JP2001095593A - ｄａｐＦ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｄａｐＦ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｄａｐＦ遺伝子をコードする新規ヌクレオチ
ド配列 【解決手段】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも
７０％までは同一であるポリヌクレオチド、ｂ）寄託さ
れたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株 ＤＳＭ
１２９６８中のベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ
に含まれるｄａｐＦ遺伝子によって発現されるポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％
までは同一であるポリヌクレオチド、ｃ）配列番号２の
アミノ酸配列と少なくとも７０％までは同一であるアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド、ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチドに対
して相補性であるポリヌクレオチド、ｅ）ａ）、ｂ）、
ｃ）又はｄ）のポリヌクレオチド配列の少なくとも１５
個の連続塩基を含むポリヌクレオチドからなるグループ
から選択されたポリヌクレオチド配列を含む。 【効果】 ｄａｐＦ遺伝子の増幅によりＬ−リシンを発
酵的に製造できる。
ド配列 【解決手段】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも
７０％までは同一であるポリヌクレオチド、ｂ）寄託さ
れたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株 ＤＳＭ
１２９６８中のベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ
に含まれるｄａｐＦ遺伝子によって発現されるポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％
までは同一であるポリヌクレオチド、ｃ）配列番号２の
アミノ酸配列と少なくとも７０％までは同一であるアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド、ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチドに対
して相補性であるポリヌクレオチド、ｅ）ａ）、ｂ）、
ｃ）又はｄ）のポリヌクレオチド配列の少なくとも１５
個の連続塩基を含むポリヌクレオチドからなるグループ
から選択されたポリヌクレオチド配列を含む。 【効果】 ｄａｐＦ遺伝子の増幅によりＬ−リシンを発
酵的に製造できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｄａｐＦ遺伝子を
コードするヌクレオチド配列及びｄａｐＦ遺伝子が増幅
されているコリネフォルム細菌を用いるＬ−リシンの発
酵調製法に関するものである。
コードするヌクレオチド配列及びｄａｐＦ遺伝子が増幅
されているコリネフォルム細菌を用いるＬ−リシンの発
酵調製法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−リシンは、人間の医薬品及び医薬産
業、特に動物栄養に用いられている。
業、特に動物栄養に用いられている。
【０００３】Ｌ−リシンが、コリネフォルム細菌の菌
株、特にコリネバクテリウム・グルタミクムの発酵によ
って調製されることは公知である。その重要性のため、
調製法の改善しようとする研究がが常に着手されてい
る。この方法の改善は、発酵手段、例えば攪拌及び酸素
の供給又は養分媒体の組成、例えば発酵の間の糖濃度又
は例えば生成物が形成するまでのイオン交換クロマトグ
ラフィーによる後処理又は微生物自体の固有出力特性に
関連していることもある。
株、特にコリネバクテリウム・グルタミクムの発酵によ
って調製されることは公知である。その重要性のため、
調製法の改善しようとする研究がが常に着手されてい
る。この方法の改善は、発酵手段、例えば攪拌及び酸素
の供給又は養分媒体の組成、例えば発酵の間の糖濃度又
は例えば生成物が形成するまでのイオン交換クロマトグ
ラフィーによる後処理又は微生物自体の固有出力特性に
関連していることもある。
【０００４】突然変異誘発、選択及び突然変異株選択の
方法は、前記微生物の出力特性を改善するために用いら
れる。代謝拮抗物質、例えばリシン類縁体Ｓ−（２−ア
ミノエチル）−システインに対して耐性であるか又は調
節的に重要性のアミノ酸のための栄養要求的であり、か
つＬ−リシンを生産する菌株は、前記の方法で得られ
る。
方法は、前記微生物の出力特性を改善するために用いら
れる。代謝拮抗物質、例えばリシン類縁体Ｓ−（２−ア
ミノエチル）−システインに対して耐性であるか又は調
節的に重要性のアミノ酸のための栄養要求的であり、か
つＬ−リシンを生産する菌株は、前記の方法で得られ
る。
【０００５】組み換えＤＮＡ技術の方法もまた、個々の
リシン生合成遺伝子を増幅し、かつＬ−リシン製造に対
する効果を調べることによって、Ｌ−リシンを生産する
コリネバクテリウム種の菌株を改良するために、数年に
わたって採用されてきた。このような関係において、研
究論文、就中、キノシタ（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｄ
ｅｍａｉｎ及びＳｏｌｏｍｏｎ（編）、Ｂｅｎｊａｍｉ
ｎ ｃｕｍｍｉｎｇｓ、英国、ロンドン在、１９８５、
１１５〜１４２中の“Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ”）、Ｈｉｌｌｉｎｇｅｒ（ＢｉｏＴｅ
ｃｈ ２、４０〜４４（１９９１））、Ｅｇｇｅｌｉｎ
ｇ（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ６：２６１〜２７２（１
９９４））、Ｊｅｔｔｅｎ及びＳｉｎｓｋｅｙ（Ｃｒｉ
ｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １５、７３〜１０３（１９９５））及びＳ
ａｈｍ他（Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７８
２、２５〜３９（１９９６））が存在している。
リシン生合成遺伝子を増幅し、かつＬ−リシン製造に対
する効果を調べることによって、Ｌ−リシンを生産する
コリネバクテリウム種の菌株を改良するために、数年に
わたって採用されてきた。このような関係において、研
究論文、就中、キノシタ（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｄ
ｅｍａｉｎ及びＳｏｌｏｍｏｎ（編）、Ｂｅｎｊａｍｉ
ｎ ｃｕｍｍｉｎｇｓ、英国、ロンドン在、１９８５、
１１５〜１４２中の“Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ”）、Ｈｉｌｌｉｎｇｅｒ（ＢｉｏＴｅ
ｃｈ ２、４０〜４４（１９９１））、Ｅｇｇｅｌｉｎ
ｇ（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ６：２６１〜２７２（１
９９４））、Ｊｅｔｔｅｎ及びＳｉｎｓｋｅｙ（Ｃｒｉ
ｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １５、７３〜１０３（１９９５））及びＳ
ａｈｍ他（Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７８
２、２５〜３９（１９９６））が存在している。
【０００６】原核生物においては、Ｄ，Ｌ−ジアミノピ
メレート又はＬ−リシンの生合成について、３つの異な
る経路が知られている。これらの経路は、Ｌ−ピペリジ
ン−２，６−ジカルボキシレート（テトラヒドロジピコ
リネート）の反応において異なっている。
メレート又はＬ−リシンの生合成について、３つの異な
る経路が知られている。これらの経路は、Ｌ−ピペリジ
ン−２，６−ジカルボキシレート（テトラヒドロジピコ
リネート）の反応において異なっている。
【０００７】スクシニレート経路の場合、テトラヒドロ
ジピコリネートは、テトラヒドロピコリネート スクシ
ニラーゼによるスクシニル化、引き続く、ケト基のアミ
ノ基転移（Ｎ−スクシニル−アミノ−ケトピメレートト
ランスアミナーゼ）、脱スクシニル化（Ｎ−スクシニル
−アミノ−ケトピメレートデスクシニラーゼ）及び次の
エピマー化（ジアミノピメレート・エピメラーゼ）によ
り、Ｄ，Ｌ−ジアミノピメレートに変換される（Ｇｉｌ
ｖａｒｇ、１９５８、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３３：１
５０１〜１５０４）。
ジピコリネートは、テトラヒドロピコリネート スクシ
ニラーゼによるスクシニル化、引き続く、ケト基のアミ
ノ基転移（Ｎ−スクシニル−アミノ−ケトピメレートト
ランスアミナーゼ）、脱スクシニル化（Ｎ−スクシニル
−アミノ−ケトピメレートデスクシニラーゼ）及び次の
エピマー化（ジアミノピメレート・エピメラーゼ）によ
り、Ｄ，Ｌ−ジアミノピメレートに変換される（Ｇｉｌ
ｖａｒｇ、１９５８、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３３：１
５０１〜１５０４）。
【０００８】アセチラーゼの場合、これは、枯草菌及び
巨大菌において実現されるが、テトラヒドロジピコリネ
ートのアシル化が、アセチル基によって実施される（Ｗ
ｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｇｉｌｖａｒｇ、１９７０、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１
０１：３２３〜３２４）。
巨大菌において実現されるが、テトラヒドロジピコリネ
ートのアシル化が、アセチル基によって実施される（Ｗ
ｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｇｉｌｖａｒｇ、１９７０、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１
０１：３２３〜３２４）。
【０００９】第三の生合成経路は、Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉ
ｃｕｓについて説明されている（ミソノ他、１９７６、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１
３７：２２〜２７）。この生合成工程の場合、デヒドロ
ゲナーゼ経路と呼称され、Ｄ，Ｌ−ＤＡＰにするための
テトラヒドロジピコリネートの直接還元アミン化が行わ
れる。
ｃｕｓについて説明されている（ミソノ他、１９７６、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１
３７：２２〜２７）。この生合成工程の場合、デヒドロ
ゲナーゼ経路と呼称され、Ｄ，Ｌ−ＤＡＰにするための
テトラヒドロジピコリネートの直接還元アミン化が行わ
れる。
【００１０】遺伝子研究及び酵素研究を用いて、Ｓｃｈ
ｒｕｍｐｆ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ １７３ 、４５１０〜４５１６（１９９
１））は、コリネバクテリウム・グルタミクム中で、リ
シン生合成が、デヒドロゲナーゼ経路及びスクシニラー
ゼ経路の両方によって行われていることを証明した。
ｒｕｍｐｆ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ １７３ 、４５１０〜４５１６（１９９
１））は、コリネバクテリウム・グルタミクム中で、リ
シン生合成が、デヒドロゲナーゼ経路及びスクシニラー
ゼ経路の両方によって行われていることを証明した。
【００１１】Ｍａｒｘ他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５６、１６
８〜１８０（１９９７））及びＳｏｎｎｔａｇ（Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｒｙ ２１３：１３２５〜１３３１（１９９３））に
よるｉｎ ｖｉｖｏＮＭＲ研究によって、コリネバクテ
リウム・グルタミクム中で、スクシニラーゼ経路とデヒ
ドロゲナーゼ経路の両方がＬ−リシンの生産に寄与して
いることが判明した。
ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５６、１６
８〜１８０（１９９７））及びＳｏｎｎｔａｇ（Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｒｙ ２１３：１３２５〜１３３１（１９９３））に
よるｉｎ ｖｉｖｏＮＭＲ研究によって、コリネバクテ
リウム・グルタミクム中で、スクシニラーゼ経路とデヒ
ドロゲナーゼ経路の両方がＬ−リシンの生産に寄与して
いることが判明した。
【００１２】コリネバクテリウム・グルタミクムからの
デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）の遺伝子は、Ｗｅｈｒｍ
ａｎｎ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ １７７：５９９１〜５９９３（１９９５））に
よってクローンされ、配列された。また、コリネバクテ
リウム・グルタミクムからのスクシニラーゼ（ｄａｐ
Ｄ）の遺伝子をクローン及び配列させることも可能であ
る（Ｗｅｈｒｍａｎｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｃ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ １８０、３１５９〜３１６５（１９
９８））。
デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）の遺伝子は、Ｗｅｈｒｍ
ａｎｎ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ １７７：５９９１〜５９９３（１９９５））に
よってクローンされ、配列された。また、コリネバクテ
リウム・グルタミクムからのスクシニラーゼ（ｄａｐ
Ｄ）の遺伝子をクローン及び配列させることも可能であ
る（Ｗｅｈｒｍａｎｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｃ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ １８０、３１５９〜３１６５（１９
９８））。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】発明者らには、Ｌ−リ
シンの改善された発酵調製のための新規手段を提供する
という課題を課された。
シンの改善された発酵調製のための新規手段を提供する
という課題を課された。
【００１４】発明の説明 Ｌ−リシンは、人間の医薬品及び医薬産業、特に動物栄
養に用いられている。従って、Ｌ−リシンの調製のため
の新規の改善された方法を提供することに一般的な関心
が存在している。
養に用いられている。従って、Ｌ−リシンの調製のため
の新規の改善された方法を提供することに一般的な関心
が存在している。
【００１５】Ｌ−リシン又はリシンが、以下に記載され
る場合には、塩基だけでなく、塩類、例えばリシンモノ
ヒドロクロライド又はリシンスルフェートも表してい
る。
る場合には、塩基だけでなく、塩類、例えばリシンモノ
ヒドロクロライド又はリシンスルフェートも表してい
る。
【００１６】本発明は、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％までは同
一であるポリヌクレオチド、 ｂ）寄託されたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株
ＤＳＭ １２９６８中のプラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９
Ａ−ｄａｐＦに含まれるｄａｐＦ遺伝子によって発現さ
れるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少な
くとも７０％までは同一であるポリヌクレオチド、 ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
は同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、 ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチドに対して相
補性であるポリヌクレオチド、 ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のポリヌクレオチド配列
の少なくとも１５個の連続塩基を含むポリヌクレオチド
からなるグループから選択されたポリヌクレオチド配列
を含む単離ポリヌクレオチド。
ードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％までは同
一であるポリヌクレオチド、 ｂ）寄託されたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株
ＤＳＭ １２９６８中のプラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９
Ａ−ｄａｐＦに含まれるｄａｐＦ遺伝子によって発現さ
れるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少な
くとも７０％までは同一であるポリヌクレオチド、 ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
は同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、 ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチドに対して相
補性であるポリヌクレオチド、 ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のポリヌクレオチド配列
の少なくとも１５個の連続塩基を含むポリヌクレオチド
からなるグループから選択されたポリヌクレオチド配列
を含む単離ポリヌクレオチド。
【００１７】また、本発明は、有利に、（ｉ）配列番号
１において示したヌクレオチド配列又は（ｉｉ）遺伝子
コードの縮重の範囲内で配列（ｉ）に対応する少なくと
も１種の配列又は（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の配列
に対して相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも
１種の配列、及び場合により、（ｉｖ）（ｉ）における
中立機能のセンス変異を含む、複製可能なＤＮＡである
請求項１によるポリヌクレオチドを提供する。
１において示したヌクレオチド配列又は（ｉｉ）遺伝子
コードの縮重の範囲内で配列（ｉ）に対応する少なくと
も１種の配列又は（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の配列
に対して相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも
１種の配列、及び場合により、（ｉｖ）（ｉ）における
中立機能のセンス変異を含む、複製可能なＤＮＡである
請求項１によるポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】また、本発明は、配列番号１に示したヌク
レオチド配列を含む請求項２によるポリヌクレオチド、
配列番号２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードする請求項２によるポリヌクレオチド、請求項１
によるポリペプチド配列、特にＤＳＭ１２９６８として
寄託されたｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦを含むベクタ
ー、及び請求項７によるベクターを含む宿主細胞として
働くコリネフォルム細菌を提供する。
レオチド配列を含む請求項２によるポリヌクレオチド、
配列番号２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードする請求項２によるポリヌクレオチド、請求項１
によるポリペプチド配列、特にＤＳＭ１２９６８として
寄託されたｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦを含むベクタ
ー、及び請求項７によるベクターを含む宿主細胞として
働くコリネフォルム細菌を提供する。
【００１９】また、本発明は、本質的に、配列番号１に
相応するポリヌクレオチド配列を有する完全遺伝子を含
む相応する遺伝子ライブラリーと、配列番号１による前
記ポリヌクレオチドの配列又はそのフラグメントを含む
プローブとのハイブリダイズを用いるスクリーニング及
び前記ＤＮＡ配列の単離によって得られるポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
相応するポリヌクレオチド配列を有する完全遺伝子を含
む相応する遺伝子ライブラリーと、配列番号１による前
記ポリヌクレオチドの配列又はそのフラグメントを含む
プローブとのハイブリダイズを用いるスクリーニング及
び前記ＤＮＡ配列の単離によって得られるポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】本発明によるポリヌクレオチド配列は、ジ
アミノピメレート・エピメラーゼをコードするｃＤＮＡ
を全長で単離するため、及び前記ｃＤＮＡ又はジアミノ
ピメレート・エピメラーゼ遺伝子の配列との配列の高い
類似性を有する遺伝子を単離するための、ＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡ及びＤＮＡのハイブリダイズプローブとして適して
いる。
アミノピメレート・エピメラーゼをコードするｃＤＮＡ
を全長で単離するため、及び前記ｃＤＮＡ又はジアミノ
ピメレート・エピメラーゼ遺伝子の配列との配列の高い
類似性を有する遺伝子を単離するための、ＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡ及びＤＮＡのハイブリダイズプローブとして適して
いる。
【００２１】その上更に、本発明によるポリヌクレオチ
ド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるジア
ミノピメレート・エピメラーゼのためにコードする遺伝
子のＤＮＡの調製のためのプライマーとして適してい
る。
ド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるジア
ミノピメレート・エピメラーゼのためにコードする遺伝
子のＤＮＡの調製のためのプライマーとして適してい
る。
【００２２】プローブ又はプライマーとして働く前記オ
リゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、有利に少なく
とも２０個、特に有利に少なくとも１５個の連続塩基を
含んでいる。少なくとも４０個又は５０個の塩基対の長
さを有するオリゴヌクレオチドも適している。
リゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、有利に少なく
とも２０個、特に有利に少なくとも１５個の連続塩基を
含んでいる。少なくとも４０個又は５０個の塩基対の長
さを有するオリゴヌクレオチドも適している。
【００２３】「単離された」というのは、その自然環境
から分離されたことを意味するものである。
から分離されたことを意味するものである。
【００２４】「ポリヌクレオチド」は、一般にポリリボ
ヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドに関す
るものであるが、これは、変異されていないＲＮＡ又は
ＤＮＡあるいは変異されたＲＮＡ又はＤＮＡであること
も可能である。
ヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドに関す
るものであるが、これは、変異されていないＲＮＡ又は
ＤＮＡあるいは変異されたＲＮＡ又はＤＮＡであること
も可能である。
【００２５】「ポリペプチド」は、ペプチド又はペプチ
ド結合を介して結合した２つ又はそれ以上のアミノ酸を
含む蛋白質を意味するものと理解される。
ド結合を介して結合した２つ又はそれ以上のアミノ酸を
含む蛋白質を意味するものと理解される。
【００２６】本発明によるポリペプチドには、特にジア
ミノピメレート・エピメラーゼの生物活性を有する配列
番号２によるポリペプチド並びに配列番号２によるポリ
ペプチドと少なくとも７０％まで同一であるもの、配列
番号２によるポリペプチドと有利に８０％まで、特に９
０％から９５％まで同一であり、前記の活性を有するも
のが含まれる。
ミノピメレート・エピメラーゼの生物活性を有する配列
番号２によるポリペプチド並びに配列番号２によるポリ
ペプチドと少なくとも７０％まで同一であるもの、配列
番号２によるポリペプチドと有利に８０％まで、特に９
０％から９５％まで同一であり、前記の活性を有するも
のが含まれる。
【００２７】また、本発明は、特に既にＬ−リシンを生
産し、ｄａｐＦ遺伝子をコードするヌクレオチド配列が
増幅され、特に過剰発現させられているコリネフォルム
細菌を用いるＬ−リシンの発酵調製法を提供するもので
ある。
産し、ｄａｐＦ遺伝子をコードするヌクレオチド配列が
増幅され、特に過剰発現させられているコリネフォルム
細菌を用いるＬ−リシンの発酵調製法を提供するもので
ある。
【００２８】「増幅」という語は、この場合、例えば１
つ又はそれ以上の遺伝子の複製の数の増大、強いプロモ
ーターの使用又は高い活性を有する対応酵素をコードす
る遺伝子の使用及び場合によりこれらの手法の組合せに
よって、微生物中の、対応するＤＮＡによってコードさ
れる１つ又はそれ以上の酵素の細胞内活性の増大を説明
するものである。
つ又はそれ以上の遺伝子の複製の数の増大、強いプロモ
ーターの使用又は高い活性を有する対応酵素をコードす
る遺伝子の使用及び場合によりこれらの手法の組合せに
よって、微生物中の、対応するＤＮＡによってコードさ
れる１つ又はそれ以上の酵素の細胞内活性の増大を説明
するものである。
【００２９】本発明が提供する微生物は、グルコース、
サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、糖蜜、デンプン、セルロースから、又はグリセリン
とエタノールとから、Ｌ−リシンを製造できる。これら
は、代表的なコリネフォルム細菌、特にコリネバクテリ
ウム属の代表である。コリネバクテリウム属では、特に
コリネバクテリウム・グルタミクム種を挙げることがで
きるが、これは、専門家の間では、Ｌ−アミノ酸を産生
する能力について知られている。
サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、糖蜜、デンプン、セルロースから、又はグリセリン
とエタノールとから、Ｌ−リシンを製造できる。これら
は、代表的なコリネフォルム細菌、特にコリネバクテリ
ウム属の代表である。コリネバクテリウム属では、特に
コリネバクテリウム・グルタミクム種を挙げることがで
きるが、これは、専門家の間では、Ｌ−アミノ酸を産生
する能力について知られている。
【００３０】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミクム種の適当な菌株は、例えば公知の
野生型株の コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍ）ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌ
ｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅ
ｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
ＡＴＣＣ１３８６９及びブレビバクテリウム・ジバリカ
ツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃ
ａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０及びこれらから製造され
たＬ−リシン生産性突然変異体又は菌株、例えばコリネ
バクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４及びコリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳＭ
５７１５である。
リウム・グルタミクム種の適当な菌株は、例えば公知の
野生型株の コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍ）ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌ
ｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅ
ｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
ＡＴＣＣ１３８６９及びブレビバクテリウム・ジバリカ
ツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃ
ａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０及びこれらから製造され
たＬ−リシン生産性突然変異体又は菌株、例えばコリネ
バクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４及びコリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳＭ
５７１５である。
【００３１】発明者らは、酵素ジアミノピメレート・エ
ピメラーゼ（ＥＣ５．１．１．７）をコードするＣ．グ
ルタミクムの新規ｄａｐＦ遺伝子を単離することに成功
した。
ピメラーゼ（ＥＣ５．１．１．７）をコードするＣ．グ
ルタミクムの新規ｄａｐＦ遺伝子を単離することに成功
した。
【００３２】Ｃ．グルタミクムのｄａｐＦ遺伝子あるい
はまた別の遺伝子を単離するために、前記微生物の遺伝
子ライブラリーを、まず、Ｅ．ｃｏｌｉに設定する。遺
伝子ライブラリーの設定は、一般に公知の教書及びハン
ドブックに記載されている。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒによる
教書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ、Ｅｉｎｅ Ｅｉ
ｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅ（Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、ドイツ連
邦共和国、ヴァインハイム、１９９０）又はＳａｍｂｒ
ｏｏｋ他によるハンドブック：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）を例としてあげ
ることができる。よく知られた遺伝子ライブラリーは、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｗ３１１０のものであり、
コハラ他（Ｃｅｌｌ ５０、４９５〜５０８（１９８
７）によってλベクターに設定されている。Ｂａｔｈｅ
他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ、２５２：２５５〜２６５、１９９６）
は、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライ
ブラリーを記載しているが、これは、コスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Ｗａｈｌ他、１９８７、Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、８４：
２１６０〜２１６４）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１
２菌株ＮＭ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１９８８、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１
５６３〜１５７５）中に設定されたものであった。更
に、Ｂｏｅｒｍａｎｎ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６（３）、３１７〜３２６））は、
コスミドｐＨＣ７９（Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎ
ｓ，Ｇｅｎｅ １１、２９１〜２９８（１９８０））を
用いてＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ラ
イブラリーを記載している。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．グル
タミクムの遺伝子ライブラリーの製造のためには、ｐＢ
Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、２５、８０７〜８１８（１９７９））又はｐＵＣ９
（Ｖｉｅｒａ他、１９８２、Ｇｅｎｅ、１９：２５９〜
２６８）のようなプラスミドを使用することも可能であ
る。適当な宿主は、特に、前記Ｅ．ｃｏｌｉ菌株である
が、これは、制限欠陥及び組換え欠陥である。これらの
１つの例は、菌株ＤＨ５αｍｃｒであるが、これは、Ｇ
ｒａｎｔ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ ａｄａｃｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ＵＳＡ、８７（１９９０）４６４５〜４６４９）
によって記載されている。この後更に、コスミドを用い
てクローンした長いＤＮＡフラグメントを、例えばＳａ
ｎｇｅｒ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、７４：５４６３〜５４６７、１
９７７）によって記載されているように、サブクローニ
ングし、引き続き、配列するのに適する通常のベクター
において配列する。
はまた別の遺伝子を単離するために、前記微生物の遺伝
子ライブラリーを、まず、Ｅ．ｃｏｌｉに設定する。遺
伝子ライブラリーの設定は、一般に公知の教書及びハン
ドブックに記載されている。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒによる
教書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ、Ｅｉｎｅ Ｅｉ
ｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅ（Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、ドイツ連
邦共和国、ヴァインハイム、１９９０）又はＳａｍｂｒ
ｏｏｋ他によるハンドブック：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）を例としてあげ
ることができる。よく知られた遺伝子ライブラリーは、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｗ３１１０のものであり、
コハラ他（Ｃｅｌｌ ５０、４９５〜５０８（１９８
７）によってλベクターに設定されている。Ｂａｔｈｅ
他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ、２５２：２５５〜２６５、１９９６）
は、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライ
ブラリーを記載しているが、これは、コスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Ｗａｈｌ他、１９８７、Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、８４：
２１６０〜２１６４）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１
２菌株ＮＭ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１９８８、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１
５６３〜１５７５）中に設定されたものであった。更
に、Ｂｏｅｒｍａｎｎ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６（３）、３１７〜３２６））は、
コスミドｐＨＣ７９（Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎ
ｓ，Ｇｅｎｅ １１、２９１〜２９８（１９８０））を
用いてＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ラ
イブラリーを記載している。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．グル
タミクムの遺伝子ライブラリーの製造のためには、ｐＢ
Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、２５、８０７〜８１８（１９７９））又はｐＵＣ９
（Ｖｉｅｒａ他、１９８２、Ｇｅｎｅ、１９：２５９〜
２６８）のようなプラスミドを使用することも可能であ
る。適当な宿主は、特に、前記Ｅ．ｃｏｌｉ菌株である
が、これは、制限欠陥及び組換え欠陥である。これらの
１つの例は、菌株ＤＨ５αｍｃｒであるが、これは、Ｇ
ｒａｎｔ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ ａｄａｃｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ＵＳＡ、８７（１９９０）４６４５〜４６４９）
によって記載されている。この後更に、コスミドを用い
てクローンした長いＤＮＡフラグメントを、例えばＳａ
ｎｇｅｒ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、７４：５４６３〜５４６７、１
９７７）によって記載されているように、サブクローニ
ングし、引き続き、配列するのに適する通常のベクター
において配列する。
【００３３】ｄａｐＦ遺伝子をコードし、かつ配列番号
１としての本発明の１つの構成要素であるＣ．グルタミ
クムの新規ＤＮＡ配列が、前記の方法で得られた。その
上更に、対応する蛋白質のアミノ酸配列は、上記の方法
によって既存のＤＮＡ配列から分離される。ｄａｐＦ遺
伝子生成物の生じたアミノ酸配列を、配列番号２中にお
いて示す。
１としての本発明の１つの構成要素であるＣ．グルタミ
クムの新規ＤＮＡ配列が、前記の方法で得られた。その
上更に、対応する蛋白質のアミノ酸配列は、上記の方法
によって既存のＤＮＡ配列から分離される。ｄａｐＦ遺
伝子生成物の生じたアミノ酸配列を、配列番号２中にお
いて示す。
【００３４】配列番号１から遺伝子コードのによって生
じるコーディングＤＮＡ配列も、本発明の１つの構成要
素である。同様に、配列番号１又は配列番号１の一部と
のハイブリダイズするＤＮＡ配列は、本発明の１つの構
成要素である。その上更に、同類アミノ酸交換、例えば
蛋白質中のアラニンについてはグリシン又はグルタミン
酸についてはアスパラギン酸の交換は、専門家の間で
は、タンパク質の活性における基本的変化につながらな
い、即ち、中立機能である「センス変異」として公知で
ある。その上更に、１つのタンパク質のＮ末端及び／又
はＣ末端上での変化は、本質的に減ずることはできない
か又はその機能を安定させることができることは公知で
ある。この状況における情報は、専門家によって、就
中、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９：７５１〜７５７
（１９８７））、Ｏ’Ｒｅｇａｎ他（Ｇｅｎｅ ７７：
２３７〜２５１（１９８９））、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ
他（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３：２４０〜
２４７（１９９４））、Ｈｏｃｈｕｌｉ他（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１３２１〜１３２５（１９８
８））及び遺伝生物学及び分子生物学の公知の教書に見
出すことができる。対応する方法で配列番号２から生じ
るアミノ酸配列も、本発明の１つの構成要素である。
じるコーディングＤＮＡ配列も、本発明の１つの構成要
素である。同様に、配列番号１又は配列番号１の一部と
のハイブリダイズするＤＮＡ配列は、本発明の１つの構
成要素である。その上更に、同類アミノ酸交換、例えば
蛋白質中のアラニンについてはグリシン又はグルタミン
酸についてはアスパラギン酸の交換は、専門家の間で
は、タンパク質の活性における基本的変化につながらな
い、即ち、中立機能である「センス変異」として公知で
ある。その上更に、１つのタンパク質のＮ末端及び／又
はＣ末端上での変化は、本質的に減ずることはできない
か又はその機能を安定させることができることは公知で
ある。この状況における情報は、専門家によって、就
中、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９：７５１〜７５７
（１９８７））、Ｏ’Ｒｅｇａｎ他（Ｇｅｎｅ ７７：
２３７〜２５１（１９８９））、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ
他（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３：２４０〜
２４７（１９９４））、Ｈｏｃｈｕｌｉ他（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１３２１〜１３２５（１９８
８））及び遺伝生物学及び分子生物学の公知の教書に見
出すことができる。対応する方法で配列番号２から生じ
るアミノ酸配列も、本発明の１つの構成要素である。
【００３５】同様に、配列番号１又は配列番号１の一部
とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の１つの構成
要素である。最終的に、配列番号１から生じるプライマ
ーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製
造されるＤＮＡ配列模本発明の１つの構成要素である。
かかるオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも
１５個の塩基対の長さを有している。
とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の１つの構成
要素である。最終的に、配列番号１から生じるプライマ
ーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製
造されるＤＮＡ配列模本発明の１つの構成要素である。
かかるオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも
１５個の塩基対の長さを有している。
【００３６】ハイブリダイズを用いるＤＮＡ配列の同定
についての教示は、専門家によって、就中、ベーリンガ
ー・マンハイム社（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）（ドイツ連邦共和国、マンハイム
在、１９９３）のハンドブック“Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙ
ｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔ
ｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”及びＬｉｅｂｅｌ
他（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
（１９９１）４１：２５５〜２６０）に見出すことがで
きる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ
配列の増幅についての教示は、専門家により、就中、Ｇ
ａｉｔによるハンドブック：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、英国、オック
スフォード在、１９８４）及びＮｅｗｔｏｎ ａｎｄＧ
ｒａｈａｍ：ＰＣＲ（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍ
ｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、ドイツ連邦共和国、ハイ
デルベルク、１９９４）に見出すことができる。
についての教示は、専門家によって、就中、ベーリンガ
ー・マンハイム社（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）（ドイツ連邦共和国、マンハイム
在、１９９３）のハンドブック“Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙ
ｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔ
ｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”及びＬｉｅｂｅｌ
他（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
（１９９１）４１：２５５〜２６０）に見出すことがで
きる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ
配列の増幅についての教示は、専門家により、就中、Ｇ
ａｉｔによるハンドブック：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、英国、オック
スフォード在、１９８４）及びＮｅｗｔｏｎ ａｎｄＧ
ｒａｈａｍ：ＰＣＲ（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍ
ｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、ドイツ連邦共和国、ハイ
デルベルク、１９９４）に見出すことができる。
【００３７】発明者らは、コリネフォルム細菌が、改善
された方法で、ｄａｐＦ遺伝子の過剰発現後にＬ−リシ
ンを生産することを見出した。
された方法で、ｄａｐＦ遺伝子の過剰発現後にＬ−リシ
ンを生産することを見出した。
【００３８】過剰発現を達成するために、対抗する遺伝
子の複製の個数を増大させることができるか又は構造遺
伝子の手前の部位のプロモーター及び調節領域又はリボ
ソーム結合部位を突然変異させることができる。構造遺
伝子の手前似鳥込まれた発現カセットは、同様に作用す
る。誘導性プロモーターによって、付加的に、発酵的Ｌ
−リシン生産の間に発現を増大させることが可能であ
る。同様に、発現は、ｍ−ＲＮＡの延命措置によって改
善される。その上更に、酵素活性も、酵素タンパク質の
分解を予防することによって増大させられる。該遺伝子
又は遺伝子構造は、多数の様々な複製を有するプラスミ
ド中に存在していることがあるか又は染色体の中に組み
込まれ、増幅されていることがある。また、当該の遺伝
子の過剰発現は、その上更に、培地の組成及び培養手段
の変更によって達成することができる。
子の複製の個数を増大させることができるか又は構造遺
伝子の手前の部位のプロモーター及び調節領域又はリボ
ソーム結合部位を突然変異させることができる。構造遺
伝子の手前似鳥込まれた発現カセットは、同様に作用す
る。誘導性プロモーターによって、付加的に、発酵的Ｌ
−リシン生産の間に発現を増大させることが可能であ
る。同様に、発現は、ｍ−ＲＮＡの延命措置によって改
善される。その上更に、酵素活性も、酵素タンパク質の
分解を予防することによって増大させられる。該遺伝子
又は遺伝子構造は、多数の様々な複製を有するプラスミ
ド中に存在していることがあるか又は染色体の中に組み
込まれ、増幅されていることがある。また、当該の遺伝
子の過剰発現は、その上更に、培地の組成及び培養手段
の変更によって達成することができる。
【００３９】前記の状況における教示は、専門家によっ
て、就中、Ｍａｒｔｉｎ他（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ５、１３７〜１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒ
ｅｒｏ他（Ｇｅｎｅ １３８，３５〜４１（１９９
４））、ツチヤ及びモリナガ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ６、４２８〜４３０（１９８８））、Ｅｉｋｍ
ａｎｎｓ他（Ｇｅｎｅ １０２、９３〜９８（１９９
１））、欧州特許第０４７２８６９号明細書、米国特許
第４６０１８９３号明細書、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ及びＰ
ｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９、８
４〜８７（１９９１））、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ他（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０、１２６〜１３２（１
９９４））、ＬａＢａｒｒｅ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５、１００１〜１０
０７（１９９３）、国際公開番号ＷＯ９６／１５２４
６、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ他（Ｇｅｎｅ １３４、１５〜
２４（１９９３））、特開平１０−２２９８９１号公
報、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
５８、１９１〜１９５（１９９８））、Ｍａｋｒｉｄｅ
ｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
６０：５１２〜５３８（１９９６））及び遺伝子及び分
子生物学の公知の教書に見出すことができる。
て、就中、Ｍａｒｔｉｎ他（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ５、１３７〜１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒ
ｅｒｏ他（Ｇｅｎｅ １３８，３５〜４１（１９９
４））、ツチヤ及びモリナガ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ６、４２８〜４３０（１９８８））、Ｅｉｋｍ
ａｎｎｓ他（Ｇｅｎｅ １０２、９３〜９８（１９９
１））、欧州特許第０４７２８６９号明細書、米国特許
第４６０１８９３号明細書、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ及びＰ
ｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９、８
４〜８７（１９９１））、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ他（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０、１２６〜１３２（１
９９４））、ＬａＢａｒｒｅ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５、１００１〜１０
０７（１９９３）、国際公開番号ＷＯ９６／１５２４
６、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ他（Ｇｅｎｅ １３４、１５〜
２４（１９９３））、特開平１０−２２９８９１号公
報、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
５８、１９１〜１９５（１９９８））、Ｍａｋｒｉｄｅ
ｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
６０：５１２〜５３８（１９９６））及び遺伝子及び分
子生物学の公知の教書に見出すことができる。
【００４０】ｄａｐＦ遺伝子を過剰発現させることがで
きるプラスミドの例は、ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ
（図２）であるが、これは、菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＥ
Ｃ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ中に含まれている。プラスミ
ドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦは、プラスミドｐＥＣ
−ＸＴ９９Ａ（図１）をベースとするＥ．ｃｏｌｉ−
Ｃ．グルタミクム・シャトルベクターである。このプラ
スミドベクターは、プラスミドｐＧＡ１（米国特許第５
１７５１０８号Ｂ）の複製領域及びプラスミドｐＡＧ１
（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ、ＵＳＡ、ＭＤ、ベテスダ在の寄託番号ＡＦ１２１０
００）のテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいる。
Ｃ．グルタミクムにおいて複製可能な他のプラスミドベ
クター、例えばｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ他、Ｇ
ｅｎｅ １０２：９３〜９８（１９９１））又はｐＺ８
−１（欧州特許第０３７５８８９号Ｂ）は、同様に使用
することができる。
きるプラスミドの例は、ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ
（図２）であるが、これは、菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＥ
Ｃ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ中に含まれている。プラスミ
ドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦは、プラスミドｐＥＣ
−ＸＴ９９Ａ（図１）をベースとするＥ．ｃｏｌｉ−
Ｃ．グルタミクム・シャトルベクターである。このプラ
スミドベクターは、プラスミドｐＧＡ１（米国特許第５
１７５１０８号Ｂ）の複製領域及びプラスミドｐＡＧ１
（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ、ＵＳＡ、ＭＤ、ベテスダ在の寄託番号ＡＦ１２１０
００）のテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいる。
Ｃ．グルタミクムにおいて複製可能な他のプラスミドベ
クター、例えばｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ他、Ｇ
ｅｎｅ １０２：９３〜９８（１９９１））又はｐＺ８
−１（欧州特許第０３７５８８９号Ｂ）は、同様に使用
することができる。
【００４１】更に、有利に、Ｌ−リシンンの生産のため
に、ｄａｐＦ遺伝子以外に、リシン生合成経路の１つ又
はそれ以上の酵素を過剰発現させてもよい。従って、 ・ 同時に、ジヒドロジピコリネート・シンターゼをコ
ードするｄａｐＡ遺伝子を過剰発現させることができる
（欧州特許第０１９７３３５号Ｂ）、又は ・ 同時に、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン耐
性を付与するＤＮＡフラグメントを増幅することができ
る（欧州特許出願公開第００８８１６６号）、又は ・ 同時に、テトラヒドロジピコリネート・スクシニラ
ーゼをコードするｄａｐＤ遺伝子（Ｗｅｈｒｍａｎｎ
他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１８０、３１５９〜３１６５（１９９８））、又は ・ 同時に、スクシニルジアミノピメレート・デスクシ
ニラーゼをコードするｄａｐＥ遺伝子（Ｗｅｈｒｍａｎ
ｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ １７７、５９９１〜５９９３（１９９５））を過剰
発現させることができる。
に、ｄａｐＦ遺伝子以外に、リシン生合成経路の１つ又
はそれ以上の酵素を過剰発現させてもよい。従って、 ・ 同時に、ジヒドロジピコリネート・シンターゼをコ
ードするｄａｐＡ遺伝子を過剰発現させることができる
（欧州特許第０１９７３３５号Ｂ）、又は ・ 同時に、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン耐
性を付与するＤＮＡフラグメントを増幅することができ
る（欧州特許出願公開第００８８１６６号）、又は ・ 同時に、テトラヒドロジピコリネート・スクシニラ
ーゼをコードするｄａｐＤ遺伝子（Ｗｅｈｒｍａｎｎ
他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１８０、３１５９〜３１６５（１９９８））、又は ・ 同時に、スクシニルジアミノピメレート・デスクシ
ニラーゼをコードするｄａｐＥ遺伝子（Ｗｅｈｒｍａｎ
ｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ １７７、５９９１〜５９９３（１９９５））を過剰
発現させることができる。
【００４２】ｄａｐＦ遺伝子の過剰発現以外に、更に、
Ｌ−リシンの生産にとっては、望ましくない副反応（Ｏ
ｖｅｒｂｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｋｒｕｍｐｈａｎｚｌ、Ｓｉｋｙ
ｔａ、Ｖａｎｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、英国、ロンドン在、１９９２中のナカヤマ：“Ｂｒ
ｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｄ
ｕｃｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”）を除
くことが有利である。
Ｌ−リシンの生産にとっては、望ましくない副反応（Ｏ
ｖｅｒｂｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｋｒｕｍｐｈａｎｚｌ、Ｓｉｋｙ
ｔａ、Ｖａｎｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ、英国、ロンドン在、１９９２中のナカヤマ：“Ｂｒ
ｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｄ
ｕｃｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”）を除
くことが有利である。
【００４３】本発明により製造される微生物は、Ｌ−リ
シンの生産の目的で、連続的又はバッチ法において非連
続的に（バッチ培養）又は流加法（供給法）又は反復流
加法（反復供給法）で培養することができる。公知の培
養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教書（Ｂｉｏｐｒｅ
ｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ
ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈ
ｎｉｋ（ＧｕｓｔａｖＦｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、
シュトゥットガルト在、１９９１））又はＳｔｏｒｈａ
ｓによる教書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐ
ｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉ
ｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ、ブラウンシュヴァイヒ／ヴィ
ースバーデン在、１９９４））に記載されている。
シンの生産の目的で、連続的又はバッチ法において非連
続的に（バッチ培養）又は流加法（供給法）又は反復流
加法（反復供給法）で培養することができる。公知の培
養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教書（Ｂｉｏｐｒｅ
ｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ
ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈ
ｎｉｋ（ＧｕｓｔａｖＦｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、
シュトゥットガルト在、１９９１））又はＳｔｏｒｈａ
ｓによる教書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐ
ｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉ
ｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ、ブラウンシュヴァイヒ／ヴィ
ースバーデン在、１９９４））に記載されている。
【００４４】使用すべき培養基は、適当な方法で特殊な
菌株の必要条件を満たすものでなければならない。種々
の微生物のための培養基の説明は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ（ＵＳＡ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．在、
１９８１）のハンドブック“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”に含まれてい
る。糖類及び炭水化物、例えばブドウ糖、蔗糖、乳糖、
果糖、麦芽糖、糖蜜、デンプン及びセルロース、オイル
及び油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びコ
コナツ油脂、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン
酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及び
エタノール、有機酸、例えば酢酸を、炭素源として衣装
することができる。これらの物質は、別個にか又は混合
物として使用することができる。有機窒素含有化合物、
例えばペプトン、イーストエキス、肉エキス、麦芽エキ
ス、コーン浸漬液、大豆フッ素及び尿素又は無機化合
物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウ
ムを、窒素源として使用することができる。該窒素源
は、別個にか又は又は混合物として使用することができ
る。リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又
は対応するナトリウム含有塩を、リン源として使用する
ことができる。その上更に、培養基は、成長のために必
要である金属の塩、例えば硫酸マグネシウム、硫酸鉄を
含有していなければならない。最終的に、必須の成長物
質、例えばアミノ酸及びビタミンを、上記の物質以外に
使用することができる。適当な前駆物質を、更に培養基
に添加することができる。前記の出発物質は、単独バッ
チの形で培養物に添加することができるか又は適当な方
法で培養の間に供給することができる。
菌株の必要条件を満たすものでなければならない。種々
の微生物のための培養基の説明は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ（ＵＳＡ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．在、
１９８１）のハンドブック“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”に含まれてい
る。糖類及び炭水化物、例えばブドウ糖、蔗糖、乳糖、
果糖、麦芽糖、糖蜜、デンプン及びセルロース、オイル
及び油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びコ
コナツ油脂、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン
酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及び
エタノール、有機酸、例えば酢酸を、炭素源として衣装
することができる。これらの物質は、別個にか又は混合
物として使用することができる。有機窒素含有化合物、
例えばペプトン、イーストエキス、肉エキス、麦芽エキ
ス、コーン浸漬液、大豆フッ素及び尿素又は無機化合
物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウ
ムを、窒素源として使用することができる。該窒素源
は、別個にか又は又は混合物として使用することができ
る。リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又
は対応するナトリウム含有塩を、リン源として使用する
ことができる。その上更に、培養基は、成長のために必
要である金属の塩、例えば硫酸マグネシウム、硫酸鉄を
含有していなければならない。最終的に、必須の成長物
質、例えばアミノ酸及びビタミンを、上記の物質以外に
使用することができる。適当な前駆物質を、更に培養基
に添加することができる。前記の出発物質は、単独バッ
チの形で培養物に添加することができるか又は適当な方
法で培養の間に供給することができる。
【００４５】塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アンモニア又は水性アンモニア又は酸
性化合物、例えばリン酸又は硫酸を、適当な方法で、ｐ
Ｈ制御に使用することができる。消泡剤、例えば脂肪酸
ポリグリコールエステルを、フォームの発生の制御に使
用することができる。選択的作用を有する適当な物質、
例えば抗生物質を、プラスミドの安定性を維持するため
に媒体に添加することができる。好気性条件を維持する
ために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培
養物に導入させる。培養物の温度は、通常２０℃から４
５℃、有利に２５℃から４０℃である。培養は、リシン
の最大値が形成されるまで継続される。この目的は、通
常、１０時間から１６０時間の間に達成される。
水酸化カリウム、アンモニア又は水性アンモニア又は酸
性化合物、例えばリン酸又は硫酸を、適当な方法で、ｐ
Ｈ制御に使用することができる。消泡剤、例えば脂肪酸
ポリグリコールエステルを、フォームの発生の制御に使
用することができる。選択的作用を有する適当な物質、
例えば抗生物質を、プラスミドの安定性を維持するため
に媒体に添加することができる。好気性条件を維持する
ために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培
養物に導入させる。培養物の温度は、通常２０℃から４
５℃、有利に２５℃から４０℃である。培養は、リシン
の最大値が形成されるまで継続される。この目的は、通
常、１０時間から１６０時間の間に達成される。
【００４６】Ｌ−リシンの分析は、Ｓｐａｃｋｍａｎ他
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、
（１９５８）、１１９０）によって説明されているよう
に、陰イオン交換クロマトグラフィー、引き続くニンヒ
ドリン誘導によって実施することができる。
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、
（１９５８）、１１９０）によって説明されているよう
に、陰イオン交換クロマトグラフィー、引き続くニンヒ
ドリン誘導によって実施することができる。
【００４７】以下の微生物は、ブタベスト条約により、
ドイチュ ザンムルング フュアミクロオルガニスメン
ウント ツェルクルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（ＤＳ
ＭＺ＝ドイツ微生物国際寄託局（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ａｎｄ ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ、ドイツ連邦共和
国、ブラウンシュヴァイヒ在）に寄託されている： ・ コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ、ＤＳＭ１２９６７ ・ コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ、ＤＳＭ１２９６
８ 本発明による方法を、Ｌ−リシンの発酵的調製に使用す
る。
ドイチュ ザンムルング フュアミクロオルガニスメン
ウント ツェルクルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（ＤＳ
ＭＺ＝ドイツ微生物国際寄託局（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ａｎｄ ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ、ドイツ連邦共和
国、ブラウンシュヴァイヒ在）に寄託されている： ・ コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ、ＤＳＭ１２９６７ ・ コリネバクテリウム・グルタミクム菌株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ、ＤＳＭ１２９６
８ 本発明による方法を、Ｌ−リシンの発酵的調製に使用す
る。
【００４８】
【実施例】本発明は、実施例を用いて以下により詳細に
説明される。
説明される。
【００４９】例 １ コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの調製 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡを、Ｔａｕｃｈ他（１９９５年、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ ３３：１６８〜１７９）によって記載さ
れているようにして単離し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク、製品番号Ｓａ３ＡＩ、コード番号２
７−０９１３−０２）を用いて部分的に切断させた。Ｄ
ＮＡフラグメントを、エビ アルカリホスファターゼを
用いて脱リンさせた（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハ
イム在、製品名ＳＡＰ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．１７５８２５
０）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、US
A、製品名ＳｕｐｅｒＣｏｓ１ ＣｏｓｍｉｄＶｅｋｔ
ｏｒ Ｋｉｔ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２５１３０１）から得
られたコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ
（Ｗａｈｌ他、（１９８７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ
ｆ Ｓｃｉｎｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８４：２１６０〜２
１６４）を、制限酵素ＸｂａＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク
在、製品名ＸｂａＩ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２７−０９４８
−０２）を用いて切断させ、同様に、エビ アルカリホ
スファターゼを用いて脱リンさせた。次に、コスミドＤ
ＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、
製品名ＢａｍＨＩ）を用いて切断させた。こうして処理
したコスミドＤＮＡを、処理したＡＴＣＣ１３０３２Ｄ
ＮＡと混合させ、かつバッチ量を、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連
邦共和国、フライブルク在、製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉ
ｇａｓｅ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２７−０８７０−０４）を
用いて処理した。次に、この結紮混合物を、Ｇｉｇａｐ
ａｃｋ ＩＩ ＸＬ Ｐａｃｋｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ
ｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳ
Ａ、製品名ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ＸＬ Ｐａｃｋｉｎ
ｇ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２００２１７）
を用いてファージ中に詰め込んだ。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｎ
Ｍ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１９８８、Ｎｅｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１５６３〜１
５７５）の感染のために、前記の細胞を、１０ｍＭのＭ
ｇＳＯ4の中に入れ、かつファージ懸濁液のアリコート
と混合させた。コスミドライブラリーの感染及び滴定
を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に
よって説明された要にして実施したが、細胞を、アンピ
シリン１０μｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天（Ｌｅｎｎｏ
ｘ、１９５５、Ｖｏｒｏｌｏｇｙ、１：１９０）上で培
養する。３７℃で一晩の培養後に、組換え個体クローン
を選択した。
からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの調製 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡを、Ｔａｕｃｈ他（１９９５年、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ ３３：１６８〜１７９）によって記載さ
れているようにして単離し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク、製品番号Ｓａ３ＡＩ、コード番号２
７−０９１３−０２）を用いて部分的に切断させた。Ｄ
ＮＡフラグメントを、エビ アルカリホスファターゼを
用いて脱リンさせた（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハ
イム在、製品名ＳＡＰ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．１７５８２５
０）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、US
A、製品名ＳｕｐｅｒＣｏｓ１ ＣｏｓｍｉｄＶｅｋｔ
ｏｒ Ｋｉｔ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２５１３０１）から得
られたコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ
（Ｗａｈｌ他、（１９８７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ
ｆ Ｓｃｉｎｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８４：２１６０〜２
１６４）を、制限酵素ＸｂａＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク
在、製品名ＸｂａＩ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２７−０９４８
−０２）を用いて切断させ、同様に、エビ アルカリホ
スファターゼを用いて脱リンさせた。次に、コスミドＤ
ＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、
製品名ＢａｍＨＩ）を用いて切断させた。こうして処理
したコスミドＤＮＡを、処理したＡＴＣＣ１３０３２Ｄ
ＮＡと混合させ、かつバッチ量を、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連
邦共和国、フライブルク在、製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉ
ｇａｓｅ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２７−０８７０−０４）を
用いて処理した。次に、この結紮混合物を、Ｇｉｇａｐ
ａｃｋ ＩＩ ＸＬ Ｐａｃｋｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ
ｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳ
Ａ、製品名ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ ＸＬ Ｐａｃｋｉｎ
ｇ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｃｏｄｅ ｎｏ．２００２１７）
を用いてファージ中に詰め込んだ。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｎ
Ｍ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１９８８、Ｎｅｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１５６３〜１
５７５）の感染のために、前記の細胞を、１０ｍＭのＭ
ｇＳＯ4の中に入れ、かつファージ懸濁液のアリコート
と混合させた。コスミドライブラリーの感染及び滴定
を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に
よって説明された要にして実施したが、細胞を、アンピ
シリン１０μｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天（Ｌｅｎｎｏ
ｘ、１９５５、Ｖｏｒｏｌｏｇｙ、１：１９０）上で培
養する。３７℃で一晩の培養後に、組換え個体クローン
を選択した。
【００５０】例 ２ ｄａｐＦ遺伝子の単離及び配列 個体コロニーのコスミドＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓ
ｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（製品番号２７１０
６，Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）
を用いて、製造元の指示書により単離し、かつ制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｓａｕ
３ＡＩ、製品番号２７−０９１３−０２）を用いて部分
的に切断させた。ＤＮＡフラグメントを、エビ アルカ
リホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハ
イム在、製品名ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０）を用
いて脱リンさせた。ゲル電気泳動法による分離後に、１
５００から２０００ｂｐの範囲の大きさのコスミドフラ
グメントを、ＱｉａＥｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ（製品番号２００２１、Ｑｉａｇｅｎ、
Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）を用いて単離した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（オランダ王国、クローニンゲ
ン在、製品名Ｚｅｒｏ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｋｉｔ、製品番号Ｋ２５００−０１）から入
手した配列ベクターｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡを、制限酵
素ＢａｍＨＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｂａｍ
ＨＩ、製品番号２７−０８６８−０４）を用いて切断さ
せた。配列ベクターｐＺｅｒｏ−１中のコスミドフラグ
メントの結紮を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ）によって説明されたようにして実施したが、
ＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在）と
一緒に一晩培養した。次に、この結紮混合物を、電気穿
孔して（Ｔａｕｃｈ他、１９９４、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３４３〜７）、
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Ｇｒａｎｔ、１９９
０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）の中へ導入
し、かつｚｅｏｃｉｎ５０μｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天
（Ｌｅｎｎｏｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：１
９０）の上で培養した。組換えクローンのプラスミド調
製を、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ９６００（製品番号９００２０
０、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）
を用いて実施した。配列を、Ｓａｎｇｅｒ他のジデオキ
シ連鎖停止法（１９７７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３〜
５４６７）によって、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他による変
異（１９９０、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ、１８：１０６７）を用いて実施した。ＰＥＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（製品番号４０３０
４４、ドイツ連邦共和国、ヴァイターシュタット在）か
らの“ＲＲ ｄＲｈｏｄａｍｉｎ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ”を使
用した。ゲル電気泳動による分離及び配列反応の分析
を、“Ｒｏｔｉｐｈｏｒｅｓｉｓ ＮＦＡｃｒｙｌａｍ
ｉｄｅ／Ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ”ゲル（２９：
１）（製品番号Ａ１２４．１、Ｒｏｔｈ、ドイツ連邦共
和国、カールスルーエ在）において、ＰＥ Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ連邦共和国、ヴァ
イターシュタット在）からの“ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３
７７”シーケンサーを用いて実施した。
ｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（製品番号２７１０
６，Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）
を用いて、製造元の指示書により単離し、かつ制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｓａｕ
３ＡＩ、製品番号２７−０９１３−０２）を用いて部分
的に切断させた。ＤＮＡフラグメントを、エビ アルカ
リホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハ
イム在、製品名ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０）を用
いて脱リンさせた。ゲル電気泳動法による分離後に、１
５００から２０００ｂｐの範囲の大きさのコスミドフラ
グメントを、ＱｉａＥｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ（製品番号２００２１、Ｑｉａｇｅｎ、
Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）を用いて単離した。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（オランダ王国、クローニンゲ
ン在、製品名Ｚｅｒｏ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｋｉｔ、製品番号Ｋ２５００−０１）から入
手した配列ベクターｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡを、制限酵
素ＢａｍＨＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｂａｍ
ＨＩ、製品番号２７−０８６８−０４）を用いて切断さ
せた。配列ベクターｐＺｅｒｏ−１中のコスミドフラグ
メントの結紮を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ）によって説明されたようにして実施したが、
ＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在）と
一緒に一晩培養した。次に、この結紮混合物を、電気穿
孔して（Ｔａｕｃｈ他、１９９４、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３４３〜７）、
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Ｇｒａｎｔ、１９９
０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）の中へ導入
し、かつｚｅｏｃｉｎ５０μｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天
（Ｌｅｎｎｏｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：１
９０）の上で培養した。組換えクローンのプラスミド調
製を、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ９６００（製品番号９００２０
０、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）
を用いて実施した。配列を、Ｓａｎｇｅｒ他のジデオキ
シ連鎖停止法（１９７７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３〜
５４６７）によって、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他による変
異（１９９０、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ、１８：１０６７）を用いて実施した。ＰＥＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（製品番号４０３０
４４、ドイツ連邦共和国、ヴァイターシュタット在）か
らの“ＲＲ ｄＲｈｏｄａｍｉｎ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ”を使
用した。ゲル電気泳動による分離及び配列反応の分析
を、“Ｒｏｔｉｐｈｏｒｅｓｉｓ ＮＦＡｃｒｙｌａｍ
ｉｄｅ／Ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ”ゲル（２９：
１）（製品番号Ａ１２４．１、Ｒｏｔｈ、ドイツ連邦共
和国、カールスルーエ在）において、ＰＥ Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ連邦共和国、ヴァ
イターシュタット在）からの“ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３
７７”シーケンサーを用いて実施した。
【００５１】次に、得られた原料配列データを、Ｓｔａ
ｄｅｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ（１９８６、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１
４：２１７〜２３１）バージョン９７−０を用いて処理
した。ｐＺｅｒｏ１誘導体の個体配列を、連続した隣接
部位に対してアセンブルした。コンピュータ支援された
コーディング領域分析を、ＸＮＩＰプログラム（Ｓｔａ
ｄｅｎ、１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、１４：２１７〜２３１）を用いて準備し
た。相同性分析を、“ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ ｐｒ
ｏｇｒａｍｓ”（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９７、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５：３
３８９〜３４０２）を用いて“Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ”（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍ
Ｄ、ＵＳＡ）の非重複データバンクと対照して実施し
た。
ｄｅｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ（１９８６、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１
４：２１７〜２３１）バージョン９７−０を用いて処理
した。ｐＺｅｒｏ１誘導体の個体配列を、連続した隣接
部位に対してアセンブルした。コンピュータ支援された
コーディング領域分析を、ＸＮＩＰプログラム（Ｓｔａ
ｄｅｎ、１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、１４：２１７〜２３１）を用いて準備し
た。相同性分析を、“ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ ｐｒ
ｏｇｒａｍｓ”（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９７、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５：３
３８９〜３４０２）を用いて“Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ”（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍ
Ｄ、ＵＳＡ）の非重複データバンクと対照して実施し
た。
【００５２】得られたヌクレオチド配列は、配列番号１
に示してある。このヌクレオチド配列の分析により、８
３１塩基対のオープンリーディングフレームを示した
が、これを、ｄａｐ１と命名した。このｄａｐＦ遺伝子
は、２７７アミノ酸のポリペプチドをコードする。
に示してある。このヌクレオチド配列の分析により、８
３１塩基対のオープンリーディングフレームを示した
が、これを、ｄａｐ１と命名した。このｄａｐＦ遺伝子
は、２７７アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【００５３】例 ３ 発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの構成 Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＴＲＣ９９Ａ（Ａｍａｎｎ
他、１９８８、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜３１５）を、
Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクムシャトル発現ベクター
ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの構成のための出発ベクターとして
使用した。ＢｓｐＨＩ−制限切断（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国、マン
ハイム在、製品名ＢｓｐＨＩ、製品番号１４６７１２
３）及び引き続くクレノウ処理（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク在、製品名Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、製品
番号２７−０９２８−０１；ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）の後に、
アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）を、Ｃ．グルタミク
ムプラスミドｐＡＧ１のテトラサイクリン耐性遺伝子
（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１２
１０００）によって置換させた。このため、耐性遺伝子
を有する領域を、ＡｌｕＩフラグメント（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連
邦共和国、フライブルク在、製品名ＡｌｕＩ、製品番号
２７−０８８４−０１）として線形化したＥ．ｃ発現ベ
クターｐＴＲＣ９９Ａの中へクローンした。結紮を、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）によって
説明されたようにして行ったが、ＤＮＡ混合物をＴ４リ
ガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品
名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２７−０８７
０−０４）と一緒に一晩培養した。次に、この結紮混合
物を、電気穿孔して（Ｔａｕｃｈ他、１９９４、ＦＥＭ
Ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３
４３〜７）、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Ｇｒａ
ｎｔ、１９９０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）
の中へ導入した。構成されたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター
を、ｐＸＴ９９Ａと命名した。プラスミドｐＧＡ１（Ｓ
ｏｎｎｅｎ他、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０７：６９〜７
４）を、コリネバクテリウム・グルタミクムからの最小
複製単位をクローニングするための塩基として使用し
た。ベクターｐＧＡ１のＢａｌＩ／ＰｓｔＩ制限切断
（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国、マン
ハイム在、製品名ＢａｌＩ、製品番号Ｒ６６９１；Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、
ドイツ連邦共和国、フライブルク在、Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｄｅｓ ＰｓｔＩ、製品番号２７−０９７６−０１）に
よって、ＳｍａＩ及びＰｓｔＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク在、製品名ＳｍａＩ、製品番号２７−
０９４２−０２、製品名ＰｓｔＩ、製品番号２７−０９
７６−０１）を用いて断片化されたベクターｐＫ１８ｍ
ｏｂ２（Ｔａｕｃｈ他、１９９８、Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６９：３０３〜３
１２）中の３４８４のフラブメントをクローンすること
が可能である。ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限切断（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ド
イツ連邦共和国、フライブルク在、製品名ＢａｍＨＩ、
製品番号２７−０８６８０３、製品名ＸｈｏＩ、製品番
号２７−０９５０−０１）及び引き続くクレノウ処理
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｋｌ
ｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｉ、製品番号２７−０９２８−０１；Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒの方法）に
よって、８３９ｂｐの大きさのフラグメントを削除し
た。Ｔ４リガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブル
ク在、製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２
７−０８７０−０４）を用いて再結紮された構造から、
Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＸＴ９９Ａｔｙｕｕｎｏ２
６４５ｂｐのフラグメントとしてのＣ．グルタミクム最
小複製単位をクローンすることが可能であった。このた
め、最小複製単位を有する構造体のＤＮＡを、制限酵素
ＫｐｎＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製
品名ＫｐｎＩ、製品番号２７−０９０８−０１）及びＰ
ｓｔＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品
名ＰｓｔＩ、製品番号２７−０８８６−０３）を用いて
切断させ、引き続き、３’−５’エキソヌクレアーゼ処
理（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）
を、クレノウ−ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、
フライブルク在、製品名Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、製品番
号２７−０９２８−０１）を用いて実施した。平行バッ
チにおいては、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＸＴ９９Ａ
を、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｎｏｓｔ
ｉｃｓ、ドイツ連邦共和国、マンハイム在、製品名Ｒｓ
ｒＩＩ、製品番号１２９２５８７）を用いて切断させ、
結紮のためにクレノウ−ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦
共和国、フライブルク在、製品名Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、製
品番号２７−０９２８−０１）を用いて調製した。ベク
ター構造ｐＸＴ９９Ａを有する最小複製単位の結紮を、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）によっ
て記載されたようにして実施したが、ＤＮＡ混合物をＴ
４リガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、
製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２７−０
８７０−０４）と一緒に一晩培養した。こうして構成さ
れたＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクムシャトル発現ベク
ターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａを、電気穿孔（Ｌｉｅｂｌ他、
１９８９、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ、５３：２９９〜３０３）を用いて組み換え
た。形質転換株を、再単離されたプラスミドＤＮＡの分
析によって検証できた。こうして得られたプラスミド構
造体を、ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａと命名した（図２）。Ｅ．
ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒへのプラスミドｐＥＣ−Ｘ
Ｔ９９Ａの形質転換によって得られたＥ．ｃｏｌｉ菌株
を、ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａと命名した。
他、１９８８、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜３１５）を、
Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクムシャトル発現ベクター
ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの構成のための出発ベクターとして
使用した。ＢｓｐＨＩ−制限切断（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国、マン
ハイム在、製品名ＢｓｐＨＩ、製品番号１４６７１２
３）及び引き続くクレノウ処理（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク在、製品名Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、製品
番号２７−０９２８−０１；ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）の後に、
アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）を、Ｃ．グルタミク
ムプラスミドｐＡＧ１のテトラサイクリン耐性遺伝子
（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１２
１０００）によって置換させた。このため、耐性遺伝子
を有する領域を、ＡｌｕＩフラグメント（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連
邦共和国、フライブルク在、製品名ＡｌｕＩ、製品番号
２７−０８８４−０１）として線形化したＥ．ｃ発現ベ
クターｐＴＲＣ９９Ａの中へクローンした。結紮を、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）によって
説明されたようにして行ったが、ＤＮＡ混合物をＴ４リ
ガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品
名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２７−０８７
０−０４）と一緒に一晩培養した。次に、この結紮混合
物を、電気穿孔して（Ｔａｕｃｈ他、１９９４、ＦＥＭ
Ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３
４３〜７）、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Ｇｒａ
ｎｔ、１９９０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）
の中へ導入した。構成されたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター
を、ｐＸＴ９９Ａと命名した。プラスミドｐＧＡ１（Ｓ
ｏｎｎｅｎ他、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０７：６９〜７
４）を、コリネバクテリウム・グルタミクムからの最小
複製単位をクローニングするための塩基として使用し
た。ベクターｐＧＡ１のＢａｌＩ／ＰｓｔＩ制限切断
（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国、マン
ハイム在、製品名ＢａｌＩ、製品番号Ｒ６６９１；Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、
ドイツ連邦共和国、フライブルク在、Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｄｅｓ ＰｓｔＩ、製品番号２７−０９７６−０１）に
よって、ＳｍａＩ及びＰｓｔＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク在、製品名ＳｍａＩ、製品番号２７−
０９４２−０２、製品名ＰｓｔＩ、製品番号２７−０９
７６−０１）を用いて断片化されたベクターｐＫ１８ｍ
ｏｂ２（Ｔａｕｃｈ他、１９９８、Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６９：３０３〜３
１２）中の３４８４のフラブメントをクローンすること
が可能である。ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限切断（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ド
イツ連邦共和国、フライブルク在、製品名ＢａｍＨＩ、
製品番号２７−０８６８０３、製品名ＸｈｏＩ、製品番
号２７−０９５０−０１）及び引き続くクレノウ処理
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｋｌ
ｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ Ｉ、製品番号２７−０９２８−０１；Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒの方法）に
よって、８３９ｂｐの大きさのフラグメントを削除し
た。Ｔ４リガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブル
ク在、製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２
７−０８７０−０４）を用いて再結紮された構造から、
Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＸＴ９９Ａｔｙｕｕｎｏ２
６４５ｂｐのフラグメントとしてのＣ．グルタミクム最
小複製単位をクローンすることが可能であった。このた
め、最小複製単位を有する構造体のＤＮＡを、制限酵素
ＫｐｎＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製
品名ＫｐｎＩ、製品番号２７−０９０８−０１）及びＰ
ｓｔＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品
名ＰｓｔＩ、製品番号２７−０８８６−０３）を用いて
切断させ、引き続き、３’−５’エキソヌクレアーゼ処
理（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）
を、クレノウ−ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、
フライブルク在、製品名Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、製品番
号２７−０９２８−０１）を用いて実施した。平行バッ
チにおいては、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＸＴ９９Ａ
を、制限酵素ＲｓｒＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｎｏｓｔ
ｉｃｓ、ドイツ連邦共和国、マンハイム在、製品名Ｒｓ
ｒＩＩ、製品番号１２９２５８７）を用いて切断させ、
結紮のためにクレノウ−ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦
共和国、フライブルク在、製品名Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、製
品番号２７−０９２８−０１）を用いて調製した。ベク
ター構造ｐＸＴ９９Ａを有する最小複製単位の結紮を、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）によっ
て記載されたようにして実施したが、ＤＮＡ混合物をＴ
４リガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、
製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２７−０
８７０−０４）と一緒に一晩培養した。こうして構成さ
れたＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクムシャトル発現ベク
ターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａを、電気穿孔（Ｌｉｅｂｌ他、
１９８９、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ、５３：２９９〜３０３）を用いて組み換え
た。形質転換株を、再単離されたプラスミドＤＮＡの分
析によって検証できた。こうして得られたプラスミド構
造体を、ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａと命名した（図２）。Ｅ．
ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒへのプラスミドｐＥＣ−Ｘ
Ｔ９９Ａの形質転換によって得られたＥ．ｃｏｌｉ菌株
を、ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａと命名した。
【００５４】例 ４ ｄａｐＦ遺伝子の発現 配列番号１中に示したＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２からのジアミノピメラート エピメラーゼ遺伝子ｄ
ａｐＦのヌクレオチド配列から出発して、ＰＣＲプライ
マーを合成した（ＡＲＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｍ
ｂＨ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ連邦共和国、ダル
ムシュタット在）。前記のプライマーを選択したので、
増幅フラグメントは、該遺伝子及びその天然リボソーム
結合部位を有するが、可能なプロモーター領域を有して
いない。更に、標的ベクターの中へのクローニングを可
能にする適当な制限切断部位が挿入された。ＰＣＲプラ
イマーの配列は、挿入された切断部位（下線を引いた配
列）及び増幅した遺伝子（ｂｐでのフラグメントの大き
さは、括弧に入れて記載した）を、表１中にまとめてあ
る。
３２からのジアミノピメラート エピメラーゼ遺伝子ｄ
ａｐＦのヌクレオチド配列から出発して、ＰＣＲプライ
マーを合成した（ＡＲＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｍ
ｂＨ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ連邦共和国、ダル
ムシュタット在）。前記のプライマーを選択したので、
増幅フラグメントは、該遺伝子及びその天然リボソーム
結合部位を有するが、可能なプロモーター領域を有して
いない。更に、標的ベクターの中へのクローニングを可
能にする適当な制限切断部位が挿入された。ＰＣＲプラ
イマーの配列は、挿入された切断部位（下線を引いた配
列）及び増幅した遺伝子（ｂｐでのフラグメントの大き
さは、括弧に入れて記載した）を、表１中にまとめてあ
る。
【００５５】
【表１】
【００５６】Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２から
のジアミノピメラート エピメラーゼ遺伝子ｄａｐＦ
を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び表１中に記載
した合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。ＰＣ
Ｒ試験を、“ＰＣＴ−１００Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ
ｒ”（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｗａｔｅｒ
ｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）中でＳｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ社（Ｌａ，Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、製品名ｎａｔｉｖｅ
Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、製品番号６
００２５０）からのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて
実施した。９４℃で３分間の単独変性工程の後、９４℃
で３０分間の変性、Ｔ＝（２ＡＴ；４ＧＣ）−５℃のプ
ライマー依存温度で３０分間のアニーリング工程（Ｄ．
Ｄ．Ｂｒｏｗｎ、及びＣ．Ｆ．Ｆｏｘ（編））、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｓｉｎｇ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、ニューヨーク、ＵＳＡ中、Ｓｕｇｇｓ他、１
９８１、第６８３〜６９３頁）及び７２℃で９０秒間の
拡張工程を続けた。この最後の３つの工程を、３０回１
周期として繰返し、かつ反応を７２℃で５分間の拡張工
程を用いて終了させた。こうして調製された生成物を、
アガロースゲル中での電気泳動によってその大きさにつ
いて試験した。
のジアミノピメラート エピメラーゼ遺伝子ｄａｐＦ
を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び表１中に記載
した合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。ＰＣ
Ｒ試験を、“ＰＣＴ−１００Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ
ｒ”（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｗａｔｅｒ
ｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）中でＳｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ社（Ｌａ，Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、製品名ｎａｔｉｖｅ
Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、製品番号６
００２５０）からのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて
実施した。９４℃で３分間の単独変性工程の後、９４℃
で３０分間の変性、Ｔ＝（２ＡＴ；４ＧＣ）−５℃のプ
ライマー依存温度で３０分間のアニーリング工程（Ｄ．
Ｄ．Ｂｒｏｗｎ、及びＣ．Ｆ．Ｆｏｘ（編））、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｓｉｎｇ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、ニューヨーク、ＵＳＡ中、Ｓｕｇｇｓ他、１
９８１、第６８３〜６９３頁）及び７２℃で９０秒間の
拡張工程を続けた。この最後の３つの工程を、３０回１
周期として繰返し、かつ反応を７２℃で５分間の拡張工
程を用いて終了させた。こうして調製された生成物を、
アガロースゲル中での電気泳動によってその大きさにつ
いて試験した。
【００５７】表１中に示したＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタ
ミクムシャトル発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ（例
３）を、発現のための基礎ベクターとして使用した。Ｐ
ＣＲの結果の生成物を、酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｅｃ
ｏＲＩ、製品番号２７−０８５４−０３、製品名Ｂａｍ
ＨＩ、製品番号２７−０８６８−０３）を用いて切断さ
せた制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｕｎＩを用いて完全に切
断発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの中へ結紮させた。
ミクムシャトル発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ（例
３）を、発現のための基礎ベクターとして使用した。Ｐ
ＣＲの結果の生成物を、酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｅｃ
ｏＲＩ、製品番号２７−０８５４−０３、製品名Ｂａｍ
ＨＩ、製品番号２７−０８６８−０３）を用いて切断さ
せた制限酵素ＢａｍＨＩ及びＭｕｎＩを用いて完全に切
断発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの中へ結紮させた。
【００５８】こうして、プロモーター欠如ｄａｐＦ遺伝
子が、前記プラスミド上に含まれるｔｒｃプロモーター
に制御される。
子が、前記プラスミド上に含まれるｔｒｃプロモーター
に制御される。
【００５９】発現ベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ中へのｄ
ａｐＦｅｘ増幅の結紮を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８
９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ）によって説明されたようにして実施
したが、ＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦
共和国、フライブルク在、Ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｓ Ｔ
４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２７−０８７０−
０４）と一緒に一晩培養した。次に、この結紮混合物を
電気穿孔して（Ｔａｕｃｈ他、１９９４、ＦＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３４３〜
７）、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒ（Ｇｒａｎｔ、
１９９０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）の中へ
導入し、かつテトラサイクリン５μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−
Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／を有するＬＢ寒天（Ｌｅ
ｎｎｏｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：１９０）
の上で培養した。
ａｐＦｅｘ増幅の結紮を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８
９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ）によって説明されたようにして実施
したが、ＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦
共和国、フライブルク在、Ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｓ Ｔ
４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、製品番号２７−０８７０−
０４）と一緒に一晩培養した。次に、この結紮混合物を
電気穿孔して（Ｔａｕｃｈ他、１９９４、ＦＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３４３〜
７）、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒ（Ｇｒａｎｔ、
１９９０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）の中へ
導入し、かつテトラサイクリン５μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−
Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／を有するＬＢ寒天（Ｌｅ
ｎｎｏｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：１９０）
の上で培養した。
【００６０】３７℃で２４時間の培養後に、挿入プラス
ミドを有するコロニーを、α−相補性を用いて同定する
ことができた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ）。
ミドを有するコロニーを、α−相補性を用いて同定する
ことができた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ）。
【００６１】Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（１９９
７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
７：１５１３〜１５２３）の“Ａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙ
ｓｉｓｍｅｔｈｏｄ”によるプラスミドＤＮＡの再単離
によって、対応発現構造のＤＮＡを形質転換株から取得
した。発現プラスミドの補正クローニングを、挿入物の
配列によってチェックした。
７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
７：１５１３〜１５２３）の“Ａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙ
ｓｉｓｍｅｔｈｏｄ”によるプラスミドＤＮＡの再単離
によって、対応発現構造のＤＮＡを形質転換株から取得
した。発現プラスミドの補正クローニングを、挿入物の
配列によってチェックした。
【００６２】こうして得られたプラスミド構造体を、ｐ
ＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦと命名した。Ｅ．ｃｏｌｉ
菌株ＤＨ５αｍｃｒ中のプラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
−ｄａｐＦの形質転換によって取得されたＥ．ｃｏｌｉ
菌株を、ＤＨ５αＭＣＲ／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐ
Ｆと命名した。
ＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦと命名した。Ｅ．ｃｏｌｉ
菌株ＤＨ５αｍｃｒ中のプラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
−ｄａｐＦの形質転換によって取得されたＥ．ｃｏｌｉ
菌株を、ＤＨ５αＭＣＲ／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐ
Ｆと命名した。
【００６３】例 ５ プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ及びｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
−ｄａｐＦを有する菌株ＤＳＭ５７１５の形質転換 プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ（例３）及びｐＥＣ−Ｘ
Ｔ９９Ａ−ｄａｐＦ（例４）を、電気穿孔法（Ｌｉｅｂ
ｌ他、１９８９、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、５３：２９９〜３０３）によって菌
株ＤＳＭ５７１５中に流し込んだ。
−ｄａｐＦを有する菌株ＤＳＭ５７１５の形質転換 プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ（例３）及びｐＥＣ−Ｘ
Ｔ９９Ａ−ｄａｐＦ（例４）を、電気穿孔法（Ｌｉｅｂ
ｌ他、１９８９、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ、５３：２９９〜３０３）によって菌
株ＤＳＭ５７１５中に流し込んだ。
【００６４】電気穿孔を用いて得られた形質転換株を、
カナマイシン１５ｍｇ／ｌを有する選択寒天（ＬＢＨＩ
Ｓ ａｇａｒ（脳−心臓浸出物液体培地１８．５ｇ／
ｌ、０．５Ｍのソルビトール、バクト−トリプトン５ｇ
／ｌ、バクト−イーストエキス２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／ｌ、バクトー寒天１８ｇ／ｌ））上で単離した。
プラスミドＤＮＡを常法（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓ
ｃｈ他、１９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４
４、９１５〜９２７）によって単離し、適当な制限エン
ドヌクレアーゼ（ＰｓｔＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フ
ライブルク在、製品名ＰｓｔＩ、製品番号２７−０８８
６−０３））を用いて切断し、かつチェックした。得ら
れた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ及びＤ
ＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦと命名し
た。
カナマイシン１５ｍｇ／ｌを有する選択寒天（ＬＢＨＩ
Ｓ ａｇａｒ（脳−心臓浸出物液体培地１８．５ｇ／
ｌ、０．５Ｍのソルビトール、バクト−トリプトン５ｇ
／ｌ、バクト−イーストエキス２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／ｌ、バクトー寒天１８ｇ／ｌ））上で単離した。
プラスミドＤＮＡを常法（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓ
ｃｈ他、１９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４
４、９１５〜９２７）によって単離し、適当な制限エン
ドヌクレアーゼ（ＰｓｔＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ連邦共和国、フ
ライブルク在、製品名ＰｓｔＩ、製品番号２７−０８８
６−０３））を用いて切断し、かつチェックした。得ら
れた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ及びＤ
ＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦと命名し
た。
【００６５】例 ６ Ｌ−リシンの調製 例５において調製したＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ及びＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ
−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦを、リシンの産生に適する栄養
媒体中で培養し、かつリシン含量を、培養上清中で測定
した。
１５／ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ及びＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ
−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦを、リシンの産生に適する栄養
媒体中で培養し、かつリシン含量を、培養上清中で測定
した。
【００６６】このため、該菌株を、まず、３３℃で２４
時間、寒天プレート（カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を
有する脳−心臓浸出物寒天）上で培養した。前記の寒天
プレート培養から出発して、予培地を接種した（１００
ｍｌの円錐形フラスコ中に培地１０ｍｌ）。予培地に使
用した培地は、完全培地ＣｇＩＩＩ（バクト−ペプトン
１０ｇ／ｌ、バクト−イーストエキス１０ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．４（Ｅｇｇｅｌｉｎｇ他、１９
８７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：３４６〜３
５１）。テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）を添加した。
この予培地を、３３℃で２４時間、振盪器上、２４０ｒ
ｐｍで培養した。主要培養を、前記予培地から接種し
て、主要培養の開始時のＯＤ（６６０ｎｍの波長で測
定）が、０．２ＯＤにした。培地ＭＭを、主要培養とし
て使用した。
時間、寒天プレート（カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を
有する脳−心臓浸出物寒天）上で培養した。前記の寒天
プレート培養から出発して、予培地を接種した（１００
ｍｌの円錐形フラスコ中に培地１０ｍｌ）。予培地に使
用した培地は、完全培地ＣｇＩＩＩ（バクト−ペプトン
１０ｇ／ｌ、バクト−イーストエキス１０ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．４（Ｅｇｇｅｌｉｎｇ他、１９
８７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５：３４６〜３
５１）。テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）を添加した。
この予培地を、３３℃で２４時間、振盪器上、２４０ｒ
ｐｍで培養した。主要培養を、前記予培地から接種し
て、主要培養の開始時のＯＤ（６６０ｎｍの波長で測
定）が、０．２ＯＤにした。培地ＭＭを、主要培養とし
て使用した。
【００６７】 培地ＭＭ： ＣＳＬ ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ ２０ｇ／ｌ グルコース ５０ｇ／ｌ（オートクレーブ別） 塩類： （ＮＨ4）2ＳＯ4） ２５ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 *７Ｈ2Ｏ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 *２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4 *７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4 *Ｈ2Ｏ ５．０ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシン ０．１ｇ／ｌ ビオチン ０．３ｍｇ／ｌ（無菌濾過） チアミン*ＨＣｌ ０．２ｍｇ／ｌ（無菌濾過） ＣａＣＯ3 ２５ｇ／ｌ 略語： ＣＳＬ：コーン浸漬液 ＭＯＰＳ：モルホリノプロパンスルホン酸 ＣＳＬ、ＭＯＰＳ及び塩溶液を、水性アンモニアでｐＨ
７にし、かつオートクレーブ処理する。次に、無菌基質
及びビタミン溶液を添加し、かつ乾燥状態でオートクレ
ーブ処理したＣａＣＯ3を添加する。
７にし、かつオートクレーブ処理する。次に、無菌基質
及びビタミン溶液を添加し、かつ乾燥状態でオートクレ
ーブ処理したＣａＣＯ3を添加する。
【００６８】培養を、じゃま板を有する円錐形フラスコ
１００ｍｌ中１０ｍｌの容量で実施する。テトラサイク
リン（５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃及び大気
湿度８０％で実施した。
１００ｍｌ中１０ｍｌの容量で実施する。テトラサイク
リン（５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃及び大気
湿度８０％で実施した。
【００６９】ｄａｐＦ発現を誘発させるために、１ｍＭ
のＩＰＴＧ（イソプロピル チオ−β−ガラクトシド、
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、ドイツ連邦共和国、エッゲンシュタイン在）カタ
ログ番号１５５２９−０１９）を添加した。
のＩＰＴＧ（イソプロピル チオ−β−ガラクトシド、
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、ドイツ連邦共和国、エッゲンシュタイン在）カタ
ログ番号１５５２９−０１９）を添加した。
【００７０】７２時間後に、６６０ｎｍの測定波長での
ＯＤ及び形成されたリシンの濃度を測定した。Ｌａｎｇ
ｅ社（ドイツ連邦共和国、ベルリン在）からのＬＤ １
Ｗ デジタルフォトメーターを、光学密度（ＯＤ６６
０）の測定のために採用した。リシンを、Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ−ＢｉｏＴｒｏｎｉｋ社（ドイツ連邦共和国、ハ
ンブルク材）からのアミノ酸分析器を用いて、イオン交
換クロマトグラフィー及びニンヒドリン検出を用いるポ
ストカラム誘導（ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖ
ａｔｉｚａｔｉｏｎ）によって測定した。
ＯＤ及び形成されたリシンの濃度を測定した。Ｌａｎｇ
ｅ社（ドイツ連邦共和国、ベルリン在）からのＬＤ １
Ｗ デジタルフォトメーターを、光学密度（ＯＤ６６
０）の測定のために採用した。リシンを、Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ−ＢｉｏＴｒｏｎｉｋ社（ドイツ連邦共和国、ハ
ンブルク材）からのアミノ酸分析器を用いて、イオン交
換クロマトグラフィー及びニンヒドリン検出を用いるポ
ストカラム誘導（ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖ
ａｔｉｚａｔｉｏｎ）によって測定した。
【００７１】試験の結果を、表２に示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】
【配列表】
【００７４】
【外１】
【００７５】
【外２】
【００７６】
【外３】
【図１】プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９Ａの地図を示す
図。
図。
【図２】プラスミドｐＥＣ−ＸＴ９９ＡｄａｐＦの地図
を示す図。
を示す図。
Ｔｅｔ テトラサイクリン耐性遺伝子 ｄａｐＦ Ｃ．グルタミクムのｄａｐＦ遺伝子 ｏｒｉＥ Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドをコードし
た複製起点 ｒｅｐ Ｃ．グルタミクムプラスミドｐＧＡ１からの
プラスミドをコードした複製起点 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ＥｃｏＲＶ 制限酵素ＥｃｏＲＶの切断部位 ＨｉｎｃＩＩ 制限酵素ＨｉｎｃＩＩ：の切断部位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＫｐｎＩ 制限酵素ＫｐｎＩの切断部位 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩの切断部位 ＳｍａＩ 制限酵素ＳｍａＩの切断部位 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 ＰｖｕＩＩ 制限酵素ＰｖｕＩＩの切断部位 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位
た複製起点 ｒｅｐ Ｃ．グルタミクムプラスミドｐＧＡ１からの
プラスミドをコードした複製起点 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ＥｃｏＲＶ 制限酵素ＥｃｏＲＶの切断部位 ＨｉｎｃＩＩ 制限酵素ＨｉｎｃＩＩ：の切断部位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＫｐｎＩ 制限酵素ＫｐｎＩの切断部位 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩの切断部位 ＳｍａＩ 制限酵素ＳｍａＩの切断部位 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 ＰｖｕＩＩ 制限酵素ＰｖｕＩＩの切断部位 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 ブリギッテ バーテ ドイツ連邦共和国 ザルツコッテン ツヴ ィーテン １ (72)発明者 ベッティーナ メッケル ドイツ連邦共和国 デュッセルドルフ ベ ンローデシュトラーセ 35 (72)発明者 ミヒャエル ハルトマン ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アウ フ デム ランゲン カンペ 10 (72)発明者 イェルン カリノフスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト レン バッハシュトラーセ 19 (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ヴァルトシュレスヒェン ２ (72)発明者 ヴァルター プフェッファーレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33
Claims (17)
- 【請求項１】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも
７０％までは同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）寄託されたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株
ＤＳＭ １２９６８中のベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ
−ｄａｐＦに含まれるｄａｐＦ遺伝子によって発現され
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なく
とも７０％までは同一であるポリヌクレオチド、 ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
は同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、 ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチドに対して相
補性であるポリヌクレオチド、 ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のポリヌクレオチド配列
の少なくとも１５個の連続塩基を含むポリヌクレオチド
からなるグループから選択されたポリヌクレオチド配列
を含む単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、有利にコリネフォ
ルム細菌において複製可能な組換えＤＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１において示した核酸配列を含
む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 （ｉ）配列番号１において示したヌクレ
オチド配列又は（ｉｉ）遺伝子コードの縮重の範囲内で
配列（ｉ）に対応する少なくとも１種の 配列又は （ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の配列に対して相補的な
配列とハイブリダイズする少なくとも１種の配列、及び
場合により、 （ｉｖ）（ｉ）における中立機能のセンス変異を含む、
請求項２に記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号２におけるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌク
レオチド配列。 - 【請求項７】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含
むベクター、殊にＤＳＭ１２９６８の名称で寄託され
た、図２において示した制限地図によって特徴付けられ
るシャトルベクターｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦ。 - 【請求項８】 請求項６に記載のベクターを含む宿主細
胞として働くコリネフォルム細菌。 - 【請求項９】 コリネフォルム細菌の発酵によるＬ−リ
シンの調製法において、ｄａｐＦ遺伝子又は該遺伝子を
コードするヌクレオチド配列が増幅され、特に過剰発現
させられている細菌を使用することを特徴とする、Ｌ−
リシンの調製法。 - 【請求項１０】 所望のＬ−アミノ酸の生合成経路の他
の遺伝子が付加的に増幅されている細菌を使用する、請
求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｌ−リシンの形成を減少させる代謝経
路が少なくとも部分的に除かれている細菌を使用する、
請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】 プラスミドベクターを用いて形質転換
された菌株を使用し、かつプラスミドベクターが、ｄａ
ｐＦ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する、請
求項９又は１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 ＤＳＭ１２９６８番で寄託されたコリ
ネバクテリウム・グルタミクム中のプラスミドベクター
ｐＥＣ−ＸＴ９９Ａ−ｄａｐＦを用いて形質転換された
細菌を使用する、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｌ−リシンを生産するコリネフォルム
細菌を使用する、請求項９から１２までのいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１５】 ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコー
ドするｄａｐＦ遺伝子が、同時に過剰発現されている、
請求項９に記載の方法。 - 【請求項１６】 Ｓ−（２−アミノエチル）−システイ
ン耐性を付与するＤＮＡフラグメントが、同時に増幅さ
せられる、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１７】 以下の工程： ａ）少なくともｄａｐＦ遺伝子が増幅されているＬ−リ
シン生産性コリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）媒体中又は細菌の細胞中でのＬ−リシンの濃縮及び ｃ）Ｌ−リシンの単離 を実施することを特徴とする、請求項９から１６までの
いずれか１項に記載のＬ−リシンの調製法。
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