ES2231089T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapf. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos que codifican el gen dapf.Info
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Abstract
Secuencias de nucleótidos que codifican el gen dapF y un procedimiento para la preparación fermentativa de L-lisina utilizando la bacteria corineforme en la que el gen dapF está amplificado. La L-lisina se utiliza en medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en particular en la nutrición animal. La L-lisina se prepara por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum.
Description
Secuencias de nucleótidos que codifican el gen
dapF.
La invención proporciona secuencias de
nucleótidos que codifican el gen dapF y un procedimiento para la
preparación fermentativa de L-lisina utilizando la
bacteria corineforme en la que el gen dapF está amplificado.
La L-lisina se utiliza en
medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en particular
en la nutrición animal.
Es sabido que la L-lisina se
prepara por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en
particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran
importancia, se están emprendiendo constantemente trabajos para
mejorar el proceso de preparación. Las mejoras al proceso pueden
referirse a medidas en la fermentación, tales como p. ej., agitación
y aporte de oxígeno o la composición del medio nutriente, tal como
p. ej., la concentración de azúcar durante la fermentación, o el
funcionamiento de la forma del producto p. ej., por cromatografía de
intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de la producción
del propio microorganismo.
Los métodos de mutagénesis, la selección y la
selección del mutante se utilizan para mejorar las propiedades de la
producción de estos microorganismos. Las cepas que son resistentes a
antimetabolitos, tales como por ejemplo el análogo de lisina
S-(2-aminoetil) -cisteína, o que son auxótrofas para
aminoácidos de importancia reguladora y producen
L-lisina se obtienen de esta manera.
Los métodos de la técnica de ADN recombinado se
han empleado durante algunos años para mejorar la cepa de
Corynebacterium, cepas que producen L-lisina,
amplificando los genes individuales de la biosíntesis de lisina e
investigando el efecto sobre la producción de
L-lisina. Se han encontrado artículos de consulta en
este contexto, entre otros, en Kinoshita ("Glutamic Acid
Bacteria", en: Biology of Industrial Microorganisms,
Demain y Solomon (eds.), Benjamin Cummings, Londres, R.U., 1985,
115-142), Hilliger (BioTec 2,
40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids
6:261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical
Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y
Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of
Science 782, 25-39 (1996)).
En los procariotas, se conocen tres vías
diferentes para la biosíntesis de
D,L-diaminopimelato- o de L-lisina.
Estas vías se diferencian en la reacción de
L-piperidina-2,6-dicarboxilato
(tetrahidrodipicolinato).
En la vía de la succinilasa, el
tetrahidrodipicolinato se transforma en
D,L-diamino-pimelato mediante una
succinilación por tetrahidrodipicolinato succinilasa, transaminación
posterior
(N-succinil-amino-cetopimelato
transaminasa) del grupo ceto, desuccinilación de
(N-succinil-amino-cetopimelato
desuccinilasa) y a continuación epimerización (diaminopimelato
epimerasa) (Gilvarg, 1958, The Journal of Biological
Chemistry, 233:1501-1504).
En la vía de la acetilasa, que se realiza en
Bacillus subtilis y Bacillus megaterium, la acilación
de tetrahidrodipicolinato se realiza mediante un radical acetilo
(Weinberger y Gilvarg, 1970, Journal of Bacteriology,
101:323-324).
Una tercera vía de biosíntesis se describe para
B. sphaericus (Misono et al., 1976, Journal of
Bacteriology, 137:22-27). En esta etapa de
biosíntesis que se denomina la vía de la deshidrogenasa, tiene lugar
la aminación reductora directa del tetrahidrodipicolinato a
D,L-DAP.
Con la ayuda de estudios genéticos y enzimáticos,
Schrumpf et al. (Journal of Bacteriology 173,
4510-4516 (1991)) demostraron que en
Corynebacterium glutamicum, tiene lugar la biosíntesis de la
lisina tanto por la vía de la deshidrogenasa como por la vía de la
succinilasa.
En estudios in vivo por RMN por Marx et
al., (Biotechnology and Bioengineering
56,168-18 (1997)) y Sonntag (European Journal of
Biochemistry 213: 1325-1331 (1993)) se ha
observado que en Corynebacterium glutamicum tanto la vía de
la succinilasa como la vía de la deshidrogenasa contribuyen a la
producción de L-lisina.
El gen para la desuccinilasa (dapE) de
Corynebacterium glutamicum ha sido clonado y secuenciado por
Wehrmann et al. (Journal of Bacteriology 177:
5991-5993 (1995)). Ha sido posible asimismo clonar y
secuenciar el gen para succinilasa (dapD) de Corynebacterium
glutamicum (Wehrmann et al., Journal of
Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)).
Los inventores tenían el objeto de proporcionar
nuevas medidas para mejorar la preparación fermentativa de la
L-lisina.
Se utiliza L-lisina en medicina
humana, en la industria farmacéutica y en particular en la nutrición
animal. Existe por consiguiente un interés general en proporcionar
nuevos procedimientos mejorados para la preparación de
L-lisina.
Cuando se mencionan L-lisina o
lisina en lo que sigue, no solo se mencionan la base sino también
las sales, tales como por ejemplo monohidrocloruro de lisina o
sulfato de lisina.
La invención proporciona un polinucleótido
aislado de la bacteria corineforme que comprende una secuencia de
polinucleótidos seleccionada del grupo constituido por
- a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica hasta el punto de al menos el 95% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID nº: 2, en la que dicho polipéptido presenta una actividad de diaminopimelato epimerasa.
- b)
- un polinucleótido que es complementario del polinucleótido de a).
La invención también proporciona el
polinucleótido según la reivindicación 2, que es el ADN que es capaz
de replicación en la bacteria corineforme, que comprende:
- 1)
- la secuencia de nucleótidos presentada en la SEQ. ID nº: 1, o
- 2)
- una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia (1) dentro del margen de degeneración del código genético.
La invención también proporciona
un polinucleótido según la reivindicación 2, que
comprende la secuencia de nucleótidos presentada en la SEQ. ID nº:
1,
un polinucleótido según la reivindicación 2, que
codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos
tal como se presenta en la SEQ. ID nº: 2,
un vector que contiene la secuencia de
polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 6, en particular
pEC-XT99A-dapF, depositado como DSM
12968,
y sirviendo la bacteria corineforme como célula
huésped, que contiene el vector según la reivindicación 7.
La invención proporciona también polinucleótidos
que comprenden sustancialmente una secuencia de polinucleótidos, que
se pueden obtener por cribado mediante hibridación del banco de
genes correspondiente, que comprende el gen completo con la
secuencia de polinucleótidos correspondiente a la SEQ. ID nº: 1, con
una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido mencionado,
según la SEQ. ID nº: 1 o uno de sus fragmentos y el aislamiento de
la secuencia de ADN mencionada.
Las secuencias de polinucleótido según la
invención son adecuadas como sondas de hibridación para ARN, ADNc y
ADN, con el fin de aislar, en toda su longitud, el ADNc que codifica
la diaminopimelato epimerasa y para aislar aquellos ADNc o los genes
que presentan una gran similitud de secuencia con la del gen de la
diaminopimelato epimerasa.
Las secuencias de polinucleótido según la
invención son además adecuadas como cebadores para la preparación de
ADN de los genes que codifican la diaminopimelato epimerasa mediante
la reacción en cadena de polimerasa (PCR).
Dichos oligonucleótidos que sirven como sondas o
cebadores comprenden al menos 30, preferentemente al menos 20. Los
oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 40 ó 50 pares
de bases son también adecuados.
"Aislado" significa separado de su medio
natural.
"Polinucleótido" en general se refiere a
polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, siendo posible
que éstos sean ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados.
"Polipéptidos" significa péptidos o
proteínas que comprenden dos o más aminoácidos unidos por enlaces
péptido.
Los polipéptidos según la invención incluyen un
polipéptido según la SEQ. ID nº: 2, en particular aquellos con
actividad biológica de diaminopimelato epimerasa, y también aquellos
que son idénticos hasta el punto de por lo menos el 95% del
polipéptido según la SEQ. ID nº: 2 y presentan la actividad
mencionada.
La invención también proporciona un procedimiento
para la preparación fermentativa de la L-lisina
utilizando las bacterias corineformes que en particular ya producen
L-lisina, y en las que las secuencias de nucleótidos
que codifican el gen dapF están amplificadas, en particular
sobre-expresadas.
El término "amplificación" en este contexto
describe el aumento de actividad intracelular de una o más enzimas
en un microorganismo que están codificadas por el correspondiente
ADN, por ejemplo aumentado el número de copias del gen o genes,
utilizando un activador potente o utilizando un gen que codifica una
enzima correspondiente que tiene una gran actividad y opcionalmente
combinando estas medidas.
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden preparar L-lisina a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón,
celulosa o a partir de glicerol y etanol. Pueden ser representativos
de las bacterias corineformes, en particular del género
Corynebacterium. Del género Corynebacterium, se puede
mencionar en particular la especie Corynebacterium
glutamicum, que es conocida entre los especialistas por su
capacidad para producir L-aminoácidos.
Las cepas adecuadas del género
Corynebacterium, en particular de las especies
Corynebacterium glutamicum, son, por ejemplo, las cepas
naturales conocidas
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y los mutantes o las cepas que
producen L-lisina producidos a partir de estas,
tales como, por
ejemplo
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum
FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6464 y
Corynebacterium glutamicum DSM5715
Los inventores han tenido éxito en el aislamiento
de nuevos genes dapF de C. glutamicum que codifica la enzima
diaminopimelato epimerasa (EC 5.1.1.7).
Para aislar el gen dapF o también otros genes de
C. glutamicum, en primer lugar se coloca un banco de genes de
este microorganismo en E. coli. La colocación de los bancos
de genes se describe en textos y manuales conocidos en general. El
texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die
Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el
manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) se pueden
mencionar como ejemplos. Un banco de genes bien conocido es el de la
cepa W3110 de E. coli K-12 colocado en los
vectores \lambda; por Kohara et al. (Cell 50,
495-508 (1987)). Bathe et al. (Molecular
and General Genetics, 252:255-265, 1996)
describe un banco de genes de C. glutamicum ATCC13032, que se
colocó con la ayuda del vector cósmico SuperCos I (Wahl et
al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 84:2160-2164) en la cepa NM554 de E.
coli K-12 (Raleigh et al., 1988,
Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Börman
et al. (Molecular Microbiology 6(3),
317-326)) a su vez describen un banco de genes de
C. glutamicum ATCC13032 utilizando el cósmico pHC79 (Hohn y
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Para
preparar un banco de genes de C. glutamicum en E. coli
también es posible utilizar plásmidos tales como pBR322 (Bolivar,
Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9
(Viera et al., 1982, Gene,
19:259-268). Los huéspedes adecuados son, en
particular, las cepas de E. coli que presentan defectos de
restricción y de combinación. Un ejemplo de éstas es la cepa
DH5\alphamcr, que ha sido descrita por Grant et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87
(1990) 4645-4649). Los fragmentos de ADN largo
clonados con ayuda de cósmidos pueden entonces a su vez ser
subclonados y posteriormente secuenciados en los vectores habituales
que son adecuados para el secuenciado, tal como es descrito p. ej.,
por Sanger et al. (Proceeding of the National Academy of
Sciences of the United Status of America,
74:5463-5467, 1977).
La nueva secuencia de ADN de C. glutamicum
que codifica el gen dapF y que es un constituyente de la presente
invención como SEQ. ID nº: 1 se obtuvo de esta manera. La secuencia
de aminoácidos de la correspondiente proteína se ha derivado además
de la presente secuencia de ADN por los métodos descritos
anteriormente. La secuencia de aminoácidos resultantes del producto
del gen dapF se presenta en la SEQ. ID nº: 2.
Las secuencias de codificación del ADN que
proceden de la SEQ. ID nº: 1 por degeneración del código genético
son asimismo constituyentes de la invención. De la misma manera, las
secuencias de ADN que se hibridan con la SEQ. ID nº: 1 o partes de
la SEQ. ID nº: 1 son constituyentes de la invención. Los
intercambios conservadores de aminoácidos, tal como por ejemplo el
intercambio de glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido
glutámico en las proteínas, se conocen además entre los expertos
como "mutaciones de la cadena transcrita" que no conducen a un
cambio fundamental en la actividad de la proteína, es decir son de
función neutra. Se sabe además que los cambios en el terminal N y/o
C de una proteína no pueden alterar sustancialmente o incluso pueden
estabilizar la función de ésta. La información en este contexto
puede ser encontrada por el experto, entre otros, en
Ben-Bassat et al. (Journal of
Bacteriology 169:751-757 (1987)), en O'Regan
et al. (Gene 77:237-251 (1989)), en
Sahin-Toth et al. (Protein Sciences
3:240-247 (1994)), en Hochuli et al.
(Bio/Technology 6 :1321-1325 (1988)) y en
conocidos libros de texto de genética y biología molecular. Las
secuencias de aminoácidos que dan como resultado una manera
correspondiente de la SEQ. ID nº: 2 son también constituyentes de la
invención.
Por último, las secuencias que se preparan
mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando
cebadores que proceden de la SEQ. ID nº: 1 son constituyentes de la
invención. Dichos oligonucleótidos normalmente tienen una longitud
de al menos 20 pares de bases.
Las instrucciones para la identificación de las
secuencias de ADN por medio de hibridación, pueden ser halladas por
el experto, entre otros en el manual "The DIG System Users Guide
for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GMBH (Mannheim,
Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal
of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).
Las instrucciones para la amplificación de las secuencias de ADN con
ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) pueden ser
halladas por el experto, entre otros, en el manual de Gait:
Oligonucleotide synthesis: a practical approach (IRL Press,
Oxford, UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).
Los inventores han descubierto que la bacteria
corineforme produce L-lisina de una manera mejor
después de la sobre-expresión del gen dapF.
Para conseguir una
sobre-expresión, se puede aumentar el número de
copias de los genes correspondientes o se puede mutar el activador y
la zona de regulación o el punto de fijación del ribosoma aguas
arriba del gen estructural. Los casetes de expresión que se
incorporan aguas arriba del gen estructural actúan del mismo modo.
Mediante activadores inducibles, es posible además aumentar la
expresión en el transcurso de la producción fermentativa de
L-lisina. La expresión se mejora probablemente
mediante medidas para prolongar la vida del ARN-m.
Además, la actividad de la enzima se aumenta también evitando la
degradación de la proteína enzimática. Los genes o las
construcciones de genes pueden estar presentes en los plásmidos con
un número variable de copias o pueden estar integradas y
amplificadas en el cromosoma. Por otra parte, una
sobre-expresión de los genes en cuestión puede
conseguirse además cambiando la composición del medio y el
procedimiento de cultivo.
En este contexto las instrucciones pueden ser
halladas por el experto, entre otros, en Martin et al.
(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41
(1994)), en Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6,
428-430 (1988)), en Eikmanns et al.
(Gene 102, 93-98 (1991)), en la memoria de
patente europea EPS 0 472 869, en la patente U.S. nº 4.601.893, en
Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87
(1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental
Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre
et al. (Journal of Bacteriology 175,
1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO
96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134,
15-24 (1993)), en la memoria japonesa expuesta al
público
JP-A-10-229891, en
Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological
Reviews 60:512-538 (1996) y en conocidos libros
de texto de genética y biología molecular.
Un ejemplo de un plásmido con cuya ayuda se puede
sobre-expresar el gen dapF es
pEC-XT99A-dapE (figura 2), que está
contenido en la cepa
DSM5715/pEC-XT99A-dapF. El plásmido
pEC-XT99A-dapF es un vector
lanzadera de E. coli-C. glutamicum basado en
el plásmido pEC-XT99A (figura 1). Este vector del
plásmido contiene la zona de replicación del plásmido pGA1
(documento US-B nº 5.175.108) y el gen con
resistencia a la tetraciclina del plásmido pAG1 (número de registro
AF121000 del National Center for Biotechnology Information,
Bethesda, MD, USA). Se pueden utilizar de la misma manera otros
vectores del plásmido que son capaces de replicación en C.
glutamicum, tal como p. ej., pEKEx1 (Eikmanns et al.,
Gene 102:93-98 (1991)) o
pZ8-1 (documento EP-B 0 375
889).
Además, puede ser ventajoso para la producción de
L-lisina sobre-expresar una o más
enzimas de la vía de biosíntesis de lisina, además del gen dapF. De
este modo, por ejemplo
- \bullet
- al mismo tiempo se puede sobre-expresar el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato sintetasa (documento EP-B 0 197 335), o
- \bullet
- al mismo tiempo se puede amplificar un fragmento que comunica resistencia a la S-(2-aminoetil)-cisteína (documento EP-A 0 088 166), o
- \bullet
- al mismo tiempo el gen dapD que codifica la tetrahidrodipicolinato succinilasa (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)), o
\newpage
- \bullet
- al mismo tiempo se puede sobre-expresar el gen dapE que codifica la succinildiaminopimelato desuccinilasa (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)).
Además de la sobre-expresión del
gen dapF puede ser ventajoso además, para la producción de
L-lisina, eliminar las reacciones secundarias
indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms", en: Overproduction of Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres,
R.U., 1982).
Los microorganismos preparados según la invención
se pueden cultivar de forma continua o discontinua en el
procedimiento por lotes (cultivo por lotes) o en el lote de
alimentación (procedimiento de alimentación) o procedimientos
repetidos por lotes de alimentación (procedimientos de alimentación
repetidos) con objeto de producción de L-lisina. Un
resumen de los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro
de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en
el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo que se debe utilizar debe
reunir los requisitos de determinadas cepas de una manera adecuada.
Las descripciones de los medios de cultivos para varios
microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods
for General Bacteriology" of the American Society for
Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Se pueden utilizar como
fuente de carbono azúcares y carbohidratos, tales como p. ej.,
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón y
celulosa, aceites y grasas, tales como p. ej., aceite de soja,
aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos
grasos, tales como p. ej., ácido palmítico, ácido esteárico y ácido
linoleico, alcoholes, tales como p. ej., glicerol y etanol, y ácidos
orgánicos, tal como p. ej., ácido acético. Estas sustancias se
pueden utilizar solas o como una mezcla. Se pueden utilizar como
fuente de nitrógeno los compuestos que contienen nitrógeno orgánico,
tales como las pectonas, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, licor saturado de maíz, harina de soja y urea, o
compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de
amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio.
Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar solas o como una mezcla.
Se pueden utilizar como fuente de fósforo ácido fosfórico, fosfato
diácido de potasio o fosfato ácido dipotásico o las correspondientes
sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe comprender
además sales de metales, tales como por ejemplo sulfato de magnesio
o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Por
último, se pueden emplear sustancias esenciales para el crecimiento,
tales como aminoácidos y vitaminas, además de las sustancias
mencionadas anteriormente. Además pueden añadirse precursores
adecuados al medio de cultivo. Las sustancias de partidas
mencionadas se pueden añadir al cultivo en forma de un solo lote o
se pueden añadir durante el cultivo de una manera adecuada.
Para controlar el pH se pueden emplear compuestos
básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio,
amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos ácidos tales como ácido
fosfórico o ácido sulfúrico, de una manera adecuada. Para controlar
el desarrollo de espuma se pueden emplear antiespumantes, tales como
por ejemplo los ésteres de poliglicol y ácidos grasos. Para mantener
la estabilidad de los plásmidos se pueden añadir al medio sustancias
adecuadas que tengan una acción selectiva, por ejemplo antibióticos.
Para mantener las condiciones aeróbicas, se introduce en el cultivo
oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tal como por
ejemplo aire. La temperatura del cultivo normalmente es de 20ºC a
45ºC y preferentemente de 25ºC a 40ºC. Se continua el cultivo hasta
que se haya formado un máximo de lisina. Este objetivo se alcanza
normalmente entre 10 horas y 160 horas.
El análisis de L-lisina se puede
realizar por cromatografía de intercambio aniónico con modificación
con ninhidrina posterior, tal como describe Spackman et al.
(Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).
Se han depositado los siguientes microorganismos
en el Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ =
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig,
Alemania) según el Tratado de Budapest:
\bullet Cepa DSM5715/pEC-XT99A
de Corynebacterium glutamicum como DSM 12967
\bullet Cepa DSM5715/pEC-XT99A
de Corynebacterium glutamicum como DSM 12968
El procedimiento según la invención se utiliza
para la preparación fermentativa de L-lisina.
La presente invención se explica con más detalle
a continuación con la ayuda de los ejemplos de la realización.
Se aisló ADN cromosómico de Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032 tal como describe Tauch et al.
(1995, Plasmid 33:168-179) y se escindió
parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto Sau3AI,
código nº 27-0913-02). Se
desfosforilaron fragmentos de ADN con fosfatasa alcalina de camarón
(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del
producto SAP, código nº 1758250). El ADN del vector cósmido
superCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 84:2160-2164), adquirido
en la compañía Stratagene (La Jolla, USA, descripción del
producto Kit del vector del cósmido SuperCos1, código nº 251301) se
escindió con la enzima de restricción XbaI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Alemania, descripción del producto XbaI, código nº
27-0948-02) y se desfosforiló
asimismo con fosfatasa alcalina de camarón. Se escindió a
continuación el ADN del cósmido con la enzima de restricción BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto
BamHI, código nº 27-0868-04). El ADN
del cósmido tratado de esta manera se mezcló con el ADN ATCC13032 y
el lote se trató con T4 ADN ligasa (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Alemania, descripción del producto
T4-ADN-Ligasa, código nº
27-0870-04). Se concentró a
continuación la mezcla de ligadura en fagos con la ayuda de Gigapack
II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, descripción del
producto Gigapack II XL Packing Extract, código nº 200217). Para la
infección de la cepa NM554 de E. coli (Raleigh et al.
1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) se
absorbieron las células en MgSO_{4} 10 mM y se mezclaron con una
alícuota de la suspensión del fago. La infección y la valoración del
banco del cósmido se realizó tal como describe Sambrook et
al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold
Spring Harbor), estando colocadas las células en
agar-agar de LB (Lennox, 1955, Virology,
1:190) con 100 \mug/ml de ampicilina. Después de la incubación
toda la noche a 37ºC, se seleccionaron clones individuales
recombinados.
Se aisló el ADN del cósmido de una colonia
individual con el kit Spin Miniprep de Qiaprep (producto nº 27106,
Qiagen, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante y
se escindió parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto
Sau3AI, producto nº 27-0913-02). Se
desfosforilaron los fragmentos de ADN con fosfatasa alcalina de
camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania,
descripción del producto SAP, producto nº 1758250). Después de la
separación por electroforesis en gel, se aislaron los fragmentos del
cósmido en un intervalo de tamaño de 1500 a 2000 bp con el kit de
extracción de gel QiaExII (producto nº 20021, Qiagen, Hilden,
Alemania). Los ADN del vector pCero-1 de
secuenciado, adquirido en la compañía Invitrogen (Groningen,
Holanda, descripción del producto kit de clonación con fondo Cero,
producto nº K2500-01) se escindieron con el enzima
de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
descripción del producto BamHI, producto nº
27-0868-04). Se realizó la ligadura
de los fragmentos del cósmido en el vector de secuenciado
pCero-1 tal como describe Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor), incubándose la mezcla de ADN toda la noche con T4 ligasa
(Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). A continuación se
electroporó esta mezcla de ligadura (Tauch et al. 1994,
FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa
DH5áMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A.,
87:4645-4649) y se colocaron en placas en
agar-agar de LB (Lennox, 1955, Virology,
1:190) con 50 \mug/ml de zeocina. Se realizó la preparación del
plásmido de los clones recombinados con Biorobot 9600 (producto nº
900200, Qiagen, Hilden, Alemania). Se realizó el secuenciado por el
procedimiento de interrupción con la cadena didesoxi de Sanger et
al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences
U.S.A., 74:5463-5467) con modificaciones según
Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research,
18:1067). Se utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing
Kit" de PE Applied Biosystems (producto nº 403044, Weiterstadt,
Alemania). Se realizó la separación por electroforesis en gel y el
análisis de la reacción de secuenciado en un gel "Rotiphoresis NF
Acrylamide/Bisacrylamide" (29:1) (producto nº
A124-1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el
secuenciador "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Alemania).
Se obtuvieron los datos de la secuencia en bruto,
a continuación se procesaron utilizando el paquete del programa
Staden (1986, Nucleic Acid Research, 14:217-231)
versión 97-0. Se reunieron las secuencias
individuales de los derivados de pCero1 en una unión continua. Se
prepararon análisis de la zona de codificación asistidos por
ordenador con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids
Research, 14:217-231). Se realizaron análisis de
homología con los "BLAST search programs" (Altschul et
al. 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402),
frente al banco de datos no redundante del "National Center for
Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA).
La secuencia de nucleótidos obtenida se presenta
en la SEQ. ID nº: 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos
presentaba un marco de lectura abierto de 831 pares de bases, que se
denominó gen dapF. El gen dapF codifica un polipéptido de 277
aminoácidos.
Se utilizó el vector de expresión pTRC99A de
E. coli (Amman et al. 1988, Gene
69:301-315) como vector de partida para la
construcción del vector pEC-XT99A de expresión de la
lanzadera E. coli-C. glutamicum. Después de la
escisión de BspHI de restricción (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim,
Alemania, descripción del producto BspHI, producto nº 1467123) y el
tratamiento de Klenow ulterior (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Alemania, descripción del producto fragmento de Klenow de
ADN polimerasa I, producto nº
27-0928-01; método de Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold
Spring Harbor) se reemplazó el gen (bla) de resistencia a la
ampicilina por el gen de resistencia a la tetraciclina del plásmido
pAG1 de C. glutamicum (nº de registro AF121000 del GenBank).
Para esto, se clonó la zona que lleva el gen de resistencia como un
fragmento de AluI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania,
descripción del producto AluI, producto nº
27-0884-01) en el vector de
expresión pTRC99A de E. coli linealizado. Se realizó la
ligadura como describe Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), incubándose
toda la noche la mezcla de ADN con T4 ligasa (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto
T4-ADN-Ligasa, producto nº
27-0870-04). A continuación se
electroporó esta mezcla de ligadura (Tauch et al. 1994,
FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa
DH5áMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A.,
87:4645-4649). El vector de expresión de E.
coli se denominó pXT99A. Se utilizó el plásmido pGA1 (Sonnen
et al. como base para la clonación de un replicón mínimo de
Corynebacterium glutamicum. Mediante la escisión de
restricción de BalI/PstI (Promega GMBH, Mannheim, Alemania,
descripción del producto BalI, producto nº R6691; Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto PstI, producto
nº 27-0971-01) del vector pGA1, fue
posible clonar un fragmento de 3484 bp en el vector pK18mob2 (Tauch
et al., 1998, Archives of Microbiology
169:303-312) fragmentado con SmaI y PstI (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto
SmaI, producto nº 27-0942-02,
descripción del producto PstI, producto nº
27-0976-01). Por medio de la
escisión de restricción de BamHI/XhoI (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Alemania, descripción del producto BamHI, producto nº
27-086803, descripción del producto XhoI, producto
nº 27-0950-01) y el tratamiento de
Klenow ulterior (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania,
descripción del producto fragmento de Klenow de ADN polimerasa I,
producto nº 27-0928-01; método de
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory
Manual, Cold Spring Harbor) se eliminó un fragmento de 839 bp de
tamaño. A partir de la construcción religada con T4 ligasa (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto
T4-ADN-Ligasa, producto nº
270870-04), fue posible clonar el replicón mínimo de
C. glutamicum como fragmento de 2645 bp en el vector de
expresión pXT99A de E. coli. Para esto, se escindió el ADN de
la construcción que lleva el replicón mínimo con las enzimas de
restricción KpnI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania,
descripción del producto KpnI, producto nº
27-0908-01) y PstI (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto
PstI, producto nº 27-0886-03) y
posteriormente se realizó un tratamiento con 3'-5'
exonucleasa (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning; A
laboratory Manual, Cold Spring Harbor) mediante la polimerasa de
Klenow (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, descripción
del producto fragmento de Klenow de ADN polimerasa I, producto nº
27-0928-01). En un lote paralelo, se
escindió el vector de expresión pXT99A de E. coli con la
enzima de restricción RsrII (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania,
descripción del producto RsrII, producto nº 1292587) y se preparó
para la ligadura con la polimerasa de Klenow (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania, fragmento de Klenow de ADN polimerasa
I, producto nº 27-0928-01). Se
realizó la ligadura del replicón mínimo con la construcción pXT99A
del vector tal como describe Sambrook et al. (1989,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor),
incubándose toda la noche la mezcla de ADN con T4 ligasa (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto
T4-ADN-Ligasa, producto nº
27-0870-04). El vector de expresión
pEC-XT99A de la lanzadera E. coli-C.
glutamicum construido de esta manera se transfirió a C.
glutamicum mediante electroporación (Liebl et al., 1989,
FEMS Microbiology Letters, 53:299-303). El
transformante se pudo verificar por análisis del ADN del plásmido
reaislado. La construcción del plásmido obtenida de este modo se
denominó pEC-XT99A (figura 2). La cepa de E.
coli obtenido por transformación del plásmido
pEC-XT99A en la cepa DH5\alphamcr de E.
coli se denominó DH5\alphamcr/pEC-XT99A.
Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen
dapF de diaminopimelato epimerasa procedente de C. glutamicum
ATTCC 13032 presentado en la SEQ. ID nº:1, se sintetizaron
cebadores de PCR (ARK Scientific GMBH Biosystems, Darmstadt,
Alemania). Estos cebadores se seleccionaron de modo que el fragmento
amplificado contiene el gen y el ribosoma natural que se une a los
puntos de éstos, pero no a posibles zonas del activador. Además, se
insertaron los puntos de escisión con restricción adecuada que
permiten la clonación en el vector diana. En la tabla 1 se
relacionan las secuencias de los cebadores de PCR, los puntos de
escisión insertados (secuencia subrayada) y el gen amplificado (el
tamaño del fragmento en bp se indica entre paréntesis).
Se amplificó el gen dapF de diaminopimelato
epimerasa procedente de C. glutamicum ATCC13032 utilizando la
reacción en cadena de polimerasa (PCR) y los oligonucleótidos
sintéticos descritos en la tabla 1. Se realizaron los experimentos
de PCR con la Pfu ADN polimerasa de la compañía Stratagene (La
Jolla, CA, descripción del producto natural Pfu ADN polimerasa,
producto nº 600250) en un "PCT-100
Thermocycler" (MJ Research Inc., Watertown, Mass., USA). Una sola
etapa de desnaturalización de 3 minutos a 94ºC, fue seguida de una
etapa de desnaturalización de 30 segundos a 94ºC, una etapa de
hibridación durante 30 segundos en un cebador dependiente de la
temperatura de T=(2AT+4GC) -5ºC (Suggs, et al., 1981, pág.
683-693, en: D.D. Brown, y C.F. Fox (eds.),
Developemental biology using purified genes. Academic Press,
Nueva York, USA) y una etapa de prolongación a 72ºC que emplea 90
segundos. Se repitieron las tres últimas etapas como un ciclo de 30
veces y la reacción se finalizó con una etapa de prolongación de 5
minutos a 72ºC. Se determinó el tamaño del producto preparado de
esta manera por electroforesis en gel de agarosa.
Se utilizó el vector de expresión
pEC-XT99A de la lanzadera E. coli-C.
glutamicum mostrado en la figura 1 (ejemplo 3) como vector de
base para la expresión. El producto de PCR resultante se escindió
completamente con las enzimas de restricción BamHI y MunI y se ligó
con el vector de expresión pEC-XT99A, que se había
escindido también con las enzimas EcoRI y BamHI (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto EcoRI,
producto nº 27-0854-03, descripción
del producto BamHI, producto nº
27-0868-03).
De este modo, el gen dapF sin activador es
llevado bajo el control del activador de tcr contenido en este
plásmido.
Se realizó la ligadura de la amplificación de
dapFex en el vector de expresión pEC-XT99A como
describe Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A
laboratory Manual, Cold Spring Harbor), incubándose toda la
noche la mezcla de ADN con T4 ligasa (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Alemania, descripción del producto
T4-ADN-Ligasa, producto nº
27-0870-04). A continuación se
electroporó esta mezcla de ligadura (Tauch et al. 1994,
FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa
DH5\alphaMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A.,
87:4645-4649) y se colocó en placas en
agar-agar de LB (Lennox, 1955, Virology,
1:190) con 5 \mug/ml de tetraciclina y 40 \mug/ml de
X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil
\beta-D-galactósido).
Después de la incubación durante 24 horas a 37ºC,
se pudieron identificar las colonias con los plásmidos que llevan la
inserción con ayuda de complemento \alpha Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor). Mediante reaislamiento del ADN del plásmido por el
"método de la lisis alcalina" de Birnboim y Doly (1997,
Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523), se
obtuvo el ADN de la correspondiente construcción de expresión a
partir de los transformantes. Se comprobó la correcta clonación del
plásmido de expresión mediante el secuenciado de la inserción.
La construcción del plásmido obtenido de este
modo se denominó pEC-XT99A-dapF. La
cepa de E. coli obtenida por transformación del plásmido
pEC-XT99A-dapF en la cepa
DH5\alphaMCR de E. coli se denominó
DH5\alphaMCR/pEC-XT99A-dapF.
Se lavaron los plásmidos
pEC-XT99A (ejemplo 3) y
pEC-XT99A-dapF (ejemplo 4) en la
cepa DSM5715 por el método de electroporación (Liebl et al.,
1989, FEMS Microbiology Letters,
53:299-303).
Los transformantes obtenidos con ayuda de la
electroporación se aislaron en el agar-agar de
selección (agar-agar LBHIS (18,5 g/l de caldo de
infusión cerebro-corazón, sorbitol 0,5 M, 5 g/l de
Bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de
Bacto-levadura, 5 g/l de NaCl, 18 g/l de
Bacto-agar)) con 15 mg/l de kanamicina. Se aisló el
ADN del plásmido por métodos convencionales
(Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), se cortó con
endonucleasas de restricción adecuadas (PstI (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Alemania, descripción del producto PstI, producto
nº 27-0886-03)) y se comprobó. Las
cepas obtenidas se denominaron DSM5715/pEC-XT99A y
DSM5715/pEC-XT99A-dapF.
Las cepas DSM5715/pEC-XT99A y
DSM5715/pEC-XT99A-dapF de C.
glutamicum preparadas en el ejemplo 5 se cultivaron en un medio
nutriente adecuado para la producción de lisina y se determinó el
contenido de lisina en el sobrenadante del cultivo.
Para esto, se incubaron en primer lugar las cepas
en placas de agar-agar (agar-agar de
cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l)) durante 24
horas a 33ºC. Partiendo de estos cultivos en placas con
agar-agar, se sembró un precultivo (10 ml de medio
en un matraz cónico de 100 ml). El medio utilizado para el
precultivo fue el medio completo CgIII (10 g/l de
Bacto-peptona, 10 g/l de extracto de
Bacto-levadura, 5 g/l de NaCl, pH 7,4 (Eggeling
et al., 1987, Applied Microbiology and Biotechnology,
25: 346-351). Se añadió tetraciclina (5 mg/l). Se
incubó el precultivo durante 24 horas a 33ºC a 240 rpm o en una
máquina de agitación. Se sembró un cultivo principal procedente de
este precultivo de modo que la D.O. inicial (longitud de onda de
medición 660 nm) del cultivo principal fue 0,2 D.O. Se utilizó medio
MM para el cultivo principal.
| CSL | 5 g/l |
| MOPS | 20 g/l |
| Glucosa | 50 g/l (por separado en autoclave) |
| (NH_{4})_{2}SO_{4}) | 25 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 0,1 g/l |
| MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O | 1,0 g/l |
| CaCl_{2}\cdot2 H_{2}O | 10 mg/l |
| FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4}\cdotH_{2}O | 5,0 mg/l |
| L-leucina | 0,1 g/l |
| Biotina | 0,3 mg/l (filtrada esterilizada) |
| Tiamina\cdotHCl | 0,2 mg/l (filtrada esterilizada) |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
CSL: Licor concentrado de maíz
MOPS: ácido morfolinopropanosulfónico
El CSL, el MOPS y la solución salina se llevaron
a pH 7 con amoniaco acuoso y se esterilizaron en autoclave. El
sustrato esterilizado y las soluciones de vitamina se añaden a
continuación y el CaCO_{3} esterilizado en autoclave se añade en
estado anhidro.
El cultivo se realiza en un volumen de 10 ml en
un matraz cónico con tabiques de 100 ml. Se añadió tetraciclina (5
mg/l). El cultivo se realizó a 33ºC y 80% de humedad
atmosférica.
Para inducir la expresión de dapF, se añadió IPTG
1 mM (isopropil
tio-\beta-galactósido, Gibco BRL
Life Technologies, Eggenstein, Alemania) número de catálogo
15529-019).
Después de 72 horas, se determinaron la D.O. a
una longitud de onda de medición de 660 nm y la concentración de
lisina formada. Para la determinación de la densidad óptica
(O.D._{660}) se empleó un fotómetro digital LD 1W de la compañía
Lange (Berlín, Alemania). Se determinó la lisina con un analizador
de aminoácidos de la compañía Eppendorf-BioTronik
(Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y
modificación después de la columna con detección por ninhidrina.
Los resultados del experimento se muestran en la
tabla 2.
<110> Degussa-Hüls AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas secuencias de nucleótidos que
codifican el gen dapF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 990126 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1084
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> -35_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (117)..(123)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> -10_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (138..(143)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (151)..(981)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 277
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<212> PRT
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<213> Corynebacterium glutamicum
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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Claims (23)
1. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo constituido
por
- a)
- un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica hasta el punto de al menos el 95% de la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID nº: 2, en la que dicho polipéptido presenta una actividad de diaminopimelato epimerasa.
- b)
- un polinucleótido que es complementario del polinucleótido de a).
2. El polinucleótido según la reivindicación 1,
en el que el polinucleótido es un ADN que es capaz de replicación en
la bacteria corineforme.
3. Sonda o cebador que comprende al menos 20
nucleótidos consecutivos desde la SEQ. ID nº: 1 o su
complemento.
4. El polinucleótido comprendido en el vector
pEC-XT99A-dapF, depositado en la
cepa DMS 12968 de C. glutamicum.
5. El polinucleótido que es el ADN según la
reivindicación 2, que comprende:
- 5.1
- la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID nº: 1 (gen dapF), o
- 5.2
- una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia SEC ID nº: 1 dentro del margen de degeneración del código genético.
6. El polinucleótido según la reivindicación 2,
que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de
aminoácidos en la SEQ. ID nº: 2.
7. Un vector que comprende los polinucleótidos
según una o más de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Bacterias corineformes que sirven como células
huésped, que se transforman mediante la introducción de los
polinucleótidos de una o más de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que es idéntica hasta el punto de al menos 95% a la
secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID nº: 2, en la que dicho
polipéptido presenta actividad de diaminopimelato epimerasa.
10. El polipéptido según la reivindicación 9, que
comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la
secuencia de aminoácidos de SEQ. ID nº: 2.
11. Un procedimiento para la preparación de
L-lisina por fermentación de bacterias corineformes,
caracterizado porque se emplean estas bacterias en las que se
amplifican el gen dapF o las secuencias de nucleótidos según una o
más de las reivindicaciones 1 a 6 que codifican la diaminopimelato
epimerasa.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se emplean bacterias en las que además
se amplifican genes adicionales de la vía de biosíntesis del
L-aminoácido deseado.
13. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se emplean bacterias en las que se
eliminan las vías metabólicas que reducen la formación de
L-lisina.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 11 a
13, caracterizado porque se emplea una cepa transformada con
un vector plásmido y el vector plásmido lleva la secuencia de
nucleótidos que codifica el gen dapF.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque se emplean bacterias transformadas con
el vector plásmido pEC-XT99A-dapF,
depositado en Corynebacterium glutamicum con el número DSM
12968.
16. Procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque se utilizan
bacterias corineformes según la reivindicación 8.
17. Procedimiento según las reivindicaciones 11 ó
16, caracterizado porque al mismo tiempo uno o más de los
genes seleccionados del grupo:
a) el gen dapA que codifica la
dihidrodipicolinato sintetasa,
b) el gen dapD que codifica la
tetradihidrodipicolinato succinilasa,
c) el gen dapE que codifica la
succinildiaminopimelato desuccinilasa
se sobre-expresa(n).
18. Procedimiento según las reivindicaciones 11 ó
16, caracterizado porque al mismo tiempo se amplifica un
fragmento de ADN que comunica resistencia a la
S-(2-aminoetil)-cisteína.
19. Procedimiento para la preparación
fermentativa de L-lisina según una o más de las
reivindicaciones 11 a 18, caracterizado porque se llevan a
cabo las siguientes etapas:
a) fermentación de las bacterias corineformes que
producen L-lisina en la que se amplifica el gen
dapF.
b) concentración de L-lisina en
el medio o en las células de las bacterias y
c) aislamiento de la
L-lisina.
20. Procedimiento según la reivindicación 19,
caracterizado porque se utilizan bacteria corineformes en las
que aumenta la actividad intracelular de la diaminopimelato
epimerasa cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ. ID nº:
2.
21. Procedimiento según las reivindicaciones 19 ó
20, caracterizado porque se utilizan estas bacterias
corineformes en las que la actividad intracelular de una
diaminopimelato epimerasa aumenta al aumentar el número de copias de
las secuencias de ADN que codifican dicha enzima según una o más de
las reivindicaciones 1, 5 ó 6, utilizando un activador potente o una
de sus combinaciones.
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