DE60115913T2

DE60115913T2 - Nukleotid sequenzen kodierend für das csta gen aus corynebacterium glutamicum

Info

Publication number: DE60115913T2
Application number: DE60115913T
Authority: DE
Inventors: Bettina Möckel; Achim Marx; Walter Pfefferle; Mike Farwick; Thomas Hermann
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-08-26
Filing date: 2001-07-25
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2021-07-26
Also published as: ATE312924T1; US20050266534A1; DE10042051A1; EP1311683A1; AU2001282022A1; EP1311683B1; ES2254463T3; US20020137912A1; US6972190B2; WO2002018597A1; DE60115913D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung sind Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien bereit, die für das cstA-Gen codieren sowie ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung der Bakterien, in denen das cstA-Gen überexprimiert ist.
STAND DER TECHNIK
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der re kombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Werden im Folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Wenn im Folgenden Lysin oder L-Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze, wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat, gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das cstA-Gen codierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu wenigstens 91 % mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID No. 2 identisch ist,
wobei das Polypeptid die Aktivität des Kohlenstoff mangelproteins A aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:

(i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
(ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
(iii) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und wahlweise
(iv) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).

Weitere Gegenstände sind
ein Polynukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID No. 2 umfasst;
ein Vektor, enthaltend das erfindungsgemäße Polynukleotid, insbesondere einen Shuttle-Vektor oder Plasmidvektor, und
als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das cstA-Gen überexprimiert ist.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im Wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemäßen Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz erhältlich sind.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:

a) Fermentation der coryneformen Bakterien, die das gewünschte L-Lysin produzieren, wobei diese zusätzlichen Desoxyribonukleinsäuren des cstA-Gens, umfassend eine für ein Protein, das mindestens zu 91 % mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 identisch ist und bei dem es sich um ein Kohlenstoffmangelprotein A handelt, codierende Nukleinsäuresequenz oder worin dafür codierende Nukleotidsequenzen überexprimiert werden;
b) Anreichung des L-Lysins im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
c) Isolierung des L-Lysins.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäße Polynukleotidsequenzen sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene, die für das Kohlenstoffmangelprotein A codieren, in voller Länge zu isolieren oder um solche Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des cstA-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum Einbau in so genannte "Arrays", "Mikroarrays" oder "DNA-Chips" geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide zu detektieren und zu bestimmen.
Erfindungsgemäße Polynukleotidsequenzen sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für das Kohlenstoffmangelprotein A codieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide umfassen mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinander folgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide schließen ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens 70 % bis 80 %, vorzugsweise zu wenigstens 81 % bis 85 %, besonders bevorzugt zu wenigstens 86 % bis 90 % und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91 %, 93 %, 95 %, 97 % oder 99 % identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder einem daraus hergestellten Fragment.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren umfassen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität des Kohlenstoffmangelproteins A und auch solche ein, die zu wenigstens 70 % bis 80 %, vorzugsweise zu wenigstens 81 % bis 85 %, besonders bevorzugt zu wenigstens 91 %, 93 %, 95 %, 97 % oder 99 % identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits Aminosäuren produzieren, und in denen die für das cstA-Gen codierenden Nukleotidsequenzen überexprimiert, insbesondere überexprimiert werden.
Der Begriff "Überexpression" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechenden DNA codiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens oder der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um mindestens 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500 %, maximal bis 1000 % oder 2000 % bezogen auf die des Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten oder Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Den Erfindern gelang es, das neue, für das Kohlenstoffmangelprotein A codierende cstA-Gen von C. glutamicum zu isolieren.
Zur Isolierung des cstA-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes and Clones, An introduction to Genetic Engineering] (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli-K-12-Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E. coli-K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326 (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291–298).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)) untersucht werden.
Auf diese Weise wurde die für das cstA-Gen codierende neue DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des cstA-Genproduktes dargestellt.
Codierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche, wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70 % identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst oder bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Großbritannien, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50–68 °C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70 % Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von etwa 50–68 °C eingestellt wird.
Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration auf 0,1x SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2 °C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70 % oder mindestens 80 % oder mindestens 90 % bis 95 % Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalognr. 1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Großbritannien, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es hat sich herausgestellt, dass coryneforme Bakterien nach Ausschaltung des cstA-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Lysin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukts können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869, im US-Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der Japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Das erfindungsgemäße cstA-Gen wurde beispielhaft mit Hilfe von episomalen Plasmiden überexprimiert. Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Lettern 66, 119–124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) zur Duplikation oder Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5,487,993), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337–342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zum cstA-Gen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren.
So kann beispielsweise für die Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

• dem für Dihydrodipicolinat-Synthase codierenden Gen dapA (EP-B-0 197 335),
• dem für Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6075–6086),
• dem für Triosephosphat-Isomerase codierenden Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6075–6086),
• dem für Phosphoglycerat-Kinase codierenden Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6075–6086),
• dem für Pyruvat-Carboxylase codierenden Gen pyc (Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)),
• dem für eine Feedback-resistente Aspartatkinase codierenden Gen lysC (Zugriffsnummer P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759),
• dem für den Lysin-Export codierenden Gen LysE (DE-A-19 548 222),
• dem für das Zwa1-Protein codierendem Gen zwa1 ( DE 19959328.0 , DSM 13115)

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des cstA-Gens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

• dem für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierenden Gen pck ( DE 19950409.1 , DSM 13047),
• dem für Glucose-6-Phosphat-Isomerase codierenden Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
• dem für Pyruvatoxidase codierenden Gen poxB ( DE 1995 1975.7 , DSM 13114),
• dem für das Zwa2-Protein codierenden Gen zwa2 ( DE 19959327.2 , DSM 13113)

Der Begriff "Ausschaltung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität codiert oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch Ausschaltungsmaßnahmen wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf 0 bis 50 %, 0 bis 25 %, 0 bis 10 % oder 0 bis 5 % Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins gesenkt.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Überexpression des cstA-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Micro bial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vartek (Hrsg.), Academic Press, London, Großbritannien, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im Fed-Batch- (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie zum Beispiel Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Soja bohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Ausgangsstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 °C bis 45 °C und vorzugsweise bei 25 °C bis 40 °C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von Lysin kann durch Ionenaustauschchroma tographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminsäuren, insbesondere L-Lysin.
Folgende Mikroorganismen wurden als Reinkulturen bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

• C. glutamicum-Stamm DSM 5715/pEC-K18mob2 am 20. Januar 2000 als DSM 13245,
• Escherichia coli DH5alphamcr/pEC-K18mob2cstAexp am 22. August 2000 als DSM 13671.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien, wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben, isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Codenr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp-alkalischer-Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Codenr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160–2164), bezogen von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Codenr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Codenr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit Shrimpalkalischer-Phosphatase dephosphoryliert.
Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Codenr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Codenr.27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Codenr. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli-Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titrierung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des Gens cstA
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produktnr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produktnr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp-alkalischer-Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produktnr. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produktnr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produktnr. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produktnr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA- Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli-Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87: 4645–4549) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123:343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 50 mg/t Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produktnr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produktnr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29:1) (Produktnr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Rohsequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version 97- 0 verarbeitet. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützten Codierbereichsanalysen wurden mit dem Pragramm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 2316 Basenpaaren, welches als cstA-Gen bezeichnet wurde. Das cstA-Gen codiert für ein Protein von 772 Aminosäuren (siehe SEQ ID No. 2).
Der stromaufwärts von SEQ ID No. 1 gelegene DNA-Abschnitt wurde auf die gleiche Weise identifiziert und ist als SEQ ID No. 3 gezeigt. Die um SEQ ID No. 3 verlängerte Region des Gens cstA ist als SEQ ID No. 4 gezeigt.
Beispiel 3
Herstellung eines Shuttle-Vektors pEC-K18mob2cstAexp für die Überexpression des Gens cstA in C. glutamicum
3.1 Klonierung des cstA-Gens
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Auf der Grundlage der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des cstA-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt (siehe SEQ ID No. 7 und SEQ ID No. 8):
cstA-exp1:
5' CAC CCT ACT GAA CAG CTT GG 3'
cstA-exp2:
5' CAG TGC ATG AGT AAG AGC CA 3'
Die dargestellten Primer wurden von ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR Protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase von Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines etwa 2.7 bp großen DNA-Fragments, welches das cstA-Gen einschließlich der potenziellen Promotor-Region trägt. Die DNA-Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments wurde durch Sequenzieren geprüft.
3.2 Herstellung des E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektors pEC-K18mob2
Nach dem Stand der Technik wurde E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor konstruiert. Der Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1, einschließlich des Replikationseffektors per (US-A 5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), das Kanamycinresistenz verleihende aph(3')-IIa-Gen des Transposons Tn5 (Beck et al., Gene 19, 327–336 (1982)), die Replikationsregion oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77–90 (1979)), das lacZα-Genfragment, einschließlich des lac-Promotors und einer Mehrfachklonierschnittstelle (mcs) (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101–106 (1983)) und die mob-Region des Plasmids RP4 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784–791 (1983)). Das Vektorkonstrukt wurde in den E. coli-Stamm DHSα (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmid tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mithilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit von Qiagen isoliert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII mit anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8 %) überprüft. Das Plasmid wurde pEC-K18mob2 genannt und ist in 1 dargestellt.
3.3 Klonieren von cstA in den E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-K18mob2
Als Vektor wurde der in Beispiel 3.2 beschriebene E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor verwendet. DNA dieses Plasmids wurde mit dem Restriktionsenzym Ecl136II vollständig gespalten und anschließend mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produktnr. 1758250) dephosphoryliert.
Das wie in Beispiel 3.1 beschrieben erhaltene cstA-Fragment wurde mit dem hergestellten Vektor pEC-K18mob2 gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Codenr.27-0870-04) behandelt. Der Ligationsansatz wurde in den E. coli-Stamm DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645–4649) transformiert. Die Selektion von Plasmid tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 25 mg/l Kanamycin. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produktnr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI gespalten, um das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Das erhaltene Plasmid wurde pEC-K18mob2cstAexp genannt. Es ist in 2 dargestellt.
Beispiel 4
Transformation des Stammes DSM5715 mit dem Plasmid pEC-K18mob2cstAexp
Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pEC-K18mob2cstAexp unter Verwendung des bei Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsverfahren transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, umfassend 18,5 g/l Hirn-Herz-Bouillon, 0,5 M Ssorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation wurde 2 Tage lang bei 33 °C durchgeführt.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante nach den üb lichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915–927), mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und XbaI gespalten und das Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Der erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-K18mob2cstAexp genannt.
Beispiel 5
Herstellung von Lysin
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum-Stamm DSM5715/pEC-K18mob2cstAexp wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l) 24 Stunden lang bei 33 °C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100-ml-Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet.

Medium Cg III

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (getrennt autoklaviert) 2 Gew./Vol.-%
Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestellt

Dazu wurde Kanamycin (25 mg/l) gegeben. Die Vorkultur wurde 16 Stunden lang bei 33 °C bei 240 Umdr./min auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, sodass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,05 betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.

	Medium MM
CSL (Maisquellwasser)	5 g/l
MOPS (Morpholinpropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert)	50 g/l
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7 H₂O	1,0 g/1
CaCl₂·2 H₂O	10 mg/l
FeSO₄·7 H₂O	10 mg/l
MnSO₄·H₂O	5,0 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/l
Thiamin·HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
L-Leucin (sterilfiltriert)	0,1 g/l
CaCO₃	25 g/l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt sowie das trocken autoklavierte CaCO₃ zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgt in einem 10-ml-Volumen in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Kanamycin (25 mg/l) wurde zugegeben. Die Kultivierung erfolgte bei 33 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
Die Ergebnisse des Versuchs gehen aus Tabelle 1 hervor. Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
1 ist eine Karte des Plasmids pEC-K18mob2; und
2 ist eine Karte des Plasmids pEC-K18mob2cstAexp.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:

Kan:: Kanamycin-Resistenzgen
cstA-exp:: cstA-Gen von C. glutamicum
LacZ-alpha:: lacZα-Genfragment von E. coli
LacZ-alpha':: 5'-Ende des lacZα-Genfragments
'LacZ-alpha:: 3'-Ende des lacZα-Genfragments
per:: Gen zur Steuerung der Kopienzahl von PGA1
oriV:: ColE1-ähnlicher Ursprung von pMB1
rep:: Plasmid-codierte Replikationsregion des C. glutamicum-Plasmids pGA1
RP4mob:: RP4-Mobilisierungsstelle
EcoRI:: Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII:: Spaltstelle des Restriktionsenzyms HindIII
Ecl136:II:: Spaltstelle des Restriktionsenzyms Ecl136II
XbaI:: Spaltstelle des Restriktionsenzyms XbaI

Claims

Shuttle-Vektor Escherichia coli DH5alphamcr/pEC-K18mob2cstAexp, hinterlegt unter DSM 13671 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a) Fermentation der coryneformen Bakterien, die das gewünschte L-Lysin produzieren, wobei diese zusätzliche Desoxyribonukleinsäuren des cstA-Gens, umfassend eine für ein Protein, das mindestens zu 91% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 identisch ist und bei dem es sich um ein Kohlenstoffmangelprotein A handelt, codierende Nukleinsäuresequenz, aufweisen oder worin dafür codierende Nukleotidsequenzen überexprimiert werden; b) Anreicherung des L-Lysins im Medium oder in den Zellen der Bakterien und c) Isolierung des L-Lysins.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Protein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der Nukleotide 200 bis 2515 der SEQ ID NO: 1 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Bakterien, in denen zusätzlich weitere Gene des Biosynthesewegs des L-Lysins überexprimiert werden, eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein mit einem Plasmidvektor transformierter Stamm eingesetzt wird und der Plasmidvektor die für das cstA-Gen codierende Nukleotidsequenz trägt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Expression des für das cstA-Gen codierenden Polynukleotids erhöht wird, so daß die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins um mindestens 10% erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei zur Herstellung von L-Lysin coryneforme Bakterien fermentiert werden, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem für eine Feedback-resistente Aspartatkinase codierenden Gen lysC, b) dem für Dihydrodipicolinat-Synthase codierenden Gen dapA, c) dem für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen gap, d) dem für 3-Phosphoglycerat-Kinase codierenden Gen pgk, e) dem für Pyruvat-Carboxylase codierenden Gen pyc, f) dem für Triosephosphat-Isomerase codierenden Gen tpi, g) dem für ein Protein des Lysin-Exports codierenden Gen lysE und h) dem für das Protein Zwa1 codierenden Gen zwa1, überexprimiert wird oder werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei zur Herstellung von L-Lysin coryneforme Bakterien fermentiert werden, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierenden Gen pck, b) dem für Glucose-6-phosphst-Isomerase codierenden Gen pgi, c) dem für Pyruvatoxidase codierenden Gen poxB, d) dem für das Protein Zwa2 codierenden Gen zwa2, ausgeschaltet ist oder sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei Mikroorganismen der Spezies Corynebacterium glutamicum eingesetzt werden.