KR20010051876A - ｐｆｋＡ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은

a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상이 동일한 폴리뉴클레오타이드;

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드; 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드, pfkA 유전자를 증폭시킨 L-아미노산의 발효적 생산방법 및 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서의 이의 용도를 제공한다.

Description

ｐｆｋＡ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열{Novel nucleotide sequences coding for the pfkA gene}

〈110〉 DEGUSSA-HULS AKTIENGESELLSCHAFT

〈120〉 Novel nucleotide sequences coding for the pfkA gene

〈130〉 990169 BT

〈150〉 DE 199 56 133.8

〈151〉 1999-11-23

〈150〉 DE 100 11 922.0

〈151〉 2000-03-11

〈160〉 2

〈170〉 KopatentIn 1.71

〈210〉 1

〈211〉 1274

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (143)..(1171)

〈400〉 1

gtcgatttgt taatgaaact gcagctctgg cgattaaata agatggtcag agacagtttt 60

ttggcctgtc aacccctgtg attctcttat ttttgggtga ttgttccggc gcgggtgttg 120

tgatgggttt aatatggaag ac atg cga att gct act ctc acg tca 166

Met Arg Ile Ala Thr Leu Thr Ser

1 5

ggc ggc gac tgc ccc gga cta aac gcc gtc atc cga gga atc gtc cgc 214

Gly Gly Asp Cys Pro Gly Leu Asn Ala Val Ile Arg Gly Ile Val Arg

10 15 20

aca gcc agc aat gaa ttt ggc tcc acc gtc gtt ggt tat caa gac ggt 262

Thr Ala Ser Asn Glu Phe Gly Ser Thr Val Val Gly Tyr Gln Asp Gly

25 30 35 40

tgg gaa gga ctg tta ggc gat cgt cgc gta cag ctg tat gac gat gaa 310

Trp Glu Gly Leu Leu Gly Asp Arg Arg Val Gln Leu Tyr Asp Asp Glu

45 50 55

gat att gac cga atc ctc ctt cga ggc ggc acc att ttg ggc act ggt 358

Asp Ile Asp Arg Ile Leu Leu Arg Gly Gly Thr Ile Leu Gly Thr Gly

60 65 70

cgc ctc cat ccg gac aag ttt aag gcc gga att gat cag att aag gcc 406

Arg Leu His Pro Asp Lys Phe Lys Ala Gly Ile Asp Gln Ile Lys Ala

75 80 85

aac tta gaa gac gcc ggc atc gat gcc ctt atc cca atc ggt ggc gaa 454

Asn Leu Glu Asp Ala Gly Ile Asp Ala Leu Ile Pro Ile Gly Gly Glu

90 95 100

gga acc ctg aag ggt gcc aag tgg ctg tct gat aac ggt atc cct gtt 502

Gly Thr Leu Lys Gly Ala Lys Trp Leu Ser Asp Asn Gly Ile Pro Val

105 110 115 120

gtc ggt gtc cca aag acc att gac aat gac gtg aat ggc act gac ttc 550

Val Gly Val Pro Lys Thr Ile Asp Asn Asp Val Asn Gly Thr Asp Phe

125 130 135

acc ttc ggt ttc gat act gct gtg gca gtg gct acc gac gct gtt gac 598

Thr Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val Ala Val Ala Thr Asp Ala Val Asp

140 145 150

cgc ctg cac acc acc gct gaa tct cac aac cgt gtg atg atc gtg gag 646

Arg Leu His Thr Thr Ala Glu Ser His Asn Arg Val Met Ile Val Glu

155 160 165

gtc atg ggc cgc cac gtg ggt tgg att gct ctg cac gca ggt atg gcc 694

Val Met Gly Arg His Val Gly Trp Ile Ala Leu His Ala Gly Met Ala

170 175 180

ggc ggt gct cac tac acc gtt att cca gaa gta cct ttc gat att gca 742

Gly Gly Ala His Tyr Thr Val Ile Pro Glu Val Pro Phe Asp Ile Ala

185 190 195 200

gag atc tgc aag gcg atg gaa cgt cgc ttc cag atg ggc gag aag tac 790

Glu Ile Cys Lys Ala Met Glu Arg Arg Phe Gln Met Gly Glu Lys Tyr

205 210 215

ggc att atc gtc gtt gcg gaa ggt gcg ttg cca cgc gaa ggc acc atg 838

Gly Ile Ile Val Val Ala Glu Gly Ala Leu Pro Arg Glu Gly Thr Met

220 225 230

gag ctt cgt gaa ggc cac att gac cag ttc ggt cac aag acc ttc acg 886

Glu Leu Arg Glu Gly His Ile Asp Gln Phe Gly His Lys Thr Phe Thr

235 240 245

gga att gga cag cag atc gct gat gag atc cac gtg cgc ctc ggc cac 934

Gly Ile Gly Gln Gln Ile Ala Asp Glu Ile His Val Arg Leu Gly His

250 255 260

gat gtt cgt acg acc gtt ctt ggc cac att caa cgt ggt gga acc cca 982

Asp Val Arg Thr Thr Val Leu Gly His Ile Gln Arg Gly Gly Thr Pro

265 270 275 280

act gct ttc gac cgt gtt ctg gcc act cgt tat ggt gtt cgt gca gct 1030

Thr Ala Phe Asp Arg Val Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Arg Ala Ala

285 290 295

cgt gcg tgc cat gag gga agc ttt gac aag gtt gtt gct ttg aag ggt 1078

Arg Ala Cys His Glu Gly Ser Phe Asp Lys Val Val Ala Leu Lys Gly

300 305 310

gag agc att gag atg atc acc ttt gaa gaa gca gtc gga acc ttg aag 1126

Glu Ser Ile Glu Met Ile Thr Phe Glu Glu Ala Val Gly Thr Leu Lys

315 320 325

gaa gtt cca ttc gaa cgc tgg gtt act gcc cag gca atg ttt gga 1171

Glu Val Pro Phe Glu Arg Trp Val Thr Ala Gln Ala Met Phe Gly

330 335 340

tagtttttc gggcttttat caacagccaa taacagctct ttcgcccatt gaggtggagg 1230

ggctgttttt tcatgccgta aggaaagtgc aagtaagtga aatc 1274

〈210〉 2

〈211〉 343

〈212〉 PRT

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈400〉 2

Met Arg Ile Ala Thr Leu Thr Ser Gly Gly Asp Cys Pro Gly Leu Asn

1 5 10 15

Ala Val Ile Arg Gly Ile Val Arg Thr Ala Ser Asn Glu Phe Gly Ser

20 25 30

Thr Val Val Gly Tyr Gln Asp Gly Trp Glu Gly Leu Leu Gly Asp Arg

35 40 45

Arg Val Gln Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Asp Arg Ile Leu Leu Arg

50 55 60

Gly Gly Thr Ile Leu Gly Thr Gly Arg Leu His Pro Asp Lys Phe Lys

65 70 75 80

Ala Gly Ile Asp Gln Ile Lys Ala Asn Leu Glu Asp Ala Gly Ile Asp

85 90 95

Ala Leu Ile Pro Ile Gly Gly Glu Gly Thr Leu Lys Gly Ala Lys Trp

100 105 110

Leu Ser Asp Asn Gly Ile Pro Val Val Gly Val Pro Lys Thr Ile Asp

115 120 125

Asn Asp Val Asn Gly Thr Asp Phe Thr Phe Gly Phe Asp Thr Ala Val

130 135 140

Ala Val Ala Thr Asp Ala Val Asp Arg Leu His Thr Thr Ala Glu Ser

145 150 155 160

His Asn Arg Val Met Ile Val Glu Val Met Gly Arg His Val Gly Trp

165 170 175

Ile Ala Leu His Ala Gly Met Ala Gly Gly Ala His Tyr Thr Val Ile

180 185 190

Pro Glu Val Pro Phe Asp Ile Ala Glu Ile Cys Lys Ala Met Glu Arg

195 200 205

Arg Phe Gln Met Gly Glu Lys Tyr Gly Ile Ile Val Val Ala Glu Gly

210 215 220

Ala Leu Pro Arg Glu Gly Thr Met Glu Leu Arg Glu Gly His Ile Asp

225 230 235 240

Gln Phe Gly His Lys Thr Phe Thr Gly Ile Gly Gln Gln Ile Ala Asp

245 250 255

Glu Ile His Val Arg Leu Gly His Asp Val Arg Thr Thr Val Leu Gly

260 265 270

His Ile Gln Arg Gly Gly Thr Pro Thr Ala Phe Asp Arg Val Leu Ala

275 280 285

Thr Arg Tyr Gly Val Arg Ala Ala Arg Ala Cys His Glu Gly Ser Phe

290 295 300

Asp Lys Val Val Ala Leu Lys Gly Glu Ser Ile Glu Met Ile Thr Phe

305 310 315 320

Glu Glu Ala Val Gly Thr Leu Lys Glu Val Pro Phe Glu Arg Trp Val

325 330 335

Thr Ala Gln Ala Met Phe Gly

340

본 발명은 pfkA 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 pfkA 유전자가 증폭된 코리네형 세균을 사용하여 L-아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

L-아미노산, 특히 L-라이신은 인간 의학 및 약학 산업, 특히 동물 사료에서 사용되고 있다.

이러한 아미노산은 코리네형 세균 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 생산된다. 이러한 아미노산의 상당한 중요성으로 인해, 생산 공정을 개선시키려는 끊임없는 노력이 있어왔다. 생산 공정을 개선시키는 것은, 발효 기술과 관련된 수단(예: 교반 및 산소 공급), 또는 영양분 배지의 조성(예: 발효 동안의 당 농도) 또는 수득한 산물의 후처리(예: 이온 교환 크로마토그래피) 또는 미생물 자체의 고유 수행 특성과 관련될 수 있다.

이러한 미생물의 수행 특성은 돌연변이유발, 선별법 및 돌연변이체 선별법을 사용하여 개선시킨다. 상기한 방법으로, 항대사물(예: 라이신 유사체 S-(2-아미노에틸)시스테인)에 내성이 있거나, 조절에 중요한 대사물에 대해 영양요구성이고 L-아미노산, 예를 들어 L-라이신을 생산하는 균주를 수득한다.

몇년 동안, 개별적인 생합성 유전자를 증폭시키고 L-아미노산 생산에 대한 이의 효과를 조사함으로써, 재조합 DNA 기술법이 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선시키는데 또한 사용되어 왔다. 이러한 목적에 대한 논문은 특히 다음 문헌에서 찾아볼 수 있다[참조 문헌: Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger(BioTec 2, 40-44(1991); Eggeling(Amino Acids 6:261-272(1994); Jetten and Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995) and Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39(1996)].

본 발명은 아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 개선된 방법을 위한 신규한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 플라스미드 pEC-T18mob2의 지도이다.

도 2는 플라스미드 pT-pfkAexp의 지도이다.

아미노산, 특히 L-라이신은 인간 의학 및 약학 산업, 특히 동물 사료 산업에 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-라이신을 생산하기 위한 신규하고 개선된 방법을 제공하는데 일반적으로 관심이 있어왔다.

하기에서 L-라이신 또는 라이신은 이의 염기뿐만 아니라, 예를 들어 라이신 일염산염 또는 라이신 황산염과 같은 이의 염을 또한 의미한다.

본 발명은

a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상이 동일한 폴리뉴클레오타이드;

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드; 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 코리네형 세균으로부터 분리시킨 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한

(i) 서열 1의 뉴클레오타이드 서열; 또는

(ii) 유전자 코드의 축퇴성 범위내에서 서열(i)과 일치하는 하나 이상의 서열; 또는

(iii) 서열(i) 또는 (ii)와 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열; 및 임의로

(iv) 서열(i)내에 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 포함하는 복제가능한 DNA를 바람직하게는 포함하는, 특허청구범위 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드를 포함하는, 특허청구범위 제4항에 따르는 폴리뉴클레오타이드; 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 특허청구범위 제6항에 따르는 폴리뉴클레오타이드; 특히 셔틀 벡터 또는 플라스미드 벡터인, 특허청구범위 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 벡터를 포함하는 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 세균을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 완전한 유전자를 포함하는 적합한 유전자 라이브러리를, 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 프로브와 하이브리드화시켜 선별하고 상기한 DNA 서열을 분리시킴으로써 수득할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열로 실질적으로 구성된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 포스포프럭토키나제를 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 분리하고 포스포프럭토키나제 유전자의 서열과 유사성이 높은 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한 RNA, cDNA 및 DNA용 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 포스포프럭토키나제를 암호화하는 유전자의 DNA를 제조하기 위한 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 상기한 올리고뉴클레오타이드는 연속적인 뉴클레오타이드를 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 특히 매우 바람직하게는 15개 이상을 포함한다. 40 내지 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드도 또한 적합하다.

"분리된"은 이의 천연 환경으로부터 분리된 것을 의미한다.

"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 RNA 또는 DNA가 변형되거나 변형되지 않은 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드에 관한 것이다.

"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명에 따르는 폴리펩타이드는 서열 2에 따르는 폴리펩타이드, 특히 포스포프럭토키나제의 생물학적 활성을 가지며 또한 서열 2에 따르는 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상이 동일한 폴리펩타이드, 특별하게는 서열 2에 따르는 폴리펩타이드와 90 내지 95%가 동일하고 상기한 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명은, 특히 이미 아미노산을 생산하고 있으며 pfkA 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증폭되고 특히 과발현된 코리네형 세균을 사용하여 아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

이와 관련하여, 용어 "증폭"은 예를 들어 상승된 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하는 유전자나 강력한 프로모터를 사용하고 임의로 이들 수단을 결합시켜 유전자 또는 유전자들의 복제수를 증가시킴으로써, 미생물에서 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 효소 하나 이상의 세포내 활성을 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 제공되는 미생물은 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산할 수 있다. 미생물에는 대표적으로 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속이 포함될 수 있다. 코리네박테리움 속중에서도, 특별히 L-아미노산을 생산하는 능력이 탁월한 종으로 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종을 언급할 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종중에서 적합한 균주로는 다음의 공지된 야생형 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032;

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806;

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870;

코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539;

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965;

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067;

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및 L-아미노산을 생산하는, 이로부터 제조된 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면 L-라이신 생산 균주로서:

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709;

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712;

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463;

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715이다.

본 발명에 이르러, 씨. 글루타미쿰으로부터 효소 포스포프럭토키나제(EC 2.7.1.11)를 암호화하는 신규한 pfkA 유전자를 분리해내었다.

씨. 글루타미쿰의 pfkA 유전자 또는 다른 유전자는 이. 콜라이중의 상기한 미생물의 유전자 라이브러리를 먼저 작제하여 분리시킨다. 유전자 라이브러리 작제는 공지된 일반적인 문헌 및 매뉴얼에 기술되어 있다. 예를 들어 다음의 문헌[참조 문헌: Winnacker, Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie; Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 삼브룩 등(Sambrook et al.)의 매뉴얼[참조 문헌: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 언급할 수 있다. 익히 공지된 유전자 라이브러리로는 코하라 등[참조 문헌: Kohara et al., Cell 50, 496-508 (1987)]에 의해 λ-벡터중에 작제된, 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 라이브러리가 있다. 바테 등[참조 문헌: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996]은 코스미드 벡터 SuperCosI[참조 문헌: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164]을 사용하여 이. 콜라이 K-12 균주 MN554[참조 문헌: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]중에 작제한 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. 뵈르만 등[참조 문헌: Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326, 1992]은 또한 코스미드 pHC79[참조 문헌: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]를 사용한 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. 이. 콜라이중의 씨. 글루타미쿰 유전자 라이브러리는 또한 pBR322[참조 문헌: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[참조 문헌: Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268]와 같은 플라스미드를 사용하여 생성할 수 있다. 적합한 숙주는 특히 제한 부위 및 재조합 결점이 있는 이. 콜라이 균주이다. 이러한 균주의 한가지 예로는 그랜트 등[참조 문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 의해 기술된 바 있는 균주 DH5αmcr이 있다. 코스미드의 도움으로 클로닝된 긴 DNA 단편은 서열화하기에 적합한 일반적인 벡터로 서브클로닝한 다음, 예를 들어 생거 등[참조 문헌: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977]에 의해 기술된 바와 같이 서열화할 수 있다.

pfkA 유전자를 암호화하고 본 발명에서 서열 1로서 제공되는 씨. 글루타미쿰으로부터의 신규한 DNA 서열은 상기한 방식으로 수득한다. 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 또한 상기한 방법을 사용하여 상기한 DNA 서열로부터 추가로 유추한다. 서열 2는 pfkA 유전자 산물의 수득한 아미노산 서열을 나타낸다.

유전자 코드의 축퇴성으로 유발되는 암호화 DNA 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 단백질중 아미노산의 보존적 치환, 예를 들어 알라닌을 글리신으로 또는 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 것은 단백질의 활성을 근본적으로 변화시키지 않는, 즉 기능적으로 중립인 "센스 돌연변이"이라는 전문적인 부류로서 공지되어 있다. 단백질의 N 및/또는 C 말단에 대한 변화가 단백질의 기능을 실질적으로 손상시키지 않으며 오히려 이를 안정화시킬 수 있음은 공지되어 있다. 당해 분야의 숙련가는 특히 하기하는 문헌[참조 문헌: Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169:751-757(1987); O'Regan et al., Gene 77: 237-251(1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3:240-247(1984); Hochuli et al., Bio/Technology 6:1321-1325(1988)] 및 유전학과 분자생물학의 공지된 교과서에서 이에 관한 정보를 찾을 수 있을 것이다. 서열 2로부터 상응하는 방식으로 수득되는 아미노산 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다.

유사하게, 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화되는 DNA 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 최종적으로, 서열 1로부터 수득된 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되는 DNA 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 15개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다.

당해 분야의 숙련가는 특히 매뉴얼("DIG System Users Guide for Filter Hybridization"; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993) 및 문헌[참조 문헌: Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 하이브리드화에 의해 DNA 서열을 확인하기 위한 설명서를 찾을 수 있을 것이다. 당해 분야의 숙련가는 특히 게이트(Gait)의 매뉴얼(Oligonucleotide synthesis: a practical approach; IRL Press, Oxford, UK, 1984) 및 뉴튼과 그래함(Newton ＆ Graham)의 문헌[참조 문헌: Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994]에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 DNA 서열을 증폭시키기 위한 설명서를 찾을 수 있을 것이다.

본 발명자들은 pfkA를 과발현시키는 개선된 방법으로 코리네형 세균이 L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산한다는 것을 밝혀내었다.

과발현은 상응하는 유전자의 복제수를 증가시키거나, 구조 유전자의 상부스트림에 위치한 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시켜 수행할 수 있다. 구조 유전자의 상부스트림에 통합시킨 발현 카세트가 동일한 방식으로 작용한다. L-라이신을 발효적으로 생산하는 동안에 유도성 프로모터에 의해 발현을 또한 증가시킬 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 발현을 또한 개선시킬 수 있다. 또한 효소 단백질의 분해를 방지하여 효소 활성을 증폭시킨다. 유전자 또는 유전자 작제물은 가변적인 복제수로 플라스미드에 존재하거나 또는 크로모좀에 통합되어 증폭될 수 있다. 선택적으로, 영양 배지 조성 및 배양 조건을 변화시켜 관련 유전자를 또한 과발현시킬 수 있다.

당해 분야의 숙련가는 특히 다음 문헌[참조 문헌: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 제0 472 869호; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 제WO 96/15246호; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993), 일본 공개 특허공보 제10-229891호; Jensen and Hammmer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); Makrides, Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)] 및 공지된 유전학과 분자생물학 교과서에서 관련 지침사항을 찾을 수 있을 것이다

예를 들어, 본 발명에 따르는 pfkA 유전자는 플라스미드의 도움으로 과발현시킨다.

적합한 플라스미드는 코리네형 세균중에서 복제되는 것이다. pZ1[참조 문헌: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554], pEKEx1[참조 문헌: Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[참조 문헌: Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)]과 같은 다수의 공지된 플라스미드 벡터는 잠재 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기본으로 한다. 예를 들어, pCG4[참조 문헌: 미국 특허 제4,489,160호], pNG2[참조 문헌: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)] 또는 pAG1(미국 특허 제5,158,891호)를 기본으로 하는 다른 플라스미드 벡터를 동일한 방식에 사용할 수 있다.

예를 들어 hom-thrB 오페론을 복제 또는 증폭시키기 위해서는, 라인샤이드 등[참조 문헌: Reinscheid et al., Appled and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]이 기술한 바와 같이, 유전자를 염색체내에 통합시켜 증폭시킬 수 있는 플라스미드 벡터가 적합하다. 상기 방법에서, 숙주(통상 이. 콜라이)내에서 복제될 수는 있으나 씨. 글루타미쿰내에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터로 완전한 유전자를 클로닝한다. 고려할 수 있는 벡터로는, 예를 들어 pSUP301[참조 문헌: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[참조 문헌: Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T(Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO[참조 문헌: Shuman(1994), Journal of Biological Chemistry 269:32678-84, 미국 특허 제5,487-993호], pCR^RBlunt(Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)] 또는 pEM1[참조 문헌: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]이 있다. 이어서, 증폭시킬 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환에 의해 씨. 글루타미쿰의 목적하는 균주로 이전시킨다. 접합 방법은, 예를 들어 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]. 형질전환 방법은, 예를 들어 다음 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988); Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) and Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]. "교차"에 의한 상동성 재조합 후, 수득한 균주는 문제의 유전자를 2개 이상의 복사체로 포함한다.

pfkA 유전자뿐만 아니라 해당 과정, 보충 대사경로, 시트르산 사이클 또는 아미노산 수송 경로의 하나 이상의 효소를 증폭시키거나 과발현시키는 것이 아미노산, 특히 L-라이신 생산에 또한 유리할 수 있다.

예를 들어, L-라이신의 생산을 위해 하기의 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 과발현시킬 수 있다:

·디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(참조 문헌: EP-B 0 197 335);

·글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086];

·트리오스포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[참조 문헌: Eikmanns(1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086];

·3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[참조 문헌: Eikmanns(1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086];

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조 문헌: Eikmanns(1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086] 또는

·라이신 수송에 관여하는 효소를 암호화하는 lysE 유전자[참조 문헌: DE-A-195 48 222].

아미노산, 특히 L-라이신을 생산하기 위해, pfkA 유전자 외에, 추가로 하기의 유전자를 동시에 감쇠시키는 것이 유리할 수 있다:

·포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[참조 문헌: DE 199 50 409.1, DSM 13047] 및/또는

·글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[참조 문헌: US 09/396,478, DSM 12969].

아미노산, 특히 L-라이신을 생산하기 위해 pfkA 유전자의 과발현 뿐만 아니라 목적하지 않은 부반응을 억제하는 것이 또한 유리할 수 있다[참조 문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

아미노산, 특히 L-라이신을 생산할 목적으로, 본 발명에 따라 제조된 미생물은 배치 방법 또는 유가식(fed batch) 방법 또는 반복적인 유가식 방법을 사용하여 연속적 또는 비연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 문헌[참조 문헌: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); or Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden), 1994]에 기술되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 균주의 요구성을 적절하게 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 문헌[참조 문헌: "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981]에 기술되어 있다. 탄소원으로서 슈가 및 탄수화물(예: 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스), 오일 및 지방(예: 콩기름, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산)이 사용될 수 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소원으로서 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두 가루 및 우레아) 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 사용될 수 있다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 나트륨을 포함하는 상응하는 염이 사용될 수 있다. 배양 배지는 증식을 위해 필수적인 금속 염, 예를 들어, 황산마그네슘 및 황화철을 추가로 포함한다. 최종적으로, 상기 언급된 물질외에 필수 증식 촉진 물질, 예를 들어, 아미노산 및 비타민이 추가로 사용될 수 있다. 더욱이 적합한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 언급된 공급 물질은 단일 배치의 형태로 배양물에 첨가되거나 배양 동안에 적절하게 공급될 수 있다.

염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)이 pH를 조절하기 위해 적절하게 사용된다. 소포제, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 발포를 조절할 수 있다. 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가하여 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물(예: 공기)을 배양물에 도입할 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이고 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 최대량으로 라이신이 형성될 때까지 배양을 지속한다. 이러한 목표는 일반적으로 10시간 내지 160시간내에 달성된다.

L-라이신의 분석은 문헌[참조 문헌: Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화로 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 아미노산, 특히 L-라이신의 발효 생산을 위해 사용된다.

실시예

본 발명은 하기에서 실시예에 의해 보다 상세하게 설명된다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 게놈 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 염색체 DNA를 문헌[참조 참조: Tauch et al.(1995, Plasmid 33:168-179)]에 기술된 바와 같이 분리하고, 제한효소 Sau3AI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description Sau3AI, code no. 27-0913-02]로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 작은 새우 알칼리 포스파타제[Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany; product description SAP, code no. 1758250]로 탈인산화시킨다. 스트라타진(Stratagene, La Jolla, USA, product description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, code no. 251301)로부터 구입한 코스미드 벡터 SuperCos1의 DNA[참조 문헌: Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Science USA 84:2160-2164]를 제한효소 XbaI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description XbaI, code no. 27-0948-02]로 절단하고, 마찬가지로 작은 새우 알칼리 포스파타제로 탈인산화시킨다. 이어서 코스미드 DNA를 제한효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description BamHI, code no. 27-0868-04)로 절단한다. 상기 방법으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC13032 DNA와 혼합하고, 배치를 T4 DNA 리가제[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description T4 DNA Ligase, code no, 27-0870-04]로 처리한다. 이어서 연결 혼합물은 기가팩 II XL 패킹 추출물[Stratagene, La Jolla, USA, product description Gigapack II XL Packing Extract, code no. 200217]을 사용하여 파아지에 패킹시킨다. 이. 콜라이 균주 NM554[참조 문헌: Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575]는, 세포를 10mM MgSO₄에 넣고 파이지 현탁액의 분취량과 혼합하여 감염시킨다. 코스미드 라이브러리는 문헌[참조 문헌: Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기술된 바와 같이 감염시켜 역가를 측정하고, 100㎍/ml의 앰피실린을 함유한 LB 한천상에 세포를 플레이팅한다[참조 문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]. 37℃에서 밤새 배양한 후에 재조합 단일 클론을 선별한다.

실시예 2

pfkA 유전자의 분리 및 서열화

개별적인 콜로니의 코스미드 DNA를 제조업자의 지침에 따라 키아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep Spin Miniprep Kit)[product no. 27106, Qiagen, Hilden, Germany]를 사용하여 분리하고, 제한효소 Sau3AI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description Sau3AI, product no. 27-0913-02]로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 작은 새우 알칼리 포스파타제[Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany; product description SAP, product no. 1758250]로 탈인산화시킨다. 겔 전기영동으로 분리시킨 후, 1500 내지 2000bp 크기의 코스미드 단편을 QiaExII 겔 추출 키트[product no. 20021, Qiagen, Hilden, Germany]를 사용하여 분리한다. 인비트로젠(Invitrogen, Groningen, Netherlands, product description Zero Background Cloning Kit, product no. K2500-01]로부터 구입한 서열화 벡터 pZero-1의 DNA를 제한효소 BamHI[Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany; product description BamHI, product no. 27-0868-04]으로 절단한다. 서열화 벡터 pZero-1내 코스미드 단편은, 문헌[참조 문헌: Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기술된 바와 같이 DNA 혼합물을 T4 리가제[Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany]로 밤새 항온처리하여 연결시킨다. 이어서 상기 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조 문헌: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649)내로 전기천공[참조 문헌: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7]시키고, 50㎍/ml 제오신을 함유한 LB 한천[참조 문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]상에 플레이팅한다. 재조합 클론의 플라스미드를 바이오로봇 9600[product no. 900200, Qiagen, Hilden, Germany]을 사용하여 작제한다. 짐머만(Zimmermann et al.)등의 방법[참조: 1990, Nucleic acids Research, 18:1067]에 따라 변형된 생거 등(Sanger et al.)의 디데옥시 쇄 종결 방법을 사용하여 서열화한다[참조 문헌: 1977, Proceedingsof the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467]. PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems)로부터 구입한 "RR d로다민 종결 사이클 서열화 키트(RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit)(product no. 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용한다. 겔 전기영동으로 분리하고, 서열화 반응을 "로티포레시스 NF" 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔(29:1)[product no. A124.1. Roth, Karlsruhe, Germany]중에서 PE 어플라이드 바이오시스템즈(Weiterstadt, Germany)로부터 구입한 "ABI 프리즘 377" 서열기를 사용하여 분석한다.

미처리된 수득한 서열 데이터를 스타덴 소프트웨어 패키지(Staden software package, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) 버젼 97-0을 사용하여 처리한다. pZero 1 유도체의 각각의 서열을 연속된 배열로 합한다. 컴퓨터-보조된 암호화 영역 분석은 XNIP 소프트웨어(Staden, 1986, Nucleic acids Rearch, 14:217-231]으로 수행한다. 기관[National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 풍부하지 못한 데이터베이스에 대해, "블래스트 서치 프로그램"(BLAST search program)[참조 문헌: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402)을 사용하여 추가로 분석한다.

수득한 뉴클레오타이드 서열은 서열 1에 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열의 분석은 pfkA 유전자로서 지정된 1029개 염기쌍의 개방 판독 프레임을 보여준다. pfkA 유전자는 343개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화한다.

실시예 3

코리네박테리움 글루타미쿰에서 pfkA를 과발현시키기 위한 플라스미드 제조

3.1. pCR2-Blunt 벡터에 pfkA 유전자 클로닝

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 타우치 등[참조 문헌: Tauch et al., 1995, plasmid 33:168-179]이 기술한 바와 따라 분리시킨다. 실시예 2로부터 수득한 씨. 글루타미쿰에 대한 pfkA 유전자의 서열을 기본으로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응용으로 하기의 올리고뉴클레오타이드를 선택한다:

pfkA-exp: 5'-AAC TGC AGC TCT GGC GAT TA-3'

pfk-ex2: 5'-AAC TAT CCA AAC ATT GCC TG-3'

상기한 프라이머는 MMG 바이오텍(MMG Biotech, Ebersberg, Germany)에서 합성하고, 인니스 등의 표준 PCR 방법[참조 문헌: Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]에 따라 Pwo 폴리머라제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. pfkA 유전자를 함유하는, 크기가 대략 1160bp인 DNA 단편을 폴리머라제 연쇄 반응의 도움으로 분리한다.

증폭시킨 DNA 단편은 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA, USA; 카달로그 번호 K2700-20)의 제로 블런트 PCR 클로닝 키트(Zero Blunt PCR Cloning Kit)를 사용하여 벡터 pCR2 Blunt 벡터[참조 문헌: Bernard et al., 1983, Journal of Molecular Biology. 234: 534-541]와 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 Top10F[참조 문헌: Grand et al., 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87:4645-4649]를 연결 배치에서 형질전환시킨다. 플라스미드 함유 세포는 형질전환 배치를 카나마이신 50㎎/ℓ가 보충된 LB 한천상에 플레이팅하여 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 플라스미드 DNA는 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit; Qiagen)를 사용하여 형질전환체로부터 분리시키고, 제한효소 EcoRI을 사용하여 절단한 다음, 아가로스 겔(0.8%)상에서 전기영동시켜 확인한다. 이 플라스미드는 pCRB1-pfkAexp1으로 명명한다.

3.2. 셔틀 벡터 pEC-T18mob2의 제조

이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터는 선행 기술에 따라 작제한다. 벡터는, 복제 이펙터(effector) per을 갖는 플라스미드 pGA1의 복제 영역 rep[참조 문헌: 미국 특허 제5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)], 테트라사이클린 내성을 부여하는 플라스미드 pAG1의 tetA(Z) 유전자[참조 문헌: 미국 특허 제5,158,891호, 승인 번호 AF121000의 유전자 라이브러리 명(the National Center for Biotechnology Information(NCBI), Bethesda, MD, USA)], 플라스미드 pMB1의 복제 오리진 oriV[참조 문헌: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)], lac 프로모터 및 다중 클로닝 부위(multiple cloning site; mcs)를 포함한 lacZα 유전자 단편[참조 문헌: Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)] 및 플라스미드 RP4의 mob 영역[참조 문헌: Simon et al., 1983, Bio/Technology 1:784-791]를 포함한다. 작제된 벡터로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킨다[참조 문헌: Hanahan, in: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]. 플라스미드 함유 세포는 테트라사이클린 5㎎/ℓ가 보충된 LB 한천상에 형질전환 배치를 플레이팅하여 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 플라스미드 DNA는 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit; Qiagen)를 사용하여 형질전환체로부터 분리시키고, 제한효소 EcoRI 및 HindIII를 사용하여 절단한 다음, 아가로스 겔(0.8%)상에서 전기영동시켜 확인한다. 이 플라스미드는 pEC-T18mob2로 명명하고 도 1에 나타내었다.

3.3. 셔틀 벡터 pEC-T18mob2에 pfkA 클로닝

사용된 벡터는 실시예 3.2에서 기술한 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2이다. 이 플라스미드의 DNA를 제한효소 EcoRI으로 완전히 절단시킨 다음, 작은 새우 알칼리 포스파타제(Roche Molecualr Biochemicals, Mannheim, Germany, product description SAP, product no.: 1758250)로 탈인산화시킨다.

pfkA 유전자는 실시예 3.1에서 기술한 플라스미드 pCRB1-pfkAexp1을 효소 EcoRI을 사용하여 완전하게 절단시켜 이로부터 분리한다. QiaExII 겔 추출 키트(QiaExII Gel Extraction Kit; product no.: 20021, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 대략 1160bp의 pfkA 단편을 아가로스 겔로부터 분리한다.

상기한 방식으로 수득한 pfkA 단편을 제조한 pEC-T18mob2 벡터와 혼합하고 배치를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description T4 DNA Ligase, code no.: 27-0870-04)로 처리한다. 이어서, 연결 배치로 이. 콜라이 균주 DH5α를 형질전환시킨다[참조 문헌: Hanahan, in: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]. 플라스미드 함유 세포는 테트라사이클린 5㎎/ℓ가 보충된 LB 한천상에 형질전환 배치를 플레이팅하여 선별한다[참조 문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]. 37℃에서 밤새 배양한 다음, 개별적인 재조합 클론을 선별한다. 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(product no.: 27106; Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조자 지침서에 따라 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고, 제한효소 EcoRI을 사용하여 절단한 다음, 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 플라스미드를 확인한다. 수득한 플라스미드는 pT-pfkAexp로 명명한다. 이는 도 2에 나타내었다.

실시예 4

플라스미드 pT-pfkAexp를 사용한 균주 DSM5715의 형질전환

균주 DSM5715(EP-B 0 435 132)는 리블 등[참조 문헌: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)]이 기술한 천기천공법을 사용하여 플라스미드 pT-pfkAexp로 형질전환시킨다. 뇌-심장 주입 부용 18.5g/ℓ, 0.5M 소르비톨, 박토 트립톤 5g/ℓ, 박토 효모 추출물, 2.5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ 및 박토 한천 18g/ℓ으로 구성되고 테트라사이클린 5㎎/ℓ가 보충된 LBHIS 한천상에서 형질전환체를 선별한다. 33℃에서 2일 동안 배양을 실시한다.

통상의 방법[참조 문헌: Perters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927]을 사용하여 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고, 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 절단한 다음, 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 플라스미드를 확인한다. 수득한 균주는 DSM5715/pT-pfkAexp로 명명한다.

실시예 5

라이신 생산

실시예 4에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715/pT-pfkAexp는 라이신을 생산하기에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양 상층액의 라이신 함량을 측정한다.

이를 위해, 균주는 적절한 항생제를 갖는 한천 플레이트(테트라사이클린(5㎎/ℓ)이 있는 뇌/심장 한천)상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 한천 플레이트 배양으로부터 개시하여, 예비배양물을 접종한다(100㎖들이 에를렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크중 배지 10㎖). 상기 예비배양용 배지로서 완전 배지 CgIII(NaCl 2.5g/ℓ, 박토 펩톤 10g/ℓ, 박토 효모 추출물 10g/ℓ, 글루코스 20g/ℓ, pH 7.4)를 사용한다. 테트라사이클린(5㎎/ℓ)을 상기 배지에 가한다. 예비배양물은 240rpm의 진탕기상에서 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물은 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1OD가 되도록 상기 예비배양물로부터 접종시킨다. 주 배양물용 배지로는 배지 MM을 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코스(개별적으로 오토클레이브함) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄*7H₂0 1.0g/ℓ

CaCl₂*2H₂O 10㎎/ℓ

FeSO₄*7H₂O 10㎎/ℓ

MnSO₄*H₂O 5.0㎎/ℓ

바이오틴(멸균-여과시킴) 0.3㎎/ℓ

티아민*HCl(멸균-여과시킴) 0.2㎎/ℓ

L-류신(멸균-여과시킴) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염수는 암모니아수를 사용하여 pH를 7로 조절하고 오토클레이브시킨다. 이어서 무수-오토클레이브시킨 CaCO₃와 함께 멸균 기질 및 비타민 용액을 가한다.

유동 스포일러를 갖는 100㎖들이 에를렌메이어 플라스크중 10㎖ 용적으로 배양을 실시한다. 카나마이신(25㎎/ℓ)을 가한다. 배양은 33℃ 및 80%의 대기 습도하에 수행한다.

24시간 후, 바이오멕(Biomek) 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 660nm의 측정 파장에서 OD를 측정한다. 형성된 라이신의 양은 이온 교환 크로마토그래피와 닌하이드린 검출법을 사용하는 칼럼후 유도체화에 의해, 에펜도르프-바이오트로닉(Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)의 아미노산 분석기를 사용하여 측정한다.

시험 결과는 표 1에 나타내었다.

균주	OD(660)	라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715/pT-pfkAexp	14.6	10.1
DSM5715	15.2	8.1

도면 및 명세서에서의 약어 및 명칭은 다음과 같이 정의된다.

Tet: 테트라사이클린 내성 유전자

OriV: 이. 콜라이의 플라스미드 암호화 복제 오리진

RP4mob: 플라시미드 유동을 위한 mob 영역

rep: 씨. 글루타미쿰 플라스미드 pGA1의 플라스미드 암호화 복제 오리진

per: 복제수를 조절하기 위한 pGA1로부터의 유전자

lacZ-알파: β-갈락토시다제 유전자의 lacZα 유전자 단편(N 말단)

'lacZa': lacZα 유전자 단편의 5' 말단

lacZ-알파': lacZα 유전자 단편의 3' 말단

pfkA: 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 pfkA 유전자

BamHI: 제한효소 BamHI의 제한 부위

EcoRI: 제한효소 EcoRI의 제한 부위

HindIII: 제한효소 HindIII의 제한 부위

KpnI: 제한효소 KpnI의 제한 부위

PstI: 제한효소 PstI의 제한 부위

PvuI: 제한효소 PvuI의 제한 부위

SalI: 제한효소 SalI의 제한 부위

SacI: 제한효소 SacI의 제한 부위

SmaI: 제한효소 SmaI의 제한 부위

SphI: 제한효소 SphI의 제한 부위

XbaI: 제한효소 XbaI의 제한 부위

XhoI: 제한효소 XhoI의 제한 부위

본 발명의 pfkA 유전자가 증폭된 코리네형 세균을 사용하면 발효에 의해 L-아미노산, 특히 L-라이신을 보다 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (16)

1. a) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상이 동일한 폴리뉴클레오타이드;

   b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

   c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드; 및

   d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드.
2. 제1항에 있어서, 바람직하게는 코리네형 세균에서 복제될 수 있는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
3. 제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
4. 제2항에 있어서, 서열 1에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
5. 제2항에 있어서,

   (i) 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는

   (ii) 유전자 코드의 축퇴성 범위내에서 서열(i)과 일치하는 하나 이상의 서열, 또는

   (iii) 서열(i) 또는 (ii)와 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로

   (iv) 서열(i)내에 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 포함하는, 복제가능한 DNA.
6. 제2항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
7. a) 적어도 pfkA 유전자 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증폭되고 특히 과발현된 L-아미노산 생산 코리네형 세균을 발효시키는 단계;

   b) 배지내에 또는 세균 세포내에 L-아미노산을 축적시키는 단계; 및

   c) L-아미노산을 분리시키는 단계를 수행하는, L-아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로중의 추가의 유전자가 추가로 증폭된 세균을 사용하는 방법.
9. 제7항에 있어서, L-라이신의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 억제된 세균을 사용하는 방법.
10. 제7항에 있어서, 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용하고 플라스미드 벡터가 pfkA 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 방법.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L-라이신을 생산하는 코리네형 세균을 사용하는 방법.
12. 제6항에 있어서,

    12.1 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

    12.2 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

    12.3 트리오스포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자,

    12.4 석시닐디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자,

    12.5 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

    12.6 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자 및

    12.7 라이신 수송에 관여하는 효소를 암호화하는 lysE 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 증폭되고, 특히 과발현된 세균을 발효시켜 라이신을 생산하는 방법.
13. 제9항에 있어서,

    13.1 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자; 및

    13.2 글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 세균을 발효시켜 L-라이신을 생산하는 방법.
14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 속의 미생물이 사용되는 방법.
15. 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 포스포프럭토키나제를 암호화하는 유전자의 DNA를 제조하기 위한 프라이머로서의, 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.
16. 하이브리드화 프로브로서의, 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.