지 10㎖). 완전 배지 CgIII(NaCl 2.5g/ℓ, 박토-펩톤 10g/ℓ, 박토- 효모 추출물 10g/ℓ, pH 7.4, 글루코스(개별적으로 오토클레이브시킴) 20g/ℓ)를 예비배양용 배지로서 사용한다. 가나마이신(25mg/ℓ)을 상기 배지에 첨가한다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물을 상기 예비배양물로부터 접종시켜, 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 한다. 배지 CgxII를 주 배양물용으로 사용한다.

배지 CgIII[참조 문헌: Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603]에서 예비배양한 후, 균주 ATCC13032/pJ1cma를 생산 배지 CgXII에서 배양한다[참조 문헌: Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603]. 4% 글루코스 및 50mg/ℓ 가나마이신 설페이트를 첨가한다.

글루타메이트 형성을 유도하기 위해, 20g 트윈 60(P-1629, 제조원: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany)과 함께 물 80㎖을 혼합하고 오토클레이브시킨다. 접종한지 약 4시간 후에 상기 트윈 용액 75㎕을 배양물에 첨가하고 계속해서 배양한다.

배양은 배플이 장착된 100㎖들이 원뿔형 플라스크내에서 10㎖ 용적으로 수행한다. 가나마이신(25mg/ℓ)을 첨가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도에서 배양한다.

48시간 후, 660nm의 측정 파장에서 바이오멕 1000(Biomek 1000, 제조원: Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 OD를 측정한다. 형성된 글루타메이트의 양은 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌히드린 검출법을 사용하는 컬럼후 유도체화에 의해 측정한다.

당해 시험 결과는 표 1에 제시한다.

균주	OD(660)	글루타메이트 HCl mM
ATCC13032/pJC1cma	14.7	106
ATCC 13032	13.8	94

실시예 6:

라이신의 제조

실시예 4에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1cma를 라이신의 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상청액 중의 라이신 함량을 측정한다.

이를 위해, 균주를 먼저 상응하는 항생제를 함유하는 한천 플레이트(가나마이신(50mg/ℓ)을 함유하는 뇌/심장 한천)에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 한천 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 배양한다(100㎖들이 원뿔형 플라스크내의 배지 10㎖). 완전 배지 CgIII(NaCl 2.5g/ℓ, 박토-펩톤 10g/ℓ, 박토- 효모 추출물 10g/ℓ, pH 7.4, 글루코스(개별적으로 오토클레이브시킴) 20g/ℓ)를 상기 예비배양물용 배지로서 사용한다. 상기 배지에 가나마이신(25mg/ℓ)을 첨가한다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물을 상기 예비배양물로부터 접종시켜, 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 한다. 배지 MM을 주 배양물용으로 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코스(개별적으로 오토클레이브시킴) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄*7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂*2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄*7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄*H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴(멸균-여과시킴) 0.3mg/ℓ

티아민*HCl(멸균-여과시킴) 0.2mg/ℓ

L-루신(멸균-여과시킴) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염 용액을 암모니아수를 사용하여 pH 7로 조정하고 오토클레이브시킨다. 이어서 멸균 기질 및 비타민 용액과 함께 무수 상태에서 오토클레이브시킨 CaCO₃를 첨가한다.

배양은 배플이 장착된 100㎖들이 원뿔형 플라스크에서 10㎖ 용적으로 수행한다. 가나마이신(25㎍/ℓ)을 첨가한다. 33℃ 및 80%의 대기 습도에서 배양한다.

24시간 후, 660nm의 측정 파장에서 바이오멕 1000(Biomek 1000, 제조원: Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 OD를 측정한다. 형성된 라이신의양은 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌히드린 검출법을 사용하는 컬럼후 유도체화에 의해 측정한다.

당해 실험 결과는 표 2에 제시한다.

균주	OD(660)	라이신 HCl g/ℓ
DSM5715/pJC1cma	12.47	8.51
DSM5715	11.90	7.80

Claims

사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 cma 유전자가 증폭된 유전적으로 변형된 코리네형 세균.
제1항에 있어서, 출발 세균(야생형)이

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870,

코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067;

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전적으로 변형된 코리네형 세균.
제1항에 있어서, cma 유전자의 증폭이, 유전자를 과발현시키거나, 특히 유전자의 복제수를 증가시키거나, 강한 프로모터 또는 판독 프레임의 상부에 위치하는 조절 영역을 선택하거나, 프로모터, 조절 영역 또는 리보좀-결합 부위를 돌연변이시키거나, 절합한 발현 카세트를 구조 유전자의 상부에 혼입시키거나, 유도성 프로모터를 혼입하거나, 상응하는 mRNA의 수명을 연장시키거나, 발현된 단백질의 분해를 감소시키거나, 이러한 가능성들 중 수가지를 조합함으로써 수행되는 유전적으로 변형된 코리네형 세균.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 균주가 플라스미드 벡터로 형질전환되고, 플라스미드 벡터가 cma 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지니는 유전적으로 변형된 코리네형 세균.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 유전형이 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 13248에 상응하는 유전적으로 변형된 코리네형 세균.
(a) 서열 2의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

(b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 및

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제6항에 있어서, 바람직하게는 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제6항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
제7항에 있어서,

(i) 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열,

(ii) 유전 코드의 축퇴 범위내에서 서열(i)에 상응하는 하나 이상의 서열 또는

(iii) 서열(i) 또는 서열(ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열 및 임의로

(iv) 상동성 아미노산을 초래하는, (i)에서 중립 기능의 돌연변이를 포함하는 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는, 제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열.
(a) L-아미노산을 생산하며 적어도 cma 유전자 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증폭, 특히 과발현된 코리네형 세균을 발효시키는 단계,

(b) L-아미노산을 배지 또는 당해 세균의 세포내에 농축시키는 단계 및

(c) L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 발효적 제조방법.
제11항에 있어서, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 균주가 사용되는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로 중의 단백질을 암호화하는 추가의 유전자가 세균내에서 추가로 증폭되는 방법.
제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 목적하는 아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로가 세균내에서 적어도 부분적으로 억제되는 방법.
제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 생산된 아미노산이 L-라이신 또는 L-글루타메이트인 방법.
제11항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 라이신 또는 글루타메이트의 제조를 위해,

(a) 디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

(b) 석시닐 디아미노피멜레이트 디석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자,

(c) 피드백(feed back) 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

(d) 트리오스 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자,

(e) 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

(f) 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자,

(g) 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

(h) 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자 또는

(i) 라이신 배출을 암호화하는 lysE 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 증폭, 특히 과발현되거나 증폭된 세균이 발효되는 방법.
제11항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, L-라이신의 제조를 위해,

(a) 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자 및

(b) 글루코스 6-포스페이트 이소머라아제를 암호화하는 pgi 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 약독화된 세균이 발효되는 방법.
폴리머라제 연쇄 반응에 의한 사이클로프로판-미콜산 신타제를 암호화하는 유전자의 DNA의 제조를 위한 프라이머로서 제6항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 용도.
cma 유전자의 서열과 높은 상동성을 나타내는 cDNA 또는 유전자의 분리를 위한 하이브리드화 프로브로서 제6항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.