DE60015042T2

DE60015042T2 - Nukleotidsequenzen, welche für das dapF-Gen kodieren

Info

Publication number: DE60015042T2
Application number: DE60015042T
Authority: DE
Inventors: Oliver Kirchner; Dr. Brigitte Bathe; Dr. Bettina Möckel; Michael Hartmann; Dr. Jörn Kalinowski; Prof. Alfred Pühler; Dr. Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1999-09-11
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2020-07-26
Also published as: DE60015042D1; ZA200004723B; HUP0003553A2; AU5507400A; BR0004059A; ID27239A; JP2001095593A; EP1085094B1; ES2231089T3; ATE280232T1; EP1085094A2; CN1288055A; DK1085094T3; CN100387714C; SK13282000A3; EP1085094B2; MXPA00008678A; DE19943587A1; EP1085094A3; DE60015042T3

Description

Gegenstand der Erfindung sind Nucleotidsequenzen, die das dapF-Gen kodieren, und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das Gen dapF verstärkt wird.
Stand der Technik
L-Lysin findet in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, insbesondere aber in der Tierernährung Verwendung.
Es ist bekannt, dass L-Lysin durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt wird. Aufgrund ihrer großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellungsverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch beispielsweise Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise werden Stämme erhalten, die resistent gegen Antimetabolite, wie z.B. das Lysin-Analog S-(2-Aminoethyl)-Cystein, oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Aminosäuren sind und L-Lysin produzieren.
Seit einigen Jahren werden auch Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Lysin produzierenden Stämmen von Corynebacterium angewendet, indem einzelne Lysin-Biosynthesegene amplifiziert werden und die Auswirkung auf die L-Lysin-Produktion untersucht wird. Übersichtsartikel hierzu sind unter anderem bei Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain und Solomon (Hrsg.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115–142), Hilliger (BioTec 2, 40–44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261–272 (1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73–103 (1995)) und Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25–39 (1996)) zu finden.
In Prokaryoten sind drei unterschiedliche Wege für die Biosynthese von D,L-Diaminopimelat- oder L-Lysin bekannt. Diese Wege unterscheiden sich in der Reaktion von L-Piperidin-2,6-dicarboxylat (Tetrahydrodipicolinat).
Beim Succinylaseweg wird Tetrahydrodipicolinat über eine Succinylierung durch die Tetrahydrodipicolinat-Succinylase, anschließende Transaminierung (N-Succinyl-Amino-Ketopimelat-Transaminase) der Ketogruppe, Desuccinylierung (N-Succinyl-Amino-Ketopimelat-Desuccinylase) und anschließende Epimerisierung (Diaminopimelat-Epimerase) in D,L-Diaminopimelat umgewandelt (Gilvarg, 1958, The Journal of Biological Chemistry, 233: 1501–1504).
Beim Acetylaseweg, der in Bacillus subtilis und Bacillus megaterium verwirklicht ist, erfolgt die Acylierung von Tetrahydrodipicolinat durch ein Acetylradikal (Weinberger & Gilvarg, 1970, Journal of Bacteriology, 101:323–324).
Ein dritter Biosyntheseweg ist für B. sphaericus beschrieben (Misono et al., 1976, Journal of Bacteriology, 137:22–27). Bei diesem als Dehydrogenaseweg bezeichneten Biosyntheseschritt erfolgt die direkte reduktive Aminierung des Tetrahydrodipicolinats zu D,L-DAP.
Schrumpf et al. (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) zeigten anhand genetischer und enzymatischer Untersuchungen, dass in Corynebacterium glutamicum die Lysin-Biosynthese sowohl über den Dehydrogenaseweg als auch über den Succinylaseweg erfolgt.
Durch In-vivo-NMR-Untersuchungen von Marx et al. (Biotechnology and Bioengineering 56, 168–180 (1997)) und Sonntag (European Journal of Biochemistry 213:1325–1331 (1993)) wurde festgestellt, dass in Corynebacterium glutamicum sowohl der Succinylaseweg als auch der Dehydrogenaseweg zur Produktion von L-Lysin beiträgt.
Das Gen für die Desuccinylase (dapE) aus Corynebacterium glutamicum wurde von Wehrmann et al. kloniert und sequenziert (Journal of Bacteriology 177: 5991–5993 (1995)). Weiterhin konnte das Gen für die Succinylase (dapD) aus Corynebacterium glutamicum kloniert und sequenziert werden (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159–3165 (1998)).
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder hatten die Aufgabe, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
L-Lysin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und insbesondere in der Tierernährung Verwendung. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt wird, sind damit nicht nur die Base, sondern auch die Salze, wie z.B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat, gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynucleotid von coryneformen Bakterien, umfassend eine Polynucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu wenigstens 95 identisch mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 ist, wobei das genannte Polypeptid Diaminopimelatepimeraseaktivität aufweist;
b) einem Polynucleotid, das komplementär zum Polynucleotid aus a) ist.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem das Polynucleotid gemäß Anspruch 2, das DNA ist, die in coryneformen Bakterien replizierbar ist, umfassend:

(1) die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder
(2) eine Nucleotidsequenz, die der Sequenz (1) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht.

Die Erfindung betrifft ferner
ein Polynucleotid gemäß Anspruch 2, umfassend die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz,
ein Polynucleotid gemäß Anspruch 2, das ein Polypeptid kodiert, das aus der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht,
einen Vektor, der die Polynucleotidsequenz gemäß den Ansprüchen 4 bis 6 enthält, insbesondere pEC-XT99A-dapF, hinterlegt als DSM 12968,
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor gemäß Anspruch 7 enthalten.
Die Erfindung betrifft außerdem Polynucleotide, die im Wesentlichen eine Polynucleotidsequenz umfassen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank, die das vollständige Gen mit der Polynucleotidsequenz entsprechend SEQ ID Nr. 1 enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten Polynucleotids gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment davon umfasst, und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.
Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind geeignet als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA, um cDNA in voller Länge zu isolieren, die Diaminopimelat-Epimerase kodiert, und solche cDNA oder Gene zu isolieren, deren Sequenz eine hohe Ähnlichkeit mit der des Diaminopimelat-Epimerasegens aufweist.
Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind ferner als Primer zur Herstellung von DNA von Genen, die Diaminopimelat-Epimerase kodieren, durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geeignet.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonucleotide umfassen wenigstens 30, bevorzugt wenigstens 20. Geeignet sind auch Oligonucleotide mit einer Länge von wenigstens 40 oder 50 Basenpaaren.
„Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.
„Polynucleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonucleotide und Polydesoxyribonuncleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Unter „Polypeptiden" sind Peptide oder Proteine zu verstehen, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren umfassen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Diaminopimelat-Epimerase und auch solche ein, die zu wenigstens 95 % identisch mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 sind und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren und in denen die das dapF-Gen kodierenden Nucleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Der Begriff „Verstärkung" (Amplifikation) beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem zum Beispiel die Kopiezahl des Gens oder der Gene erhöht, ein potenter Promotor verwendet oder ein Gen verwendet wird, das ein entsprechendes Enzym mit hoher Aktivität kodiert, und bei Bedarf diese Maßnahmen kombiniert werden.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Lysin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerol und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium, handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum, sind zum Beispiel die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum RTCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten oder Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715
Den Erfindern gelang es, das neue dapF-Gen von C. glutamicum zu isolieren, das das Enzym Diaminopimelat-Epimerase (EC 5.1.1.7) kodiert.
Zur Isolierung des dapF-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern beschrieben. Als Beispiele sind das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) zu nennen. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160–2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563–1575) angelegt wurde. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326 ) beschreiben wiederum eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)). Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259–268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, wie es z.B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463–5467, 1977) beschrieben ist.
Auf diese Weise wurde die neue, das Gen dapF kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID Nr. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID Nr. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des dapF-Genproduktes dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID Nr. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID Nr. 1 oder Teilen von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z.B. der Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als „Sinnmutationen" bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d.h. funktionsneutral sind. Ferner ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Informationen hierzu findet die fachkundige Person unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77:237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID Nr. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID Nr. 1 ergeben. Derartige Oligonucleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 20 Basenpaaren.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet die fachkundige Person unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260 ). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) findet die fachkundige Person unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Die Erfinder fanden heraus, dass coryneforme Bakterien nach einer Überexpression des dapF-Gens in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopiezahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts des Strukturgens mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Laufe der fermentativen L-Lysin-Produktion zu steigern. Die Expression wird ebenfalls durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA verbessert. Weiterhin wird durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins auch die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstruktionen können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopiezahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann außerdem eine Überexpression der betreffenden Gene durch Verändern der Medienzusammensetzung und Kulturmethode erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet die fachkundige Person unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US-Patent 4,601–893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60:512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Ein Beispiel für ein Plasmid, mit dessen Hilfe das dapF-Gen überexprimiert werden kann, ist pEC-XT99A-dapF (2), das in dem Stamm DSM5715/pEC-XT99A-dapF enthalten ist. Das Plasmid pEC-XT99A-dapF ist ein auf dem Plasmid pEC-XT99A (1) basierender E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor. Dieser Plasmidvektor enthält die Replikationsregion des Plasmids pGA1 (US-B 5,175,108) und das Tetracyclin-Resistenzgen des Plasmids pAG1 (Beitritts-Nr. AF121000 des National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA). Andere in C. glutamicum replizierbare Plasmidvektoren wie z.B. pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102:93–98 (1991)) oder pZ8-1 (EP-B 0 375 889) können in gleicher Weise verwendet werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben dem dapF-Gen ein oder mehrere Enzyme des Lysin-Biosyntheseweges zu überexprimieren. So kann beispielsweise

– gleichzeitig das die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen überexprimiert werden (EP-B 0 197 335), oder
– gleichzeitig ein S-(2-Aminoethyl)-Cystein-Resistenz verleihendes DNA-Fragment amplifiziert werden (EP-A 0 088 166), oder
– gleichzeitig das die Tetradihydrodipicolinat-Succinylase kodierende dapD-Gen (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159 – 3165 (1998)), oder
– gleichzeitig das die Succinyldiaminopimelat-Desuccinylase kodierende dapF-Gen (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991–5993 (1995)) überexprimiert werden.

Des Weiteren kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Überexpression des dapF-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder im Fed-batch-(Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) enthalten.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z.B. Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie z.B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff sowie anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss ferner Salze von Metallen enthalten, wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorläufer zugesetzt werden. Die genannten Ausgangsstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden.
Zur pH-Kontrolle können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser oder Säureverbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z.B. Antibiotika, zugegeben werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie z.B. Luft, in die Kultur eingebracht. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 20°C und 45°C und vorzugsweise zwischen 25°C und 40°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum von Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Lysin kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben.
Folgende Mikroorganismen wurden bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

– Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC-XT99A als DSM 12967
– Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715/pEC-XT99A-dapF als DSM 12968

Das erfindungsgemäße Verfahren dient der fermentativen Herstellung von L-Lysin.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
1. Beispiel
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie von Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168–179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al., (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84:2160–2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit Shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNR-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe von Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37° wurden rekombinante Einzelklone selektiert.
2. Beispiel
Isolierung und Sequenzierung des dapF-Gens
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Nach einer Trennung durch Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Die DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87:4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert. Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 74:5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Trennung durch Gelelektrophorese und Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgte in einem „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29:1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem „ABI Prism 377" Sequenzierungsgerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend mit dem Staden-Progammpaket (1986, Nucleic Acids Research, 14:217–231) Version 97-0 verarbeitet. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützten Kodierregionanalysen wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217–231) angefertigt. Homologieanalysen wurden mit den „BLAST search programs" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) anhand der nichtredundanten Datenbank des „National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nucleotidsequenz ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Eine Analyse der Nucleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 831 Basenpaaren, das als dapF-Gen bezeichnet wurde. Das dapF-Gen kodiert ein Polypeptid von 277 Aminosäuren.
3. Beispiel
Konstruktion des Expressionsvektors pEC-XT99A
Als Ausgangsvektor zur Konstruktion des E. coli-C. glutamicum Shuttle-Expressionsvektors pEC-XT99A wurde der E. coli-Expressionsvektor pTRC99A (Amann et al. 1988, Gene 69:301–315) verwendet. Nach einer BspHI-Restriktionsspaltung (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung BspHI, Produkt-Nr. 1467123) und anschließenden Klenow-Behandlung (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Produkt-Nr. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) wurde das Ampicillin-Resistenzgen (bla) gegen das Tetracyclin-Resistenzgen des C. glutamicum Plasmids pAG1 (GenBank Beitritts-Nr. AF121000) ausgetauscht. Hierzu wurde die Resistenzgen tragende Region als AluI-Fragment (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung AluI, Produkt-Nr. 27-0884-01) in den linearisierten E. coli-Expressionsvektor pTRC99A kloniert. Die Ligation wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Produkt-Nr. 27-0870-04) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli-Stamm DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiology Letters, 123:343–7). Der konstruierte E. coli-Expressionsvektor wurde pXT99A genannt. Als Basis zur Klonierung eines Minimalreplikons von Corynebacterium glutamicum wurde das Plasmid pGA1 (Sonnen et al. 1991, Gene, 107:69–74) verwendet. Durch BalI/PstI-Restriktionsspaltung (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung BalI, Produkt-Nr. R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung PstI, Produkt-Nr. 27-0976-01) des Vektors pGA1 konnte ein 3484 bp großes Fragment in den mit SmaI und PstI (Amersham Pharmacia Biotechn, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung SamI, Produkt-Nr. 27-0942-02, Produktbeschreibung PstI, Produkt-Nr. 27-0976-01) fragmentierten Vektor pK18mob2 (Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169:303–312) kloniert werden. Mittels BamHI/XhoI-Restriktionsspaltung (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-086803, Produktbeschreibung XhoI, Produkt-Nr. 27-0950-01) und anschließender Klenow-Behandlung (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Produkt-Nr. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) wurde ein 839 bp großes Fragment deletiert. Aus der mit T4-Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Produkt-Nr. 27-0870-04) religierten Konstruktion konnte das C. glutamicum Minimalreplikon als 2645 bp großes Fragment in den E. coli-Expressionsvektor pXT99A kloniert werden. Hierzu wurde die DNA der Minimalreplikon tragenden Konstruktion mit den Restriktionsenzymen KpnI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung KpnI, Produkt-Nr. 27-0908-01) und PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung PstI, Produkt-Nr. 27-0886-03) gespalten und anschließend mittels Klenow-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Produkt-Nr. 27-0928-01) eine 3'-5'-Exonucleasebehandlung (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) durchgeführt. In einem parallelen Ansatz wurde der E.coli-Expressionsvektor pXT99A mit dem Restriktionsenzym RsrII (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung RsrII, Produkt-Nr. 1292587) gespalten und zur Ligation mit Klenow-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Klenow-Fragment of DNA Polymerase I, Produkt-Nr. 27-0928-01) vorbereitet. Die Ligation des Minimalreplikons mit der Vektorkonstruktion pXT99A wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Produkt-Nr. 27-0870-04) über Nacht inkubiert wurde. Der so konstruierte E. coli-C. glutamicum Shuttle-Expressionsvektor pEC-XT99A wurde durch Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53:299–303) in C. glutamicum transferiert. Durch eine Analyse der reisolierten Plasmid-DNA konnte der Transformant verifiziert werden. Die so erhaltene Plasmidkonstruktion wurde als pEC-XT99A (2) bezeichnet. Der durch Transformation des Plasmids pEC-XT99A in den E. coli Stamm DH5αmcr erhaltene E. coli Stamm wurde DH5amcr/pEC-XT99A genannt.
4. Beispiel
Expression des dapF-Gens
Ausgehend von der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz des Diaminopimelatepimerase-Gens dapF von C. glutamicum ATCC 13032 wurden PCR-Primer synthetisiert (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Deutschland). Diese Primer wurden so ausgewählt, dass das amplifizierte Fragment das Gen sowie native Ribosomenbindungsstellen davon, nicht aber mögliche Promotor-Regionen enthielt.
Zusätzlich wurden geeignete Restriktionsspaltstellen eingefügt, die das Klonieren in den Zielvektor ermöglichten. Die Sequenzen der PCR-Primer, die eingefügten Spaltstellen (Sequenz unterstrichen) sowie das amplifizierte Gen (Fragmentgröße in bp ist in Klammern angegeben) sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1
Das Diaminopimelatepimerase-Gen dapF von C. Glutamicum ATCC13032 wurde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie der in Tabelle 1 beschriebenen synthetischen Oligonucleotide amplifiziert. Die PCR-Experimente wurden mit der Pfu DNA-Polymerase der Firma Stratagene (La, Jolla, CA, Produktbeschreibung native Pfu DNA Polymerase, Produkt-Nr. 600250) in einem „PCT-100 Thermocycler" (MJ Research Inc., Watertown, Mass., USA) durchgeführt. Auf einen einmaligen Denaturierungsschritt von 3 Minuten bei 94°C folgte ein Denaturierungsschritt von 30 Sekunden bei 94°C, ein Annealingschritt von 30 Sekunden bei einer primerabhängigen Temperatur von T=(2AT+4GC) –5°C (Suggs, et al., 1981, S. 683–693, In: D.D. Brown und C.F. Fox (Hrsg.), Developmental biology using purified genes. Academic Press, New York, USA) sowie ein 90 Sekunden dauernder Extensionsschritt bei 72°C. Die letzten drei Schritte wurden 30 Mal zyklisch wiederholt und die Reaktion wurde mit einem Extensionsschritt von 5 Minuten bei 72°C beendet. Das auf diese Weise hergestellte Produkt wurde durch Elektrophorese in Agarosegel auf seine Größe geprüft.
Als Basisvektor zur Expression wurde der in 1 (Beispiel 3) dargestellte E. coli-C. glutamicum Shuttle-Expressionsvektor pEC-XT99A eingesetzt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und MunI vollständig gespalten und in den ebenfalls mit den Enzymen EcoRI und BamHI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung EcoRI, Produkt-Nr. 27-0854-03), Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-03) gespaltenen Expressionsvektor pEC-XT99A ligiert.
Auf diese Weise wird das promotorlose dapF-Gen unter die Kontrolle des auf diesem Plasmid enthaltenen trc-Promotors gebracht.
Die Ligation der dapFex-Amplifikation in den Expressionsvektor pEC-XT99A wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Produkt-Nr. 27-0870-04) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiology Letters, 123:343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 5 μg/ml Tetracyclin und 40 μg/ml X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktosid) ausplattiert.
Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37°C konnten Kolonien mit inserttragenden Plasmiden anhand von α-Komplementation (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) identifiziert werden. Durch Reisolierung der Plasmid-DNA nach der „alkalischen Lyse-Methode" von Birnboim und Doly (1997, Nucleic Acids Research, 7: 1513–1523) wurde aus den Transformanten die DNA der entsprechenden Expressionskonstruktion gewonnen. Die korrekte Klonierung des Expressionsplasmids wurde durch Sequenzierung des Inserts überprüft.
Die so erhaltene Plasmidkonstruktion wurde als pEC-XT99A-dapF bezeichnet. Der durch Transformation des Plasmids pEC-XT99A-dapF in den E. coli Stamm DH5αmcr erhaltene E.coli Stamm wurde DH5αMCR/pEC-XT99A-dapF genannt.
5. Beispiel
Transformation des Stammes DSM5715 mit den Plasmiden pEC-XT99A und pEC-XT99A-dapF
Die Plasmide pEC-XT99A (Beispiel 3) und pEC-XT99A-dapF (Beispiel 4) wurden mit der Elektroporationsmethode (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53:299–303) in den Stamm DSM5715 eingeschleust.
Die mit Hilfe der Elektroporation erhaltenen Transformanten wurden auf Selektionsagar (LBHIS Agar (18,5 g/L Brain-Heart-Infusion-Bouillon, 0,5 M Sorbitol, 5 g/L Bacto-Trypton, 2,5 g/L Bacto-Yeast-Extract, 5 g/L NaCl, 18 g/L Bacto-Agar)) mit 15 mg/L Kanamycin isoliert. Plasmid-DNA wurde nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915–927), mit geeigneten Restriktionsendonucleasen (PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung PstI, Produkt-Nr. 27-0886-03)) geschnitten und überprüft. Die erhaltenen Stämme wurden DSM5715/pEC-XT99A und DSM5715/pEC-XT99A-dapF genannt.
6. Beispiel
Herstellung von L-Lysin
Die im 5. Beispiel hergestellten C. glutamicum Stämme DSM5715/pEC-XT99A und DSM5715/pEC-XT99A-dapF wurden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt wurde im Kulturüberstand bestimmt.

Dazu wurden die Stämme zunächst auf Agarplatten (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/L)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII (Bacto-Pepton 10 g/L, Bacto-Yeast-Extract 10 g/L, NaCl 5 g/L, pH 7,4 (Eggeling et al., 1987, Applied Microbiology and Biotechnology, 25: 346–351) verwendet. Es wurde Tetracyclin (5 mg/L) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 24 Stunden lang bei 33°C bei 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (Messwellenlänge 660 nm) der Hauptkultur 0,2 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.

Medium MM:
CSL	5 g/L
MOPS	20 g/L
Glucose	50 g/L (getrennt autoklaviert)
Salze:
(NH₄)₂SO₄)	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄* 7 H₂O	1,0 g/l
CaCl₂* 2H₂O	10 mg/l
FeSO₄* 7 H₂O	10 mg/l
MnSO₉* H₂O	5,0 mg/l

L-Leucin	0,1 g/l
Biotin	0,3 mg/l (sterilfiltriert)
Thiamin*HCl	0,2 mg/l (sterilfiltriert)
CaCO₃	25 g/l

Abkürzungen:

CSL: Maisquellwasser
MOPS: Morpholinopropansulfonsäure

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO₃ zugegeben.
Die Kultivierung erfolgte in einem 10-ml-Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Tetracyclin (5 mg/L) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80 % Luftfeuchtigkeit.
Zur Induktion der dapF-Expression wurde 1 mM IPTG (Isopropyl-thio-β-galaktosid, Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) Katalog Nummer 15529-019) zugegeben.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm und die Konzentration des gebildeten Lysins bestimmt. Zur Bestimmung der optischen Dichte (0D660) wurde ein LD 1W Digital Photometer der Firma Lange (Berlin, Deutschland) verwendet. Lysin wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Tabelle 2
SEQUENZPROTOKOLL
Folgende Figuren sind beigefügt:
1: Karte des Plasmids pEC-XT99A.
2: Karte des Plasmids pEC-XT99AdapF
Die in den Figuren verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:

Tet: Resistenzgen für Tetracyclin
dapF: dapF-Gen von C. glutamicum
oriE: Plasmidkodierter Replikationsstartpunkt von E. coli
rep: Plasmidkodierter Replikationsstartpunkt vom C. glutamicum Plasmid pGA1
per: Gen zur Kontrolle der Kopiezahl von pGA1
EcoRI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
EcoRV: Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRV
HincII: Spaltstelle des Restriktionsenzyms HincII
HindIII: Spaltstelle des Restriktionsenzyms HindIII
KpnI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms KpnI
SalI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms SalI
SmaI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms SmaI
SphI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms SphI
PvuII: Spaltstelle des Restriktionsenzyms PvuII
BamHI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms BamHI

Claims

Isoliertes Polynucleotid, umfassend eine Polynucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu wenigstens 95 identisch mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 ist, wobei das genannte Polypeptid Diaminopimelatepimeraseaktivität aufweist. b) einem Polynucleotid, das komplementär zum Polynucleotid aus a) ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare DNA ist.
Sonde oder Primer, umfassend wenigstens 20 konsekutive Nucleotide der SEQ ID Nr. 1 oder das Komplement davon.
Polynucleotid, enthalten auf Vektor pEC-XT99A-dapF, hinterlegt im C. glutamicum Stamm DSM 12968.
Polynucleotid, das DNA gemäß Anspruch 2 ist, umfassend 5.1 die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz (dapF-Gen) oder 5.2 eine Nucleotidsequenz, die der Sequenz SEQ ID Nr. 1 innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht.
Polynucleotidsequenz nach Anspruch 2, die ein Polypeptid kodiert, das aus der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 besteht.
Vektor, umfassend die Polynucleotide gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6.
Coryneforme Bakterien, die als Wirtszellen dienen, die durch die Einführung der Polynucleotide aus einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 transformiert sind.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 95 % identisch mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 ist, wobei das genannte Polypeptid Diaminopimelatepimeraseaktivität aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 9, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 identisch ist.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation coryneformer Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien verwendet werden, in denen das dapF-Gen oder Nucleotidsequenzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, die Diaminopimelatepimerase kodieren, verstärkt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien verwendet werden, in denen weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure zusätzlich verstärkt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien verwendet werden, in denen die Stoffwechselwege ausgeschaltet werden, die die Bildung von L-Lysin verringern.
Verfahren nach den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit einem Plasmidvektor transformierter Stamm verwendet wird und der Plasmidvektor die Nucleotidsequenz trägt, die das dapF-Gen kodiert.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Bakterien verwendet werden, die mit dem Plasmidvektor pEC-XT99A-dapF, hinterlegt in Corynebacterium glutamicum unter der Nummer DSM 12968, transformiert sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die coryneformen Bakterien gemäß Anspruch 8 verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig ein oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem Dihydrodipicolinatsynthase kodierenden Gen dapA, b) dem Tetradihydrodipicolinatsuccinylase kodierenden Gen dapD, c) dem Succinyldiaminopimelatdesuccinylase kodierenden Gen dapF, überexprimiert wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 11 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig ein DNA-Fragment amplifiziert wird, das S-(2-Aminoethyl)-Cystein-Resistenz vermittelt.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 18, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: a) Fermentation der L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, in denen das dapF-Gen amplifiziert wird; b) Konzentration von L-Lysin im Medium oder in den Zellen der Bakterien und c) Isolierung des L-Lysins.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass coryneforme Bakterien verwendet werden, in denen die intrazelluläre Aktivität der Diaminopimelatepimerase erhöht wird, deren Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 dargelegt ist.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass coryneforme Bakterien verwendet werden, in denen die intrazelluläre Aktivität einer Diaminopimelatepimerase angehoben wird durch Erhöhen der Kopiezahl der DNA-Sequenzen, die das genannte Enzym gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1, 5 oder 6 kodieren, Verwenden eines starken Promotors, oder eine Kombination davon.