DE10032174A1 - Neue für das gpsA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein coryneformes Bakterium, dessen gpsA-Gen verstärkt ist, sowie ein isoliertes Polynukleotid, das für die Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase aus coryneformen Bakterien kodiert, wie auch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verstärkung des gpsA-Gens in den Bakterien und die Verwendung des Polynukleotids als Primer oder Hybridisierungs-Sonde.

Description

Gegenstand der Erfindung sind für die Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Nukleotidsequenzen, coryneforme Bakterien, in denen das gpsA-Gen, das für die Glycerol-3- Phosphat Dehydrogenase kodiert, verstärkt wird, sowie Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Glutamat, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen das gpsA-Gen verstärkt wird.

Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in die Lebensmittelindustrie, insbesondere aber in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rühren und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Lysin oder L-Glutamat produzieren.

Seit einigen Jahren werden außerdem Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung Aminosäure- produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht. Übersichtsartikel hierzu findet man unter anderem bei Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) und Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Hilfsmittel zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein coryneformes Bakterium, dessen Gen gpsA, das die Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase kodiert, verstärkt wird.

Aminosäuren, insbesondere L-Glutamat und L-Lysin, finden in der Humanmedizin, in der Tierernährung, in der pharmazeutischen Industrie und insbesondere in der Lebensmittelindustrie Anwendung. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L- Glutamat, bereitzustellen.

Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin bzw. L-Glutamat oder Glutamat erwähnt werden, sind damit nicht nur die Base, sondern auch deren Salze gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein coryneformes Bakterium, in dem dessen Gen gpsA, das die Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase kodiert, verstärkt ist.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden.

Die Verstärkung kann mit Hilfe verschiedener Manipulationen der Bakterienzelle erreicht werden.

Zur Erzielung einer Verstärkung, insbesondere einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, man kann einen starken Promotor verwenden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Lysin- bzw. L-Glutamat- Produktion zu steigern. Es kann auch ein Gen verwendet werden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Außerdem wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzyms ebenfalls die Enzymaktivität insgesamt erhöht. Gegebenenfalls können diese Maßnahmen auch beliebig kombiniert werden.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind zum Beispiel die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

• a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% homolog ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
• b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% homolog ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
• c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
• d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c).

"Homolog" im Rahmen der vorliegenden Anmeldung ist eine Polynukleotidsequenz zu der erfindungsgemäßen Sequenz dann, wenn sie in ihrer Basenzusammensetzung und -sequenz wenigstens zu 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders bevorzugt wenigstens 90% mit der erfindungsgemäßen Sequenz übereinstimmt. Unter einem "homologen Protein" sollen gemäß der vorliegenden Erfindung Proteine verstanden werden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit der Aminosäuresequenz, die durch das Gen cma (SEQ ID Nr. 1) kodiert wird zu wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders bevorzugt wenigstens 90% übereinstimmen, wobei "übereinstimmen" so zu verstehen ist, daß die sich entsprechenden Aminosäuren entweder identisch sind, oder es sich um zueinander homologe Aminosäuren handelt. Als "homologe Aminosäuren" werden solche bezeichnet, die sich in ihren Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich Ladung, Hydrophobizität, sterischen Eigenschaften usw. entsprechen.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein wie oben beschriebenes Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:

• a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
• b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
• c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
• d) funktionsneutrale Mutationen in (i), die zu derselben oder einer homologen Aminosäure führen.

Weitere Gegenstände sind
ein replizierbares Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 umfasst oder aus ihr besteht,
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 umfasst, oder aus ihr besteht,
ein Vektor, enthaltend die für das plsC-Gen kodierende DNA- Sequenz von C. glutamicum, enthalten in dem Vektor (Plasmid) pJC1plsC, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer DSM 13493
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das gpsA-Gen verstärkt wird.

Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die das vollständige Gen mit der Polynukleotidsequenz entsprechend SEQ ID No. 1 oder Fragmente davon enthalten, und die durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon enthält, und Isolierung der genannten DNA- Sequenz erhältlich sind.

Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um cDNA in voller Länge zu isolieren, die für die Glycerol-3- Phosphat Dehydrogenase kodieren und solche cDNA oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der mit der Sequenz des Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase-Gens aufweisen.

Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind außerdem geeignet als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Herstellung von DNA, die für die Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase kodieren.

Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide können mehr als 30, bevorzugt bis zu 30, besonders bevorzugt bis zu 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide enthalten. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.

"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.

"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.

Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.

Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 ein, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase und auch solche, die zu wenigstens 70% homolog sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders die zu wenigstens 90% bis 95% Homologie mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L- Lysin und L-Glutamat, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits eine Aminosäure produzieren, und in denen die für das gpsA-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

In der vorliegenden Erfindung wird erstmals das für die Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase (EC 1.1.1.94) kodierende gpsA-Gen von C. glutamicum gezeigt.

Zur Isolierung des gpsA-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli- Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DHSamcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.

Auf diese Weise wurde die neue für das Gen gpsA kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Außerdem wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des gpsA-Genproduktes dargestellt.

Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind außerdem konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Außerdem ist bekannt, daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder diese sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.

In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonukleotid-Primlern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID NO. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA- Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).

Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden, daß coryneforme Bakterien nach Verstärkung des gpsA-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, produzieren.

Die betrachteten Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann außerdem eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

Beispielhaft wurde das erfindungsgemäße gpsA-Gen mit Hilfe von Plasmiden überexprimiert.

Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert und exprimiert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.

Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das gpsA-Gen überexprimiert werden kann, ist pJC1gpsA (Fig. 1), welches auf dem E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor pJC1 (Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-­ 480) basiert und die für das gpsA-Gen kodierende DNA- Sequenz von C. glutamicum enthält. Es ist in dem Stamm DSM5715/pJC1gpsA enthalten.

Außerdem eignen sich solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-­ 4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.

Zusätzlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Glutamat vorteilhaft sein, neben dem gpsA- Gen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus oder des Aminosäure-Exports zu verstärken oder zu überexprimieren.

So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA- Gen (EP-B 0 197 335), oder
• - das für die Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase kodierende dapE-Gen, oder
• - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224, 317-324), oder
• - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
• - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
• - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), oder
• - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609), oder
• - gleichzeitig das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), oder
• - das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen (DE-A-195 48 222)

verstärkt, insbesondere überexprimiert oder amplifiziert werden.

Weiter kann beispielsweise für die Herstellung von L- Glutamat gleichzeitig eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdh-Gen (DE: 199 07 347.3) und/oder
• - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (Peters-Wendisch et al. (1998), Microbiology 144: 915-­ 927)

verstärkt, insbesondere überexprimiert oder amplifiziert werden.

Außerdem kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verstärkung des gpsA-Gen gleichzeitig

• - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen (DE 199 50 409.1, DSM 13047) und/oder
• - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi- Gen (US 09/396,478, DSM 12969)

abzuschwächen.

Weiter kann es für die Produktion von L-Glutamat vorteilhaft sein, neben der Verstärkung des gpsA-Gen gleichzeitig

• - das für die α-Ketoglutarat-Dehydrogenase kodierende odhA-Gen (WO 9534672 A1 951221*), oder
• - das für das DtsR1-Protein kodierende dtsR1-Gen (WO 952324 A1 950831*), oder
• - das für das DtsR2-Protein kodierende dtsR2-Gen (WO 9902692A A1 990121*)

abzuschwächen.

Außerdem kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, vorteilhaft sein, neben der Überexpression des gpsA-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Glutamat kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß außerdem Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an Glutamat gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

• - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pJC1gpsA als DSM 13493.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L- Glutamat.

Legende zur Figur Fig. 1: Karte des Plasmids pJC1gpsA

Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca.- Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhalten werden. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung.
Orf2,rep: Plasmidkodierter Replikationsursprung C. glutamicum (von pHM1519)
gpsA: gpsA (Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase) Gen aus C. glutamicum ATCC13032
Kan: Kanamycin-Resistenzgen
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
XhoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
BglII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BglII
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit Shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868- 04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC 13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27- 0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektiert.

Beispiel 2 Isolierung und Sequenzierung des gpsA-Gens

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27- 0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany). Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) mittels Elektroporation transferiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und der Ansatz auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert. Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-­ 3402), gegen die non-redundant Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 996 Basenpaaren, welches als gpsA- Gen bezeichnet wurde. Das gpsA-Gen kodiert für ein Protein von 332 Aminosäuren (SEQ ID No. 2).

Beispiel 3 Klonierung des gpsA Gens im Vektor pJC1

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion wurde ein DNA Fragment amplifiziert, das das gpsA Gen trägt. Dazu wurden die folgenden Primer verwendet:
5'-TGC TCT AGA TGC GGG TGG CTT GGG ACA T-3'
5'-TGC TCT AGA ACG ACT GCG ACG CGG ACT TTT C-3'

Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und damit nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al., (PCR protocol. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) die PCR Reaktion durchgeführt. Die Primer ermöglichten die Amplifizierung eines ca. 1131 bp großen DNA-Fragmentes, welches das gpsA Gen aus Corynebacterium glutamicum trägt.

Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung des PCR-Fragmentes aus dem Agarosegel mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).

Als Vektor wurde der E. coli - C. glutamicum Shuttle-Vektor pJC1 (Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480) verwendet. Dieses Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI vollständig gespalten, mit Klenow Polymerase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) behandelt und anschließend mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert.

Das auf diese Weise gewonnene gpsA-Fragment wurde mit dem vorbereiteten Vektor pJC1 gemischt und mit Hilfe des SureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nach Angaben des Herstellers ligiert. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli Stamm DH5α (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 50 mg/l Kanamycin. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektiert. Plasmid DNA wurde aus einer Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten, um das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Das erhaltene Plasmid wurde pJC1gpsA genannt.

Beispiel 4 Transformation der Stämme ATCC13032 und DSM5715 mit dem Plasmid pJC1gpsA

Die Stämme ATCC13032 und DSM5715 wurden mit dem Plasmid pJC1gpsA unter Anwendung der von Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsmethode transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.

Plasmid DNA wurde aus je einer Transformante nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), mit der Restriktionsendonuklease XbaI geschnitten und das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Die erhaltenen Stämme wurden ATCC13032/pJC1gpsA und DSM5715/pJC1gpsA genannt.

Beispiel 5 Herstellung von L-Glutamat mit dem Stamm ATCC13032/­ pJC1gpsA

Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm ATCC13032/pJC1gpsA wurde in einem zur Produktion von Glutamat geeigneten Nährmedium kultiviert und der Glutamatgehalt im Kulturüberstand bestimmt.

Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin (50 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII (2,5 g/l NaCl, 10 g/l Bacto-Pepton, 10 g/l Bacto-Yeast Extract, pH7,4, 20 g/l Glucose (getrennt autoklaviert) verwendet. Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium CgXII verwendet.

Der Stamm ATCC13032/pJC1gpsA wurde nach Vorkultivierung in Medium CgIII (Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603), im Produktionsmedium CgXII (Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-­ 5603) kultiviert. Es wurden 4% Glukose und 50 mg/l Kanamycinsulfat zugesetzt.

Zur Induktion der Glutamatbildung wurde 20 g Tween 60 (P- 1629, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) plus 80 ml Wasser gemischt und autoklaviert. Etwa 4 Stunden nach dem Animpfen, wurde 75 µl dieser Tween-Lösung zu der Kultur gegeben und die Kultivierung wurde fortgeführt.

Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchte.

Nach 48 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Glutamatmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.

Tabelle 1

Beispiel 6 Herstellung von L-Lysin

Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5715/pJC1gpsA wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.

Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin (50 mg/l)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben) Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII (2,5 g/l NaCl, 10 g/l Bacto-Pepton, 10 g/l Bacto-Yeast Extract, pH7,4, 20 g/l Glucose (getrennt autoklaviert) verwendet. Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.

Medium MM

CSL (Corn Steep Liquor)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose(getrennt autoklaviert)	50 g/l
(NH4)2SO4	25 g/l
KH2PO4	0,1 g/l
MgSO4.7 H2O	1,0 g/l
CaCl2.2 H2O	10 mg/l
FeSO4.7 H2O	10 mg/l
MnSO4.H2O	5,0 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/l
Thiamin.HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
L-Leucin	0,1 g/l
CaCO3	25 g/l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das trocken autoklavierte CaCO₃.

Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 µg/ml zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchte.

Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.

Tabelle 2

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (19)

1. Coryneformes Bakterium, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Gen gpsA, das für die Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase kodiert, verstärkt ist.

2. Coryneformes Bakterium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangs-Bakterium (Wildtyp) ausgewählt ist aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum (ATCC13032), Corynebacterium acetoglutamicum (ATCC15806), Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC13870), Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP- 1539), Corynebacterium melassecola (ATCC17965), Brevibacterium flavum (ATCC14067), Brevibacterium lactofermentum (ATCC13869) und Brevibacterium divaricatum (ATCC14020), oder ausgewählt ist aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709, Brevibacterium flavum FERM-P 1708, Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und Corynebacterium glutamicum DSM5715.

3. Coryneformes Bakterium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verstärkung des gpsA-Gens durch Überexpression des Gens, insbesondere durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens, durch Auswahl eines starken Promotors oder einer Regulationsregion oberhalb des Leserasters, durch Mutation des Promotors, der Regulationsregion oder der Ribosomenbindungsstelle, durch Einbau einer geeigneten Expressionskassette oberhalb des Strukturgens oder durch Einbau von induzierbaren Promotoren, durch die Verlängerung der Lebensdauer der entsprechenden mRNA, durch einen verminderten Abbau der exprimierten Proteine, oder durch die Kombination mehrerer dieser Möglichkeiten erfolgt.

4. Coryneformes Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm mit einem Plasmidvektor transformiert ist und der Plasmidvektor die für das gpsA-Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.

5. Coryneformes Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es genotypisch dem Stamm Corynebacterium glutamicum DSM 13493 entspricht.

6. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

• a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% homolog ist zu einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 umfasst, oder aus dieser besteht,
• b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 70% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
• c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
• d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfol­ gende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c)

7. Polynukleotid gemäß Anspruch 6, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.

8. Polynukleotid gemäß Anspruch 6, wobei das Polynukleotid eine RNA ist.

9. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 7, enthaltend

• a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
• b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
• c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
• d) funktionsneutrale Mutationen in (i), die zu homologen Aminosäuren führen.

10. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 7, 8 oder 9, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 hat, umfasst.

11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation von L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest das gpsA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert ist,
• b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
• c) Isolieren von der L-Aminosäure.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 einsetzt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich weitere Gene, die ein Protein des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure kodieren, in den Bakterien verstärkt sind.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Stoffwechselwege, die die Bildung der gewünschten Aminosäure verringern, in den Bakterien zumindest teilweise ausgeschaltet sind.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der hergestellten Aminosäure um L- Glutamat oder L-Lysin handelt.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von Glutamat Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• a) das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen,
• b) das Gen für die Succinyldiaminopimelat- Desuccinylase kodierende dapE-Gen,
• c) das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende lysC-Gen,
• d) das für die Triosephosphat Isomerase kodierende tpi-Gen,
• e) das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende gap-Gen,
• f) das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende pgk-Gen,
• g) das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen,
• h) das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,
• i) das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen,

gleichzeitig verstärkt, insbesondere überexprimiert oder amplifiziert ist.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß für die Herstellung von L-Lysin Bakterien fermentiert werden, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• a) das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
• b) das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen

abgeschwächt ist.

18. Verwendung von Polynukleotidsequenzen oder Teilen davon gemäß Anspruch 6 als Primer für die Polymerase- Kettenreaktion zur Herstellung der DNA von Genen, die für Glycerol-3-Phosphat Dehydrogenase kodieren.

19. Verwendung von Polynukleotidsequenzen gemäß Anspruch 6 als Hybridisierungs-Sonden zur Isolierung von cDNA oder Genen, die eine hohe Homologie mit der Sequenz des gpsA-Gens aufweisen.