DE60120724T2

DE60120724T2 - Rekombinante coryneformbakterie die glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase -2 überexprimieren , und verfahren zur herstellung von l-lysine

Info

Publication number: DE60120724T2
Application number: DE60120724T
Authority: DE
Inventors: Brigitte Bathe; Stephan Hans; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-09-09
Filing date: 2001-08-24
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-08-25
Also published as: DE60120724D1; DE10136985A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bietet Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien, die für das gap2-Gen codieren und ein Verfahren für die fermentative Herstellung von Aminosäuren unter Anwendung von Bakterien, wobei das endogene gap2-Gen verstärkt wird.
STAND DER TECHNIK
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, werden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und insbesondere bei der Tierernährung verwendet.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentieren aus Stämmen von coryneformen Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Aufgrund ihrer großen Bedeutung werden ständig Arbeiten zum Verbessern der Herstellungsverfahren durchgeführt. Verbesserungen des Verfahrens können Fermentationsmaßnahmen, wie beispielsweise Rühren und Einspeisen von Sauerstoff, oder die Zusammensetzung des Nährstoffmediums, wie beispielsweise die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder das Aufarbeiten zur Produktform beispielsweise durch Ionenaustauschchromatografie oder die intrinsischen Ausstoßeigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Verfahren zur Mutagenese, Selektion und Mutantenselektion werden zum Verbessern der Ausstoßeigenschaften dieser Mikroorganismen angewendet. Stämme, die gegen Antimetaboliten widerstandsfähig oder für Metaboliten auxotroph sind, die eine Bedeutung bezüglich der Regulation aufweisen und Aminosäuren bilden, werden auf diese Weise erhalten.
Verfahren zur rekombinanten DNA-Technik werden ebenfalls schon seit einigen Jahren zum Verbessern der Stämme von Corynebacterium-Stämmen, die L-Aminosäuren bilden, durch Amplifizieren einzelner Aminosäurebiosynthesegene und Untersuchen der Wirkung auf die Aminosäureherstellung verwendet.
In EP 0 806 480 A2 ist ein Streptomyces frenolicin-Gencluster offenbart, das Enzyme codiert, die die Biosynthese von Frenocilius in prokaryotischen Zellen katalysiert.
Gencluster umfassen ein Gen mit einer starken Ähnlichkeit mit denjenigen, die Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus einer Reihe von Organismen codieren.
Die Datenbase Trembl [Online] 1. August 1988 (1988-08-01) Reeves et al. offenbart ein Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Homologon von Streptomyces roseofulvus.
WO 01/00844 A und EP 1 108 790 A1 offenbaren Sequenzen neuer Polynukleotide von Corynebacterium glutamicum, bieten jedoch keine technischen Merkmale außer einer vagen Angabe, dass derartige Nukleinsäuremoleküle für eine Reihe allgemeiner Zwecke angewendet werden können.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Die Erfinder hatten die Aufgabe, neue Maßnahmen zum Verbessern der fermentativen Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Wo L-Aminosäuren oder Aminosäuren im Folgenden erwähnt werden, bedeutet dies eine oder mehrere Aminosäuren, einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenyla lanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin. L-Lysin wird besonders bevorzugt.
Wo L-Lysin oder Lysin im Folgenden erwähnt werden, bedeutet dies nicht nur die Basen sondern auch die Salze, wie beispielsweise Lysinmonohydrochlorid oder Lysinsulfat.
Die Erfindung offenbart ein isoliertes Polynukleotid von coryneformen Bakterien umfassend eine Polynukleotidsequenz, die für das gap2-Gen codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus:

a) Polynukleotid, das in einem Ausmaß von mindestens 70% mit einem Polynukleotid identisch ist, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2 umfasst,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einem Ausmaß von mindestens 70% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2 identisch ist,
c) Polynukleotid, das den Polynukleotiden von a) oder b) komplementär ist und
d) Polynukleotid umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),

Die Erfindung offenbart auch das oben erwähnte Polynukleotid, wobei dies bevorzugt eine DNA ist, die der Replikation fähig ist, umfassend:

(i) die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID No: 1 gezeigt ist oder
(ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Degenerationsbereichs der genetischen Code entspricht, oder
(iii) mindestens eine Sequenz, die mit der Sequenz hybridisiert, die der Sequenz (i) oder (ii) komplementär ist und wahlweise
(iv) Sensemutationen neutraler Funktion in (i).

Die Erfindung offenbart auch
ein Polynukleotid, insbesondere DNA, das der Replikation fähig ist und die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No: 1 gezeigt, umfasst;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID No: 2 gezeigt, umfasst;
einen Vektor, der das erfindungsgemäße Polynukleotid enthält, insbesondere einen Shuttle-Vektor oder Plasmidvektor und
coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten, oder in denen das endogene gap2-Gen verstärkt ist.
Die Erfindung offenbart auch Polynukleotide, die im Wesentlichen eine Polynukleotidsequenz umfassen, die durch Screenen durch Hybridisierung einer entsprechenden Genbibliothek eines coryneformen Bakteriums erhältlich sind, das das vollständige Gen oder Teile desselben umfasst, mit einer Sonde, die die Sequenz der erfindungsgemäßen Polynukleotide SEQ ID No: 1 entsprechend oder ein Fragment derselben umfasst, und Isolieren der erwähnten Polynukleotidsequenz.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Polynukleotide, die die erfindungsgemäßen Sequenzen umfassen, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA offenbart, um Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene, die für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 2 codieren, in voller Länge zu isolieren oder diejenigen Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine starke Sequenzähnlichkeit mit derjenigen des gap2-Gens aufweisen. Sie sind auch zum Einbauen in sogenannte „Anordnungen", „Mikroanordnungen" oder „DNA-Chips" offenbart, um die entsprechenden Polynukleotide zu erfassen und zu bestimmen.
Polynukleotide, die die erfindungsgemäßen Sequenzen umfassen, sind des Weiteren als Primer offenbart, mit Hilfe derer die DNA von Genen, die für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 2 codieren, durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden können.
Derartige Oligonukleotide, die als Sonden oder Primer dienen, umfassen mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23, oder 24, insbesondere bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinanderfolgende Nukleotide. Oligonukleotide, die Längen von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden aufweisen, sind ebenfalls nützlich. Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden sind wahlweise ebenfalls geeignet.
„Isoliert" bedeutet von ihrer natürlichen Umgebung getrennt.
„Polynukleotid" betrifft im Allgemeinen Polyribonukleotide und Polydesoxyribonukleotide, wobei es möglich ist, dass diese aus nicht-modifizierter RNA oder DNA oder modifizierter RNA und DNA bestehen.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen ein SEQ ID No: 1 entsprechendes Polynukleotid oder daraus hergestelltes Fragment und auch diejenigen, die zu mindestens insbesondere 70% bis 80%, bevorzugt mindestens 81% bis 85%, besonders bevorzugt mindestens 86% bis 90% und äußerst bevorzugt mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% mit dem SEQ ID No: 1 entsprechenden Polynukleotid oder einem daraus hergestellten Fragment identisch sind.
„Polypeptide" sind so zu verstehen, dass damit Peptide oder Proteine gemeint sind, die Aminosäuren umfassen, die durch zwei oder mehr Peptidbindungen gebunden sind.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, insbesondere diejenigen mit der biologischen Aktivität von Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 2 und auch diejenigen, die mindestens zu 70% bis 80%, bevorzugt mindestens 81% bis 85%, besonders bevorzugt mindestens 86% bis 90% und sehr spezifisch bevorzugt mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% mit dem Polypeptid SEQ ID No: 2 gemäß identisch sind und die oben erwähnte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum fermentativen Herstellen von Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin unter Anwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere schon Aminosäuren bilden und in denen die Nukleotidsequenz, die für das gap2-Gen codieren, verstärkt, insbesondere überexprimiert sind.
Der Begriff „Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert sind, beispielsweise durch Erhöhen der Anzahl von Kopien des Gens oder der Gene unter Anwendung eines potenten Promotors oder unter Anwendung eines Gens, das für ein entsprechendes Enzym codiert, das eine hohe Aktivität aufweist, und wahlweise Kombinieren dieser Maßnahmen.
Durch Verbesserungsmaßnahmen, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500% bis zu maximal 1000% oder 2000%, auf diejenige des Proteins vom Wildtyp oder die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus bezogen, erhöht.
Die Mikroorganismen, die die vorliegende Erfindung bereitstellt, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol bilden. Sie können für coryneforme Bakterien, insbesondere die Gattung Corynebacterium, repräsentativ sein. Von der Gattung Corynebacterium kann insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum erwähnt werden, die unter Fachleuten für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu bilden.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacteriu glutamicum (C. glutamicum), sind insbesondere die bekannten Stämme vom Wildtyp
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und L-Aminosäure bildende Mutanten oder Stämme, die daraus hergestellt werden.
Das neue gap2-Gen von C. glutamicum, das für das Enzym Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 2 (EC 1.2.1.12) codiert, ist isoliert worden.
Um das gap2-Gen oder auch andere Gene von C. glutamicum zu isolieren, wird zuerst eine Genbibliothek dieses Mikroorganismuses in Escherichia coli (E. coli) erstellt. Das Erstellen von Genbibliotheken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern beschrieben. Das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) können als Beispiel erwähnt werden. Eine allgemein bekannte Genbibliothek ist diejenige des E. coli K-12-Stamms W3110, das in λ-Vektoren von Kohara et al. erstellt worden ist (Cell 50, 495–508 (1987)). Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreibt eine Genbibliothek von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmid-Vektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84: 2160–2164) im E. coli K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) erstellt worden ist.
Bormann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326 (1992)) beschreiben wiederum eine Genbibliothek von C. glutamicum RTCC13032 bei der das Cosmid pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)) angewendet worden ist.
Um eine Genbibliothek von C. glutamicum in E. coli herzustellen, ist es auch möglich, Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) zu verwenden. Geeignete Wirte sind insbesondere diejenigen E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefektiv sind. Ein Beispiel dieser ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. beschrieben worden ist (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649). Die langen DNA-Fragmente, die mit Hilfe von Cosmiden kloniert werden, können wiederum in den gewöhnlichen Vektoren subkloniert werden, die für das Sequenzieren geeignet sind, und daraufhin wie z.B. von Sanger et al. beschrieben (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) sequenziert werden.
Die neue DNA-Sequenz von C. glutamicum, die für das gap2-Gen codiert und die als SEQ ID No: 1 ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist, ist gefunden worden. Die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins ist des Weiteren von der vorliegenden DNA-Sequenz durch die oben beschriebenen Verfahren deriviert worden. Die so erhaltene Aminosäuresequenz des gap2-Genprodukts ist in SEQ ID No: 2 gezeigt. Es ist bekannt, dass Enzyme, die dem Wirt endogen sind, das N-terminale Aminosäuremethionin oder -formylmethionin des gebildeten Proteins abspalten können.
Codierende DNA-Sequenzen, die aus SEQ ID No: 1 durch die Degeneration der genetischen Code gebildet werden, sind ebenfalls ein Bestandteil der Erfindung. Auf die gleiche Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No: 1 oder Teilen von SEQ ID No: 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. Konservative Aminosäureaustausche, wie beispielsweise der Austausch von Glycin für Alanin oder von Asparaginsäure für Glutaminsäure in Proteinen sind des Weiteren unter Fachleuten als „Sensemutationen" bekannt, die nicht zu einer grundsätzlichen Änderung der Aktivität des Proteins führen, d.h. neutraler Funktion sind. Derartige Mutationen werden auch unter anderem neutrale Substitutionen genannt. Es ist des Weiteren bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins die Funktion desselben nicht wesentlich beeinträchtigen oder dieses sogar stabilisieren können. Angaben in dieser Beziehung können vom Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie gefunden werden. Aminosäuresequenzen, die auf entsprechende Weise aus SEQ ID No: 2 gebildet werden, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Auf die gleiche Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No: 1 oder Teilen von SEQ ID No: 1 hybridisieren, ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Anwendung von Primern, die aus SEQ ID No: 1 gebildet werden, hergestellt werden, ein Bestandteil der Erfindung. Typischerweise besitzen derartige Oligonukleotide eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anweisungen zum Identifizieren von DNA-Sequenzen durch Hybridisierung können vom Fachmann unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization (Der Führer für Anwender des DIG-Systems für die Filterhybridisierung)" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260) gefunden werden. Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt es werden nur Hybride gebildet, bei denen die Sonde und die Zielsequenzen, d.h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, zu mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung, einschließlich der Waschschritte, durch Ändern der Pufferzusammensetzung, Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst oder bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird bevorzugt unter relativ geringer Stringenz im Vergleich mit den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide (Hybaid-Hybridisierungsführer), Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Ein 5 × SSC-Puffer kann beispielsweise bei einer Temperatur von 50–68°C für die Hybridisierungsreaktion verwendet werden. Sonden können auch hier mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als zu 70% mit der Sequenz der Sonde identisch sind. Derartige Hybride sind weniger beständig und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies lässt sich beispielsweise durch Reduzieren der Salzkonzentration auf 2 × SSC und wahlweise daraufhin auf 0,5 × SSC („The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation (Führer für den Anwender des DIG-Systems für Filterhybridisierung)", Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland, 1995) erreichen, wobei eine Temperatur von etwa 50–68°C eingestellt wird. Es ist wahlweise auch möglich, die Salzkonzentration auf 0,1 × SSC zu reduzieren. Polynukleotidfragmente, die beispielsweise zu mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% mit der Sequenz der angewendeten Probe identisch sind, können durch Erhöhen der Hybridisierungstemperatur schrittweise von 50 auf 68°C in Schritten von etwa 1–2°C isoliert werden. Weitere Anweisungen zur Hybridisierung sind auf dem Markt in Form sogenannter Kits (z.B. DIG Easy Hyb von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalog-Nr. 1603558) erhältlich.
Anweisungen zur Amplifizierung von DNA-Sequenzen durch Polymerasekettenreaktion (PCR) kann der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Oligonukleotid synthese: ein praktischer Ansatz) (IRL Press, Oxford, Großbritannien, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) finden.
Es hat sich erwiesen, dass coryneforme Bakterien Aminosäuren auf verbesserte Art und Weise nach dem Überexprimieren des gap2-Gens bilden.
Um eine Überexpression zu erreichen, kann die Anzahl von Kopien der entsprechenden Gene erhöht werden, oder der Promotor und die Regulationsregion oder die Ribosombindungsstelle stromaufwärts vom strukturellen Gen können mutiert werden. Expressionskassetten, die stromaufwärts vom strukturellen Gen eingearbeitet werden, wirken auf die gleiche Weise. Durch induzierbare Promotoren ist es außerdem möglich, die Expression im Laufe einer fermentativen Aminosäureherstellung zu erhöhen. Die Expression wird desgleichen durch Maßnahmen zum Verlängern der Lebensdauer der m-RNA verbessert. Des Weiteren wird die Enzymaktivität auch durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins erhöht. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit einer veränderlichen Anzahl von Kopien vorliegen, oder sie können in das Chromosom integriert und amplifiziert werden. Als Alternative kann eine Überexpression der in Frage kommenden Gene des Weiteren durch Ändern der Zusammensetzung des Mediums und des Kulturvorgangs erreicht werden.
Anweisungen in dieser Beziehung können vom Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentbeschreibung 0 472 869, in der US-Patentschrift 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126– 132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der offengelegten Japanischen Patentbeschreibung JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie gefunden werden.
Als Beispiel wurde für die Verstärkung das erfindungsgemäße gap2-Gen mit Hilfe episomaler Plasmide überexprimiert. Geeignete Plasmide sind diejenigen, die sich in coryneformen Bakterien replizieren. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie beispielsweise pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) basieren auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie beispielsweise diejenigen auf der Basis von pCG4 (US-A 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158,891), können auf die gleiche Weise verwendet werden.
Plasmidvektoren, die des Weiteren geeignet sind, sind diejenigen, mit Hilfe derer das Verfahren der Genamplifikation durch Integrieren in Chromosomen, wie beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) beschrieben worden ist, zur Duplikation oder Amplifikation des hom-thrB-Operons verwendet werden kann. Bei diesem Verfahren wird das vollständige Gen in einem Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), aber nicht in C. glutamicum repliziert werden kann. Mögliche Vektoren sind beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84; US-A 5,487,993), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337–342). Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird dann in den erwünschten Stamm von C. glutamicum durch Konjugation oder Transformation übertragen. Das Konjugationsverfahren ist beispielsweise von Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben worden. Transformationsverfahren sind beispielsweise von Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben worden. Nach der homologen Rekombination durch ein „Überkreuzungs"-Ereignis enthält der dabei gebildete Stamm mindestens zwei Kopien des in Frage kommenden Gens. Außerdem kann es für die Herstellung von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, ein oder mehrere Enzyme des spezifischen biosynthetischen Wegs der Glycolyse, Anaplerose, des Zitronensäurezyklus, des Pentosephosphatzyklus, des Aminosäureexports und wahlweise von Regulationsproteinen zusätzlich zum gap2-Gen zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
So können beispielsweise für die Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich zum Verstärken des gap2-Gens ein oder mehrere endogene Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem dapA-Gen, das für die Dihydrodipicolinat-Synthase codiert (EP-B 0 197 335),
• dem gap-Gen, das für die Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase codiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• dem tpi-Gen, das für die Triosephosphat-Isomerase codiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• dem pgk-Gen, das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase codiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• dem zwf-Gen, das für die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codiert (JP-A-09224661),
• dem pyc-Gen, das für die Pyruvat-Carboxylase codiert (DE-A 198 31 609),
• dem mqo-Gen, das für Malat:chinon-Oxidoreductase codiert (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
• dem lysC-Gen, das für eine gegen Feedback resistente Aspartatkinase codiert (Zugangs-Nr. P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759),
• dem lysE-Gen, das für Lysinexport codiert (DE-A-195 48 222),
• dem hom-Gen, das für Homoserin-Dehydrogenase codiert (EP-A 0131171),
• dem ilvA-Gen, das für die Threonin-Deydratase codiert (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065–8072) oder dem ilvA(Fbr)-Allel, das für eine gegen Feedback resistente Threonin-Dehydratase codiert (Möckel et al. (1994), Molecular Microbiology 13: 833–842),
• dem ilvBN-Gen, das für die Acetohydroxysäure-Synthase codiert (EP-B 0356739),
• dem ilvD-Gen, das für die Dihydroxysäure-Dehydratase codiert (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973–1979),
• dem zwal-Gen, das für das Zwalprotein codiert ( DE: 19959328.0 , DSM 13115)
• verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Es kann des Weiteren für die Herstellung von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, dass zusätzlich zum Verstärken des gap2-Gens ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem pck-Gen, das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codiert ( DE 199 50 409.1 ; DSM 13047),
• dem pgi-Gen, das für die Glucose-6-phosphat-Isomerase codiert (US 09/396,478; DSM 12969),
• dem poxB-Gen, das für die Pyruvat-Oxidase codiert ( DE: 1995 1975.7 ; DSM 13114),
• dem zwa2-Gen, das für das Zwa2-Protein codiert ( DE: 19959327.2 , DSM 13113)

Der Ausdruck „Schwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Reduzierung oder Eliminierung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, beispielsweise durch Anwendung eines schwachen Promotors oder Anwendung eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzym mit geringer Aktivität codiert oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein), inaktiviert, und wahlweise Kombinieren dieser Maßnahmen.
Durch Abschwächungsmaßnahmen wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Proteins vom Wildtyp oder die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus reduziert.
Zusätzlich zur Überexpression des gap2-Gens kann es für die Herstellung von Aminosäuren außerdem vorteilhaft sein, unerwünschte Nebenreakionen zu eliminieren (Nakayama: „Breeding of Aminoacid Producing Micro-organisms (Züchten von Aminosäure bildenden Mikroorganismen)" in: Overproduction of Microbial Products (Überproduktion von mikrobiellen Produkten), Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Verfasser), Academic Press, London, Großbritannien, 1982).
Die Erfindung bietet auch die Mikroorganismen, die erfindungsgemäß hergestellt werden, und diese können kontinuierlich oder chargenweise im Chargenverfahren (chargenweise Kultur) oder im Speisechargen(Speisungs-) Verfahren oder wiederholten Speisechargenverfahren (wiederholtes Einspeisungsverfahren) zum Zweck der Bildung von Aminosäuren gezüchtet werden. Eine Zusammenfassung bekannter Züchtungsverfahren ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1984)) oder in dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss den Erfordernissen der spezifischen Stämme auf geeignete Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien für ver schiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology (Handbuch der Verfahren für die allgemeine Bakteriologie)" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) beschrieben.
Zucker und Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie beispielsweise Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosnussfett, Fettsäuren, wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie beispielsweise Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, können als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, können als Stickstoffquelle verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze können als Phosphorquelle verwendet werden. Das Kulturmedium muss des Weiteren Salze von Metallen wie beispielsweise Magnesiumsulfat oder Eisensulfat umfassen, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen, wie beispielsweise Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den oben erwähnten Substanzen verwendet werden. Geeignete Vorläufer können des Weiteren dem Kulturmedium zugegeben werden. Die erwähnten Ausgangssubstanzen können der Kultur in Form einer einzigen Charge zugegeben werden, oder sie können während des Züchtens auf geeignete Weise eingespeist werden.
Grundverbindungen wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder wässriges Ammoniak oder Säureverbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, können auf geeignete Weise zum Regulieren des pH-Werts der Kultur verwendet werden. Schaumverhinderungsmittel, wie beispielsweise Fettsäurepolyglycolester, können zum Regulieren der Schaumentwicklung verwendet werden. Geeignete Substanzen, die eine selektive Wirkung besitzen, wie beispielsweise Antibiotika, können dem Medium zum Aufrechterhalten der Beständigkeit von Plasmiden zugegeben werden. Um aerobe Bedingungen beizubehalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie beispielsweise Luft, in die Kultur eingeführt. Die Temperatur der Kultur beträgt gewöhnlich 20°C bis 45°C und bevorzugt 25°C bis 40°C. Das Züchten wird fortgeführt, bis ein Maximum des erwünschten Produkts gebildet ist. Dieses Ziel wird gewöhnlich innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Verfahren zum Bestimmen von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so beispielsweise wie von Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, durch Ionenaustauschchromatografie mit darauffolgender Ninhydrinderivation durchgeführt werden, oder sie kann durch Umkehrphasen-HPLC, wie beispielsweise von Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben, durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird für die fermentative Herstellung von Aminosäuren verwendet.
Folgende Mikroorganismen wurden als reine Kultur am 18. Juli 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) dem Budapester Vertrag gemäß hinterlegt:

• Escherichia coli DH5αmcr/pEC-K18mob2gap2exp als DSM 14407.

Die vorliegende Erfindung wird in weiteren Einzelheiten im Folgenden mit Hilfe von Beispielen der Ausführungsform erklärt.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und alle Techniken der Restriktions-, Klenow- und Alkaliphosphatasebehandlung wurden durch das Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren. Ein Laborhandbuch) (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Verfahren zum Transformieren von Escherichia coli sind im diesem Handbuch ebenfalls beschrieben.
Die Zusammensetzung der gewöhnlichen Nährmedien, wie beispielsweise LB- oder TY-Medium, ist in dem Handbuch von Sambrook et al. ebenfalls aufzufinden.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmidgenbibliothek aus Corynebacterium glutanicum ATCC 13032.
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutanicum ATCC 13032 wurde wie von Tauch et al. (1995), Plasmid 33: 168–179 beschrieben, isoliert und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Codenr. 27-0913-02) gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Garnelenphosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Codenr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmidvektors SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164), der von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vector Kit, Codenr. 251301) erhalten worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Codenr. 27-0948-02) gespalten und desgleichen mit einer alkalischen Garnelenphosphatase dephosphoryliert.
Schließlich wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Codenr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und die Charge wurde mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Codenr. 27-0870-04) behandelt. Die Ligationsmischung wurde dann mit Hilfe von Gigapack II XL Packungsextrakt (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packungsextrakt, Codenr. 200217) in Phagen gepackt.
Zum Infizieren des E. coli-Stamms NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem aliquoten Teil der Phagensuspension gemischt. Die Infektion und das Titrieren der Cosmidbibliothek wurden wie von Sambrook et al. beschrieben (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual (Molekulares Klonieren: ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor) durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach dem Inkubieren über Nacht bei 37°C wurden einzelne rekombinante Klone ausgewählt.
Beispiel 2
Isolation und Sequenzieren des gap2-Gens
Die Cosmid-DNA einer einzelnen Kolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produktnr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) den Anweisungen des Herstellers gemäß isoliert und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produktnr. 27-0913-02) gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Garnelenphosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produktnr. 1758250) dephosphoryliert. Nach dem Trennen durch Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QuiaExII Gel Extraction Kit (Produktnr. 20021, Quiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die DNA des sequenzierenden Vektors pZero-1, der von Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Nullhintergrund-Klonierkit, Produktnr. K2500-01) erhalten worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in dem sequenzierenden Vektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al beschrieben (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbour) durchgeführt, wobei die DNA-Mischung über Nacht mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) inkubiert wurde. Diese Ligationsmischung wurde dann in den E. coli-Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidherstellung der rekombinanten Klone wurde mit dem Biorobot 9600 (Produktnr 900200, Quiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Das Sequenzieren wurde durch die Didesoxykettenterminationsmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen Zimmermann et al. gemäß (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067) durchgeführt. Der „RR dRhodamin Terminator Zyklus-Sequenzierkit" von PE Applied Biosystems (Produktnr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) wurde verwendet. Die Trennung durch Gelelektrophorese und Analyse der sequenzierenden Reaktion wurden in einem „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29:1) (Produktnr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem „ABI Prisma 377"-Sequenzer von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt.
Die rohen Sequenzdaten, die erhalten wurden, wurden dann unter Anwendung der Staden-Programmpackung (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231), Version 97-0, verarbeitet. Die einzelnen Sequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem kontinuierlichen Kontig zusammengefasst. Die computerunterstützte Codierregionsanalyse wurde mit dem XNIP-Programm (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) hergestellt.
Die dabei gebildete Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No: 1 gezeigt. Die Analyse der Nukleotidsequenz zeigte ein offenes Leseraster von 1440 Basenpaaren, das gap2-Gen genannt wurde. Die gap2-Gene codieren für ein Protein von 480 Aminosäuren.
Beispiel 3
Herstellung eines Shuttlevektors pEC-K18mob2gap2exp für das Verstärkung des gap2-Gens in C. glutamicum.
3.1 Klonieren des gap2-Gens im Vektor pCR^®Blunt II
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde eine chromosomale DNA durch das Verfahren von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert. Auf der Basis der Sequenz des für C. glutamicum aus Beispiel 2 bekannten gap2-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion (man vergleiche auch SEQ ID No: 3 und SEQ ID No: 4): gap2exp1:
gap2exp2:
gewählt.
Die gezeigten Primer wurden durch ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion wurde durch das Standard-PCR-Verfahren von Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications (PCR Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase von Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion erlauben die Primer die Amplifikation eines DNA-Fragments einer Größe von 2022 bp, das das gap2-Gen mit der potentiellen Promotorregion trägt. Die DNA-Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments wurde durch Sequenzieren überprüft.
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem Zero Blunt^WZ Kit von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalognummer K2700-20) in den Vektor pCR^®Blunt II (Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) ligiert.
Der E. coli Stamm TOP10 wurde dann mit der Ligationscharge (Hanahan, In: DNA cloning. A Practical Approach (DNA-Klonieren. Ein praktischer Ansatz), Band I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Wahl von Plasmid tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren der Transformationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: ein Laborhandbuch), 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin ergänzt worden war. Plasmid-DNA wurde aus einem Transformanten mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits von Quiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und darauffolgende Agarosegelelektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCRB1-gap2exp genannt.
3.2 Herstellung des E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektors pEC-K18mob2
Der E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektor wurde dem Stand der Technik gemäß hergestellt. Der Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1, das den Replikationseffektor per (US-A-5,175,108; Nesvera et al, Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), das Kanamycinresistenz verleihende aph(3')-IIa-Gen des Transposons Tn5 (Beck et al., Gene 19, 327–336 (1982)), die Replikationsregion oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77–90, 1979)), das lacZα-Genfragment, das den lac-Promotor und eine multiple Klonierstelle enthält (mcs) (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101–106 (1983)) und die mob-Region des Plasmids RP4 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784–791 (1983)) enthält.
Der konstruierte Vektor pEC-K18mob2 wurde in C. glutamicum DSM5715 durch Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303) übertragen.
Die Auswahl der Transformanten erfolgte auf LBHIS-A umfassend 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionsboullion, 0,5 M Sorbit, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, das mit 25 mg/l Kanamycin ergänzt worden war. Die Inkubation wurde 2 Tage lang bei 33°C durchgeführt.
Plasmid-DNA wurde von einem Transformanten durch herkömmliche Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915–927) isoliert, mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII gespalten und das Plasmid wurde durch darauffolgende Agarosegelelektrophorese überprüft.
Die so erhaltene Plasmidkonstruktion wurde pEC-K18mob2 genannt und ist in 1 gezeigt. Der durch Elektroporation des Plasmids pEC-K18mob2 im C. glutamicumstamm DSM5715 erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-K18mob2 genannt und am 20. Januar 2000 als DSM13245 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) dem Budapester Vertrag gemäß hinterlegt.
3.3 Klonieren von gap2 im E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektor pEC-K18mob2
Für das Klonieren des gap2-Gens im E. coli-C. glutamicum-Shuttlevektor pEC-K18mob2, der in Beispiel 3.2 beschrieben ist, wurde Plasmid-DNA von pEC-K18mob2 vollständig mit den Restriktionsendonukleasen Ec1136II und XbaI gespalten und mit alkalischer Phosphatase (Alkalische Phosphatase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) behandelt.
Der vektor pCRB1-gap2exp wurde aus Escherichia coli Top10 isoliert und vollständig mit den Restriktionsendonukleasen Ec1136II und XbaI gespalten und das Fragment einer Größe von etwa 2120 bp mit dem gap2-Gen wurde aus einem 0,8%igen Agarosegel (QIAquick Gelextraktionskit der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt. Das Fragment mit dem gap2-Gen wurde dann mit dem Vektor pEC-K18mob2 ligiert (T4-Ligase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland). Die Ligationscharge wurde in den E. coli Stamm DH5alphamcr (Hanahan, In: DNA cloning. A Practical Approach (DNA-Klonieren. Ein praktischer Ansatz), Band I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Wahl von Plasmid tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren der Transformationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: ein Laborhandbuch), 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin ergänzt worden war. Plasmid-DNA wurde aus einem Transformanten mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits von Quiagen (Hilden, Deutschland) isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und darauffolgende Agarosegelelektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pEC-K18mob2gap2exp genannt und ist in 2 gezeigt.
Beispiel 4
Transformation des Stamms DSM5715 mit dem Plasmid pEC-K18mob2gap2exp
Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pEC-K18mob2gap2exp unter Anwendung der von Liebl et al. beschriebenen Elektroporationsmethode (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989)) transformiert. Die Auswahl der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar umfassend 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionsboullion, 0,5 M Sorbit, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin ergänzt worden war. Die Inkubation wurde 2 Tage lang bei 33°C durchgeführt.
Plasmid-DNA wurde von einem Transformanten durch herkömmliche Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915–927) isoliert, mit der Restriktionsendonuklease EcoRi gespalten und das Plasmid wurde durch darauffolgende Agarosegelelektrophorese überprüft. Der auf diese Weise erhaltene Stamm wurde DSM5715/pEC-K18mob2gap2exp genannt.
Beispiel 5
Herstellung von Lysin
Der C. glutamicum-Stamm DSM5715/pEC-K18mob2gap2exp, der in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde in einem Nährmedium gezüchtet, das für die Herstellung von Lysin geeignet war, und der Lysingehalt des Überstehenden der Kultur wurde bestimmt.
Zu diesem Zweck wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur beimpft (10 ml Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben). Das vollständige Medium CgIII wurde als Medium für die Vorkultur verwendet. Medium CgIII

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (getrennt 2% (Gew./Vol.) autoclaviert)
Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 gebracht.

Kanamycin (25 mg/l) wurde hinzugegeben. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 UpM auf einer Schüttelmaschine inkubiert. Die Hauptkultur wurde aus dieser Vorkultur so beimpft, dass die ursprüngliche OD (660 nm) der Hauptkultur 0,05 betrug. Das Medium MM wurde für die Hauptkultur verwendet. Medium MM

CSL (Maiseinweichflüssigkeit)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert)	100 g/l
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7H₂O	1,0 g/l
CaCl₂·2H₂O	10 mg/l

FeSO₄·7H₂O	10 mg/l
MnSO₄·H₂O	5,0 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/l
Thiamin·HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
L-Leucin (sterilfiltriert)	0,1 mg/l
CaCO₃	25 g/l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7 gebracht und autoklaviert. Das sterile Substrat und die Vitaminlösungen sowie das im Trockenzustand autoklavierte CaCO₃ wurden hinzugegeben.
Das Züchten wird in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Prallblechen durchgeführt. Kanamycin (25 mg/l) wurde hinzugegeben. Das Züchten wurde bei 33°C und 80% Luftfeuchtigkeit durchgeführt.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge an gebildetem Lysin wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatografie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Karte des Plasmids pEC-K18mob2
2: Karte des Plasmids pEC-K18mob2gap2exp
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:

Kan:: Resistenzgen für Kanamycin
per:: Gen für das Regulieren der Anzahl von Kopien aus PGA1
oriV:: Co1E1-ähnlicher Ursprung aus pMB1
rep:: Plasmidcodierte Replikationsregion aus C. glutamicum-Plasmid pGA1
RP4mob:: Rp4-Mobilisationsstelle
gap2:: gap2-Gen aus C. glutamicum
EcoRI:: Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII:: Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms HindIII
Ec113II:: Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms Ec1136II
XbaI:: Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms XbaI

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes coryneformes Bakterium, in dem ein für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 90% mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz identisch ist, codierendes Polynukleotid rekombinant überexprimiert wird, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase 2 aufweist und das rekombinante Bakterium L-Lysin auf verbesserte Weise im Vergleich zu dem nicht rekombinanten, L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterium produziert.
Corynebacterium gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zu 95% mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz identisch ist.
Corynebacterium gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe: a) Polynukleotid mit der wie in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz; oder b) Polynukleotide mit Nukleotidsequenzen, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 im Rahmen der Degeneriertheit des genetischen Codes entsprechen; oder c) Polynukleotide mit Nukleotidsequenzen mit neutralen Sense-Mutationen in SEQ ID NO: 1.
Corynebacterium nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, umfassend das Corynebacterium gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, bei dem man die Fermentation eines coryneformen Bakteriums durchführt, von dem man weiß, daß es zur Produktion dieser L-Aminosäure fähig ist, und in dem ein für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 90% mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz identisch ist, codierendes Polynukleotid rekombinant überexprimiert wird, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase 2 aufweist und das Bakterium auf verbesserte Weise L-Lysin produziert.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Polypeptid zu dem Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz identisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe: a) Polynukleotid mit der wie in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz; b) Polynukleotide mit Nukleotidsequenzen, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 im Rahmen der Degeneriertheit des genetischen Codes entsprechen; oder c) Polynukleotide mit Nukleotidsequenzen mit neutralen Sense-Mutationen in SEQ ID NO: 1.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 8, bei dem man a) eine Fermentation des Corynebacterium, b) eine Anreicherung von L-Lysin im Medium oder in den Zellen der Bakterien und c) eine Isolierung der L-Aminosäure durchführt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 9, wobei coryneforme Bakterien mit einem Plasmidvektor transformiert werden und der Plasmidvektor die Nukleotidsequenzen trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: a) das für die Dihydrodipicolinat-Synthase codierende dapA-Gen, b) das für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierende gap-Gen, c) das für die Triosephosphat-Isomerase codierende tpi-Gen, d) das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase codierende pgk-Gen, e) das für die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierende zwf-Gen, f) das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen, g) das für die Malat:Chinon-Oxidoreduktase codierende mqo-Gen, h) das für eine Aspartatkinase codierende lysC-Gen, i) das für ein Protein für den Lysin-Export codierende lysE-Gen, j) das für die Homoserin-Dehydrogenase codierende hom-Gen, k) das für die Threonin-Dehydratase codierende ilvA-Gen, l) das für die Acetohydroxysäure-Synthase codierende ilvBN-Gen, m) das für die Dihydroxysäure-Dehydratase codierende ilvD-Gen, überexprimiert sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei man coryneforme Bakterien fermentiert, in denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: a) das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pck-Gen, b) das für die Glucose-6-phosphat-Isomerase codierende pgi-Gen, c) das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen, abgeschwächt ist bzw. sind.
Coryneforme Bakterien, transformiert mit einem Vektor, der ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 1 oder 3 trägt.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 13, wobei Mikroorganismen der Spezies Corynebacterium glutamicum eingesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Corynebacterium glutamicum-Stamm DSM5715/pEC-K18mob2gap2exp eingesetzt wird.
Escherichia coli-Stamm DH5αmcr/pEC-K18mob2gap2exp, hinterlegt unter DSM 14407 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig.