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Gebiet der Erfindung
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Gegenstand
der Beschreibung sind für
die Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen
aus coryneformen Bakterien und Gegenstand der Erfindung ist ein
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter
Verwendung von Bakterien, in denen die genannten endogenen Gene verstärkt sind.
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Stand der Technik
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L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, L-Cystein und L-Methionin,
finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
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Es
ist bekannt, dass Aminosäuren
durch Fermentation von. Stämmen
coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum,
hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an
der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können
fermentationstechnische Massnahmen wie zum Beispiel Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
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Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch
bedeutsame Metabolite sind und Aminosäuren produzieren.
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Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden
Stämmen
von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene
amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Massnahmen zur verbesserten
fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
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Darstellung der Erfindung
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Werden
im folgenden L-Aminosäuren
oder Aminosäuren
erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschliesslich ihrer
Salze, ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparagin,
L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin,
L-Isoleucin, L-Leucin,
L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und
L-Arginin gemeint.
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Wenn
im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht
nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid
oder Lysin-Sulfat gemeint.
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Werden
im folgenden L-Cystein oder Cystein erwähnt, sind damit auch die Salze
wie z. B. Cystein-Hydrochlorid oder Cystein-S-Sulfat gemeint.
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Werden
im folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze
wie z. B. Methionin-Hydrochlorid
oder Methionin-Sulfat gemeint.
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Gegenstand
der Beschreibung sind isolierte Polynukleotide aus coryneformen
Bakterien, enthaltend eine oder mehrere der für das cysD-Gen, das cysN-Gen,
das cysK-Gen, das cysE-Gen oder das cysH-Gen kodierenden Polynukleotidsequenzen,
ausgewählt
aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens
zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid
kodiert, das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem
Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3
enthält,
- c) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem
Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 5
enthält,
- d) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem
Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 6
enthält,
- e) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem
Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8
enthält,
- f) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- g) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
- h) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 5,
- i) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 6,
- j) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8,
- k) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden
von a), b), c), d), e), f), g), h), i) oder j), und
- l) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b), c), d), e), f),
g), h), i), j) oder k),
wobei die Polypeptide bevorzugt
die entsprechenden Aktivitäten,
nämlich
der Sulfat-Adenylyltransferase, der Cysteinsynthase A, der Serinacetyltransferase
oder der 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase,
aufweisen.
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Gegenstand
der Beschreibung sind ebenfalls die oben genannten Polynukleotide,
wobei es sich bevorzugt um replizierbare DNAs handelt, enthaltend:
- i) eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, gezeigt
in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7, oder
- ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des
Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- iii) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder
(ii) komplementären
Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- iv) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
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Weitere
Gegenstände
der Beschreibung sind
replizierbare Polynukleotide, insbesondere
DNAs, enthaltend eine oder mehrere Nukleotidsequenzen wie in SEQ
ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7, dargestellt;
Polynukleotide,
die für
ein oder mehrere Polypeptide kodieren, die die entsprechenden Aminosäuresequenzen,
wie in SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 beziehungsweise
SEQ ID No. 8 dargestellt, enthalten;
ein Vektor, enthaltend
eines oder mehrere der erfindungsgemässen Polynukleotide, insbesondere
Pendelvektore oder Plasmidvektore, und
coryneforme Bakterien,
die den Vektor enthalten oder in denen eines oder mehrere der endogenen
Gene ausgewählt
aus der Gruppe von cysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH-Gen
verstärkt
ist/sind.
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Ein
Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen
Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien, in denen
eines oder mehrere endogene Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- – das
für die
Untereinheit II der Sulfat-Adenylyltransferase
kodierende cysD-Gen,
- – das
für die
Untereinheit I der Sulfat-Adenylyltransferase
kodierende cysN-Gen,
- – das
für die
Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen,
- – das
für die
Serinacetyltransferase kodierende cysE-Gen,
- – das
für die
3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase
kodierende cysH-Gen
überexperimiert
wird.
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Alle
fünf endogenen
Gene (cysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH-Gen) sind
an der Biosynthese der schwefelhaltigen L-Aminosäuren L-Cystein und L-Methionin
beteiligt. Das Kohlenstoffgrundgerüst dieser Aminosäuren leitet
sich zum überwiegenden
Teil von den gleichen metabolischen Intermediaten ab wie das der
Aminosäuren
der Aspartat-Familie, zu welcher L-Lysin gehört. Durch die Überexpression
eines oder mehrerer der genannten Gene kommt es zu Poolverschiebungen
in den beteiligten Biosynthesewegen, was sich positiv auf die Bildung
von L-Lysin, L-Methionin
und L-Cystein auswirkt.
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Gegenstand
der Beschreibung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen
eine Polynukleotidsequenz enthalten, die erhältlich sind durch Screening
mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen
Bakteriums, die das vollständige
Gen oder Teile davon enthält,
mit einer Sonde, die die Sequenz der erfindungsgemässen Polynukleotide
gemäss
SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7 oder ein
Fragment davon enthält
und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Polynukleotide,
die die Sequenzen gemäss
der Erfindung enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA
und DNA geeignet, um Nukleinsäuren
beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren,
die für
die Sulfat-Adenylyltransferase, die Cysteinsynthase A, die Serinacetyltransferase und/oder
die 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase
kodieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide
oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit
der des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder
des cysH-Gens aufweisen.
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Polynukleotide,
die die Sequenzen gemäss
der Beschreibung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet,
mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von
Genen hergestellt werden kann, die für die Sulfat-Adenylyltransferase,
die Cysteinsynthase A, die Serinacetyltransferase und/oder die 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase kodieren.
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In
einem Aspekt dieser Erfindung kodiert das erfindungsgemässe cysD-Gen
für die
Untereinheit II der Sulfat-Adenylyltransferase, das erfindungsgemässe cysN-Gen für die Untereinheit
I der Sulfat-Adenylyltransferase, das erfindungsgemässe cysK-Gen
für die
Cystein-Synthase A, das erfindungsgemässe cysE-Gen für die Serinacetyltransferase
und das erfindungsgemässe
cysH-Gen für
die 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase.
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In
einem weiterem Aspekt dieser Erfindung ist es möglich, dass diese erfindungsgemässen Gene
zu zweit oder mit mehreren Genen in Kombination auftreten, wobei
sie dann für
die kombinierten Aktivitäten
kodiern. Das heisst, verstärkt
man, zum Beispiel, gleichzeitig a) cysE-Gen und cysK-Gen, oder b)
cysK-Gen und cysH-Gen, oder c) cysN-Gen und cysD-Gen und cysE-Gen
und cysK-Gen, kodieren diese für
a) die Serinacetyltransferase und die Cystein-Synthase A, b) die Cystein-Synthase
A und die 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase
und c) die Sulfat-Adenylyltransferase
und die Serinacetyltransferase und die Cystein-Synthase A.
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Solche
als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens
30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens
15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide
mit einer Länge
von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch
Oligonukleotide mit einer Länge
von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.
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"Isoliert" bedeutet aus seinem
natürlichen
Umfeld herausgetrennt.
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"Polynukleotid" bezieht sich im
allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide,
wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
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Die
Polynukleotide gemäss
Beschreibung schliessen ein Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1, SEQ ID No.
4 beziehungsweise SEQ ID No. 7 oder ein daraus hergestelltes Fragment
und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens
80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem
Polynukleotid gemäss
SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 beziehungsweise SEQ ID No. 7 oder einem
daraus hergestellten Fragment.
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Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide
oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren
enthalten.
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Die
Polypeptide gemäss
Beschreibung schliessen die Polypeptide gemäss SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3,
SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 8, insbesondere solche
mit der biologischen Aktivität
der Sulfat-Adenylyltransferase, der Cystein-Synthase A, der Serinacetyltransferase
und/oder der 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase
und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens
80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit den
Polypeptiden gemäss
SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 oder SEQ
ID No. 8 und die genannten Aktivitäten aufweisen.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermermentativen
Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien,
die insbesondere bereits L-Lysin
produzieren und in denen die für
das cysD-Gen, das cysN-Gen, cysE-Gen, das cysK-Gen und/oder das
cysH-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen überexprimiert werden.
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Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor
verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Massnahmen kombiniert.
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Durch
die Massnahmen der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise
der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
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Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Beschreibung sind,
können
L-Aminosäuren aus
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose
oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter
coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium
glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
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Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes
FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium
flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium
divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Lysin produzierende
Mutanten bzw. Stämme.
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Die
neuen, für
die Enzyme Sulfat-Adenylyltransferase (EC 2.7.7.4), Cystein-Synthase
A (EC 4.2.99.8), Serinacetyltransferase (EC 2.3.1.30) und 3'-Phosphoadenylylsulfat-Reduktase (EC
1.8.99.4) kodierenden Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH von C.
glutamicum wurden isoliert.
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Zur
Isolierung des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens,
des cysH-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine
Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt.
Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern niedergeschrieben.
Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einführung
in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990),
oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr
bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von
Kohara et al. (Cell 50, 495–508
(1987)) in lambda-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular
and General Genetics, 252: 255–265,
1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings
of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im
E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research
16: 1563–1575)
angelegt wurde.
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Börmann et
al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326) (1992)) wiederum beschreiben
eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids
pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)).
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Zur
Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch
Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979))
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als
Wirte eignen sich besonders solche E. coli Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der
von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 87 (1990) 4645–4649)
beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente
können
wiederum in gängige,
für die
Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschliessend sequenziert
werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977)
beschrieben ist.
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Die
erhaltenen DNA-Sequenzen können
dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie
z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 1986)),
dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm
von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998))
untersucht werden.
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Die
für die
Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierenden DNA-Sequenzen von
C. glutamicum wurden erhalten, die als SEQ ID No. I, SEQ ID No.
4 und SEQ ID No. 7 Bestandteile der vorliegenden Beschreibung sind.
Weiterhin wurde aus den vorliegenden DNA-Sequenzen mit den oben
beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der entsprechenden
Proteine abgeleitet. In SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5,
SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 8 sind die sich ergebenden Aminosäuresequenzen
der cysD-, cysN-, cysK-, cysE- und cysH-Genprodukte dargestellt.
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Kodierende
DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 4 oder SEQ
ID No. 7 durch die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben,
sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1
beziehungsweise SEQ ID No. 4 oder Teilen von SEQ ID No. 4 oder SEQ
ID No. 7 oder Teilen von SEQ ID No. 7 hybridisieren, Bestandteil
der Beschreibung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen
Glutaminsäure
in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations)
bekannt, die zu keiner grundsätzlichen
Veränderung
der Aktivität
des Proteins führen,
d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen
am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich
beeinträchtigen
oder sogar stabilisieren können.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat
et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237–251
(1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)),
bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender
Weise aus SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6
und SEQ ID No. 8 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.
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In
gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen
von SEQ ID No. 1 beziehungsweise SEQ ID No. 4 oder Teilen von SEQ
ID No. 4 oder SEQ ID No. 7 oder Teilen von SEQ ID No. 7 hybridisieren,
Bestandteil der Beschreibung. Schliesslich sind DNA-Sequenzen Bestandteil
der Beschreibung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ
ID No. 1, SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 7 ergeben. Derartige Oligonukleotide
haben typischerweise eine Länge
von mindestens 15 Nukleotiden.
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Anleitungen
zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet
der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der
Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und
bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255–260).
Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das
heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz,
d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung
einschliesslich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung,
der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt
wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid
Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
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Für die Hybridisierungsreaktion
kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer
bei einer Temperatur von ca. 50°C–68°C eingesetzt
werden. Dabei können
Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität
zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil
und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt.
Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf
2 × SSC
und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter
Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995)
erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C eingestellt
wird. Es ist gegebenenfalls möglich,
die Salzkonzentration bis auf 0,1 × SSC zu senken. Durch schrittweise
Erhöhung
der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente
isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens
80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten
Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form
sogenannter Kits am Markt erhältlich
(z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland, Katalog Nr. 1603558).
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Anleitungen
zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und
bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland,
1994).
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Es
wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Überexpression eines oder mehrerer
Gene ausgewählt
aus der Gruppe von CysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH-Gen
in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.
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Zur
Erzielung einer Überexpression
kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken
Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut
werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe
der fermentativen Aminosäure-Produktion
zu steigern. Durch Massnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der
m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch
Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die
Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
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Anleitungen
hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology
5, 137–146 (1987)),
bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga
(Bio/Technology 6, 428–430 (1988)),
bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der
Europäischen Patentschrift 0 472
869 , im
US Patent 4,601,893 ,
bei Schwarzer und Pühler
(Bio/Technology 9, 84–87
(1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126–132
(1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)),
in der Patentanmeldung
WO 96/15246 ,
bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen
Offenlegungsschrift
JP-A-10-229891 ,
bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)),
bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie.
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Zur
Verstärkung
wurden die erfindungsgemässen
Gene cysD, cysN, cysK, cysE oder cysH beispielhaft mit Hilfe von
episomalen Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert
werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel
et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKEx1
(Eikmanns et al., Gene 102: 93–98
(1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren
wie z. B. solche, die auf pCG4 (
US-A 4,489,160 ) oder pNG2 (Serwold-Davis et
al., FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)) oder pAG1 (
US-A 5,158,891 )
beruhen, können
in gleicher Weise verwendet werden.
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Weiterhin
eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das
Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom
anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied
and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) zur Duplikation
bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser
Methode wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen
beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)),
pK18mob oder pK19mob (Schäfer
et al., Gene 145, 69–73
(1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman
(1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84;
US-A 5,487,993 ),
pCR
®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534–541
(1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173:
4510–4516)
oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337–342) in Frage. Der Plasmidvektor,
der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschliessend durch
Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden
zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach at al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067–1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994))
beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende
Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
-
Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben dem cysD-Gen,
dem cysN-Gen, dem cysK-Gen, dem cysE-Gen und/oder dem cysH-Gen ein
oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse,
der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus,
des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls
regulatorische Proteine überzuexprimieren.
-
So
kann für
die Herstellung von L-Aminosäuren
zusätzlich
zur Verstärkung
des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens
ein oder mehrere endogene Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- – das
für Dihydrodipicolinatsynthase
kodierende Gen dapA ( EP-B
0 197 335 ),
- – das
für die
Glyceraldehyd3-Phosphatdehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns
(1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- – das
für die
Triosephosphatisomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076–6086);
- – das
für die
3-Phosphoglyceratkinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076–6086),
- – das
für die
Glucose6-Phosphatdehydrogenase kodierende Gen zwf ( JP-A-09224661 ),
- – das
für die
Pyruvatcarboxylase kodierende Gen pyc ( DE-A-198 31 609 ),
- – das
für die
Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al.,
European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
- – das
für eine
feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession
No. P26512; EP-B-0387527 ; EP-A-0699759 ),
- – das
für den
Lysinexport kodierende Gen lysE ( DE-A-195
48 222 ),
- – das
für die
Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom ( EP-A 0131171 )
- – das
für die
Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology
(1992) 8065– 8072))
oder das für
eine "feed back
resistente" Threonin-Dehydratase
kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel
et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833–842),
- – das
für die
Acetohydroxysäure-Synthase
kodierende Gen ilvBN ( EP-B
0356739 ),
- – das
für die
Dihydroxysäuredehydratase
kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental
Microbiology 65: 1973–1979),
- – das
für das
Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 ( DE
199 59 328.0 , DSM 13115)
insbesondere überexprimiert
werden.
-
Weiterhin
kann es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des cysD-Gens, des cysN-Gens,
des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder des cysH-Gens ein oder mehrere
Gene, ausgewählt
aus der Gruppe
- – das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
kodierende Gen pck ( DE 199 50
409.1 ; DSM 13047),
- – das
für die
Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi ( US 09/396,478 ; DSM 12969),
- – das
für die
Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB ( DE
199 51 975.7 ; DSM 13114),
- – das
für das
Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 ( DE
199 59 327.2 , DSM 13113)
abzuschwächen, insbesondere
die Expression davon zu verringern. Insbesondere für die Produktion
von L-Cystein kann es vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des
cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder
des cysH-Gens ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe - – das
für die
Cystathionin-β-Lyase
kodierende aecD-Gen (Accession Number M89931 des National Center for
Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
- – das
für die
Cystathionin-γ-Synthase
kodierende metB-Gen
(Accession Number AF1236953 des National Center for Biotechnology
Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)
abzuschwächen, insbesondere
die Expression davon zu verringern.
-
Der
Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen
schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert
bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und
gegebenenfalls diese Massnahmen kombiniert.
-
Durch
die Massnahmen der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangs-Mikroorganismus herabgesenkt.
-
Weiterhin
kann es für
die Produktion von Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben der Überexpression
des cysD-Gens, des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens und/oder
des cysH-Gens unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction
of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, London, UK, 1982).
-
Die
erfindungsgemäss
hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Beschreibung und
können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung)
oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
-
Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
-
Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl
und Kokosfett, Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie
z. B. Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Stickstoffquelle können
organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
-
Als
Schwefelquelle, insbesondere für
die Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren, können organische und anorganische
schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfide, Sulfite,
Sulfate und Thiosulfate verwendet werden.
-
Das
Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.
B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Schliesslich können
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu
den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
-
Zur
pH-Kontrolle der Kultur können
basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise
bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten
Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
-
Die
so erhaltenen, insbesondere L-Methionin enthaltenden Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine
Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-% und enthalten L-Methionin.
-
Vorteilhaft
ist ausserdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere
jedoch über mindestens
30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heisst,
dass während
dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium
auf ≥ 0 bis
3 g/l abgesenkt wird.
-
Die
in dieser Weise hergestellte, insbesondere L-Methionin-haltige, Fermentationsbrühe wird
anschliessend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse
ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z. B. der Zentrifugation,
der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus
der Fermentationsbrühe
entfernt oder vollständig
in ihr belassen werden. Anschliessend wird diese mit bekannten Methoden
wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers,
Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration
eingedickt beziehungsweise konzentriert. Diese aufkonzentrierte
Fermentationsbrühe
kann anschliessend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung,
der Sprühgranulation
oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen
Pulver aufgearbeitet werden.
-
Dieses
rieselfähige,
feinteilige Pulver kann dann wiederum durch geeignete Kompaktier-
oder Granulier-Verfahren
in ein grobkörniges,
gut rieselfähiges,
lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Vorteilhaft bei
der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen
organischen oder anorganischen Hilfsstoffen beziehungsweise Trägern wie
Stärke,
Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise
in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-
oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen
wie zum Beispiel Kieselsäuren,
Silikaten oder Stearaten.
-
Unter "rieselfähig" versteht man Pulver,
die aus einer Serie von Glasauslaufgefässen mit verschieden grossen
Auslauföffnungen
mindestens aus dem Gefäss
mit der Öffnung
5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein, Seifen, Öle, Fette,
Wachse 94, 12 (1968)).
-
Wie
hier beschrieben ist mit "feinteilig" ein Pulver mit überwiegendem
Anteil (> 50%) einer
Korngrösse von
20 bis 200 μm
Durchmesser gemeint. Mit "grobkörnig" sind Produkte mit überwiegendem
Anteil (> 50%) einer
Korngrösse
von 200 bis 2000 μm
Durchmesser gemeint. In diesem Sinne bedeutet "staubfrei", dass das Produkt lediglich geringe
Anteile (< 5%)
an Körngrössen unter
20 um Durchmesser enthält.
Die Korngrössenbestimmung
kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden.
Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur "Teilchengrössenmessung
in der Laborpraxis" von
R. H. Müller
und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart
(1996) oder im Lehrbuch "Introduction
to Particle Technology" von
M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons
(1998) beschrieben.
-
"Lagerbar" im Sinne dieser
Erfindung bedeutet ein Produkt, das bis zu 120 Tagen, bevorzugt
bis 52 Wochen, besonders bevorzugt 60 Monate gelagert werden kann,
ohne dass ein wesentlicher Verlust (< 5%) an Methionin auftritt.
-
Alternativ
kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung
bekannten und üblichen
organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate,
Schrote, Kleien, Mehle, Stärken,
Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln
vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren
hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132
(1995) 49, Seite 817) beschrieben.
-
Schliesslich
kann das Produkt durch Beschichtungsverfahren ("Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise
Metallcarbonate, Kieselsäuren,
Silikate, Alginate, Stearate, Stärken,
Gummis und Celluloseether, wie in der
DE-C-41 00 920 beschrieben, in einen Zustand
gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen insbesondere
dem Magen von Wiederkäuern
ist.
-
Wird
die Biomasse während
des Verfahrens abgetrennt, werden im allgemeinen weitere, zum Beispiel während der
Fermentation zugesetzte anorganische Feststoffe entfernt. Daneben
enthält
das erfindungsgemässe
Tierfuttermitteladditiv zumindest den überwiegenden Teil der in der
Fermentationsbrühe
gelöst
vorliegenden, weiteren gebildeten oder zugesetzten, insbesondere
organischen Stoffe, soweit sie nicht durch geeignete Verfahren abgetrennt
wurden.
-
In
einem Aspekt der Erfindung kann die Biomasse bis zu 70%, bevorzugt
bis zu 80%, bevorzugt bis zu 90%, bevorzugt bis zu 95%, und besonders
bevorzugt bis zu 100% abgetrennt werden. In einem weiteren Aspekt
der Erfindung werden bis zu 20% der Biomasse, bevorzugt bis zu 15%,
bevorzugt bis zu 10%, bevorzugt bis zu 5%, besonders bevorzugt keine
Biomasse abgetrennt.
-
Zu
diesen organischen Stoffen gehören
organische Nebenprodukte, die von den bei der Fermentation eingesetzten
Mikroorganismen gegebenenfalls neben dem L-Methionin erzeugt und gegebenenfalls
ausgeschieden werden. Dazu zählen
L-Aminosäuren,
ausgewählt
aus der Gruppe L- Lysin,
L-Valin, L-Threonin, L-Alanin oder L-Tryptophan. Dazu zählen Vitamine
ausgewählt
aus der Gruppe Vitamin B1 (Thiamin), Vitamin B2 (Riboflavin), Vitamin
B5 (Pantothensäure),
Vitamin B6 (Pyridoxin), Vitamin B12 (Cyanocobalamin), Nicotinsäure/Nicotinsäureamid
und Vitamin E (Tocopherol). Dazu gehören weiterhin organische Säuren, die
ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure oder
Fumarsäure.
Schliesslich gehören
dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose. Diese Verbindungen
sind gegebenenfalls erwünscht,
wenn sie die nutritive Wertigkeit des Produktes verbessern.
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Diese
organischen Stoffe einschliesslich des L-Methionins und/oder D-Methionins
und/oder des racemischen Gemisches D,L-Methionin können auch
je nach Anforderung während
eines geeigneten Verfahrensschrittes als Konzentrat oder Reinsubstanz
in fester oder flüssiger
Form hinzugefügt
werden. Diese genannten organischen Stoffe können einzeln oder als Mischungen
zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder
auch während
des Trocknungs- oder
Granulationsprozesses hinzugefügt
werden. Es ist gleichfalls möglich,
einen organischen Stoff oder eine Mischung mehrerer organischer
Stoffe zur Fermentationsbrühe
und einen weiteren organischen Stoff oder eine weitere Mischung
mehrerer organischer Stoffe bei einem späteren Verfahrensschritt, beispielsweise
der Granulation, hinzuzufügen.
-
Das
oben beschriebene Produkt ist als Futtermittelzusatz, d. h. Futtermittel-Additiv,
für die
Tierernährung
geeignet.
-
Der
L-Methionin-Gehalt des Tierfuttermittel-Additivs beträgt üblicherweise
1 Gew.-% bis 80 Gew.-%, bevorzugt 2 Gew.-% bis 80 Gew.-% besonders
bevorzugt 4 Gew.-% bis 80 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 8
Gew.-% bis 80 Gew.-%, bezogen auf die Trockenmasse des Tierfuttermittel-Additivs. Gehalte
von 1 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 2 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 4 Gew.-% bis
60 Gew.-%, 6 Gew.-% bis 60 Gew.-%, 1 Gew.-% bis 40 Gew.-%, 2 Gew.-%
bis 40 Gew.-% oder 4 Gew.-% bis 40 Gew.-% sind gleichfalls möglich. Der Wassergehalt
des Futtermittel-Additivs beträgt üblicherweise
bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt
weniger als 2 Gew.-%.
-
Ein
weiterer Gegenstand der Beschreibung ist dementsprechend ein Verfahren
zur Herstellung eines L-Methionin-haltigen
Tierfuttermittel-Additivs aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die
Schritte
- a) Kultivierung und Fermentation eines
L-Methionin produzierenden Mikroorganismus in einem Fermentationsmedium;
- b) Entfernung von Wasser aus der L-Methionin-haltigen Fermentationsbrühe (Aufkonzentration);
- c) Entfernung der während
der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100
Gew.-%; und
- d) Trocknung der gemäss
a) und/oder b) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Tierfuttermittel-Additiv
in der gewünschten
Pulver- oder Granulatform zu erhalten.
-
Wenn
erwünscht,
können
in dem erfindungsgemässen
Verfahren weiterhin einer oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt werden:
- e) Zusatz von einem oder mehreren organischen
Stoffen, einschliesslich L-Methionin und/oder D-Methionin und/oder
des racemischen Gemisches D,L-Methionin, zu den gemäss a), b)
und/oder c) erhaltenen Produkten;
- f) Zugabe von Hilfsstoffen zu den nach a) bis d) erhaltenen
Stoffen zur Stabilisierung und Erhöhung der Lagerfähigkeit
ausgewählt
aus der Gruppe Kieselsäuren,
Silikate, Stearate, Schrot und Kleie; oder
- g) Überführung der
nach a) bis e) erhaltenen Stoffe in eine Tiermagen-, insbesondere
Pansen-stabile Form durch Beschichtung mit Filmbildnern.
-
Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so zum
Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190) beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie mit anschliessender
Ninhydrin-Derivatisierung
erfolgen, oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen, so wie
bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben.
-
Das
erfindungsgemässe
Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
-
Folgende
Mikroorganismen wurden als Reinkultur am 18. Mai 2001 bei der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäss Budapester
Vertrag hinterlegt:
- – E. coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysEb1ex
als DSM 14308,
- – E.
coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysKa1ex
als DSM 14310,
- – E.
coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysDa1ex
als DSM 14311,
- – E.
coli DH5αmcr/pEC-XK99EcysHa1ex
als DSM 14315.
-
Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
-
Die
Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken
zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden
nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989)
Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt.
Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls
in diesem Handbuch beschrieben.
-
Die
Zusammensetzung gängiger
Nährmedien
wie LB- oder TY-Medium
kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.
-
Beispiel 1
-
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank
aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
-
Chromosomale
DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch
et al. (1995, Plasmid 33: 168–179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code
no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert.
Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings
of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164), bezogen von der Firma Stratagene
(La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit,
Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code
no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
-
Anschliessend
wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die
auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten
ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase,
Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschliessend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla,
USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no.
200217) in Phagen verpackt.
-
Zur
Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Research 16: 1563–1575) wurden
die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und
mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und
Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei
die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100
mg/l Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht
bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
-
Beispiel 2
-
Isolierung und Sequenzierung des cysD-Gens,
des cysN-Gens, des cysK-Gens, des cysE-Gens oder des cysH-Gens
-
Die
Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep
Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer
Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Grössenbereich
von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product
No. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland).
-
Die
DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen
(Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente
in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben
durchgeführt,
wobei das DNA-Gemisch
mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht
inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschliessend in
den E. coli Stamm DH5αmcr
(Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.
S. A., 87: 4645–4649)
elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:
343–7)
und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin
ausplattiert.
-
Die
Plasmidpräparation
der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product
No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte
nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977,
Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 74: 5463–5467) mit
Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research,
18: 1067). Es wurde der "RR
dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product
No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische
Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29: 1) (Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
-
Die
erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschliessend unter Anwendung
des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version
97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden
zu einem zusammenhängenden
Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse
wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research,
14: 217–231)
angefertigt.
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Die
erhaltenen Nukleotidsequenzen sind in SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 4
und SEQ ID No. 7 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenzen
ergab sechs offene Leseraster von 915 Basenpaaren, 1302 Basenpaaren,
936 Basenpaaren, 567 Basenpaaren und 786 Basenpaaren, welche als
cysD-Gen, cysN-Gen, cysK-Gen, cysE-Gen und cysH-Gen bezeichnet wurden.
Das cysD-Gen kodiert für
ein Protein von 304 Aminosäuren,
das cysN-Gen kodiert für
ein Protein von 433 Aminosäuren,
das cysK-Gen kodiert für
ein Protein von 311 Aminosäuren,
das cysE-Gen kodiert für
ein Protein von 188 Aminosäuren
und das cysH-Gen kodiert für
ein Protein von 261 Aminosäuren.
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Beispiel 3
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Herstellung von Shuttle-Expressionsvektoren
auf Basis von pEC-XK99E zur Verstärkung der Gene cysD, cysK,
cysE und cysH in C. glutamicum
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3.1 Amplifikation der Gene cysD, cysK,
cysE und cysH
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Aus
dem Stamm ATCC 13032 wurde nach Eikmanns et al. (Microbiology 140:
1817–1828
(1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum
bekannten Sequenzen der Gene cysD, cysK, cysE und cysH wurden die
folgenden Oligonukleotide, aufgelistet in Tabelle 1, für die Polymerase Kettenreaktion
ausgewählt
(siehe SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12,
SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15 und SEQ ID No. 16).
Zusätzlich
wurden bei den Primern geeignete Restriktionsschittstellen eingefügt, die
das Klonieren in den Zielvektor ermöglichen. Sie sind in Tabelle
1 aufgeführt und
in der Nukleotidabfolge durch Unterstreichen gekennzeichnet.
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-
Die
dargestellten Primer wurden von der Firma MWG-Biotech AG (Ebersberg,
Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von
Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications,
1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Roche Diagnostics
GmbH (Mannheim, Deutschland) die PCR-Reaktion durchgeführt. Mit
Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation
eines 1017 bp grossen DNA-Fragmentes,
welches das cysD-Gen trägt,
eines 1005 bp grossen DNA-Fragmentes, welches das cysK-Gen trägt, eines
672 bp grossen DNA-Fragmentes, welches das cysE-Gen trägt und eines
884 bp grossen DNA-Fragmentes, welches das cysH-Gen trägt.
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Das
cysD-Fragment, das cysK-Fragment, das cysE-Fragment und das cysH-Fragment
wurden mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und XbaI gespalten
und anschliessend aus dem Agarosegel mit dem QiaExII Gel Extraction
Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany) isoliert.
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3.2 Konstruktion des Shuttle-Vektors pEC-XK99E
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Nach
dem Stand der Technik wurde der E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor
pEC-XK99E konstruiert. Der Vektor enthält die Replikationsregion rep
des Plasmids pGA1 einschliesslich des Replikationseffectors per (
US-A-5,175,108 ; Nesvera et al.,
Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), das Kanamycin-Resistenzgen
aph(3')-IIa aus
Escherichia coli (Heck et al. (1982), Gene 19: 327–336), den
Replikationsursprung des trc-Promotors, die Terminationsregionen
T1 und T2, das lacI
q-Gen (Repressor des
lac-Operons von E. coli) und eine Mehrfachklonierschnittstelle (multiple
cloning site, mcs) (Norrander, J. M. et al. Gene 26, 101–106 (1983)) des
Plasmids pTRC99A (Amann et al. (1988), Gene 69: 301–315).
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Der
konstruierte E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-XK99E wurde
mittels Elektroporation (Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters,
53: 299–303)
in C. glutamicum DSM5715 transferiert. Die Selektion der Transformanten
erfolgte auf LBHIS-Agar enthaltend 18,5 g/l Brain-Heart Infusion
Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract,
5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert
worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.
-
Plasmid
DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen Methoden isoliert (Peters-Wendisch et
al., 1998, Microbiology, 144, 915–927), mit der Restriktionsendonuklease
HindIII geschnitten und das Plasmid durch anschliessende Agarosegel-Elektrophorese überprüft.
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Das
so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-XK99E bezeichnet und
ist in 1 dargestellt. Der durch Elektroporation des Plasmides
pEC-XK99E in den C. glutamicum-Stamm DSM5715 erhaltene Stamm wurde
DSM5715/pEC-XK99E genannt und als DSM 13455 bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäss Budapester
Vertrag hinterlegt.
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3.3 Klonierung der Gene cysD, cysK, cysE
und cysR in den E. coli-C. glutamicum Shuttle-Vektor pEC-XK99E
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Als
Vektor wurde der in Beispiel 3.1 beschriebene E. coli-C. glutamicum
Shuttle-Vektor pEC-XK99E verwendet. DNA dieses Plasmids wurde mit
den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI vollständig gespalten und anschliessend
mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert.
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Die
mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI geschnittenen, aus dem
Agarosegel isolierten Fragmente cysD, ca. 1000 bp gross, cysK, ca.
990 bp gross, cysE, ca. 660 bp gross und cysH, ca. 870 bp gross, wurden
jeweils mit dem vorbereiteten Vektor pEC-XK99E gemischt und die
Ansätze
mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Die Ligationsansätze wurden
in den E. coli Stamm DH5αmcr
(Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press,
Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmidtragenden Zellen
erfolgte durch Ausplattieren der Transformationsansätze auf
LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Kanamycin.
Nach Inkubation über
Nacht bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert. Plasmid DNA wurde
aus jeweils einer Transformante mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit
(Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben
isoliert und mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI gespalten,
um das Plasmid durch anschliessende Agarosegel-Elektrophorese zu überprüfen. Die
erhaltenen Plasmide wurden pEC-XK99EcysDa1ex,
pEC-XK99EcysKa1ex, pEC-XK99EcysEb1ex und pEC-XK99EcysHa1ex genannt.
Sie sind in den 2, 3, 4 und 5 dargestellt.
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Beispiel 4
-
Transformation des Stammes DSM5715 mit
den Plasmiden pEC-XK99EcysDa1ex,
pEC-XK99EcysKa1ex, pEC-XK99EcysEb1ex beziehungsweise pEC-XK99EcysHa1ex
-
Der
Stamm DSM5715 wurde mit jeweils einem der Plasmide pEC-XK99EcysDa1ex, pEC-XK99EcysKa1ex,
pEC-XK99EcysEb1ex und pEC-XK99EcysHa1ex unter Anwendung der von
Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989))
beschriebenen Elektroporationsmethode transformiert. Die Selektion
der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar enthaltend 18,5 g/l Brain-Heart
Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l
Bacto-Yeast-Extract,
5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert
worden war. Die Inkubation erfolgte für 2 Tage bei 33°C.
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Plasmid
DNA wurde aus jeweils einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144,
915–927).
DNA der Plasmide pEC-XK99EcysDa1ex, pEC-XK99EcysKa1ex,
pEC-XK99EcysEb1ex und pEC-XK99EcysHa1ex wurde mit den Restriktionsendonukleasen
KpnI und XbaI geschnitten. Die Plasmide wurden durch anschliessende
Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Die
erhaltenen Stämme
wurden DSM5715/pEC-XK99EcysDa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysKa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysEb1ex
oder DSM5715/pEC-XK99EcysHa1ex genannt.
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Beispiel 5
-
Herstellung von Lysin
-
Die
in Beispiel 4 erhaltenen C. glutamicum Stämme DSM5715/pEC-XK99EcysDa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysKa1ex,
DSM5715/pEC-XK99EcysEb1ex oder DSM5715/pEC-XK99EcysHa1ex wurden
in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der
Lysingehalt im Kulturüberstand
jedes Stammes bestimmt.
-
Dazu
wurden die Stämme
zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar
mit Kanamycin (25 mg/l)) für
24 Stunden bei 33°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde je eine
Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als
Medium für
die Vorkulturen wurde das Vollmedium CgIII verwendet.
| Medium
CgIII |
NaCl | 2,5
g/l |
Bacto-Pepton | 10
g/l |
Bacto-Yeast-Extrakt | 10
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 2%
(w/v) |
Der
pH-Wert wurde auf pH 7.4 eingestellt | |
-
Diesem
wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkulturen wurden 16 Stunden
bei 33°C
bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von diesen Vorkulturen wurde je eine Hauptkultur angeimpft,
so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkulturen 0,1 betrug. Für die Hauptkulturen
wurde das Medium MM verwendet. Medium MM
CSL
(Corn Steep Liquor) | 5
g/l |
MOPS
(Morpholinopropansulfonsäure) | 20
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 50
g/l |
(NH4)2SO4 | 25
g/l |
KH2PO4 | 0,1
g/l |
MgSO4·7
H2O | 1,0
g/l |
CaCl2·2
H2O | 10
mg/l |
FeSO4·7
H2O | 10
mg/l |
MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
Biotin
(sterilfiltriert) | 0,3
mg/l |
Thiamin·HCl (sterilfiltriert) | 0,2
mg/l |
L-Leucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
CaCO3 | 25
g/l |
-
CSL,
MOPS und die Salzlösung
wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschliessend
wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3.
-
Die
Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben
mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung
erfolgte bei 33°C
und 80% Luftfeuchtigkeit.
-
Nach
48 Stunden wurde die OD der Kulturen DSM5715, DSM5715/pEC-XK99EcysDa1ex, DSM5715/pEC-XK99EcysKa1ex
und DSM5715/pEC-XK99EcysHa1ex und nach 72 Stunden die OD der Kultur
DSM5715/pEC-XK99EcysEb1ex bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete
Lysinmenge wurde jeweils mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrindetektion bestimmt.
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In
den Tabellen 2 und 3 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 2
Stamm | OD
(660 nm) (48 h) | Lysin-HCl
g/l (48 h) |
DSM5715 | 11,3 | 13,11 |
DSM5715/pEC-KK99EcysDa1ex | 13,7 | 13,54 |
DSM5715/pEC-XK99EcysKa1ex | 13,5 | 14,35 |
DSM5715/pEC-XK99EcysHa1ex | 11,5 | 15,22 |
Tabelle 3
Stamm | OD
(660 nm) (72 h) | Lysin-HCl
g/l (72 h) |
DSM5715 | 7,17 | 14,27 |
DSM5715/pEC-XK99EcysEb1ex | 9,0 | 15,22 |
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Kurze Beschreibung der Figuren:
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1:
Karte des Plasmids pEC-XK99E
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2:
Karte des Plasmids pEC-XK99EcysDa1ex
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3:
Karte des Plasmids pEC-XK99EcysKa1ex
-
4:
Karte des Plasmids pEC-XK99EcysEb1ex
-
5:
Karte des Plasmids pEC-XK99EcysHa1ex
-
Die
verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
- Kan:
- Kanamycin Resistenz-Gen
aph(3')-IIa aus
Escherichia coli
- HindIII
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms HindIII
- XbaI
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms XbaI
- KpnI
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms KpnI
- Ptrc
- trc-Promotor
- T1
- Terminationsregion
T1
- T2
- Terminationsregion
T2
- per
- Replikationseffektor
per
- rep
- Replikationregion
rep des Plasmides pGA1
- lacIq
- lacIq-Repressor des
lac-Operons von Escherichia coli
- cysD
- kloniertes cysD-Gen
- cysK
- kloniertes cysK-Gen
- cysE
- kloniertes cysE-Gen
- cysH
- kloniertes cysH-Gen
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