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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung stellt transformierte coryneforme Bakterien und ein Fermentationsverfahren
zur Herstellung von Aminosäuren
unter Verwendung von Bakterien, in denen das endogene pknD-Gen überexprimiert wird,
bereit.
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Stand der Technik
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L-Aminosäuren, insbesondere
Lysin, werden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie,
in der Nahrungsmittelindustrie und ganz besonders bei der Tierernährung verwendet.
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Bekanntlich
werden Aminosäuren
durch Fermentation von Stämmen
von Corynebakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt.
Aufgrund ihrer großen
Bedeutung werden ständig
Versuche unternommen, die Herstellungsverfahren zu verbessern. Verbesserungen
der Verfahren können
Maßnahmen in
Zusammenhang mit der Fermentationstechnologie, z. B. Rühren und
Sauerstoffversorgung, oder mit der Zusammensetzung der Nährmedien,
z. B. die Zuckerkonzentration während
der Fermentation, oder mit der Aufarbeitung zur Produktform, z.
B. durch Ionenaustauschchromatographie, oder mit den dem Mikroorganismus selbst
innewohnenden Produktivitäts-merkmale
betreffen.
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Die
Produktivitätsmerkmale
dieser Mikroorganismen werden unter Verwendung von Mutagenese-,
Selektions- und
Mutantenauswahlverfahren verbessert, wobei Stämme erhalten werden, die gegenüber Antimetaboliten
resistent oder auxotroph für
Metaboliten sind, die bei der Regulation von Bedeutung sind, und
die Aminosäuren
produzieren.
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Verfahren
der DNA-Rekombinationstechnik werden ebenfalls seit einigen Jahren
zur Verbesserung L-Aminosäuren produzierender
Stämme
von Corynebacterium eingesetzt, indem einzelne Aminosäurebiosynthese-Gene
amplifiziert werden und die Wirkung auf die Aminosäureproduktion
untersucht wird.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Aufgabe, die sich die Erfinder stellten, bestand darin, neue Maßnahmen
zur Verbesserung der Herstellung von Aminosäuren mittels Fermentation bereitzustellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Wenn
nachstehend L-Aminosäuren
oder Aminosäuren
erwähnt
werden, sollen diese eine oder mehrere Aminosäure, einschließlich ihrer
Salze, bedeuten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin,
L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin,
L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin
umfasst. L-Lysin ist besonders bevorzugt.
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Wenn
im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt ist, soll dieses nicht
nur die Basen, sondern auch die Salze, z. B. Lysinmonohydrochlorid
oder Lysinsulfat, bedeuten.
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Die
Erfindung stellt transformierte coryneforme Bakterien bereit, in
denen ein Polynucleotid aus einem coryneformen Bakterium, das ein
Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens
90% identisch zu der in SEQ ID NR: 2 dargestellten Aminosäuresequenz
ist, oder eine Aminosäuresequenz
der Variante von SEQ ID NR: 2 mit Aminosäureaustauschen im Abschnitt
zwischen Position 661 und 669 besitzt, überexprimiert wird.
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Diese
Aminosäureaustausche
sind aus der folgenden Gruppe ausgewählt:
- a)
SEQ ID NR: 2, wobei die Glutaminsäure an Position 664 ausgetauscht
ist, oder
- b) SEQ ID NR: 2, wobei das Glycin an Position 666 ausgetauscht
ist, oder
- c) SEQ ID NR: 2, wobei die Glutaminsäure an Position 664 und das
Glycin an Position 666 ausgetauscht sind.
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Bevorzugt
sind Bakterien, wobei
- (a) die Glutaminsäure an Position
664 der SEQ ID NR: 2 durch L-Lysin oder L-Arginin ausgetauscht ist;
- (b) das Glycin an Position 666 der SEQ ID NR: 2 durch L-Serin
oder L-Threonin ausgetauscht ist und
- (c) die Glutaminsäure
an Position 664 durch L-Lysin und das Glycin an Position 666 der
SEQ ID NR: 2 durch L-Serin ausgetauscht sind (SEQ ID NR: 4).
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Bevorzugt
sind ferner Bakterien, wobei das Polynucleotid aus der folgenden
Gruppe ausgewählt
ist:
- a) Nucleotidsequenzen, wie in SEQ ID NR:
1 Nucleotide 512 bis 2731 oder SEQ ID NR: 3 Nucleotide 512 bis 2731
dargestellt, oder
- b) Nucleotidsequenzen, wie in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 3
dargestellt, oder
- c) Nucleotidsequenzen, die den Nucleotiden 512 bis 2731 der
Sequenz SEQ ID NR: 1 oder den Nucleotiden 512 bis 2731 der Sequenz
SEQ ID NR: 3 innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entsprechen, oder
- d) Nucleotidsequenzen mit neutralen Sense-Mutationen in SEQ
ID NR: 1 Nucleotide 512 bis 2731 oder SEQ ID NR: 3 Nucleotide 512
bis 2731.
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Erfindungsgemäß wird eine Überexpression
durch ein Verfahren erzielt, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
- a) Erhöhen
der Kopienzahl des Polynucleotids oder
- b) Verwenden eines Promotors oder
- c) Einfügen
des Polynucleotids in das Chromosom.
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Die
Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren bereit,
das Folgendes umfasst:
- a) Fermentieren der
Bakterien,
- b) Anreichern der L-Aminosäure
im Medium oder in den Zellen der Bakterien.
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Die
Beschreibung stellt ferner Folgendes bereit:
ein replizierbares
Polynucleotid, insbesondere DNA, das die Nucleotidsequenz, wie in
SEQ. ID. Nr. 1 gezeigt, enthält,
ein
Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz,
wie in SEQ. ID. Nr. 2 gezeigt, enthält,
einen Vektor, der
das erfindungsgemäße Polynucleotid
enthält,
insbesondere einen Shuttle-Vektor
oder einen Plasmidvektor, und
Corynebakterien, die den Vektor
enthalten oder in denen das endogene pknD-Gen überexprimiert wird.
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Die
Beschreibung stellt auch Polynucleotide bereit, die im Wesentlichen
aus einer Polynucleotidsequenz bestehen, die durch Screening einer
geeigneten Genbibliothek eines Corynebakteriums, die das vollständige Gen
oder Teile davon enthält,
mithilfe von Hybridisierung mit einer Sonde, welche die Sequenz
des erfindungsgemäßen Polynucleotids
gemäß SEQ. ID.
Nr. 1 oder ein Fragment davon enthält, und durch Isolierung der
Polynucleotidsequenz erhältlich
sind.
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Eingehende Beschreibung der Erfindung
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Als
Hybridisierungssonden für
RNA, cDNA und DNA eignen sich Polynucleotide, welche die Sequenzen
gemäß der Beschreibung
enthalten, zur Isolation der vollen Länge von Nucleinsäuren oder
Polynucleotiden oder Genen, die Proteinkinase D codieren, oder zur
Isolation von Nucleinsäuren
oder Polynucleotiden oder Genen, deren Sequenz eine hohen Grad an Ähnlichkeit
mit der Sequenz des pknD-Gens aufweist. Sie eignen sich ferner zum
Einbringen in so genannte Arrays, Mikroarrays oder DNA-Chips zum
Nachweisen und Bestimmen der entsprechenden Polynucleotide.
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Polynucleotide,
die diese Sequenzen enthalten, eignen sich auch als Primer zur Herstellung
von DNA von Genen, die Proteinkinase D codieren, mit der Polymerasekettenreaktion
(PCR).
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Solche
Oligonucleotide, die als Sonden oder Primer dienen, umfassen mindestens
25, 26, 27, 28, 29 oder 30, vorzugsweise mindestens 20, 21, 22,
23 oder 24 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18
oder 19 aufeinanderfolgende Nucleotide. Oligonucleotide mit einer
Länge von
mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder mindestens
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 Nucleotiden sind ebenfalls geeignet.
Oligonucleotide mit einer Länge
von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nucleotiden können ebenfalls
geeignet sein.
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”Isoliert” bedeutet
aus seiner natürlichen
Umgebung abgetrennt.
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”Polynucleotid” betrifft
im Allgemeinen Polyribonucleotide und Polydesoxyribonucleotide,
wobei die in Frage kommenden RNAs oder DNAs unmodifiziert oder modifiziert
sein können.
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Die
beschriebenen Polynucleotide umfassen ein Polynucleotid gemäß SEQ ID
Nr. 1 oder ein davon hergestelltes Fragment sowie Polynucleotide,
die insbesondere zu mindestens 70% bis 80%, vorzugsweise mindestens
81% bis 85%, besonders bevorzugt zu mindestens 86% bis 90% und ganz
besonders bevorzugt zu mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch
zu dem Polynucleotid gemäß SEQ ID
Nr. 1 oder einem davon hergestellten Fragment sind.
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Unter ”Polypeptiden” werden
Peptide oder Proteine verstanden, die zwei oder mehrere Aminosäuren umfassen,
die über
Peptidbindungen gebunden sind.
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Die
beschriebenen Polypeptide umfassen ein Polypeptid gemäß SEQ ID
Nr. 2 mit der biologischen Aktivität der Proteinkinase D und ferner
solche, die zu mindestens 70% bis 80%, vorzugsweise mindestens 81% bis
85%, besonders bevorzugt zu mindestens 86% bis 90% und ganz besonders
bevorzugt zu mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch zu
dem Polypeptid gemäß SEQ ID
Nr. 2 sind und die genannte Aktivität besitzen.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Fermentationsverfahren zur Herstellung
von Aminosäuren,
die aus der Gruppe ausgewählt
sind, die L-Asparagin, L-Threonin,
L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin,
L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin
umfasst, unter Verwendung von Corynebakterien, die insbesondere
bereits Aminosäuren
produzieren und in denen die Nucleotidsequenzen, die das pknD-Gen
codieren, überexprimiert
werden.
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In
diesem Zusammenhang beschreibt der Begriff ”Amplifikation” den Anstieg
der intrazellulären
Aktivität
in einem Mikroorganismus von einem oder mehreren Enzymen, die von
der entsprechenden DNA codiert werden, zum Beispiel durch Erhöhung der
Kopienzahl des (der) Gen(s/e) oder Allel(s/e) unter Verwendung eines
starken Promotors oder unter Verwendung eines Gens oder Allels,
das ein entsprechendes Enzym mit hoher Aktivität codiert, und gegebenenfalls
durch Kombination dieser Maßnahmen.
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Durch Überexpression
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500% bis zu einem Maximum von 1000% oder 2000%, bezogen auf diejenige
des Wildtyp-Proteins oder die Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangsorganismus, erhöht.
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Die
Mikroorganismen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt
werden, können
L-Aminosäuren
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, Stärke oder
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Diese Mikroorganismen
können
repräsentativ
für Corynebakterien,
insbesondere die Gattung Corynebacterium, sein. Aus der Gattung
Corynebacterium kann insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum
genannt werden, die dem Fachmann für ihre Fähigkeit zur Produktion von
L-Aminosäuren bekannt
ist.
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Die
folgenden bekannten Wildtyp-Stämme:
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes
FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium
flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium
divaricatum ATCC14020
und L-Aminosäuren produzierende Mutanten
oder Stämme,
die daraus hergestellt wurden, sind besonders geeignete Stämme der
Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium
glutamicum (C. glutamicum).
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Das
neue pknD-Gen von C. glutamicum, welches das Enzym Proteinkinase
D (EC 2.7.1.37) codiert, ist isoliert worden.
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Ein
erster Schritt bei der Isolation des pknD-Gens oder anderer Gene
von C. glutamicum ist die Konstruktion einer Genbibliothek dieses
Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli). Die Konstruktion
von Genbibliotheken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern
dokumentiert. Beispiele, die erwähnt werden
können,
sind das Lehrbuch von Winnacker mit dem Titel From Genes to Clones,
Introduction to Gene Technology (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland,
1990) oder das Handbuch von Sambrook et al. mit dem Titel Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Eine sehr bekannte Genbibliothek ist diejenige des E. coli-K-12-Stammes
W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren
konstruiert wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics
252, 255–265,
1996) beschreiben eine Genbibliothek von C. glutamicum ATCC13032,
die unter Verwendung des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al.,
1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 2160–2164) im
E. coli-K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research
16, 1563–1575)
konstruiert wurde.
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Börmann et
al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326 (1992)) beschreiben wiederum
eine Genbibliothek von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung
des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)).
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Eine
Genbibliothek von C. glutamicum in E. coli kann auch unter Verwendung
von Plasmiden, wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences 25, 807–818 (1979))
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene 19, 259–268) konstruiert werden. Restriktions-
und rekombinationsdefiziente E. coli-Stämme sind als Wirte besonders
geeignet, wofür
der Stamm DH5αmcr,
der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 87 (1990) 4645–4649)
beschrieben wurde, ein Beispiel ist. Die langen DNA-Fragmente, die
mithilfe von Cosmiden kloniert werden, können dann wiederum in übliche Vektoren,
die sich zur Sequenzierung eignen, subkloniert und anschließend sequenziert
werden, z. B. wie von Sanger et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 74, 5463–5467, 1977)
beschrieben.
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Die
erhaltenen DNA-Sequenzen können
dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyseprogrammen, wie
z. B. demjenigen von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)),
demjenigen von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988))
oder dem GCG-Programm
von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)),
untersucht werden.
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Die
DNA-Sequenz aus C. glutamicum, die das pknD-Gen codiert, wurde gefunden und ist
als SEQ ID Nr. 1 Teil der vorliegenden Beschreibung. Die Aminosäuresequenz
des entsprechenden Proteins wurde zudem von dieser DNA-Sequenz durch
die vorstehend beschriebenen Verfahren abgeleitet. Die so erhaltene
Aminosäuresequenz
des pknD-Genproduktes ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
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Codierende
DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID Nr. 1 durch die Degeneration
des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Ebenso sind DNA-Sequenzen,
die mit SEQ ID Nr. 1 oder Abschnitten von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren,
Teil der Erfindung. Ferner sind konservative Aminosäurenaustausche,
z. B. der Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen
Glutaminsäure,
in Proteinen dem Fachmann als ”Sense-Mutationen” bekannt,
die keine grundlegende Veränderung
der Aktivität
des Proteins verursachen, d. h. sie sind neutral. Es ist ebenfalls
bekannt, dass Veränderungen
am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion im Wesentlichen
nicht behindern oder diese sogar stabilisieren können. Der Fachmann findet Informationen
zu diesem Thema u. a. in Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology
169, 751–757
(1987)), O'Regan
et al. (Gene 77, 237–251
(1989)), Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3, 240–247 (1994))
und Hochhuli et al. (Bio/Technology 6, 1321–1325 (1988)) sowie in bekannten
Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie.
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Aminosäuresequenzen,
die sich entsprechend aus SEQ ID Nr. 2 ergeben, bilden ebenfalls
einen Teil der Beschreibung.
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Ebenso
sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID Nr. 1 oder Abschnitten von SEQ
ID Nr. 1 hybridisieren, Teil der Beschreibung. Schließlich sind
DNA-Sequenzen, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung
von Primern, die sich aus SEQ ID Nr. 1 ergeben, Teil der Beschreibung.
Solche Oligonucleotide haben üblicherweise
eine Länge
von mindestens 15 Nucleotiden.
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Der
Fachmann findet Anleitungen für
die Identifikation von DNA-Sequenzen mithilfe von Hybridisierung
u. a. in dem Handbuch mit dem Titel ”The DIG System User's Guide for Filter
Hybridization” von
Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und in Liebl
et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41, 255–260).
Die Hybridisierung erfolgt unter stringenten Bedingungen; anders
gesagt, werden nur Hybride gebildet, bei denen die Sonde und die
Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynucleotide,
zu mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz
der Hybridisierung, einschließlich
der Waschschritte, durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der
Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst oder bestimmt wird.
Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise unter relativ niedriger
Stringenz, verglichen mit den Waschschritten, durchgeführt (Hybaid
Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, GB, 1996).
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Die
Hybridisierungsreaktion kann zum Beispiel unter Verwendung eines
5 × SSC-Puffers
bei einer Temperatur von etwa 50°C–68°C durchgeführt werden,
wobei es ebenfalls möglich
ist, dass Sonden mit Polynucleotiden hybridisieren, die zu weniger
als 70% identisch zu der Sequenz der Sonde sind. Solche Hybride sind
weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen
entfernt. Dies kann zum Beispiel durch Senken der Salzkonzentration
auf 2 × SSC
und anschließend
auf 0,5 × SSC,
wenn nötig,
erzielt werden (The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer
Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995), wobei die Temperatur auf
etwa 50°C–68°C eingestellt
wird. Es ist möglich,
die Salzkonzentration, wenn nötig,
auf 0,1 × SSC
zu senken. Durch Erhöhen
der Hybridisierungstemperatur in Schritten von etwa 1–2°C von 50°C auf 68°C ist es
möglich,
Polynucleotidfragmente zu isolieren, die z. B. zu mindestens 70%,
zu mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% identisch zu der Sequenz
der verwendeten Sonde sind. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung
sind in Form von Kits kommerziell erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb
von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalog-Nr. 1603558).
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Der
Fachmann findet Anleitungen für
die Amplifikation von DNA-Sequenzen mithilfe der Polymerasekettenreaktion
(PCR) u. a. in dem Handbuch von Gait mit dem Titel Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, GB, 1984) und
in Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Deutschland, 1994).
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Es
wurde gefunden, dass nach Überexpression
des pknD-Gens die Produktion von Aminosäuren durch Corynebakterien
verbessert ist.
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Eine Überexpression
kann durch Erhöhen
der Kopienzahl der entsprechenden Gene oder Mutieren des Promotors
und der regulatorischen Region oder der Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts
des Strukturgens befinden, erzielt werden. Expressions kassetten,
die stromaufwärts
des Strukturgens eingebracht werden, arbeiten auf die gleiche Weise.
Induzierbare Promotoren machen es weiterhin möglich, die Expression im Verlauf
der Aminosäureproduktion
durch Fermentation zu erhöhen.
Maßnahmen
zur Verlängerung
der Lebensdauer der mRNA verbessern ebenfalls die Expression. Ferner
wird die Enzymaktivität
auch durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins erhöht. Die
Gene oder Genkonstrukte können
sich entweder in Plasmiden variabler Kopienzahl oder integriert
und amplifiziert im Chromosom befinden. Alternativ ist es ebenfalls möglich, eine Überexpression
der in Frage kommenden Gene durch Verändern der Zusammensetzung der Medien
und der Anzuchttechnik zu erreichen.
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Der
Fachmann findet relevante Anleitungen u. a. in Martin et al. (Bio/Technology
5, 137–146
(1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga
(Bio/Technology 6, 428–430
(1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)),
EP 0 472 869 ,
US 4,601,893 , Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9,
84–87,
(1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126–132
(1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)),
WO 96/15246 , Malumbres
et al. (Gene 134, 15–24 (1993)),
JP-A-10-229891 ,
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998))
und Makrides (Microbiological Reviews 60, 512–538 (1996)) sowie in bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie.
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Zur
Amplifikation ist das pknD-Gen gemäß der Beschreibung zum Beispiel
mithilfe episomaler Plasmide überexprimiert
worden. Geeignete Plasmide sind solche, die in Corynebakterien repliziert
werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, z. B. pZ1 (Menkel et
al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64, 549–554), pEKEx1
(Eikmanns et al., Gene 102, 93–98
(1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107, 69–74 (1991)), basieren auf den
kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren,
z. B. diejenigen auf Basis von pCG4 (
US-A-4,489,160 ), pNG2 (Serwold-Davis et al.,
FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)) oder pAG1 (
US-A-5,158,891 ),
können
auf die gleiche Weise eingesetzt werden.
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Andere
geeignete Plasmidvektoren sind solche, die es ermöglichen,
das Genamplifikationsverfahren mittels Integration in das Chromosom
zu verwenden, wie zum Beispiel von Reinscheid et al. (Applied and
Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) für die Duplikation
oder Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben. Bei diesem
Verfahren wird das vollständige
Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der sich in einem Wirt (üblicherweise
E. coli), aber nicht in C. glutamicum replizieren kann. Beispiele
für geeignete
Vektoren sind pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology l, 784–791 (1983)),
pK18mob oder pK19mob (Schäfer
et al., Gene 145, 69–73
(1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO
(Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269, 32678–84;
US-A-5,487,993 ),
pCR
®Blunt
(Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of
Molecular Biology, 234: 534–541
(1993)), pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173,
4510–4516)
oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41, 337–342). Der Plasmidvektor, der das
zu amplifizierende Gen enthält,
wird dann durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm
von C. glutamicum übertragen.
Das Verfahren der Konjugation ist beispielsweise in Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Verfahren
zur Transformation sind beispielsweise in Thierbach et al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067–1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994))
beschrieben. Nach homologer Rekombination mithilfe eines Crossover-Ereignisses
enthält
der so erhaltene Stamm mindestens zwei Kopien des in Frage kommenden
Gens.
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Es
wurde ebenfalls gefunden, dass Aminosäureaustausche in dem Abschnitt
zwischen Position 661 und Position 669 der Aminosäuresequenz
der Proteinkinase D, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, die Produktion
von Aminosäuren,
insbesondere Lysin, durch Corynebakterien verbessern.
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Vorzugsweise
wird die Glutaminsäure
an Position 664 gegen jede andere proteogene Aminosäure, mit Ausnahme
von L-Glutaminsäure,
ausgetauscht, und/oder Glycin an Position 666 wird gegen jede andere
proteogene Aminosäure,
mit Ausnahme von Glycin, ausgetauscht.
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Der
Austausch an Position 664 erfolgt vorzugsweise gegen L-Lysin oder
L-Arginin, insbesondere L-Lysin, und der Austausch an Position 666
erfolgt vorzugsweise gegen L-Serin oder L-Threonin, insbesondere L-Serin.
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SEQ
ID Nr. 3 zeigt die Rasensequenz des pknD-1547-Allels, das im Stamm DM1547 enthalten
ist. Das pknD-1547-Allel
codiert ein Protein, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 4
gezeigt ist. Das Protein enthält
L-Lysin an Position 664 und L-Serin an Position 666. Die DNA-Sequenz
des pknD-1547-Allels (SEQ ID Nr. 3) enthält die Base Adenin anstelle
der Base Guanin, die im pknD-Wildtypgen (SEQ ID Nr. 1) enthalten
ist, an Position 2501 und die Base Adenin anstelle der Base Guanin
an Position 2507.
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Eine
Mutagenese kann durch herkömmliche
Verfahren unter Verwendung von mutagenen Substanzen, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
oder Ultraviolettlicht, durchgeführt
werden. Eine Mutagenese kann auch unter Verwendung von In-vitro-Verfahren,
wie Behandlung mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in
Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, 1992) oder mutagene Oligonucleotide (T. A. Brown: Gentechnologie
für Einsteiger
(Gene Technology for Beginners), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993)
oder die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie in dem Handbuch von
Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
1994) beschrieben, erfolgen.
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Die
entsprechenden Allele oder Mutationen werden sequenziert und in
das Chromosom durch das Verfahren des Genaustausches, wie zum Beispiel
in Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) für das pyc-Gen von C. glutamicum,
in Schäfer
et al. (Gene 145, 69–73
(1994)) für
die hom-thrB-Genregion von C. glutamicum oder in Schäfer et al.
(Journal of Bacteriology 176, 7309–7319 (1994)) für die cg1-Genregion
von C. glutamicum beschrieben, eingebracht. Die entsprechenden Allele
oder die damit in Zusammenhang stehenden Proteine können gegebenenfalls
wiederum amplifiziert werden.
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Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft
sein, nicht nur das pknD-Gen, sondern auch ein oder mehrere Enzyme
des bestimmten Biosyntheseweges, der Glycolyse, der Anaplerose, des
Citratzyklus, des Pentosephosphat-Zyklus oder des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren.
-
So
können
beispielsweise zur Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich zur Überexpression des pknD-Gens
ein oder mehrere endogene Gene überexprimiert
werden, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
- • das dapA-Gen,
das Dihydrodipicolinatsynthase codiert, ( EP-B-0 197 335 ),
- • das
gap-Gen, das Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase codiert, (Eikmanns
(1992), Journal
- • of
Bacteriology 174, 6076–6086),
- • das
tpi-Gen, das Triosephosphatisomerase codiert, (Eikmanns (1992),
Journal of Bacteriology 174, 6076–6086),
- • das
pgk-Gen, das 3-Phosphoglyceratkinase codiert, (Eikmanns (1992),
Journal of Bacteriology 174, 6076–6086),
- • das
zwf-Gen, das Glucose-6-phosphatdehydrogenase codiert, ( JP-A-09224661 ),
- • das
pyc-Gen, das Pyruvatcarboxylase codiert, ( DE-A-198 31 609 ),
- • das
lysC-Gen, das eine rückkopplungsresistente
Aspartatkinase codiert, (Zugangsur. P26512; EP-B-0387527 ; EP-A-0699759 ),
- • das
lysE-Gen, das Lysin-Export codiert, ( DE-A-195 48 222 ),
- • das
hom-Gen, das Homoserindehydrogenase codiert, ( EP-A-0131171 ),
- • das
ilvA-Gen, das Threonindehydratase codiert, (Möckel et al., Journal of Bacteriology
(1992) 8065–8072)),
oder das ilvA(Fbr)-Allel, das eine rückkopp-lungsresistente Threonindehydratase
codiert, (Möckel
et al., (1994), Molecular Microbiology 13, 833–842),
- • das
ilvBN-Gen, das Acetohydroxysäuresynthase
codiert, ( EP-B-0356739 ),
- • das
ilvD-Gen das Dihydroxysäuredehydratase
Codiert, (Sahm und Eggeling (1999); Applied and Environmental Microbiology
65, 1973–1979),
- • das
zwa1-Gen, das das Zwa1-Protein codiert, ( DE 199 59 328.0 , DSM13115).
-
Zusätzlich zur Überexpression
des pknD-Gens kann es für
die Produktion von L-Aminosäuren
ferner vorteilhaft sein, ein oder mehrere Gene, die aus der Gruppe
ausgewählt
sind:
- • das
pck-Gen, das Phosphoenolpyruvatcarboxykinase codiert, ( DE 199 50 409.1 , DSM13047),
- • das
pgi-Gen, das Glucose-6-phosphatisomerase codiert, ( US 09/396,478 , DSM12969),
- • das
poxB-Gen, das Pyruvatoxidase codiert, ( DE 199 51 975.7 , DSM13114),
- • das
zwa2-Gen, das das Zwa2-Protein codiert, ( DE 199 59 327.2 , DSM13113),
zu
attenuieren und insbesondere die Expression zu verringern.
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In
diesem Zusammenhang beschreibt ”Attenuation” die Verringerung
oder das Abschalten der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen
(Proteinen), die von der entsprechenden DNA codiert werden, in einem
Mikroorganismus, zum Beispiel indem ein schwacher Promotor oder
ein Gen oder Allel, die ein entsprechendes Enzym mit niedriger Aktivität codieren,
verwendet werden oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein)
inaktiviert wird und gegebenenfalls durch Kombination dieser Maßnamen.
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Durch
Attenuationsmaßnahmen
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins gewöhnlich auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangsmikroorganismus verringert.
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Für die Produktion
von Aminosäuren
kann ebenfalls von Vorteil sein, nicht nur das pknD-Gen überzuexprimieren,
sondern auch ungewünschte
Nebenreaktionen abzuschalten (Nakayama: ”Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms”,
in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.),
Academic Press, London, GB, 1982).
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Die
erfindungsgemäß hergestellten
Mikroorganismen werden ebenfalls von der Erfindung bereitgestellt
und können
zur Herstellung von Aminosäuren
kontinuierlich oder diskontinuierlich durch das Batch-Verfahren,
das Fed-Batch-Verfahren oder das wiederholte Fed-Batch-Verfahren gezüchtet werden.
Eine Zusammenfassung bekannter Anzuchtverfahren ist im Lehrbuch
von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg-Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)) beschrieben.
-
Das
zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der jeweiligen
Stämme
auf geeignete Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien
für verschiedene
Mikroorganismen können
in ”Manual of
Methods for General Bacteriology” der American Society for
Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) gefunden werden.
-
Kohlenstoffquellen,
die verwendet werden können,
sind Zucker und Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melassen, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette, z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl
und Kokosnussbutter, Fettsäuren,
z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole, z. B. Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, z.
B. Essigsäure.
Diese Substanzen können
einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
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Stickstoffquellen,
die verwendet werden können,
sind organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maiseinweich-flüssigkeit, Sojabohnenmehl und
Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
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Phosphorquellen,
die verwendet werden können,
sind Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhy-drogenphosphat oder die
entsprechenden Natriumsalze. Das Kulturmedium muss ferner Metallsalze
enthalten, z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum
erforderlich sind. Schließlich können essentielle
wachstumsfördernde
Substanzen, wie Aminosäuren
und Vitamine, zusätzlich
zu den vorstehend genannten Substanzen verwendet werden. Geeignete
Vorstufen können
ebenfalls zum Kulturmedium gegeben werden. Diese Nährmaterialien
können
zu der Kultur auf einmal zugefügt
oder während
der Anzucht auf geeignete Weise eingespeist werden.
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Der
pH-Wert der Kultur wird durch geeignete Verwendung basischer Verbindungen,
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser,
oder saurer Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, reguliert.
Das Schäumen
kann unter Verwendung von Antischäummitteln, wie Fettsäurepolyglycolestern,
reguliert werden. Die Stabilität
von Plasmiden kann durch Zugabe geeigneter selektiv wirkender Substanzen,
z. B. von Antibiotika, zu dem Medium aufrechterhalten werden. Aerobe
Bedingungen werden durch Einbringen von Sauerstoff oder sauerstoffhaltiger
Gasgemische, z. B. Luft, in die Kultur aufrechterhalten. Die Temperatur
der Kultur beträgt
gewöhnlich
20°C bis
45°C und
vorzugsweise 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird fortgesetzt, bis die Bildung des gewünschten
Produkts ein Maximum erreicht hat. Dieses Ziel wird gewöhnlich innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erzielt.
-
Verfahren
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Sie können zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie
mit anschließender
Ninhydrin-Derivatisierung, wie von Spackman et al. (Analytical Chemistry
30 (1958) 1190) beschrieben, oder durch Umkehrphasen-HPLC, wie von
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51, 1167–1174) beschrieben,
analysiert werden.
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Eine
reine Kultur des Corynebacterium glutamicum-Stammes DM1547 wurde als DSM 13994 bei
der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)
am 16. Januar 2001 gemäß dem Budapester
Vertrag hinterlegt.
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Eine
reine Kultur des Escherichia coli-Stammes S17-l/pKl8mobsacB_pknD_XL
wurde als DSM 14410 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Deutschland) am 18. Juli 2001 gemäß dem Budapester
Vertrag hinterlegt.
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Das
erfindungsgemäße Fermentationsverfahren
wird zur Herstellung von Aminosäuren
verwendet.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen eingehender
erläutert.
-
Die
Isolation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und sämtliche
Techniken zur Restriktions, Klenow-Behand-lung und alkalische-Phosphatase-Behandlung
erfolgten gemäß Sambrook
et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Verfahren
zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem
Handbuch beschrieben.
-
Die
Zusammensetzung bekannter Nährmedien,
wie LB- oder TV-Medium,
kann ebenfalls in dem Handbuch von Sambrook et al. gefunden werden.
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Beispiel 1
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Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbibliothek
aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032
-
Chromosomale
DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde isoliert, wie
von Tauch et al. (1995, Plasmid 33, 168–179) beschrieben, und mit
dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente
wurden mit alkalischer Phosphatase aus Krabben (Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmidvektors SuperCos1 (Wahl et al.
(1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84,
2160–2164),
die von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1-Cosmidvektor-Kit,
Code-Nr. 251301) erhalten wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym
XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI,
Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit alkalischer Phosphatase
aus Krabben dephosphoryliert.
-
Die
Cosmid-DNA wurde dann mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr.
27-0868-04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten
ATCC13032-DNA gemischt, und das Gemisch wurde mit T4-DNA-Ligase
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch
wurde dann unter Verwendung von Gigapack-II-XL-Verpackungsextrakt
(Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack-II-XL-Verpackungsextrakt,
Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt.
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Zur
Infektion des E. coli-Stammes NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic
Acid Research 16, 1563–1575) wurden
die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und
mit einem Aliquot der Phagensuspension gemischt. Infektion und Titerbestimmung
der Cosmidbibliothek erfolgten wie von Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben, wobei
die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology 1, 190), der 100
mg/l Ampicillin enthielt, plattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht
bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektiert.
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Beispiel 2
-
Isolation und Sequenzierung des pknD-Gens
-
Die
Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep-Spin-Miniprep-Kit
(Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach den Anweisungen
des Herstellers isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr.
27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurde mit alkalischer
Phosphatase aus Krabben (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephospho-ryliert.
Nach Auftrennung mittels Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente
im Größenbereich
von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII-Gelextraktionskit (Produkt-Nr.
20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
-
Die
DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, die von Invitrogen (Groningen,
Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr.
K2500-01) erhalten wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente
in den Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt,
wobei das DNA-Gemisch über Nacht
mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) inkubiert
wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde dann in den E. Coli Stamm DH5αMCR (Grant;
1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 4645–4649) mittels
Elektroporation (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters 123,
343–7)
eingebracht und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology 1, 190), der
50 mg/l Zeocin enthielt, ausplattiert.
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Die
Plasmidpräparation
der rekombinanten Klone wurde mittels Biorobot 9600 (Produkt-Nr.
900200, Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die Sequenzierung erfolgte
durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren
von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 74, 5463–5467) mit
Modifikationen von Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Reasearch
18, 1067). Das ”RRdRhodamin-Terminator-Cycle-Sequenzierungs-kit” von PE
Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland)
wurde verwendet. Eine Auftrennung mittels Gelelektrophorese und
Analyse der Sequenzreaktion wurde in einem ”Rotiphorese-NF-Acrylamid/Bisacrylamid”-Gel (29:1)
(Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit der ”ABI Prism
377”-Sequenzierapparatur
von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt.
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Die
erhaltenen rohen Sequenzdaten wurden dann unter Verwendung des Staden-Programmierpakets (1986,
Nucleic Acids Research 14, 217–231),
Version 97-0, verarbeitet. Die einzelnen Sequenzen der pzero-1-Derivate wurden zu
einem zusammenhängenden
Contig zusammengefügt.
Eine computerunterstützte Analyse
der codierenden Region erfolgte mit dem XNIP-Programm (Staden, 1986,
Nucleic Acids Research 14, 217–231).
-
Die
erhaltene Nucleotidsequenz ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Eine
Analyse der Nucleotidsequenz ergab einen offenen Leserahmen von
2223 Basenpaaren, der als pknD-Gen bezeichnet wurde. Das pknD-Gen codiert
ein Protein mit 740 Aminosäuren.
-
Beispiel 3
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Präparation
eines Austauschvektors zum Austausch der pknD-Allele
-
Chromosomale
DNA wurde aus dem Stamm DSM13994 durch das Verfahren von Eikmanns
et al. (Microbiology 140: 1817–1828
(1994)) isoliert. Auf Basis der für C. glutamicum aus Beispiel
2 bekannten Sequenz des pknD-Gens
wurden die folgenden Oligonucleotide für die Polymerasekettenreak-tion
ausgewählt
(s. a. SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6):
pknD_XL-A1:
5' (tct aga) cgg ttg
gtg gtt cgg ttc ag 3'
pknD_XL-E1:
5' (tct aga) agc ggc
aat gcc ggt gag ta 3'
-
Die
dargestellten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland)
synthetisiert, und die PCR-Reaktion
wurde durch das PCR-Verfahren von Karreman (BioTechniques 24: 736–742, 1998)
mit Pwo-Polymerase von Boehringer durchgeführt. Die Primer pknD_XL-A1
und pknD_XL-E1 enthalten jeweils eine eingefügte Spaltstelle für das Restriktionsenzym
XbaI, die in der Darstellung in Klammern angegeben sind. Mithilfe
der Polymeraseketten-reaktion wird ein 1,6 kb großer DNA-Abschnitt amplifiziert
und isoliert, der das pknD-Gen oder -Allel trägt.
-
Das
amplifizierte DNA-Fragment von etwa 1,6 kb Länge, welches das pknD-Allel
des Stammes DSM13994 trägt,
wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten, auf einem 0,8%igen
Agarosegel identifiziert, aus dem Gel isoliert und mittels herkömmlicher
Verfahren (QIAquick-Gelextraktionskit, Qiagen, Hilden) gereinigt.
-
Das
Plasmid pK18mobsacB (Jäger
et al., Journal of Bacteriology, 1: 784–791 (1992)) wurde ebenfalls mit
dem Restriktionsenzym XbaI gespalten. Das Plasmid pK18mobsacB und
das PCR-Fragment wurden ligiert. Der E. coli-Stamm S17-1 (Simon
et al., 1993, Bio/Technology 1: 784–791) wurde dann mit dem Ligationsansatz elektroporiert
(Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. Band I, IRL-Press,
Oxford, Washington DC, USA, 1985). Eine Selektion plasmidtragender
Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes
auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual.
2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin angereichert war. Plasmid-DNA
wurde aus einer Transformante mithilfe des QIAprep-Spin-Miniprep-Kits
von Qiagen isoliert und mittels Restriktion mit dem Restriktionsenzym
XbaI und anschließender
Agarosegelelektrophorese (0,8%) überprüft. Das
Plasmid wurde als pK18mobsacB_pknD_XL bezeichnet und ist in 1 dargestellt.
-
Kurze Beschreibung der Figur:
-
1:
Karte des Plasmids pK18mobsacB_pknD_XL
-
Die
verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung. Die Längendaten sollen
als ungefähre
Werte verstanden werden.
- sacB: sacB-Gen
- oriV: Replikationsursprung V
- KmR: Kanamycinresistenz
- XbaI: Spaltstelle für
das Restriktionsenzym XbaI
- pknD': unvollständiges Fragment
des pknD-Gens aus DM1547
SEQUENZPROTOROLL
