DE19943587A1 - Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen - Google Patents

Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen

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DE19943587A1
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identsich ist mit einem Polynukleotid, das für das Polypeptid codiert, das durch das in dem hinterlegten C.glutamicum Stamm DSM 12969 auf dem Vektor pEC-XT-99A-dapF enthaltene dapF-Gen exprimiert wird, DOLLAR A c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, DOLLAR A d) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b) oder c), und DOLLAR A e) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Polynukleotidsequenz von a), b), c) oder d), DOLLAR A und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- unter Verstärkung des dapF-Gens.

Description

Gegenstand der Erfindung sind für das dapF-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen das Gen dapF verstärkt wird.
Stand der Technik
L-Lysin findet in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie insbesondere aber in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß L-Lysin durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Aminosäuren sind und L-Lysin produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Lysin produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Lysin-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Lysin-Produktion untersucht.
Übersichtsartikel hierzu findet man unter anderem bei Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) und Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).
In Prokaryoten sind drei unterschiedliche Wege für die Biosynthese von D,L-Diaminopimelat- bzw. L-Lysin bekannt. Diese Wege unterscheiden sich in der Umsetzung von L- Piperidin-2,6-dicarboxylat (Tetrahydrodipicolinat).
Beim Succinylaseweg wird Tetrahydrodipicolinat über eine Succinylierung durch die Tetrahydrodipicolinat-Succinylase, anschließender Transaminierung (N-Succinyl-amino- Ketopimelat Transaminase) der Ketogruppe, Desuccinylierung (N-Succinyl-amino-Ketopimelat Desuccinylase) und anschließender Epimerisierung (Diaminopimelat Epimerase) zu D,L Diaminopimelat umgesetzt (Gilvarg, 1958, The Journal of Biological Chemistry, 233: 1501-1504).
Beim Acetylaseweg, der in Bacillus subtilis und Bacillus megaterium verwirklicht ist, erfolgt die Acylierung von Tetrahydrodipicolinat durch einen Acetylrest (Weinberger & Gilvarg, 1970, Journal of Bacteriology, 101: 323-324).
Ein dritter Biosyntheseweg ist für B. sphaericus beschrieben (Misono et al., 1976, Journal of Bacteriology, 137: 22-27). Bei diesem als Dehydrogenaseweg bezeichneten Biosyntheseschritt erfolgt die direkte reduktive Aminierung des Tetrahydrodipicolinats zu D,L-DAP.
Schrumpf et al. (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) zeigten anhand genetischer und enzymatischer Untersuchungen, daß in Corynebacterium glutamicum die Lysin-Biosynthese sowohl über den Dehydrogenaseweg als auch über den Succinylaseweg erfolgt.
Durch in-vivo-NMR-Untersuchungen von Marx et al., (Biotechnology and Bioengineering 56, 168-180 (1997)) und Sonntag (European Journal of Biochemistry 213: 1325-1331 (1993)) ist gezeigt worden, daß in Corynebacterium glutamicum sowohl der Succinylaseweg als auch der Dehydrogenaseweg zur Produktion von L-Lysin beitragen.
Das Gen für die Desuccinylase (dapE) aus Corynebacterium glutamicum wurde von Wehrmann et al. kloniert und sequenziert (Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)). Weiterhin konnte das Gen für die Succinylase (dapD) aus Corynebacterium glutamicum und kloniert und sequenziert werden (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)).
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
L-Lysin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und insbesondere in der Tierernährung Anwendung. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran neue verbesserte Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Base sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bkaterien, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe:
  • a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
  • b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für das Polypeptid codiert, das durch das in dem hinterlegten C.-glutamicum-Stamm DSM 12968 auf Plasmid pEC-XT99A-dapF enthaltene dapF-Gen exprimiert wird,
  • c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
  • d) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b) oder c), und
  • e) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Polynukleotidsequenz von a), b), c) oder d).
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:
  • a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ-ID-No. 1, oder
  • b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
  • c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
  • d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
Weitere Gegenstände sind
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleo­ tidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt,
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält
ein Vektor, enthaltend das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, insbesondere pEC-XT99A-dapF, hinterlegt als DSM 12 968
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor gemäß Anspruch 7 enthalten.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank, die das vollständige Gen mit der Polynukleotidsequenz entsprechend SEQ ID No. 1 enthalten mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten Polynukleotids gemäss SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.
Polynukleotidsequenzen gemäss der Erfindung sind geeignet als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA, um cDNA in voller Länge zu isolieren, die für Diaminopinelat- Epimerase codieren und solche cDNA oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der des Diaminopimelat-Epimerase-Gens aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäss der Erfindung sind weiterhin geeignet als Primer zur Herstellung von DNA von Genen, die für Diaminopinelat-Epimerase codieren, durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Basenpaaren.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schliessen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Diaminopimelat-Epimerase und auch solche ein, die zu wenigstens 70% identisch sind mit dem Polypeptid gemäss SEQ ID No. 2, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders die zu wenigstens 90% bis 95% Identität mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren, und in denen die für das dapF-Gen codierenden Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Lysin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind die zum Beispiel bekannten Wildtypstämme:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 und
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
Den Erfindern gelang es, das neue, für das Enzym Diaminopimelat-Epimerase (EC 5.1.1.7) kodierende dapF-Gen von C. glutamicum zu isolieren.
Zur Isolierung des dapF-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikrorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Viera et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli- Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente. können anschließend wiederum in gängige für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.
Auf diese Weise wurde die neue für das Gen dapF kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID NO 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID NO 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des dapF-Genproduktes dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID NO 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID NO 1 oder Teilen von SEQ ID NO 1 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID NO 2 ergeben sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID NO 1 oder Teilen von SEQ ID NO 1 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID NO 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Basenpaaren.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA- Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Die Erfinder fanden heraus, daß coryneforme Bakterien nach Überexpression des dapF-Gens in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Lysin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15 246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10- 229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Ein Beispiel für ein Plasmid mit Hilfe dessen das dapF-Gen überexprimiert werden kann ist pEC-XT99A-dapF (Fig. 2), das in dem Stamm DSM 5715/pEC-XT99A-dapF enthalten ist. Plasmid pEC-XT99A-dapF ist ein auf Plasmid pEC-XT99A (Fig. 1) basierender E. coli-C. glutamicum Pendelvektor. Dieser Plasmidvektor enthält die Replikationsregion des Plasmids pGA1 (US-B 5,175,108) und das Tetracyclin-Resistenzgen des Plasmids pAG1 (Accession No. AF121000 des National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA). Andere in C. glutamicum replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pZ8-1 (EP-B 0 375 889) können in gleicher Weise verwendet werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein neben dem dapF-Gen ein oder mehrere Enzyme des Lysin-Biosyntheseweges zu überexprimieren. So kann beispielsweise
  • - gleichzeitig das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen überexprimiert werden (EP-B 0 197 335), oder
  • - gleichzeitig ein S-(2-Aminoethyl)-Cystein-Resistenz vermittelndes DNA-Fragment amplifiziert werden (EP-A 0 088 166), oder
  • - gleichzeitig das für die Tetradihydrodipicolinat Succinylase kodierende dapD-Gen (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)), oder
  • - gleichzeitig das Gen für die Succinyldiaminopimelate- Desuccinylase kodierende dapE-Gen (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)) überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der Überexpression des dapF-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Lysin erfolgt kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben.
Folgende Mikroorganismen wurden bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
  • - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM 5715/pEC-XT99A als DSM 12 967
  • - Corynebacterium glutamicum Stamm DSM 5715/pEC-XT99A-dapF als DSM 12 968
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1 Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032 wurde wie bei Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben, isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHiI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar. (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 100 µg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Beispiel 2 Isolierung und Sequenzierung des dapF-Gens
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20 021, Qiagen, Hilden, Germany). Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 50 µg/ml Zeocin ausplattiert. Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy- Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen. Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt. Homologieanalysen wurden mit den "BLAST search programs" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402), gegen die non-redundant Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 831 Basenpaaren, welches als dapF- Gen bezeichnet wurde. Das dapF-Gen kodiert für ein Polypeptid von 277 Aminosäuren.
Beispiel 3 Konstruktion des Expressionsvektors pEC-XT99A
Als Ausgangsvektor zur Konstruktion des E. coli-C. glutamicum-Shuttle-Expressionsvektors pEC-XT99A wurde der E. coli-Expressionsvektor pTRC99A (Amann et al. 1988, Gene 69: 301-315) verwandt. Nach BspHI-Restriktionsspaltung (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung BspHI, Product No. 1467123) und anschließender Klenow-Behandlung (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) wurde das Ampicillin-Restenzgen (bla) gegen das Tetracyclin- Resistenzgen des C. glutamicum Plasmids pAG1 (GenBank Accession No. AF121000) ausgetauscht. Hierzu wurde der Resistenzgen-tragende Bereich als AluI-Fragment (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Alul, Product No. 27-0884-01) in den linearisierten E. coli-Expressionsvektor pTRC99A kloniert. Die Ligation wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4- Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli-Stamm DHSczmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiology Letters, 123: 343-7). Der konstruierte E. coli- Expressionsvektor wurde mit pXT99A bezeichnet. Als Basis zur Klonierung eines Minimalreplikons aus Corynebacterium glutamicum wurde das Plasmid pGA1 (Sonnen et al. 1991, Gene, 107: 69-74) verwandt. Durch BalI/PstI- Restriktionsspaltung (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung BalIf Product No. R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01) des Vektors pGA1 konnte ein 3484 bp großes Fragment in den mit SmaI und PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung SmaI, Product No. 27-0942-02, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01) fragmentierten Vektor pK18mob2 (Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169: 303-312) kloniert werden. Mittels BamHI/XhoI-Restriktionsspaltung (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-086803, Produktbeschreibung XhoI, Product No. 27-0950-01) und anschließender Klenow-Behandlung (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) wurde ein 839 bp großes Fragment deletiert. Aus dem mit T4- Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04) religierten Konstrukt konnte das C. glutamicum Minimalreplikon als 2645 bp großes Fragment in den E. coli- Expressionsvektor pXT99A kloniert werden. Hierzu wurde die DNA des Minimalreplikon-tragenden Konstruktes mit den Restriktionsenzymen Kpnl (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung KpnI, Product No. 27-0908-01) und PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0886-03) gespalten und anschließend mittels Klenow- Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01) eine 3'-5'- Exonukleasebehandlung (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) durchgeführt. In einem parallelen Ansatz wurde der E. coli- Expressionsvektor pXT99A mit dem Restriktionsenzym RsrII (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung RsrII, Product No. 1292587) gespalten und mit Klenow-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01) zur Ligation vorbereitet. Die Ligation des Minimalreplikons mit dem Vektorkonstrukt pXT99A wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4- Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04) über Nacht inkubiert wurde. Der so konstruierte E. coli- C. glutamicum-Shuttle-Expressionsvektor pEC-XT99A wurde mittels Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303) in C. glutamicum transferiert. Durch Analyse der reisolierten Plasmid-DNA konnten die Transformanten verifiziert werden. Das so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-XT99A (Fig. 2) bezeichnet. Der durch Transformation des Plasmides pEC- XT99A in den E. coli Stamm DH5αmcr erhaltene E. coli Stamm wurde DH5αmcr/pEC-XT99A genannt.
Beispiel 4 Expression des dapF-Gens
Ausgehend von der in SEQ ID NO 1 dargestellten Nucleotidsequenz des Diaminopimelatepimerase-Gens dapF aus C. glutamicum ATCC 13032 wurden PCR-Primer synthetisiert (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Deutschland). Diese Primer wurden so ausgewählt, daß das amplifizierte Fragment das Gen sowie deren native Ribosomen-Bindestellen, nicht aber mögliche Promotor-Regionen enthält. Zusätzlich wurden geeignete Restriktionsschnittstellen eingefügt, die das Klonieren in den Zielvektor ermöglichen. Die Sequenzen der PCR-Primer, die eingefügten Schnittstellen (Sequenz unterstrichen) sowie das amplifizierte Gen (Fragmentgröße in bp ist in Klammern angegeben) sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1
Das Diaminopimelatepimerase-Gen dapF aus C. glutamicum ATCC13032 wurde unter Anwendung der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) sowie der in Tabelle 1 beschriebenen synthetischen Oligonucleotiden amplifiziert. Die PCR- Experimente wurden mit der Pfu DNA Polymerase der Firma Stratagene (La, Jolla, CA, Produktbeschreibung native Pfu DNA Polymerase, Product No. 600250) in einem "PCT-100 Thermocycler" (MJ Research Inc., Watertown, Mass., USA) durchgeführt. Auf einen einmaligen Denaturierungsschritt von 3 Minuten bei 94°C folgte ein Denaturierungsschritt von 30 Sekunden bei 94°C, ein Annealingschritt für 30 Sekunden bei einer Primer-abhängigen Temperatur von T = (2AT+4GC)-5°C (Suggs, et al., 1981, S. 683-693, In: D. D. Brown, and C. F. Fox (Eds.), Developmental biology using purified genes. Academic Press, New York, USA) sowie ein 90 Sekunden dauernder Extensionsschritt bei 72°C. Die letzten drei Schritte wurden 30 mal zyklisch wiederholt und die Reaktion wurde mit einem Extensionsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Das auf diese Weise hergestellte Produkt wurde im Agarosegel auf seine Größe elektrophoretisch geprüft.
Als Basisvektor zur Expression wurde der in Fig. 1 dargestellte EX coli-C. glutamicum-Shuttle- Expressionsvektor pEC-XT99A (Beispiel 3) eingesetzt. Das erhaltene PCR Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und MunI vollständig gespalten und in den ebenfalls mit den Enzymen EcoRI und BamHI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung EcoRI, Product No. 27-0854-03,, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-03) gespaltenen Expressionsvektor pEC- XT99A ligiert.
Auf diese Weise wird das promotorlose dapF-Gen unter die Kontrolle des auf diesem Plasmid enthaltenen trc-Promotors gebracht.
Die Ligation des dapFex-Amplifikats in den Expressionsvektor pEC-XT99A wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiology Letters, 123: 343-7) und auf LB- Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 5 µg/ml Tetracyclin und 40 µg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl- β-D-Galaktosid) ausplattiert.
Nach Inkubation für 24 Stunden bei 37 C konnten Kolonien mit inserttragenden Plasmiden anhand der α-Komplementation (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) identifiziert werden. Durch Reisolierung der Plasmid-DNA nach der "Alkalischen-Lyse- Methode" von Birnboim und Doly (1997, Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523) wurde aus den Transformanten die DNA des entsprechenden Expressionskonstrukts gewonnen. Die korrekte Klonierung des Expressionsplasmids wurde durch Sequenzierung des Inserts überprüft.
Das so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-XT99A-dapF bezeichnet. Der durch Transformation des Plasmides pEC- XT99A-dapF in den E. coli Stamm DHSamcr erhaltene E. coli Stamm wurde DH5αMCR/pEC-XT99A-dapF genannt.
Beispiel 5 Transformation des Stammes DSM5715 mit den Plasmiden pEC- XT99A und pEC-XT99A-dapF
In den Stamm DSM5715 wurden mit der Elektroporationsmethode (Liebl at al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303) die Plasmide pEC-XT99A (Beispiel 3) und pEC-XT99A-dapF (Beispiel 4) eingeschleust.
Die mit Hilfe der Elektroporation erhaltenen Transformanten wurden auf Selektionsagar (LBHIS Agar (18,5 g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl, 18 g/l Bacto-Agar)) mit 15 mg/l Kanamycin isoliert. Plasmid DNA wurde nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et all, 1998, Microbiology, 144, 915-927), mit geeigneten Restriktionsendonukleasen (PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0886-03))geschnitten und überprüft. Die erhaltenen Stämme wurden DSM5715/pEC-XT99A und DSM5715/pEC- XT99A-dapF genannt.
Beispiel 6 Herstellung von L-Lysin
Die in Beipiel 5 hergestellten C. glutamicum Stämme DSM5715/pEC-XT99A und DSM5715/pEC-XT99A-dapF wurden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurden die Stämme zunächst auf Agarplatten (Hirn-Herz- Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Komplettmedium CgIII (Bacto-Pepton 10 g/l, Bacto-Yeast Extract 10 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7,4 (Eggeling et al., 1987, Applied Microbiology and Biotechnology, 25: 346-351) verwendet. Es wurde Tetracyclin (5 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 24 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (Messwellenlänge 660 nm) der Hauptkultur 0,2 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium mm verwendet.
Medium MM
CSL 5 g/l
MOPS 20 g/l
Glucose 50 g/l (getrennt autoklavieren)
Salze
(NH4)2SO4) 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4.7H2O 1,0 g/l
CaCl2.2H2O 10 mg/l
FeSO4.7H2O 10 mg/l
MnSO4.H2O 5,0 mg/l
L-Leucin 0,1 g/l
Biotin 0,3 mg/l (sterilfiltriert)
Thiamin.HCl 0,2 mg/l (sterilfiltriert)
CaCO3 25 g/l
Abkürzungen:@ CSL: Corn Steep Liquor@ MOPS: Morpholinopropansulfonsäure
CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die sterilen Substrat und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Tetracyclin (5 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchte.
Zur Induktion der dapF Expression wurde 1 mM IPTG (Isopropyl-thio-β-galaktosid, Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) Katalog Nummer 15529-019) zugesetzt.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm und die Konzentration gebildeten Lysins bestimmt. Zur Bestimmung der optischen Dichte (OD660) wurde ein LD 1W Digital Photometer der Firma (Lange, Berlin, Deutschland) eingesetzt. Lysin wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Tabelle 2
SEQUENZPROTOKOLL
Folgende Figuren sind beigefügt:
Fig. 1 Karte des Plasmids pEC-XT99A.
Fig. 2 Karte des Plasmids pEC-XT99AdapF.
Die in den Abbildungen verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
Tet: Resistenzgen für Tetracyclin
dapF: dapE-Gen von C. glutamicum
oriE: Plasmidkodierter Replikationsursprung von E. coli
rep: Plasmidkodierter Replikationsursprung aus C. glutamicum Plasmid pGA1
per: Gen zur Kontrolle der Kopienzahl aus pGAl
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
EcoRV: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRV
HincII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HincII
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
PvuII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PvuII
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI

Claims (17)

1. Isoliertes Polynukleotid enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
  • a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
  • b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für das Polypeptid codiert, das durch das in dem hinterlegten C. glutamicum Stamm DSM 12968 auf Vektor pEC-XT99A- dapF enthaltene dapF-Gen exprimiert wird,
  • c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
  • d) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b) oder c), und
  • e) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Polynukleotidsequenz von a), b), c) oder d).
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2 enthaltend (1) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ-ID-No. 1, oder
  • a) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz
  • b) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
  • c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
  • d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
6. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 2, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID No. 2 darstellt, enthält.
7. Vektor, enthaltend das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, insbesondere Pendelvektor (shuttle vector) pEC-XT99A- dapF, gekennzeichnet durch die in der Abb. 2 wiedergegebenen Restriktionskarte, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 12 968.
8. Als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor gemäss Anspruch 6 enthalten.
9. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, durch Fermentation coryneformer Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man das dapF-Gen oder dafür codierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L- Aminosäure verstärkt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Lysins verringern.
12. Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzt, und der Plasmidvektor die für das dapF- Gen codierende Nukleotidsequenz trägt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Plasmidvektor pEC-XT99A-dapF, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer DSM 12 968, transformierte Bakterien einsetzt.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien verwendet, die L-Lysin herstellen.
15. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig das für die Dihydrodipicolinat- Synthase kodierende dapA-Gen überexprimiert wird.
16. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig ein S-(2-Aminoethyl)-Cystein-Resistenz vermittelndes DNA-Fragment amplifiziert wird.
17. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
  • a) Fermentation der L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest das dapF-Gen verstärkt wird.
  • b) Anreicherung von L-Lysin im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
  • c) Isolieren des L-Lysins.
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