KR20020093985A

KR20020093985A - ａｃｐ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR20020093985A
Application number: KR1020027015120A
Authority: KR
Inventors: 뫼켈베티나; 바이쎈보른안케; 페페를레발터; 삼헤르만; 에겔링로타르; 남푸티리마드하반
Original assignee: 데구사 아게; 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2002-12-16
Also published as: US6830921B2; US20020055154A1; AU2001267387A1; EP1280913A2; WO2001085948A2; DE10023400A1; WO2001085948A3

Abstract

본 발명은 a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드, b) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보성인 폴리뉴클레오타이드, 및 d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, acp 유전자의 증강을 통한 L-아미노산의 발효 제조 방법, 및 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서의 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.

Description

ａｃｐ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 {New nucleotide sequences which code for the acp gene}

아미노산, 특히 L-라이신은 사람 의약 및 제약 산업에서 사용되지만, 특히 동물 영양에서 사용된다.

아미노산은 코리네형 세균 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰의 발효에 의해 제조되는 것으로 공지되어져 있다. 아미노산의 중요성으로 인해, 끊임없이 제조 방법을 개선시키기 위한 노력이 진행되고 있다. 상기 방법의 개선은 발효 방법, 예를 들면, 교반 및 산소 공급이나, 영양 배지의 조성, 예를 들면, 발효 동안의 당 농도, 또는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태에 대한 후처리, 또는 미생물 그 자체의 본질적인 생산 특성에 관한 것일 수 있다.

돌연변이유발, 선택 및 돌연변이체 선택 방법을 사용하여 이러한 미생물의생산 특성을 개선시킨다. 예를 들면, 라이신 유사체 S-(2-아미노에틸)-시스테인 같은 항대사산물에 내성이고 조절성 중요 대사산물에 대해서 영양 요구성이며 예를 들면, L-라이신 같은 L-아미노산을 생산하는 균주가 이러한 방법으로 수득된다.

과거 수년간 재조합 DNA 기술의 방법들이 개별적인 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 대한 효과를 조사함으로써, 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주들의 균주를 개선시키기 위해서 사용되어져 왔다. 이러한 내용의 참조 문헌들, 특히 문헌[Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria", Biology of Industrial Microorganisms, Demain and solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger, BioTec 2, 40-44, 1991; Eggeling, Amino Acids 6: 261-272 (1994); Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); and Sahm et al., Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)]이 확인된다.

본 발명의 목적

본 발명자들은 아미노산, 특히 L-라이신의 개선된 발효 제조를 위한 신규한 방법을 제공하고자 하였다.

본 발명은 acp 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 acp 유전자가 증강된 코리네형 세균을 사용한 아미노산, 특히 L-라이신의 발효 제조 방법을 제공한다. acp 유전자는 아실 수송 단백질(acyl carrier protein)을 암호화한다.

하기 도면이 첨부된다:

ㆍ 도 1: 플라스미드 pJC1acp

ㆍ 도 2: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 및 ATCC 13032/pJC1acp의 40℃에서의 성장.

도면에서 사용된 약어는 하기 의미를 갖는다:

ori Cg: (pHM1519의) 씨. 글루타미쿰으로부터의 플라스미드-암호화된 복제 오리진

Kan: pHM1519의 카나마이신 내성 유전자

Amp: 암피실린 내성 유전자

acp: 씨. 글루타미쿰의 아실 수송 단백질

OD: 광학 밀도

BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

HindIII: 제한 효소 HindIII의 절단 부위

PCT 990222 BT

원본(제출용) - 2001. 04. 25. 03:09:32 PM에 인쇄됨

0-10-1-1	Form-PCT/RO/134(EASY)기탁된 미생물(들) 또는 기타 생물학적 물질에 관한 표시(PCT Rule 13bis)제조에 사용된 것	PCT-EASY Version 2.91(2001.01.01 업데이트됨)
0-2	국제 출원 번호
0-3	출원인 또는 대리인의 파일 참조번호	990222 BT

11-11-2	하기 표시는 하기의 기재와 관련된 기탁된 미생물(들) 또는 기타 생물학적 물질에 관한 것이다:페이지행	1526-33
1-31-3-11-3-21-3-31-3-4	기탁 확인기탁기관의 명칭기탁기관의 주소기탁 일자수탁번호	DSMZ-도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌독일 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로데르 벡 1b2000년 1월 20일(20.01.2000)DSMZ 13247
1-4	부가적인 표시	없음
1-5	표시를 나타내고자 하는 지정국	모든 지정국
1-6	표시의 개별적 제공이러한 표시는 차후 국제기관에 제출될 것이다.	없음
수령기관용도만을 위함
0-4	본 형식은 국제출원과 함께 수령되었다:(예)	2001년 4월 27일(27.04.2001)
0-4-1	권한을 부여받은 공무원	쿠이퍼 나탈리
국제기관용도만을 위함
0-5	본 형식은 ~일자로 국제기관에 의해 수령되었다:
0-5-1	권한을 부여받은 공무원

아미노산, 특히 L-라이신은 사람 의약, 제약 산업 및 특히 동물 영양에서 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-라이신의 제조를 위한 신규한 개선된 방법을제공하는 것이 일반적인 관심의 대상이다.

L-라이신 또는 라이신이 하기에서 언급되는 경우, 염기뿐만 아니라 염, 예를 들면, 라이신 모노하이드로클로라이드 또는 라이신 설페이트가 또한 이로써 의미된다.

본 발명은 a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드, b) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보성인 폴리뉴클레오타이드, 및 d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 바람직하게는, (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 유전자 암호의 축퇴성 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 서열 하나 이상, 또는 (iii) 서열 (i) 또는 (ii)와 상보성인 서열과 하이브리드화하는 서열 하나 이상, 및 임의로, (iv) (i)에서 중성 작용의 센스 돌연변이를 포함하는, 복제할 수 있는 DNA인, 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 서열 번호 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 제6항에 따른 폴리뉴클레오타이드,DSM 13247로 코리네박테리움 글루타미쿰으로 기탁된, 벡터 pJC1acp에 함유된 acp 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 DNA 서열을 함유하는 벡터, 및 상기 벡터를 함유하거나 acp 유전자가 증강된 숙주 세포로서 이용할 수 있는 코리네형 세균을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열 번호 1에 따르는, 언급된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 프로브를 사용한 서열 번호 1에 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 완전한 유전자를 포함하는 상응하는 유전자 라이브러리의 하이브리드화에 의한 스크리닝, 및 언급된 DNA 서열의 분리로 수득할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 실질적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열은 아실 수송 단백질을 암호화하는 전장 cDNA의 분리 및 상기 cDNA 또는 아실 수송 단백질 유전자의 서열과 높은 유사성을 갖는 유전자를 분리하기 위한, RNA, cDNA 및 DNA용 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열은 추가로 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 아실 수송 단백질을 암호화하는 유전자의 DNA를 제조하기 위한 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 사용할 수 있는 상기 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 매우 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 40 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 또한 적합하다.

"분리된"은 이의 천연 환경으로부터 분리되는 것을 의미한다.

일반적으로 "폴리뉴클레오타이드"는 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드에 관한 것이며, 이는 비-변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 것이 가능하다.

"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 두 개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열 번호 2에 따른 폴리펩타이드, 특히 아실 수송 단백질의 생물학적 활성을 갖는 것 및 또한 서열 번호 2에 따른 폴리펩타이드와 70% 이상 동일한 것, 및 바람직하게는 서열 번호 2에 따른 폴리펩타이드와 80% 이상 및 특히 90% 내지 95% 이상 동일하며, 상기 언급된 활성을 갖는 것을 포함한다.

본 발명은 추가로, 특히 이미 아미노산을 생산하는 코리네형 세균을 사용하여, 아미노산, 특히 L-라이신의 발효 제조 방법을 제공하며, 이때 acp 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증강, 특히 과발현된다.

이와 관련하여 용어 "증강"은 예를 들면, 유전자 또는 유전자들의 복사체 수를 증가시키고, 강력한 프로모터 또는 높은 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하며, 임의로 이러한 방법들을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물 중 효소 하나 이상의 세포내 활성을 증가시키는 것을 기술한다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀, 전분, 셀룰로오스로부터 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 특히 L-라이신을 제조할 수 있다. 이들은 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속의 대표일 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰이 언급될 수 있으며, 이는 L-아미노산을 생산하는 능력으로 전문가들 사이에서 공지되어져 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주에는 예를 들면, 공지된 야생형 균주들, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토악시도필룸 ATCC13870, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 멜라쎄콜라 ATCC17965, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC13869 및 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020; 및 이로부터 제조되는 L-라이신 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715가 있다.

본 발명자들은 아실 수송 단백질을 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 신규한 acp 유전자를 분리하는데 성공하였다.

씨. 글루타미쿰의 acp 유전자 또는 다른 유전자를 분리하기 위해서, 상기 미생물의 유전자 라이브러리를 우선 이. 콜라이에서 설정한다. 유전자 라이브러리의 설정은 일반적으로 공지된 교재 및 핸드북에서 기술되어져 있다. 예로서교재[Winnacker: Gene and Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie(Genes and Clones, An Introduction to Genetic Engineering), Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 및 핸드북[Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)이 언급될 수 있다. 널리 공지된 유전자 라이브러리는 문헌[Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)]에 의해 λ 벡터내에 설정된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 것이다. 문헌[Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996]은 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리를 기술하며, 이는 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575] 중에서 코스미드 벡터 SuperCos I[Wahl et al., 1987, Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164]의 도움으로 설정되었다. 차례로, 문헌[Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)]은 코스미드 pHC79[Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]를 사용한 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리를 기술한다. 이. 콜라이 중에 씨. 글루타미쿰의 유전자 라이브러리를 제조하기 위해서, pBR322[Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979] 또는 pUC9[Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268]같은 플라스미드를 사용하는 것도 또한 가능하다. 적합한 숙주는 특히 제한- 및 재조합-결함성 이. 콜라이 균주이다. 이의 예로는 균주 DH5αmcr이 있으며, 이는 문헌[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 기술되어져 있다. 이후, 코스미드의 조력으로 클로닝된 긴 DNA 단편은 차례로 서브클로닝되고후속적으로 문헌[Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977]에 기술된 바와 같은 서열분석에 적합한 통상적인 벡터 중에서 서열분석된다.

acp 유전자를 암호화하며 서열 번호 1과 같이, 본 발명의 구성을 이루는 씨. 글루타미쿰의 신규한 DNA 서열이 상기 방식으로 수득되었다. 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 추가로 상기 기술된 방법으로 본 DNA 서열로부터 유도되었다. acp 유전자 생성물의 수득되는 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나타낸다.

유전자 암호의 축퇴성으로 인해 서열 번호 1로부터 초래되는 암호화 DNA 서열이 또한 본 발명의 구성을 이룬다. 동일한 방식으로, 서열 번호 1 또는 서열 번호 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열이 본 발명의 구성을 이룬다. 보존적 아미노산 교환, 예를 들면 단백질에서 글리신의 알라닌으로의 교환 또는 아스파르트산의 글루탐산으로의 교환이 단백질의 활성의 근본적인 변화를 초래하지 않는, 즉 중성 기능의 "센스 돌연변이"로서 전문가들 사이에 공지되어져 있다. 추가로, 단백질의 N 및/또는 C 말단 상의 변화는 실질적으로 손상을 야기하지 않거나 오히려 이의 기능을 안정화시킬 수 있는 것으로 공지되어져 있다. 이러한 내용에 관한 정보는 전문가에 의해, 특히 문헌[Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987); O'Regan et al., Gene 77: 237-251 (1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3: 240-247 (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재에서 확인될 수 있다. 서열 번호 2로부터 상응하는 방식으로 수득된 아미노산 서열이 또한 본 발명의 구성을이룬다.

동일한 방식으로, 서열 번호 1 또는 서열 번호 1의 일부분과 하이브리드화하는 DNA 서열은 본 발명의 구성을 이룬다. 최종적으로, 서열 번호 1로부터 초래되는 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된 DNA 서열이 본 발명의 구성을 이룬다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 15개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.

하이브리드화에 의해 DNA 서열을 확인하기 위한 지침은 전문가에 의해, 특히 핸드북[The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 1993] 및 문헌[Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에 의해 확인될 수 있다. DNA 서열을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 도움으로 증폭시키기 위한 지침은 전문가에 의해, 특히 핸드북[Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, UK, 1984] 및 문헌[Newton and Graham: PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994]에서 확인할 수 있다.

본 발명자들은 acp 유전자를 증강시킨 후, 코리네형 세균이 아미노산, 특히 L-라이신을 개선된 방식으로 생산한다는 것을 확인하였다.

증강, 특히 과발현을 달성하기 위해서, 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 구조 유전자 상류의 프로모터 및 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 도입된 발현 카셋트가 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터의 경우, 이는 부가적으로 발효성 L-라이신 생산 과정에서 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 발현은 mRNA의 수명을 연장시키는 방법에 의해 마찬가지로 개선된다. 추가로, 효소 활성은 또한 효소 단백질의 분해를 방지시킴으로써 증가된다. 유전자 또는 유전자 작제물은 다양한 복사체 수로 플라스미드내에 존재할 수 있거나, 염색체내로 통합되어 증폭될 수 있다. 대안으로, 당해 유전자의 과발현은 추가로 배지 조성 및 배양 과정을 변화시킴으로써 달성할 수 있다.

이러한 내용에 대한 지침은 전문가에 의해, 특히 문헌[Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); European Patent Specification EPS 0 472 869; US Patnent 4,601,893; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); Patent Application WO 96/15246; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993); Japanese Laid-Open Specification JP-A-10-229891; Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); Makrides, Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)] 및 유전학과 분자생물학의 공지된 교재에서 확인될 수 있다.

예로서, 본 발명에 따른 acp 유전자는 플라스미드의 도움으로 과발현되었다.

적합한 플라스미드는 코리네형 세균에서 복제되는 것들이다. 수 많은 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들면, pZ1[Menkel et al., Applied and EnvironmentalMicrobiology (1989) 64: 549-554], pEKEx1[Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)]은 잠적 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1에 기초한다. 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면, pCG4[US-A 4,489,160], pNG2[Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)] 또는 pAG1[US-A 5,158,891]에 기초한 것들이 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

acp 유전자를 과발현시킬 수 있는데 도움을 주는 플라스미드의 예는 pJC1acp(도 1)가 있으며, 이는 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pJC1[Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480]에 기초하며 acp 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰의 DNA 서열을 함유한다. 이는 균주 DSM5715/pJC1acp내에 함유된다.

추가로 적합한 플라스미드 벡터는, 예를 들면, hom-thrB 오페론의 복제 및 증폭에 대해서 문헌[Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기술된 바와 같이, 염색체내로 통합시킴으로써 유전자 증폭 과정이 사용될 수 있도록 도움을 주는 것들이다. 이러한 방법에서, 완전한 유전자를 숙주(전형적으로 이. 콜라이)에서 복제될 수 있지만 씨. 글루타미쿰에서는 복제되지 않는 플라스미드내로 클로닝시킨다. 가능한 벡터는 예를 들면, pSUP301[Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T(제조원: Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO[Shuman (1994). Journal ofBiological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5,487,993], pCRBlunt[제조원: Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)] 또는 pEM1[Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516]가 있다. 이후, 증폭시키고자 하는 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환에 의해 씨. 글루타미쿰의 목적하는 균주내로 전달한다. 접합 방법은 예를 들면, 문헌[Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술되어져 있다. 형질전환 방법은 예를 들면, 문헌[Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988); Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989); and Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술되어져 있다. "교차" 수단을 사용하여 상동성 재조합시킨 후, 수득되는 균주는 당해 유전자의 복사체 2개 이상을 함유한다.

또한, acp 유전자 이외에, 특정 생합성 경로, 해당과정, 보전과정(anaplerosis) 또는 아미노산 외부수송의 하나 이상의 효소를 증강 또는 과발현시키는 것이 아미노산, 특히 L-라이신의 생산에 유리할 수 있다.

따라서, 예를 들면, L-라이신의 제조를 위해서, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자 하나 이상을 동시에 증강, 특히 과발현 또는 증폭시킬 수 있다:

ㆍ 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자[EP-B 0 197 335],

ㆍ 동시에 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[Molenaaret al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

ㆍ 석시닐 디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자(승인 번호 Q59284),

ㆍ 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

ㆍ 트리오스 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

ㆍ 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자(승인 번호 P26512),

ㆍ 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

ㆍ 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086], 또는

ㆍ 라이신 외부수송을 암호화하는 lysE 유전자[DE-A-195 48 222].

또한, acp 유전자를 증강시키는 것 이외에, 하기 유전자들을 동시에 감퇴시키는 것이 아미노산, 특히 L-라이신의 생산에 유리할 수 있다:

ㆍ 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[DE 199 50 409.1, DSM 13047] 및/또는

ㆍ 글루코오스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[US 09/396,478, DSM 12969] 및/또는

ㆍ 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자[DE 199 51 975.7].

acp 유전자를 과발현시키는 것 이외에, 추가로 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 아미노산, 특히 L-라이신의 생산에 유리할 수 있다[Nakayama, "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 제조된 미생물은 아미노산, 특히 L-라이신의 생산을 위해서 배치 공정(배치 배양) 또는 페드 배치(피드 공정) 또는 반복 페드 배치 공정(반복 피드 공정)으로 연속적으로 또는 불연속적으로 배양시킬 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 교재[Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991] 또는 교재[Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Bioreactors and Peripheral Equipment), Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994]에 기술되어져 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방식으로 특정 균주의 필요조건을 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 기술은 핸드북["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981]에 포함되어져 있다. 당 및 탄수화물, 예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀, 전분 및 셀룰로오스; 오일 및 지방, 예를 들면, 대두유, 해바라기유, 낙화생유 및 코코넛 지방; 지방산, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀산; 알콜, 예를 들면, 글리세롤 및 에탄올; 및 유기산, 예를 들면, 아세트산이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이러한 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 유기 질소-함유 화합물, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아; 또는 무기 화합물, 예를 들면, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 질소원으로서 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 인 공급원으로서 사용될 수 있다. 배양 배지는 추가로 성장에 필요한 금속 염, 예를 들면, 황산마그네슘 또는 황산철을 포함해야만 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민 같은 필수 성장 물질이 상기 언급된 물질 이외에 사용될 수 있다. 또한, 적합한 전구체가 배양 배지에 부가될 수 있다. 언급된 출발 물질은 단일 배치의 형태로 배양물에 부가되거나, 적합한 방식으로 배양 동안 공급될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아 수용액 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산 같은 산성 화합물을 적합한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 지방산 폴리글리콜 에스테르 같은 소포제를 사용하여 발포체의 발생을 조절할 수 있다. 선택적 작용을 갖는 적합한 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 부가하여 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해서, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들면 공기를 배양물내로 도입시킨다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지40℃이다. 배양은 최대량의 라이신이 생성될 때까지 지속된다. 이러한 목적은 일반적으로 10시간 내지 160시간 내에 달성된다.

L-라이신의 분석은 문헌[Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속되는 닌하이드린 유도체화에 의해 수행될 수 있다.

하기 미생물은 부다페스트 조약에 따라서 기탁기관[도이췌 삼룽 퓌르 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌(DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)]에 기탁되었다:

ㆍ 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1acp(DSM 13247로서).

본 발명에 따른 방법은 아미노산, 특히 L-라이신의 발효 제조에 사용된다.

본 발명은 구체적인 실시예의 도움으로 하기에서 보다 상세히 설명된다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 염색체성 DNA를 문헌[Tauch et al., 1995, Plasmid 33: 168-179]에 기술된 바와 같이 분리하고 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI,Code No. 27-0913-02)로 부분적으로 절단시켰다. DNA 단편을 새우 알칼리 포스파타제(제조원: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code No. 1758250)로 탈인산화시켰다. 제조원(Stratagene, La Jolla, USA, Product Description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code No. 251301)으로부터 수득된 코스미드 벡터 SuperCos1[Wahl et al., (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164]의 DNA를 제한 효소 XbaI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code No. 27-0948-02)으로 절단하고 새우 알칼리 포스파타제로 마찬가지로 탈인산화시켰다. 이후, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamH1(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamH1, Code No. 27-0868-04)으로 절단시켰다. 이러한 방식으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC 13032 DNA와 혼합하고 상기 배치를 T4 DNA 리가제(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4-DNA-Ligase, Code No. 27-0870-04)로 처리하였다. 이후, 연결 혼합물을 Gigapack II XL 팩킹 추출물(제조원: Stratagene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL Packing Extract, Code No. 200217)의 도움으로 파아지내에 포장시켰다. 이. 콜라이 균주 NM554[Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575]에 대한 감염을 위해서, 상기 세포를 10mM MgSO₄에 넣고 파아지 현탁액의 분취액과 혼합하였다. 감염 및 코스미드 라이브러리의 적정은 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 세포는 100㎎/ℓ 암피실린을 함유하는 LB 아가[Lennox, 1955, Virology, 1: 190] 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 재조합 개별 클론을 선택하였다.

실시예 2

acp 유전자의 분리 및 서열분석

개별적인 콜로니의 코스미드 DNA를 제조원의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, 제조원: Qiagen, Hilden, GErmany)로 분리하고 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Product No. 27-0913-02)로 부분적으로 절단시켰다. DNA 단편을 새우 알칼리 포스파타제(제조원: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250)로 탈인산화시켰다. 겔 전기영동으로 분리한 후, 1500 내지 2000bp 크기 범위의 코스미드 단편을 QiaExII Gel Extraction Kit(Product No. 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)로 분리시켰다. 제조원(Invitrogen, Groningen, The Netherlands, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01)으로부터 수득한 서열분석 벡터 pZero-1의 DNA를 제한 효소 BamH1(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamH1, Product No. 27-0868-04)로 절단하였다. 서열분석 벡터 pZero-1로의 코스미드 단편의 연결은 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행되었으며, DNA 혼합물은 T4 리가제(제조원: Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 항온처리되었다. 이후, 상기 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649]내로 전기천공법[Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7]으로 도입하고 50㎎/ℓ 제오신을 함유하는 LB 아가[Lennox, 1955, Virology, 1: 190] 상에 플레이팅하였다. 재조합 클론의 플라스미드 제제는 Biorobot 9600(Product No. 900200, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 수행하였다. 서열분석은 문헌[Sanger et al. 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결 방법을 문헌[Zimmermann et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067]에 따라 변형시켜 수행하였다. "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit"(제조원: PE Applied Biosystems, Product No. 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열분석 반응의 분석은 "ABI Prism 377" sequencer(제조원: PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)를 사용하여 "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide" Gel (29:1)(Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany)에서 수행되었다.

이후, 수득된 미처리 서열 데이터를 Staden program package[1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231] 버전 97-0을 사용하여 처리하였다. pZero1 유도체의 개별적인 서열을 연속적인 콘티그로 조합시켰다. 컴퓨터-보조된 암호화 영역 분석은 XNIP program[Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231]을 사용하여제조하였다. 추가 분석은 "National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 비중복성 데이터뱅크에 대해서 "BLAST search programs"[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402]을 사용하여 수행하였다.

수득되는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1에 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열의 분석은 291개 염기쌍의 개방 판독 프레임을 나타내며, 이는 acp 유전자로 명명되었다. acp 유전자는 97개 아미노산의 단백질을 암호화한다.

실시예 3

acp 유전자의 클로닝

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 염색체 DNA는 문헌[Tauch et al., 1995, Plasmid 33: 168-179]에 기술된 바와 같이 분리되었다. acp 유전자를 갖는 DNA 단편을 폴리머라제 연쇄 반응의 도움으로 증폭시켰다. 하기 프라이머들이 이를 위해서 사용되었다:

5'-TCG GGG TGA AAA TGG AGT TGT-3'

5'-AAG CGC TTT GAG GTA GTT TG-3'.

나타낸 프라이머들은 MWG Biotech(Ebersberg, Germany)에 의해 합성되었으며, PCR 반응은 문헌[PCR protocol. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]의 표준 방법으로 수행하였다. 상기 프라이머들을 510bp 크기의 DNA 단편의 증폭을 가능하게 하며, 이는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 acp유전자를 갖는다.

겔 전기영동으로 분리한 후, PCR 단편을 QiaExII Gel Extraction Kit(Product No. 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 분리시켰다.

벡터 pUC18[Norrander et al., Gene (26) 101-106 (1983)]을 제한 효소 SmaI으로 완전히 절단시키고 새우 알칼리 포스파타제[제조원: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250]로 탈인산화시켰다.

상기 방식으로 수득된 PCR 단편을 상기 제조된 벡터 pUC18과 혼합하고 상기 배치를 T4 DNA 리가제(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4-DNA-Ligase, Code No. 27-0870-04)로 처리하였다. 연결 배치를 이. 콜라이 균주 DH5α[Hanahan, DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]에 형질전환시켰다. 플라스미드-함유 세포의 선택은 100㎎/ℓ 암피실린을 함유한 LB 아가[Lennox, 1955, Virology, 1:190] 상에 형질전환 배치를 플레이팅하여 수행하였다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 재조합 개별 클론을 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제조원의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 HindIII로 절단하여 후속적인 아가로오스 겔 전기영동으로 플라스미드를 검사하였다. 약 3600bp의 단편을 수득하였다. 수득되는 플라스미드를 pUC18acp로 명명하였다.

실시예 4

벡터 pJC1내의 acp 클로닝

acp 유전자는 효소 PvuII로 완전히 절단하여 실시예 3에 기술된 플라스미드 pUC18acp로부터 분리하였다. 877bp 크기의 acp 단편을 QiaExII Gel Extraction Kit(Product No. 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 분리하였다.

사용된 벡터는 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pJC1[Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480]이었다. 상기 플라스미드를 또한 제한 효소 BamHI으로 완전히 절단하고, 클레나우 폴리머라제(제조원: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 처리한 후 새우 알칼리 포스파타제(제조원: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250)로 탈인산화시켰다.

이러한 방식으로 수득된 acp 단편을 제조된 벡터 pJC1과 혼합하고 상기 배치를 T4 DNA 리가제(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4-DNA-Ligase, Code No. 27-0870-04)로 처리하였다. 연결 배치를 이. 콜라이 균주 DH5α[Hanahan, DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington, DC, USA]내로 형질전환시켰다. 플라스미드-함유 세포의 선택은 50㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 LB 아가[Lennox, 1955, Virology, 1:190] 상에 형질전환 배치를 플레이팅하여 수행하였다. 37℃에서 밤새 배양한후, 재조합 개별 클론을 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제조원의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 EcoRI으로 절단하여 후속적인 아가로오스 겔 전기영동으로 플라스미드를 검사하였다. 수득되는 플라스미드는 pJC1acp로 명명되었다.

실시예 5

플라스미드 pJC1acp를 사용한 균주 DSM5715의 형질전환

균주 DSM5715를 문헌[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)]에 기술된 전기천공법을 사용하여 플라스미드 pJC1acp로 형질전환시켰다. 형질전환체의 선택은 15㎎/ℓ 카나마이신이 보충된, 18.5g/ℓ 뇌-심장 주입 브로쓰, 0.5M 솔비톨, 5g/ℓ 박토-트립톤, 2.5g/ℓ 박토-효모 추출물, 5g/ℓ NaCl 및 18g/ℓ 박토-아가를 포함하는 LBHIS 아가 상에서 수행하였다. 배양은 33℃에서 2일 동안 수행하였다.

플라스미드 DNA를 통상적인 방법[Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927]으로 형질전환체로부터 분리하고, 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 절단한 후, 상기 플라스미드를 후속적인 아가로오스 겔 전기영동으로 검사하였다. 수득되는 균주는 DSM5715/pJC1acp로 명명하였다.

상기 미생물을 부다페스트 조약에 따라 기탁기관[도이췌 삼룽 퓌르 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌(DSMZ = German Collection of Microorganisms and CellCultures, Braunschweig, Germany)]에 기탁하였다:

ㆍ 코리네박테리움 글루타미쿰/pJC1acp(DSM 13247로서).

실시예 6

라이신의 제조

실시예 5에서 수득된 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1acp를 라이신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양한 후 배양 상등액으로부터 라이신 함량을 측정하였다.

이를 위해서, 상기 균주를 우선 상응하는 항생제를 함유하는 아가 플레이트(카나마이신 50㎎/ℓ을 함유하는 뇌-심장 아가) 상에서 33℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이러한 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 수득하였다(100㎖ 원뿔형 플라스크 중 10㎖). 완전 배지 CgIII을 예비배양을 위한 배지로서 사용하였다.

배지 Cg III

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-효모 추출물 10g/ℓ

글루코오스(따로 오토클레이브함) 2%(w/v)

pH는 pH 7.4로 조정하였다.

카나마이신(25㎎/ℓ)을 상기 배지에 부가하였다. 예비 배양물을 진탕 장치 상에서 240rpm에서 33℃에서 24시간 동안 배양하였다. 주 배양물을 주 배양물의 초기 OD(660㎚)가 0.1이 되도록 상기 예비 배양물로부터 수득하였다. 배지 MM을 주 배양을 위해서 사용하였다.

배지 MM

CSL(옥수수침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코오스(따로 오토클레이브함) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄

KH₂PO₄25g/ℓ

MgSO₄*7H₂O 0.1g/ℓ

CaCl₂*2H₂O 1.0g/ℓ

FeSO₄*7H₂O 10㎎/ℓ

MnSO₄*H₂O 10㎎/ℓ

바이오틴(멸균-여과됨) 0.3㎎/ℓ

티아민*HCl(멸균-여과됨) 0.2㎎/ℓ

L-루이신(멸균-여과됨) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염 용액을 암모니아 수용액으로 pH 7로 조정하고 오토클레이브하였다. 이후, CaCO₃뿐만 아니라 멸균된 기질 및 비타민 용액을 부가한 후 건조 상태에서 오토클레이브하였다.

배양은 배플(baffle)을 갖는 100㎖ 원뿔형 플라스크 중 10㎖ 용적으로 수행하였다. 카나마이신(25㎎/ℓ)을 부가하였다. 배양은 33℃ 및 80% 대기 습도에서 수행하였다.

48시간 후, OD를 Biomek 1000(제조원: Beckmann Instruments GmbH, Muich)을 사용하여 660㎚의 측정 파장으로 측정하였다. 형성된 라이신 양은 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출로 컬럼 후 유도체화에 의해 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)로 측정하였다.

실험 결과는 표 1에 나타낸다.

균주	OD(660)	라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715/pJC1acp	12.67	14.63
DSM5715	12.80	14.08

실시예 7

성장 특성의 개선

실시예 4에서 수득된 플라스미드 pJC1acp를 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC 13032의 형질전환에 사용하였다. 이러한 균주는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 형질전환시키고 실시예 5에 기술된 바와 같이 제한 절단 및 아가로오스 겔 전기영동으로 검사하였다. 수득되는 균주 ATCC 13032/pJC1acp를 성장의 측정에 적합한 영양 배지에서 배양하고 성장을 다양한 온도에서 측정하였다.

이를 위해서, 상기 균주를 우선 실시예 6에서 기술된 바와 같이, 상응하는 항생제를 함유하는 아가 플레이트(카나마이신 50㎎/ℓ을 함유하는 뇌-심장 아가) 상에서 24시간 동안 30℃에서 배양하였다. 이러한 아가 플레이트 배양으로 출발하여, 예비 배양물(100㎖ 원뿔형 플라스크 중 10㎖ 배지)을 수득하였다. 실시예 6에 기술된 완전한 배지 CgIII을 예비배양을 위한 배지로서 사용하였다. 카나마이신(25㎎/ℓ)을 이에 부가하였다. 예비 배양물을 30℃에서 진탕 장치 상에서 240rpm으로 16시간 동안 항온처리하였다. 주 배양물을 주 배양물의 초기 OD(600㎚)는 0.7이 되도록 이러한 예비 배양물로부터 수득하였다. 배지 MM을 주 배양에 사용하였다.

배지 MM

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 42g/ℓ

글루코오스(따로 오토클레이브함) 40g/ℓ

(NH₄)₂SO₄20g/ℓ

KH₂PO₄1.0g/ℓ

K₂HPO₄1.0g/ℓ

MgSO₄*7H₂O 0.25g/ℓ

CaCl₂*2H₂O 10㎎/ℓ

FeSO₄*7H₂O 10㎎/ℓ

MnSO₄*H₂O 10㎎/ℓ

ZnSO₄*H₂O 1㎎/ℓ

CuSO₄0.2㎎/ℓ

NiCl₂*6H₂O 0.02㎎/ℓ

바이오틴(멸균-여과시킴) 0.2㎎/ℓ

프로토카테츄산(멸균-여과시킴) 30㎎/ℓ.

MOPS 및 염 용액은 암모니아 수용액으로 pH 7로 조정하고 오토클레이브하였다. 이후, 멸균 기질 및 비타민 용액을 부가하였다.

배양은 배플을 갖는 500㎖ 원뿔형 플라스크 중 60㎖ 용적으로 수행하였다. 카나마이신(25㎎/ℓ)를 부가하였다. 배양은 40℃에서 수행하였다. OD는 Ultrospec 3000(제조원: Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden)을 사용하여 600㎚의 측정 파장에서 측정하였다. 실험 결과는 도 2에 나타낸다.

Claims

a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드, b) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보성인 폴리뉴클레오타이드, 및 d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 코리네형 세균에서 복제할 수 있는, 바람직하게는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 서열 번호 1에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, (ii) 유전자 암호의 축퇴성 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 서열 하나 이상, 또는 (iii) 서열 (i) 또는 (ii)와 상보성인 서열과 하이브리드화하는 서열 하나 이상, 및 임의로 (iv) (i)에서 중성 작용의 센스 돌연변이를 포함하는, 복제할 수 있는 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
a) 적어도 acp 유전자 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드가 증강, 특히 과발현된 L-아미노산 생산 코리네형 세균을 발효시키는 단계,

b) 배지에서 또는 세균 세포에서 L-아미노산을 농축시키는 단계, 및

c) L-아미노산을 분리하는 단계를 수행함을 특징으로 하는, L-아미노산, 특히 L-라이신의 발효 제조 방법.
제7항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 추가의 유전자들을 부가적으로 증강시킨 세균을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, L-라이신 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 제거된 세균을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, acp 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L-라이신을 생산하는 코리네형 세균을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 라이신의 제조를 위해서,

12.1 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

12.2 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

12.3 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

12.4 트리오스 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자,

12.5 석시닐 디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자,

12.6 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

12.7 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자, 및

12.8 라이신 외부수송을 암호화하는 lysE 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 증강, 특히 과발현 또는 증폭된 세균을 동시에 발효시킴을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, L-라이신을 제조하기 위해서,

13.1 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자, 및

13.2 글루코오스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감퇴된 세균을 발효시킴을 특징으로 하는 방법.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 속의 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
폴리머라제 연쇄 반응에 의해 아실 수송 단백질을 암호화하는 유전자의 DNA를 제조하기 위한 프라이머로서 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부분의 용도.
acp 유전자의 서열과 높은 유사성을 갖는 cDNA 또는 유전자의 분리를 위한 하이브리드화 프로브로서 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.