KR20160025043A - 폴리（5ｈｖ）및 5 탄소 화학물질의 생산을 위한 녹색 공정 및 조성물 - Google Patents

폴리（5ｈｖ）및 5 탄소 화학물질의 생산을 위한 녹색 공정 및 조성물 Download PDF

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제프 빅커마이어
천팽 루
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Abstract

폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 재조합 숙주 및 재생가능 탄소 기질로부터 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 방법이 제공된다. 또한, 5-아미노펜타노에이트(5AP), 5-히드록시발레레이트(5HV), 글루타레이트, 및 1,5-펜탄디올(PDO)과 같은 5-탄소 화학물질을 생산하는 특정 재조합 숙주도 제공된다. 일실시예에 따르면, 폴리히드록시알카노에이트 신타제 및 5-히드록시발레레이트-CoA(5HV-CoA) 트랜스페라제에서 선택된 이종성 효소를 암호화하는 유전자를 발현하는 재조합 숙주를 제공하며, 상기 숙주는 5-히드록시발레레이트를 포함하는 폴리머는 생산한다. 바람직하게는, 상기 숙주는 폴리히드록시알카노에이트 신타제 및 5-히드록시발레레이트-CoA(5HV-CoA) 트랜스페라제 모두를 발현한다. 상기 숙주는 원핵생물이거나 진핵생물일 수 있다. 원핵 숙주는 E. coli이다. 상기 재조합 숙주에 의해 생산된 폴리머는 5-히드록시발레레이트의 호모 폴리머 또는 공중합체일 수 있다. 바람직한 공중합체는 폴리(4-히드록시부티레이트-공중합-5-히드록시발레레이트) 이다.

Description

폴리（5ＨＶ）및 5 탄소 화학물질의 생산을 위한 녹색 공정 및 조성물{GREEN PROCESS AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING POLY(5HV)AND 5 CARBON CHEMICALS}
본 발명은 일반적으로 5-히드록시발레레이트를 함유하는 폴리히드록시알카노에이트류와 그들의 공중합체들 그리고 5개 탄소 원자를 함유하는 화학적 중간체(C5 화학물질)들을 생산하는 트랜스제닉 생물에 관한 것이다.
관련 출원의 참조
본 출원은 2008년 12월 12일 제출된 미국 가 특허출원 제61/122,250호의 우선권을 주장하며, 이것은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
폴리히드록시알카노에이트(PHA)는 필름(예를 들어, 포장 필름, 농업용 필름, 뿌리덮개용 필름), 골프 티, 캡 및 클로저, 농업용 지지대 및 말뚝, 종이 및 보드 코팅제(예를 들어, 컵, 플레이트, 상자 등), 열성형 제품(예를 들어, 트레이, 컨테이너, 요구르트 단지, 화분, 면기, 주형제품 등), 하우징(예를 들어, 전자제품용), 포대류(예를 들어, 쓰레기포대, 잡화포대, 식품포대, 비료포대 등), 위생용품(예를 들어, 기저귀, 여성용 위생용품, 요실금용 제품, 일회용 행주 등), 과립형 제품(예를 들어, 과립형 비료, 제초제, 살충제, 종자 등)용 코팅제의 제조에 제한 없이 사용될 수 있는 생분해성 플라스틱이다.
PHA는 또한 봉합사, 수선 장치, 수선 패치, 슬링, 심혈관 패치, 정형외과용 핀, 부착 장벽, 스텐트, 유도형 조직 수선/재생 장치, 인공연골 수선 장치, 신경 유도장치, 건 수선 장치, 골수 스캐폴드, 및 상처 드레싱을 포함하는 생물의학 장치의 개발에도 사용되고 있다.
폴리히드록시알카노에이트는 발효 공정에 의해 생산될 수 있다. 폴리히드록시알카노에이트를 생산하기 위한 기존의 발효 방법에서는 특정 기질에서 배양된 야생형 또는 트랜스제닉 미생물을 이용하여 원하는 PHA 폴리머 조성물을 생산하고 있다. 많은 경우, 대상 폴리머들은 3-히드록시부티레이트의 (D)-이성질체가 어느 다른 3, 4 또는 5-히드록시산과 공중합된 공중합체들이다. 이들 공중합체들은 세포 내부에 함입된 과립으로서 생산되며, 랜덤 공중합체이다. 공중합체인 폴리(3-히드록시부티레이트-공중합-5-히드록시발레레이트)(PHB5HV)와 호모폴리머인 폴리(5-히드록시발레레이트)(P5HV)는 산업상 유용한 플라스틱 재료로서, 생분해성이고 생체재흡수성 재료라는 이점을 가진다. 현재까지 이들 재료는 석유로부터 얻어지는 5-히드록시 발레르산(5HV)이나 1,5-펜탄디올 같은 5-탄소 기질을, 이러한 기질을 활성화 모노머 5HV-코엔자임 A로 대사하고, 그것을 PHA 중합효소의 작용에 의해 중합하여 PHB5HV 또는 P5HV 폴리머를 형성할 수 있는 능력을 가진 미생물에게 공급함으로써 생산되고 있었다. 이러한 방법에 의해 생산되는 PHB5HV와 P5HV는 단지 일부만 재생가능 자원으로 제조되며, 5-탄소 석유 기질의 높은 비용으로 인하여 가격이 비싸다. PHV5HV와 P5HV 폴리머의 생산을 위한 원료로서 비-석유 재생가능 탄소 기질을 사용하는 것이 비용을 낮출 수 있고 완전히 재생가능 자원으로 제조된 재료를 제공할 수 있어서 매우 바람직하다. 또한, 이들 폴리머의 생산을 위해서 온실가스 생산이 적은 공정을 개발하는 것이 바람직하다. 적합한 재생가능 자원은 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스, 아라비노오스 및 리신 및 프롤린을 포함하는 아미노산 원료로부터 선택된 하나 이상의 원료를 포함하는 농작물로부터 입수할 수 있는 탄수화물 원료를 포함한다.
따라서, 본 발명의 목적은, 야생형 또는 유전자 조작된 폴리히드록시알카노에이트 생산자에 유전자를 도입하여, 석유에서 얻어지지 않은 기질로부터 생산되는 5-히드록시발레레이트와 같은 모노머를 합성하는 새로운 균주를 만들 수 있는 공정 및 재조합 생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은, 단일 성분으로서 또는 코-모노머로서 5-히드록시발레레이트를 함유하는 PHA를 합성하는 재조합 생물을 안정하게 조작할 수 있는 과정 및 기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 5-아미노펜타노에이트(5AP), 글루타레이트, 및 1,5-펜탄디올(PDO)와 같은 5-탄소 화학물질을 합성하는 재조합 생물을 안정하게 조작할 수 있는 과정 및 기술을 제공하는 것이다.
5HV 함유 PHA 생물폴리머
본 발명에 따라서, 5-히드록시발레레이트(5HV) 모노머를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트(PHA)를 생산할 수 있는 재조합 숙주 및 재생가능 탄소 기질로부터 5HV 모노머를 포함하는 PHA를 생산하는 방법이 제공된다. 또한, 5-아미노펜타노에이트(5AP), 5HV, 글루타레이트, 및 1,5-펜탄디올(PDO)과 같은 5-탄소 화학물질을 생산하는 특정 재조합 숙주도 제공된다.
일실시예는 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 신타제 및 5-히드록시발레레이트-CoA(5HV-CoA) 트랜스페라제 또는 5HV-CoA 합성효소를 암호화하는 유전자와 리신 이화작용 경로에 연관된 이종성 효소를 암호화하는 적어도 하나의 트랜스유전자를 발현하는 재조합 숙주를 제공하며, 이때 상기 숙주는 이 생물이 리신, 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스, 아라비노오스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 재생가능 탄소 기질과 함께 제공될 때 5HV 모노머를 함유하는 PHA 폴리머를 생산하고, 생산된 5HV 모노머의 수준은 상기 트랜스유전자(들)의 발현이 부재할 때보다 높다. 예시적인 숙주는 리신 2-모노옥시게나제, 5-아미노펜탄아미다제, 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제, 글루타레이트 세미알데히드 환원효소, 5-히드록시발레레이트 CoA-트랜스페라제, 및 폴리히드록시알카노에이트 신타제를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 발현하며, 이로써 5HV 모노머를 함유하는 PHA 폴리머를 생산한다. 바람직하게, 숙주는 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소를 암호화하는 유전자 및/또는 리신 수출인자 암호화 유전자에 결실이나 돌연변이를 가진다. 특히 적합한 숙주는 또한 리신을 과다생산하는 능력을 가지며, S-(2-아미노에틸)시스테인 같은 독성 리신 유사체에 저항성이다.
다른 실시예에 따르면, PHA 신타제, 5HV-CoA 트랜스페라제 또는 5HV-CoA 합성효소를 암호화하는 유전자들 중 하나 이상은 트랜스유전자에서도 발현된다.
다른 실시예에 따르면, 재조합 생물에 리신이 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스, 아라비노오스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 재생가능 탄소 기질과 조합되어 공급되며, 이로써 5HV 함유 PHA 폴리머가 생산되고, 폴리머가 세포로부터 회수된다.
다른 실시예에 따르면, 재조합 생물에 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스, 아라비노오스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 재생가능 탄소 기질이 공급되며, 이로써 5HV 함유 PHA 폴리머가 생산되고, 폴리머가 세포로부터 회수된다.
재조합 숙주에 의해서 생산된 폴리머는 5HV 모노머의 호모폴리머이거나 또는 공중합체일 수 있다. 바람직한 공중합체는 PHB5HV이다. 재조합 숙주에 의해서 생산된 다른 유용한 폴리머는 공중합체인 폴리(3-히드록시프로피오네이트-공중합-5-히드록시발레레이트)와 폴리(4-히드록시부티레이트-공중합-5-히드록시발레레이트), 그리고 호모폴리머인 P5HV이다.
숙주는 원핵생물이거나 진핵생물일 수 있다. 바람직한 원핵생물 숙주는 E. coli, Ralstonia eutropha, Alcaligenes lotus 및 C. glutamicum이다.
또한, 리신, 또는 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스, 아라비노오스 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 재생가능 탄소 기질로부터 PHA 폴리머를 생산할 수 있는 재조합 숙주가 제공된다. 예시적인 숙주는 리신 2-모노옥시게나제, 5-아미노펜탄아미다제, 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제, 글루타레이트 세미알데히드 환원효소, 5-히드록시발레레이트 CoA-트랜스페라제, 및 폴리히드록시알카노에이트 신타제를 발현하며, 이로써 5HV를 포함하는 폴리머를 생산한다. 폴리머는 리신과 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스 및 아라비노오스로부터 선택된 하나 이상의 재생가능 탄소 기질을 원료로 사용하여 생산된다. 바람직하게, 숙주는 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소 및 리신 수출 암호화 유전자에 결실을 가진다.
1,5-펜탄디올 생산
다른 재조합 숙주는 5-히드록시발레레이트 CoA 트랜스페라제, CoA 의존성 프로피온알데히드 탈수소효소, 및 1,3-프로판디올 탈수소효소를 과발현하도록 유전자 조작되며, 이로써 1,5-펜탄디올을 생산한다. 1,5-펜탄디올은 5-히드록시발레레이트, 리신, 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스 및 아라비노오스를 단독으로 또는 조합하여 원료로 사용하여 생산된다. 바람직하게, 재조합 숙주는 adhE, ldhA, 및 ackA-pta에 결실을 가지며, 리신 2-모노옥시게나제, 5-아미노펜탄아미다제, 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제 및 하나 이상의 글루타레이트 또는 숙시네이트 세미알데히드 환원효소 암호화 유전자를 발현한다. 특히 적합한 숙주는 리신을 과다생산하는 능력을 가지며, S-(2-아미노에틸)시스테인 같은 독성 리신 유사체에 저항성이다. 바람직하게, 이 생물은 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소 활성이 감소되거나 전혀 없다.
재생가능 탄소 기질로부터 1,5-펜탄디올을 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 재조합 생물에 재생가능 탄소 기질이 공급되고, 1,5-펜탄디올이 생산되고, 배지에 분비되고, 그로부터 회수된다.
다른 실시예에 따르면, 본 발명은 재생가능 자원으로부터 생산된 1,5-펜탄디올을 제공한다.
글루타르산 생산
또한, 리신, 또는 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스 및 아라비노오스, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 재생가능 탄소 기질로부터 글루타레이트(글루타르산)를 과다생산할 수 있는 재조합 숙주가 제공된다. 예시적인 숙주는 리신 2-모노옥시게나제, 5-아미노펜탄아미다제, 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제 및 하나 이상의 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소 암호화 유전자를 발현한다. 특히 적합한 숙주는 리신을 과다생산하는 능력을 가지며, S-(2-아미노에틸)시스테인 같은 독성 리신 유사체에 저항성이다.
또한, 재생가능 탄소 기질로부터 글루타레이트를 과다생산하는 방법이 제공되며, 여기서 재조합 생물에 리신, 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스 및 아라비노오스, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 재생가능 탄소 기질이 공급되고, 글루타레이트가 과다생산되고, 배지로 분비되고, 그로부터 회수된다.
도 1은 재생가능 자원으로부터 생물학적으로 생산될 수 있는 다양한 5-탄소 분자들을 도시하는 도해이다. 일부 예에서, 이들 재생가능 자원에 기초한 분자들은 표준 화학법을 사용하여 상호전환될 수 있으며, 화학적 중합 공정에 의해 폴리머 등을 제조하는데 사용될 수 있다.
도 2a는 5-히드록시발레레이트 함유 폴리히드록시알카노에이트 폴리머, 그리고 5-아미노펜타노에이트(5-APO), 글루타레이트, δ-발레로락톤(DVL) 및 1,5-펜탄디올과 같은 5-탄소 화학물질에 도달하는 생화학적 경로를 도시하는 도해이다. 경쟁적 대사 경로도 도시되는데, 상기 열거된 바람직한 산물로의 최적의 탄소 흐름을 달성하기 위해서는 이들 경로는 제거되거나 활성이 감소되어야 할 수 있다(X로 표시한 대로). 도 2b는 생물합성 반응을 촉매하는 효소들을 도시한다: (1) 리신 2-모노옥시게나제, EC 1.13.12.2; (2) 5-아미노펜탄아미다제(a.k.a.δ-아미노발레르아미다제), EC 3.5.1.30; (3) 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제(a.k.a.δ-아미노발레레이트 트랜스아미나제), EC 2.6.1.48; (4) 숙시네이트 세미알데히드 환원효소(a.k.a.5-옥소펜타노에이트 환원효소), EC 1.1.1.61; (5) CoA-트랜스페라제, EC 2.8.3.n; (6) Acyl-CoA 합성효소,EC 6.2.1.3; (7) PHA 신타제, EC 2.3.1.n; (8) β-케토아실-CoA티올라제, EC 2.3.1.9; (9) 아세토아세틸-CoA 환원효소,EC 1.1.1.36; (10) 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소, EC 1.2.1.20.
도 3은 카다베린 및 5-아미노펜탄알을 통한 L-리신으로부터 5-아미노펜타노에이트로의 대안적 루트의 생화학적 경로를 도시하는 도해이다.
도 4는 L-프롤린으로부터 5-아미노펜타노에이트로의 생화학적 경로를 도시하는 도해이다.
도 5는 알파-케토글루타레이트로부터 대사 중간체인 글루타레이트 세미알데히드를 거쳐 5-히드록시발레레이트와 그것의 유도체 그리고 글루타레이트가 생산되는 생화학적 경로를 도시하는 도해이다.
도 6은 TCA 사이클의 중간체인 옥살로아세테이트로부터 L-리신으로의 생화학적 경로를 도시하는 도해이다.
도 7은 1,5-펜탄디올로의 생화학적 경로를 도시하는 도해이다.
도 8a는 균주 3291로부터의 가공된 세포 배양물의 시간(분)에 따른 총 이온 부화도를 도시하는 크로마토그램이다. 도 8b는 균주 3291로부터의 가공된 세포 배양물의 이온 분광도로서, 질량전하 비 "m/z"와 그것의 이온 부화도의 관계(상대적 단위)를 도시한다.
I. 정의
본원에서 사용된 많은 용어들은 다음 장에서 명확하게 정의된다.
용어 "PHA 공중합체"는 적어도 2개의 상이한 히드록시 알칸산 모노머로 이루어진 폴리머를 말한다.
용어 "PHA 호모폴리머"는 하나의 히드록시알칸산 모노머로 이루어진 폴리머를 말한다.
본원에서 사용된 "벡터"는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이며, 여기에 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입되어 삽입된 세그먼트의 복제가 일어날 수 있다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
본원에서 사용된 "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터이다.
본원에서 사용된 "발현 제어 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 제어하고 조절하는 DNA 서열이다.
본원에서 사용된 "작동 가능하게 연결된"은 발현 제어 서열이 대상 코딩 서열의 발현을 효과적으로 제어하도록 유전자 구성물에 통합된 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "형질전환된" 및 "트랜스펙션된"은 본 분야에 공지된 여러 기술에 의한 세포로의 핵산의 도입을 포괄하는 의미이다.
본원에서 사용된 "과다생산된"은 특정 화합물이 조작되지 않은 생물과 비교하여 조작된 생물에서 더 많은 양으로 생산된 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "재생가능 원료", "재생가능 탄소 기질" 및 "재생가능 기질"은 모두 상호 교환하여 사용된다.
"플라스미드"는 대문자들 및/또는 숫자들 앞에서 및/또는 뒤에서 소문자 "p"로서 표시된다.
본원에서 사용된 용어 "이종성"은 다른 숙주에서 유래한 것을 의미한다. 다른 숙주는 동일한 종이거나 상이한 종일 수 있다.
II. 폴리히드록시알카노에이트 및 5-탄소 화학물질을 생산하기 위한 대사 경로
5-히드록시발레레이트 함유 폴리히드록시알카노에이트 폴리머와 5-아미노펜타노에이트(5AP), 5-히드록시발레레이트(5HV), 글루타레이트 및 1,5-펜탄디올(PDO)와 같은 5-탄소 화학물질을 생산하는 생화학적 경로를 위한 효소들을 가진 재조합 생물들이 제공된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주가 재생가능 자원에 기초한 원료로부터 5-히드록시발레레이트, 그것의 폴리머 또는 개시된 5-탄소 화학물질들을 생산하는데 필요한 효소를 발현하도록 유전자 조작된다. 원하는 산물을 생산하기 위한 효소 경로들이 아래 제공된다.
A. 5-아미노펜타노에이트
5-아미노펜타노에이트(5AP)는 α-아미노산인 L-리신으로부터 중간체로서 5-아미노펜탄아미드를 거치는 두 단계의 효소 과정에서 생산될 수 있다(도 2). 이들 효소들 중 첫 번째로서 리신 2-모노옥시게나제는 다양한 슈도모나드 균주들의 리신 분해 경로에서 1차 효소 단계이다(Takeda and Hayaishi, J. Biol. Chem. 241:2733-2736(1966); Hayaishi, Bacteriol. Rev. 30:720-731(1966); Reitz and Rodwell, J. Biol Chem. 245:3091-3096(1970); Flashner and Massey, J. Biol. Chem. 249:2579-2586 (1974)). 리신 2-모노옥시게나제를 암호화하는 유전자가 Pseudomonas putida에서 확인되었고, davB라고 명명되었다(Revelles et al., J. Bacteriol. 187:7500-7510(2005)). 2차 효소 단계에서는 5-아미노펜탄아미드가 5AP로 전환되며, 이 과정은 5-아미노펜탄아미다제에 의해 촉매되며(Reitz et al, Anal. Biochem. 28:269-272(1969); Reitz and Rodwell, J. Biol. Chem. 245:3091-3096(1970)), 이 효소는 P. putida에서 davA에 의해 암호화된다(Revelles et al., J. Bacteriol. 187:7500-7510(2005)).
도 3에 도시된 대로, 대안적 경로가 이용될 수 있으며, 여기서는 카다베린을 생산하기 위한 리신 디카르복실라제, 5-아미노펜텐알을 형성하기 위한 퓨트레신 트랜스아미나제 및 5AP를 생합성하기 위한 γ-아미노부티르알데히드 탈수소효소를 포함하는 세 효소 반응을 거쳐 L-리신이 5AP로 전환된다.
도 4에 개략된 대로, 5AP는 L-리신 대신 L-프롤린으로부터 생산될 수도 있는데, 이것은 D-프롤린을 생합성하기 위한 프롤린 라세마제 및 5AP를 형성하기 위한 프롤린 환원효소를 포함하는 두 효소 반응을 거쳐 일어난다.
B. 5-히드록시발레레이트
또 다른 5-탄소 화학물질인 5HV의 생합성은, 도 2에 개략된 대로, 5AP로부터 두 단계의 효소 과정을 거쳐서 일어날 수 있다. 5AP가 5AP 트랜스아미나제(Reitz and Rodwell, J. Biol. Chem. 245:3091-3096(1970)) 및 P. putida로부터 확인되어 davT로 명명된 유전자(Espinosa-Urgel and Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5219-5224(2001))에 의해 글루타레이트 세미알데히드로 전환된다. 실험예 7에 개략된 대로, 몇 가지 재조합 세미알데히드 환원효소 유전자를 클로닝한 후 시험해서 암호화된 효소가 글루타레이트 세미알데히드를 5HV로 효과적으로 전환시켰는지 조사했다. 가설상의 단백질 ATEG_00539는 이 반응을 효과적으로 촉매한다는 것이 발견되었으며, 따라서 글루타레이트 세미알데히드 환원효소(glutarate semialdehyde reductase)에 맞게 gsaR이라고 재명명되었다.
일부 호열성 박테리아와 효모를 포함하는 저급 진균에서 α-아미노케노아디페이트 경로(Xu, Cell Biochem. Biophys. 46:43-64(2006))를 통해 리신이 합성되는데, 여기서는 2-케토아디페이트가 4번째 중간체이며, 따라서 글루타레이트 및 5HV와 같은 C5 화학물질뿐만 아니라 5HV-함유 PHA 폴리머의 잠재적 전구물질이다. 도 5에 도시된 대로, 이 경로는 α-케토글루타레이트와 아세틸-CoA에서 시작하여 2-케토아디페이트가 생합성된다. 이들 4개 효소를 발현하는 재조합 E. coli 숙주 균주가 2-케토아디페이트를 생산하는 것으로 밝혀졌다(Andi et al, Biochem. 43:11790-11795(2004); Jia et al., Biochem. J. 396:479-485(2006); Miyazaki et al., J. Biol. Chem. 278:1864-1871(2003)). 2-케토아디페이트는 2-케토아디페이트와 α-케토글루타레이트의 구조적 유사성으로 인해 α-케토글루타레이트 탈수소효소에 의해 글루타릴-CoA로 전환될 수 있다. 글루타릴-CoA는 역시 숙시닐-CoA와 글루타릴-CoA의 구조적 유사성으로 인해 숙시닐-CoA 합성효소(SucD)와 같은 숙신산 세미알데히드(SSA) 탈수소효소에 의해 전환될 수 있다(Sohling and Gottschalk J. Bacterid 178:871-880(1996)).
C. 글루타레이트
5-탄소 화학물질인 글루타레이트의 생합성은, 도 2에 개략된 대로, 글루타레이트 세미알데히드로부터 탈수소효소 반응을 통해서 진행된다(Ischihara et al, J. Biochem.(Tokyo) 49:154-157(1961); Reitz and Rodwell, J. Biol. Chem. 245:3091-3096(1970)). davD 유전자가 P. putida에서 이러한 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소 활성을 암호화하는 것으로 확인되었다(Espinosa-Urgel and Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67:5219-5224(2001); Revelles et al, J. Bacterid. 186:3439 -3446(2004)). 글루타레이트는 폴리에스테르 폴리에스테르 폴리올 및 폴리아미드와 같은 폴리머의 생산에 유용하다. 홀수 개의 탄소 원자(즉, 5개)가, 예를 들어 폴리머의 탄성을 감소시키는데 유용하다. 또한, 1,5-펜탄디올은 통상적인 가소제로서, 글루타레이트 및 그것의 유도체들의 수소화에 의해서 제조되는 폴리에스테르의 전구물질이다(Werle and Morawietz, "다가 알코올류", Ulhnann's Encyclopedia of Industrial Chemistry: 2002, Wiley-VCH: Weinheim. DOI 10.1002/14356007.a01_ 305).
D. 폴리(5-히드록시발레레이트)
폴리(5-히드록시발레레이트)(a.k.a.P(SHV)) PHA로 구성된 호모폴리머의 생합성은 5HV로부터 5-히드록시발레레이트-CoA를 통해서 진행될 수 있다. 두 상이한 효소 반응이 1차 단계를 촉매할 수 있는데, 즉 Huisman 외(미국특허 제7,229,804호), Sohling and Goltschalk(J. Bacterid. 178:871-880(1996)), 및 Eikmanns and Buckel(Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371:1077-1082(1990))에 의해 설명된 CoA-트랜스페라제에 의해서, 또는 van Beilen 외(Molec. Microbiol. 6:3121-3136(1992))에 의해 설명된 CoA-합성효소에 의해 촉매될 수 있다. 5-히드록시발레레이트-CoA의 중합은 Ralstonia eutropha phaC1(Peoples and Sinskey, J. Biol. Chem. 264:15298-15303(1989))에 의해 암호화되는 것과 같은 PHA 중합효소에 의해 촉매될 수 있다. 대안으로서, PhaC3/C5 신타제 융합 단백질이 Huisman 외(미국특허 제6,316,262호)에 의해 설명된 대로 사용될 수 있다.
E. 폴리(3-히드록시부티레이트-공중합-5-히드록시발레레이트)
폴리(3-히드록시부티레이트-공중합-5-히드록시발레레이트)(a.k.a.P(3HB-co-5HV))를 포함하는 공중합체의 생합성은 3-히드록시부티릴-CoA(3HB-CoA)와 5HV-CoA 모노머 전구물질 분자를 제공함으로써 일어날 수 있다. 도 2에 개략된 대로, 3HB-CoA는 아세틸-CoA로부터 두 단계 효소 과정을 통해 생합성될 수 있다: (i) 제한되는 것은 아니지만, Ralstonia eutropha부터의 bktB(Slater et al., J. Bacteriol. 180(8):1979-1987(1998))와 같은 적합한 유전자를 사용하여 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 β-케토아실-CoA 티올라제 반응(Nishimura et al., J. Biol. Chem. 116:21-27(1978)), 및 (ii) 제한되는 것은 아니지만, Bacillus megaterium로부터의 phaB(McCool and Cannon, J. Bacteriol. 181(2):585-592(1999))와 같은 적합한 유전자를 사용하여 아세토아세틸-CoA를 3HB-CoA로 전환하는 아세토아세틸-CoA 환원효소 반응(Fukui et al., Biochim. Biophys. Acta 917:365-371(1987)). 상기 개략된 대로, PHA 공중합체는 다양한 PHA 신타제들에 의해서 합성될 수 있다.
F. 리신
도 6은 E. coli에서의 리신 대사의 생합성 경로를 개략적으로 도시한다. 도면의 중심에 있는 점선과 실선은 각각 L-리신에 의한 알로스테릭 피드백 억제와 전사 제한을 나타내며, 이들은 E. coli와 같은 재조합 숙주 세포에서 L-리신 생산을 증가시키기 위해 필요한 유전자 변형의 표적을 제공한다.
G. 1,5-펜탄디올
도 7은 5HV로부터 1,5-펜탄디올(PDO)이 생산되는 개략적인 내용을 제공한다. Huisman 외(미국특허 제7,229,804호), Sohling and Gottschalk(J. Bacterid. 178: 871-880(1996)), 및 Eikmanns and Buckel(Biol Chem. Hoppe-Seyler 371:1077-1082 (1990))에 의해 설명된 대로 CoA-트랜스페라제에 의해, 또는 van Beilen 외(Molec, Microbiol. 6:3121-3136(1992))에 의해 설명된 대로 CoA-합성효소에 의해서 5HV가 5HV-CoA로 전환될 수 있다. 5HV는 Salmonella typhimurium로부터의 pduP(Leal, Arch. Microbiol. 180:353-361(2003)) 또는 E. coli로부터의 eutE(Skraly, WO 2004 /024876)와 같은 프로피온알데히드 탈수소효소나 알코올 탈수소효소에 의해 5-히드록시펜텐알로 전환될 수 있다. 5-히드록시펜텐알은 Klebsiella pneumoniae로부터의 dhaT(Tong et al., Appl. Environ. Microbiol. 57(12):3541-3546(1991))와 같은 1,3-프로판디올 탈수소효소 또는 알코올 탈수소효소에 의해 PDO로 전환될 수 있다.
H. 5-히드록시발레레이트-공중합-3-히드록시프로피오네이트
5HV로부터 5-히드록시발레레이트-공중합-히드록시프로피오네이트를 함유하는 공중합체가 생산될 수 있다. fadR+(제한된 지방산 분해(FAD)) 또는 fadR-(구성성 FAD)였던 E. coli K12 균주들이 폴리히드록시알카노에이트 및 5-히드록시발레레이트 CoA 트랜스페라제를 발현하는 핵산들로 트랜스펙션된다. 바람직한 E. coli 균주는 MG1655 및 LS5218(Spratt et al., J. Bacteriol 146(3):1166-1169(1981))을 포함한다. 표 6에 나타낸 대로, GC-FID 분석에 의해서 LS5218[pMS93]이 6.4% dcw PHA를 생산했으며, 이때 폴리머 조성은 52% 5HV와 48% 3HP라는 것이 밝혀졌다. 한편, MG1655[pMS93]는 63.1% dcw PHA를 만들어 냈으며, 이것은 5HV로만 구성되었다. 또한, LS5218[pMS93]의 GC-MS 분석에 의해 폴리머 샘플 중에 3HP가 존재한다는 것이 확인되었다. 이와 같이, LS5218의 활성 FAD 시스템은 Na5HV로부터 3HP를 합성할 수 있다.
III. 폴리히드록시알카노에이트 및 5-탄소 화학물질을 생산할 수 있는 트랜스제닉 생물의 생산
폴리히드록시알카노에이트 및 5-탄소 화학물질을 생산할 수 있는 트랜스제닉 생물들이 본 분야에 공지된 종래의 기술을 이용하여 생산된다.
A. 트랜스제닉 P(5HV) 생산자를 생산할 수 있는 유전자
5HV-함유 PHA 및 5-탄소 화학물질을 생산하는 숙주 균주에 대해 클로닝되고 및/또는 평가된 유전자들이 적합한 효소 고유 번호(EC 번호) 및 참고사항들과 함께 아래 표 1A에 제시된다. 아래 더 논의된 대로, 일부 유전자들은 코돈 최적화에 맞춰 합성되었으며, 다른 유전자들은 자생 또는 야생형 생물의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 클로닝되었다.
표 1A: 5HV-함유 PHA 및 5-탄소 화학물질을 생산하는 미생물 숙주 균주의 유전자
Figure pat00001
Figure pat00002
과학 문헌들, 특허들을 조사하거나, 예를 들어 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 뉴클레오티드 또는 단백질 데이터베이스를 BLAST 조사함으로써 표 1A에 제시된 반응들을 촉매할 수 있는 다른 단백질들이 발견될 수 있다. 다음에, 합성 유전자를 만들어 서열 데이터베이스로부터 물리적 DNA로 되는 용이한 경로를 제공할 수 있다. 이러한 합성 유전자들은 이종성 단백질 발현을 증진시킬 수 있는 코돈을 사용하여 발현 시스템과 숙주에 필요한 특성들을 최적화하면서 기초부터 설계되어 제작된다. 예를 들어, DNA 2.0(Menlo Park, CA 94025, USA)과 같은 회사들이 이러한 상용 서비스를 제공한다. 표 1A에 제시된 생화학적 반응들을 촉매할 수 있는 단백질들이 표 1B-1AA에 제공된다.
[표 1B] DavB 단백질의 적합한 상동체들
(Pseudomonas putida KT2440, EC No. 1.13.12.2 유래의 리신 2-모노옥시게나제, L-리신에 작용하여 5-아미노펜탄아미드를 생산한다; 단백질 acc. no. BAG54787 (Revelles et al., J Bacteriol. 187:7500-10(2005))).
Figure pat00003
[표 1C]: DavA 단백질의 적합한 상동체들
(Pseudomonas putida KT2440, EC No.3.5.1.30 유래의 5-아미노펜탄아미다제, 5-아미노펜탄아미드에 작용하여 5-아미노펜타노에이트를 생산한다; 단백질 acc.no. BAG54788(Revelles et al., J Bacteriol. 187:7500-10(2005))).
Figure pat00004
[표 1D] DavT 단백질의 적합한 상동체들
(Pseudomonas putida KT2440, EC No. 2.6.1.48 유래의 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제, 5-아미노펜타노에이트에 작용하여 글루타레이트 세미알데히드를 생산한다; 단백질 acc. no. AAK97868(Espinosa-Urgel and Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67(11). 5219-5224 (2001))).
Figure pat00005
[표 1E] GabT 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, EC No. 2.6.1.48(또는 EC No. 2.6.1.19) 유래의 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제, 5-아미노펜타노에이트(또는 4-아미노부티레이트)에 작용하여 글루타레이트 세미알데히드(숙산산 세미알데히드)를 생산한다; 단백질 acc. no. NP_417148(Riley et al, Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006))).
Figure pat00006
[표 1F] GsaRAt2 단백질의 적합한 상동체들
(Aspergillus terreus NIH2624, EC No. 1.1.1.61 유래의 글루타레이트 세미알데히드 환원효소, 글루타레이트 세미알데히드(또는 숙신산 세미알데히드)에 작용하여 5-히드록시발레레이트(또는 4-히드록시부티레이트)를 생산한다: 단백질 acc. no. XP_001210625(Birren, The Broad Institute Genome Sequencing Platform, NCBI에 직접 제출))).
Figure pat00007
[표 1G]
GsaRAt 단백질의 적합한 상동체들
(Arabidopsis thaliana, EC No. 1.1.1.61 유래의 글루타레이트 세미알데히드 환원효소, 이것은 글루타레이트 세미알데히드(또는 숙신산 세미알데히드)에 작용하여 5-히드록시발레레이트(또는 4-히드록시부티레이트)를 생산한다: 단백질 acc.no. AAK94781(Breitkreuz et al., J. Biol. Chem. 278 (42), 41552-41556(2003))).
Figure pat00008
[표 1H] OrfZ 단백질의 적합한 상동체들
(Clostridium Kluyveri DSM 555, EC No. 2,8.3.n 유래의 CoA-트랜스페라제, 5-히드록시발레레이트에 작용하여 5-히드록시발레릴-CoA를 생산한다; 단백질 acc. no. AAA92344(Huisman et al., 미국특허 제7,229,804호; Sohling and Gottschalk, J. Bacterid. 178:871-880(1996))).
Figure pat00009
[표 1I] AlkK 단백질의 적합한 상동체들
(Pseudomonas oleovorans; EC No. 6.2.1.3 유래의 아실-CoA 합성효소, 5-히드록시발레레이트에 작용하여 5-히드록시발레릴-CoA를 생산한다; 단백질 acc. no. Q00594(van Beilen et al., Mol. Microbiol. 6(21), 3121-3136(1992))).
Figure pat00010
[표 1J] PhaC 단백질의 적합한 상동체들
(Ralstonia eutropha, EC No. 2.3.1.n 유래의 폴리히드록시알카노에이트 신타제, 이것은 (R)-3-히드록시부티릴-CoA + [(R)-3-히드록시부타노에이트]n에 작용하여 [(R)-3-히드록시부타노에이트](n+1) + CoA를 생산한다; 단백질 acc. no. YP_ 725940(Peoples and Sinskey, J. Biol. Chem. 264:15298-15303(1989))).
Figure pat00011
[표 1K] PhaE 단백질의 적합한 상동체들
(Thiocapsa pfenigii 유래의 PhaEC PHA 신타제의 PhaE 서브유닛, (R)-3-히드록시부티릴-CoA + [(R)-3-히드록시부타노에이트]n에 작용하여 [(R)-3-히드록시부타노에이트](n+l) + CoA를 생산한다).
Figure pat00012

[표 1L] PhaC 단백질의 wrj합한 상동체들
(Thiocapsa pfenigii 유래의 PhaEC PHA 신타제의 PhaC 서브유닛, (R)-3-히드록시부티릴-CoA + [(R)-3-히드록시부타노에이트]n에 작용하여 [(R)-3-히드록시부타노에이트](n+l) + CoA를 생산한다).
Figure pat00013
[표 1M] BktB(PhaA) 단백질의 적합한 상동체들
(Ralstonia eutropha H16, EC No. 2.3.1.9 유래 β-케토아실-CoA 티올라제, 아세틸-CoA에 작용하여 아세토아세틸-CoA를 생산한다; 단백질 acc. no. CAJ92573 (Peoples & Sinskey, J Biol Chem. 1989 Sep 15;264(26): 15293-7. Pohlmann et al., Nature Biotech 24(10), 1257-1262(2006))).
Figure pat00014
[표 1N] PhaB 단백질의 적합한 상동체들
(Bacillus megaterium, EC. No. 1.1.1.36 유래 아세토아세틸-CoA 환원효소, 아세토아세틸-CoA에 작용하여 (R)-3-히드록시부티릴-CoA를 생산한다; 단백질 acc. no. AAD05259(McCool & Cannon, J. Bacteriol. 183(14), 4235-4243(2001))).
Figure pat00015
[표 1O] DavD 단백질의 적합한 상동체들
(Pseudomonas putida KT2440, EC No. 1.2.1,20 유래의 글루타레이트-세미알데히드 탈수소효소, 이것은 글루타레이트 세미알데히드에 작용하여 글루타레이트를 생산한다; 단백질 acc. no. NP_742381(Espinosa-Urgel and Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67(11), 5219-5224(2001))).
Figure pat00016
[표 1P]
GabD 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, EC No. 1.2.1.20 유래의 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소, NADP+-의존성, 글루타레이트 세미알데히드(또는 숙신산 세미알데히드)에 작용하여 글루타레이트(또는 숙시네이트)를 생산한다; 단백질 acc. no. NP_417147(Riley et al, Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006))).
Figure pat00017
[표 1Q]
YneI(Sad) 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, EC No. 1.2.1.24 유래의 숙시네이트 세미알데히드 탈수소효소, NDP+-의존성, 글루타레이트 세미알데히드(또는 숙신산 세미알데히드)에 작용하여 글루타레이트(또는 숙시네이트)를 생산한다; 단백질 acc. no. NP_416042(Fuhrer et al., J Bacterid. 2007 Nov;189(22):8073-8. Dennis and Valentin, 믹구특허 제6,117,658호))).
Figure pat00018
[표 1R]
PduP 단백질의 적합한 상동체들
(Salmonella typhimurium LT2, EC No. 1.2.1.3 유래의 CoA-의존성 프로피온알데히드 탈수소효소, 5-히드록시발레릴-CoA에 작용하여 5-히드록시펜탄알을 생산한다; 단백질 acc. no. NP_460996(Leal et al., Arch. Microbiol. 180:353-361 (2003), McClelland et al., Nature 413:852-856(2001))).
Figure pat00019
[표 1S] EutE 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, EC No. 1.2.1.3 유래의 예상된 알데히드 탈수소효소, 에탄올아민 활용 단백질, 이것은 5-히드록시발레릴-CoAtp에 작용하여 5-히드록시펜탄알을 생산한다; 단백질 acc. no, NP_416950(Riley et al., Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006))).
Figure pat00020
[표 1T] DhaT 단백질의 적합한 상동체들
(Klebsiella pneumoniae 342, EC No. 1.1.1,202 유래의 1,3-프로판디올 탈수소효소, 5-히드록시펜탄알에 작용하여 1,5-펜탄디올을 생산한다; 단백질 acc. no. YP_002236499(Fouts et al., PLoS Genet. 4(7), E1000141(2008))).
Figure pat00021
[표 1U] EutG 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. W3110, EC. No. 1.1.1.202 유래의 예상된 알코올 탈수소효소, 에탄올아민 활용, 이것은 5-히드록시펜탄알에 작용하여 1,5-펜탄디올을 생산한다; 단백질 acc. no. AP_0O3038(Riley et al, Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006))).
Figure pat00022
[표 1V] ArgO(YggA) 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. MG 1655 유래 아르기닌 수출 단백질, L-리신(세포질)에 작용하여 L-리신(외부)을 생산한다; 단백질 acc. no. NP_417398 (Nandineni and Gowrishankar, J. Bacteriol. 186:3539-3546(2004))).
Figure pat00023
[표 1W] LysE 단백질의 적합한 상동체들
(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 유래의 리신 유출 퍼미아제, L-리신(세포질)에 작용하여 L-리신(외부)을 생산한다; 단백질 acc.no. NP_600485(Tokyo Research Laboratories, Kogyo Co. Ltd., Japan, NCBI에 직접 제출)).
Figure pat00024
[표 1X] LysP 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 유래의 LysP 리신 APC 트랜스포터, L-리신(외부)에 작용하여 L-리신(세포질)을 생산한다; 단백질 acc. no. NP_416661(Steffes et al., J Bacteriol 174(10):3242-9(1992))).
Figure pat00025
[표 1Y] CadA 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 유래의 리신 디카르복실라제 1, 리신에 작용하여 카다베린을 생산한다; 단백질 acc. no. AP_004633(Riley et al., Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006))).
Figure pat00026
[표 1Z] LdcC 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 sub str. MG1655 유래의 리신 디카르복실라제 2, 리신에 작용하여 카다베린을 생산한다; 단백질 acc. no. NP_414728(Riley et al., Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006))).
Figure pat00027
[표 1AA] YjeK 단백질의 적합한 상동체들
(Escherichia coli str. K-12 sub sir. MG1655 유래의 리신 2,3-아미노뮤타제, L-리신에 작용하여 (R)-b-리신을 생산한다; 단백질 acc. no. NP_418570(Riley et al., Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006))).
Figure pat00028
일실시예에 따르면, 5HV 모노머를 함유하는 P(5HV) 또는 다른 PHA들을 생산할 수 있는 트랜스제닉 또는 재조합 생물을 제공한다. 이 생물은 원핵생물이거나 진핵생물일 수 있다. 적합한 원핵생물들은 박테리아, 예를 들어 E. coli를 포함하지만, 이것에 제한되지는 않는다.
B. 재조합 유기체 또는 세포를 생성하는 방법 및 물질
1. 변형될 유기체 또는 세포
PHA 생물폴리머(biopolymers), 5-아미노펜타노에이트(5-aminopentanoate: 5 AP), 5-히드록시발레레이트(5-hydroxyvalerate: 5HV), 글루타레이트(glutarate), 및 1,5-펜탄디올(1,5-pentanediol: PDO)을 포함하는 5HV를 생성하기 위해 변형될 수 있는 유기체 또는 세포는 진핵생물(eukaryotes) 및 원핵생물(prokaryotes)을 포함한다. 적당한 원핵생물은 박테리아를 포함한다. 다수의 박테리아는 폴리히드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates)를 생성하도록 유전학적으로 처리될 수 있다. 실례는 대장균(E. coli), 알칼리게네스 로터스(Alcaligenes lotus), 알칼리게네스 유트로푸스(Alcaligenese eutrophus), 아조토박터(Azotobacter), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 살모넬라(Salmonella), 클렙시엘라(Klebsiella), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 로도코커스(Rhodoccocus), 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)을 포함한다. 추가 원핵생물은, 그램-음성(Gram-nagative) 또는 그램-양성(Gram-positive) 유기체와 같은 진정세균(eubacteria), 예를 들어 대장균과 같은 장내세균(Enterobacteriaceae)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 대장균 K12 스트레인(E. coli K12 strain) MM294 (ATCC 31 ,446); 대장균 Xl 776 (ATCC 31.537); (ATCC 27,325) 및 K5772 (ATCC 53,635)와 같은 다양한 대장균 스트레인(E. coli strains)이 공공연하게 활용 가능하다.
이들은 대안의 기질을 이용하거나 추가 모노머를 통합하도록, 또는 생성을 증가시키도록 변형된 폴리히드록시알카노에이트를 이미 생성하는 유기체, 및 폴리히드록시알카노에이트를 생성하지 않지만 폴리히드록시알카노에이트의 생성에 요구되는 효소들 중의 일부에 대해 어느 것도 발현하지 않는 유기체를 포함한다. 랄스토니아 유트로파(R. eutropha)는 천연으로 PHA를 생성하는 유기체의 실례이다. 대장균 및 코리네박테리움 글루타미컴(C. glutamicum)은 PHA 생성을 위해 효소를 인코딩하는 이식유전자(transgenes)를 도입하는 데 필수적일 유기체의 실례이다.
PHA를 포함하는 5-히드록시발레레이트(5HV)로 중합되지 않지만 성장 매질 내로 숨겨지는 C5 화학품 5-아미노펜타노에이트(5AP), 글루타레이트, 및 1,5-펜탄디올의 생성을 위해서는, 리신(lysine)을 제조하는 데 이용되는 산업 미생물(industrial microorganisms)을 이용하는 것이 유용하다. 아종 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움인(Corynebacterium efficiens) 및 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)을 포함하며 L-리신의 산업 생산(Microbiol. Monogr. 5:39-70 (2007))에 이용될 수 있는 코리네박테리움 글루타미컴은 글루타레이트(glutarate), 1,5-펜탄디올(pentandiol), 5-히드록시발레레이트(hydroxyvalerate), 및 본 발명에서 설명되는 리신 분해 경로(lysine degradation pathways)를 통해 리신으로부터 생성될 수 있는 기타의 생성물의 생성을 위해 진화될 수 있는 미생물의 실례이다. S-(2-아미노에틸)시스테인과 같이 독소 리신 유사체(toxic lysine analogues)에 내성이 있는 뮤턴트의 랜덤 뮤터제네시스 및 순차적 선택과 같은 L-리신의 생성과, 아스파르테이트 키나아제-호모세린 디하이드로제나아제(aspartate kinase-homoserine dehydrogenase)를 각각 인코딩하는 lysC 및 혼(horn)과 같은 유전자 표적의 뮤턴트 대립유전자(alleles)의 도입을 위한 코리네박테리움 글루타미컴 스트레인(C. glutamicum strains)을 얻기 위한 절차는 잘 확립되고, 설명되었다(Curr. Opin. Microbiol. 9:268-274 (2007)). 아스파르테이트 키나아제는 트레오닌(threonine) 및 리신에 의한 피드백 억제(feedback inhibition)의 영향을 받기 쉬고, 이 효소의 피드백 억제로부터의 방출은 리신 생성 스트레인을 진화시키도록 하는 중요한 특징들 중의 하나로 간주된다. 리신 분해 경로로부터 유도되는 화학품을 생성할 수 있는 스트레인의 진화를 위한 다른 처리 표적은 C. 글루타미컴에서 LysE와 같은 리신 이출자(lysine exporter)이다. C. 글루타미컴 스트레인을 생성하는 L-리신의 LysE 유전자의 뮤타제네시스는 세포질(cytoplasm)로부터의 리신 배출(excretion)을 방지할 것이며, 그에 따라 리신을 생성물로 변환하도록 고안된 경로를 통해 생성률을 증가시킬 것이다. PHB와 같은 PHA의 생성을 위한 C. 글루타미컴 스트레인을 구성하기 위한 방법도 본 분야에서 알려져 있다(Jo, S-J et. Al., 2006. J. Bioscience and Bioengineering 102: 233-236).
적당한 진행생물 유기체 또는 세포는 곰팡이(filamentous fungi) 또는 이스트(yeast)와 같은 균류(fungi)를 포함한다. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 공통적으로 이용되는 하등 진행생물 숙주 미생물(lower eukaryotic host microorganism)이다.
2. 유전자조작 유기체를 생성하는 방법
i. 염색체 외 트랜스펙션(Extrachromosal Transfection)
벡터 DNA는 통상적인 형질변환(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection) 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질변환" 또는 "트랜스펙션"은, 숙주 세포 내에 이질적 핵산(foreign nucleic acid)(예컨대, DNA)을 도입하기 위한 다양한 분야-인지 기술(art-recognized techniques)을 지칭하도록 의도되는데, 칼슘 포스페이트(calcium phosphate) 또는 칼슘 클로라이드 공동침전(co-precipitation), DEAE-덱스트란-중재 트랜스펙션(DEAE-dextran-mediated transfection), 리포펙션(lipofection), 또는 전기천공법(electroporation)과 같은 화학적 형질변환을 포함한다. 통상적인 형질변환 기술은 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001에서 설명된다. 이스트로의 형질변환은 통상적으로 Van Solingen 등의 J Bad, 130:946 (1977) 및 Hsiao 등의 Proc. Natl. Acad. Sd. (USA), 76:3829 (1979)의 방법에 따라 실행된다.
ii. 염색체 삽입(Chromosomal Integration)
처리된 유전자 구조를 그램-음성 및 그램-양성 박테리아 세포의 염색체 DNA 내에 통합하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적인 삽입 메커니즘은 recBC 또는 recD 스트레인에서의 선형화된 DNA를 이용한 상동 재조합(homologous recombination) 및 그 뒤의 PI 트랜스덕션(Miller 1992, A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual &Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) 특수 플라스미드(Hamilton 등, J. Bacteriol. 171:4617 (1989); Metcalf 등, Plasmid 35: 1 (1996); Mascarenhas 등에게 허여된 U.S. 특허 제5,470,727호), 또는 트랜스포손 기반 시스템(transposon based systems)(Herrero 등의 J Bacteriol. 172:6557 (1990); Peredelchuk & Bennett, Gene 187:231 (1997); Richaud 등에게 허여된 U.S. 특허 제5,595,889호; Tucker 등에게 허여된 U.S. 특허 제5,102,797호)을 이용한 랜덤 삽입을 포함한다. 일반적으로, 삽입을 포함하는 미생물 스트레인(microbial strains)은 삽입된 구조에 의해 공급되는 획득된 항생물질 내성 유전자에 기초하여 선택된다. 그러나, 영양요구성 뮤턴트의 상보성도 이용될 수 있다. 동일한 방법들이 본 명세서에서 설명되는 다양한 메타볼릭 경로를 인코딩하는 이식유전자들 중 임의의 것을 도입하는 데 이용될 수 있다. 이러한 방법들 중 일부는 파(pha) 유전자에 관해 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
염색체 삽입을 위한 관심 유전자의 발현은 삽입될 DNA 구조에 전사-활성 서열(transcription-activating sequence)(프로모터)을 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 위치선택적(site-directed) 상동 재조합은, Ingram 등에게 허여된 U.S. 특허 제5,000,000호에 의해 설명되는 바와 같이, 관심 유전자의 발현의 증폭과 조합될 수 있다.
염색체 삽입은 또한 Datsenko와 Wanner(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000))의 방법에 의해, 또한 하기의 실험예 7에서 사용된 바와 같이 달성될 수 있다.
일련의 발현 카세트는 비상동 유전자(heterologous genes)를 박테리아 염색체 내에 삽입하도록 전개되었다. 이러한 카세트들은 Herrero 등의 J Bacterial. 172:6557-67 (1990); de Lorenzo 등의 J Bacterid. 172:6568 (1990)에 의해 설명된 트랜스포손 전달 시스템에 기초한다. 이러한 시스템들이 RP4-중재된 접합 전달()을 특정하고 트랜스포손 Tn10 및 Tn5만을 이용하고 있지만, 트랜스포손 단부과 전달 시스템의 임의의 조합은 설명된 기술에 적용되어, 지속되는 동종 PHA 생성물을 가져올 수 있다.
다음의 전반적인 접근법은 유전자조작 대장균 PHB 생성물을 생성하는 데 이용된다. (1) 프로모터리스 항생물질 내성(abr) 유전자는 pUC18NotI 또는 pUC18SfiI와 같은 적당한 플라스미드의 폴리링커에서 그 폴리링커의 주요 부분이 abr의 업스트림이 되도록 클론화된다; (2) 파 유전자, GABA 트랜스아미나아제를 인코딩하는 유전자, 석신 세미-알데히드 환원효소(succinic semi-aldehyde reductase), 및 4-히드록시부티레이트-CoA는 abr 유전자의 후속 클론화된 업스트림이고 그 유전자화 동일한 방향의 것이다; (3) 파-abr 카세트는 Noil 또는 AvrII 프라그먼트(ArvII는 pUC18SfiId서 SfiI 위치를 인식함)로서 절개되며, pUT- 또는 oLOF-시리즈로부터의 것들과 유사한 임의의 플라스미드의 대응하는 지역에서 클론화된다; (4) 최종 생성 플라스미드는 대장균 λ pir 스트레인에서 유지되며, 이러한 플라스미드들이 복제하지 않는 선택의 대장균 스트레인으로 전기천공 또는 접합된다; (5) 파-abr 카세트가 염색체에 성공적으로 삽입된 새로운 스트레인은 호스트(예컨대, 호스트가 날리딕스 산 내성(naladixic acid resistant)일 때의 날리딕스 산) 및 카세트(예컨대, 클로람페니콜(chloramphenicol), 카나마이신(kanamycin), 테트라사이클린(tetracyclin), 머큐리 클로라이드(mercury chloride), 비알라포스(bialaphos))에 대해 선택적 매질 상에서 선택된다. 최종 생성 파 성분은 성장 및 PHB 형성을 위한 글루코오스의 존재 시에 최조 매질 상에서 스크리닝된다.
이 절차의 여러 변형이 이루어질 수 있다. 프로모터리스 항생물질 내성 표지자가 사용되지 않는다면, PHA 유전자의 삽입은 벡터에 존재하는 표지자에 기초하여 선택되고, 희망하는 레벨의 PHA를 생성하는 삽입된 스트레인은 PHA 생성을 위한 스크리닝에 의해 검출된다. 파 유전자는, 업스트림 활성화 서열(upstream activating sequences), RNA 폴리메라제(polymerase) 결합 지역, 및/또는 오퍼레이터 서열과 같은 내생 전사 서열(endogenous transcription sequences)을 가질 수 있지만, 필수적인 것은 아니다. 파 유전자가 그러한 서열을 갖지 않는다면, 설명된 접근법은 전사가 삽입 서열을 통해 진행될 수 있는 pUT 시리즈와 같은 벡터의 이용으로 제한되지 않는다. 이러한 제한은 pLOF 플라스미드의 Tn10 측면위치 영역을 통해 판독하는 RNA 폴리메라제의 무능력으로 인한 것이다. abr 유전자는 희망한다면 자기 소유의 발현 서열을 전달할 수 있다. abr 유전자 대신, 구조는 호스트 스트레인이 대응하는 와일드형 유전자에 돌연변이를 가질 대 필수적인 유전자가 선택적 표지자로서 기능하도록 설계될 수 있다. 이 목적에 유용한 유전자의 실례는 본 분야에서 전반적으로 알려져 있다. 상이한 구조들은, 양측 구조 모두가 상이한 표지자 유전자를 전달하는 한, 하나의 호스트 내에 순차적으로 또는 동시에 통합될 수 있다. 다중 통합 이벤트를 이용하여, 파 유전자는 별도로 통합될 수 있는데, 예컨대 PHB 폴리메라아제 유전자가 먼저 phaC-cat 카세트로서 통합되고, 이어서 phaAB-칸 카세트로서 티오라제 및 환원효소 유전자의 통합이 이어진다. 대안으로, 하나의 카세트는 모든 pha 유전자를 포함할 수 있지만, 그 반면에 다른 카세트는 희망하는 PHA 폴리머를 생성하는 데 요구되는 일부 파 유전자만을 포함한다.
일부 경우, pJMS11과 같은 트랜스포손 통합 벡터(Panke 등의 Appl. Enviro, Microbiol 64: 748-751)는 선택가능한 표지자가 통합 스트레인의 염색체로부터 절개될 수 있도록 이용될 수 있다. 이것은 각각의 삽입 이벤트에 이어서 표지자를 절개함으로써 동일한 표지자 유전자를 이용하여 다중 트랜스포손 구조를 삽입하도록 하는 메커니즘을 제공하는 것을 포함하는 다수의 이유에 유용하다.
3. PHA 형성 시에 수반되는 파 및 그 밖의 유전자의 소스
PHA 형성에 수반되는 유전자에 대한 전반적인 참조는 Madison과 Huisman, 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63: 21- 53이다. 파 유전자는 상이한 소스로부터 유도될 수 있고, 단일 유기체에 조합되거나 또는 동일한 소스로부터 조합될 수 있다.
*i. 유전자를 인코딩하는 환원효소
환원효소-인코딩 유전자는 A. 라투스(latus), R. 유트로파(Peoples & Sinskey, J. Biol. Chem. 264(26): 15298-303 (1989); 아시네박터(Acinetobacter) sp. (Schembri 등의 J Bacteriol. 177(15): 4501-7 (1995)), C. 비노섬(vinosum) (Liebergesell & Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 135-50 (1992)), P. 아시도필라(acidophil1a), P. 데니트리피칸스(denitrificans) (Yabutani 등의 FEMS Microbiol. Lett. 133 (l-2): 85-90 (1995)), R. 메릴로티(meliloti) (Tombolini 등의 Microbiology 141: 2553-59 (1995)), 및 Z. 라미제라(ramigera) (Peoples 등의 J. Biol. Chem. 262(l): 97-102 (1987))로부터 분리되었다. U.S. 특허 제7,229,804호는 C. 클루이베리(Sohling과 Gottschalk, J Bacteriol 178, 871 880 (1996))로부터 4-히드록시부티레이트 디하이드로제나아제를 인코딩하는 4HbD 유전자를 이용하여 P4HB를 생성하는 유전자조작 유기체를 개시한다. 4hbD는 NADH를 요구한다. 바람직한 환원효소는, NADH를 요구하지지 않는 것들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예시적인 환원효소는 생쥐(Mus musculus)(Genlnfo Identifier :27659727 )(Hinshelwood, A. et al. FEBS Letters 523:213-218 (2002)로부터의 AKR7A5, 애기장대(Arabidopsis thaliana)(GI: 145338934) (Breitkreuz, K. 등의 J. Biol Chem. 278:41552-41556)로부터의 GHBDH, 아스페르질루스 테레우스(GI: 115491994)로부터의 ATEG_00539를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
ii. CoA 트랜스페라아제 및 CoA 합성효소
적당한 CoA 트랜스페라아제(EC 2.8.3.n)는 C. 클루이베리로부터의 orfZ를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. orfZ의 서열은 Huisman 등에게 허여된 U.S. 특허 제7,229,804호에 제공되며, 그 전체가 참조로서 인용된다. 다른 적당한 CoA 트랜스페라아제는 C. 아미노뷰티리컴(aminobutyricum)(Gerhardt 등의 Arch Microbiol 74:189-199 (2000))으로부터의 abfZ를 포함한다. 아실-CoA를 생성할 수 있는 다른 효소는 CoA 합성효소를 포함한다(EC 6.2.1.3). 이러한 효소들은 ATP 및 자유 CoA를 이용하여 카르복시산으로의 CoA의 공유원자가 추가를 촉진하며, van Beilen 등의 (Molec Microbiol (1992) 6:3121-3136) 및 Aquin 등(WO 02/40690 A2)에서 설명되었다.
iii. PHA 폴리메라제-인코딩 유전자
PHA 폴리메라제-인코딩 유전자는 에로모나스 캐비애(Aromonas caviae)(Fukui & Doi, J Bacteriol. 179(15): 4821-30 (1997)), A. 라투스(latus), R. 유트로파 (Peoples & Sinskey, J Biol. Chem. 264(26): 15298-303 (1989); 아시네박터(Acinetobacter) (Schembri 등의 J Bacteriol. 177(15):4501-7 (1995)), C. 비노섬(vinosum) (Liebergesell & Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 135-50 (1992)), 메틸로박테리움 엑스토큰(Methylobacterium extorquens) (Valentin & Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol 39(3):309-17 (1993)), 노카르디아 콜라리나(Nocardia corallina) (GenBank Acc. No. AF019964), 노카르디아 살모니콜로(Nocardia salmonicolor), P. 액시도필라(acidophila), P. 덴트리피칸스(denitrificans) (Ueda 등의 J. Bacteriol 178(3):774-79 (1996)), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (Timm & Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 15-30 (1992)), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) (Huisman 등의 J. Biol. Chem. 266:2191-98 (1991)), 리조비움 에틸(Rhizobium etli) (Cevallos 등의 J. Bacteriol 178(6): 1646-54 (1996)), R. 메릴로티(meliloti) (Tombolini 등의 Microbiology 141 (Pt 10):2553-59 (1995)), 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) (Pieper & Steinbuchel, FEMS Microbiol Lett. 96(l):73-80 (1992)), 로도스피리럼 루브럼(Rhodospirrilum rubrum) (Hustede 등의 FEMS Microbiol. Lett. 93:285-90 (1992)), 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) (Steinbuchel 등의 FEMS Microbiol. Rev. 9(2-4):217-30 (1992); Hustede 등의 Biotechnol Lett. 15:709-14 (1993)), 시네코시스티스(Synechocystis) sp. (Kaneko, DNA Res. 3(3): 109-36 (1996)), T. 바이올라시에(violaceae) (Liebergesell & Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38(4: 493-501 (1993)), 및 Z. 라미제라(ramigera) (GenBank Acc. No. U66242)로부터 분리되었다.
PHA 형성에 관련되지 않았으나 파 유전자 및/또는 대응하는 유전자 생성물과 현저한 상동성을 공유하는 다른 유전자가 마찬가지로 이용될 수 있다. 아세토아세틸 CoA 환원효소를 인코딩하는 phaB 유전자에 대해 상당한 상동성을 갖는 유전자는, 아조스피릴룸 브라질런스(Azospirillum brasiliense) (NCBI 수납번호. X64772, X52913) 리조비움(Rhizobium) sp. (NCBI 수납번호 U53327, Y00604), 대장균 (NCBI 수납번호 D90745), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi) (NCBI 수납번호 U39441), H. 인플루엔자 (NCBI 수납번호 U32701), B. 서브틸리스(subtilis) (NCBI 수납번호 U59433), P. 아에루기노사(aeruginosa) (NCBI 수납번호 U91631), 시네코시스티스(Synechocystis) sp. (NCBI 수납번호 D90907), H. 피롤리(pylori) (NCBI 수납번호 AE000570), 애기장대(Arabidopsis thaliana) (NCBI 수납번호 X64464), 쿠페아 란세올라타(Cuphea lanceolata) (NCBI 수납번호 X64566) 및 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) (NCBI 수납번호 U66800)를 포함하는 여러 유기체로부터 분리되었다.
III. 5HV 및 C5 화학품을 포함하는 PHA를 생성하는 방법
공급원료(feedstock)로서 갱신가능한 카본 소스를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트를 생성하기 위한 방법이 제공된다. 바람직한 실시예에서, 박테리아는 재생가능한 소스로부터 5-아미노펜타노에이트(aminopentanoate) (5AP), 5-히드록시발레레이트(hydroxyvalerate) (5HV), 글루타레이트(glutarate), 및 1,5-펜탄디올(pentanediol)(PDO) 및 이들의 폴리머를 생성하는 데 필수적인 유전자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 구조로 형질변환 또는 형질주입된다.
IV. 이용 방법
개시된 유전자조작 유기체는 5HV 모노머를 포함하는 PHA 생물폴리머뿐 아니라 5-아미노펜타노에이트(aminopentanoate) (5AP), 5-히드록시발레레이트(hydroxyvalerate) (5HV), 글루타레이트(glutarate), 및 1,5-펜탄디올(pentanediol) (PDO)과 같은 C5 화학품을 생성하는 데 이용될 수 있다. C5 화학품 생성의 경우, 선택적으로 비활성화되거나 삭제된 경쟁 경로를 인코딩하는 유전자를 갖는 것을 포함하여 적당한 이식유전자(들)를 발현하는 재조합 유기체는 재생가능한 발효 기질(fermentation substrate) 상에서 성장된다. 기질은 탄수화물, 리신, 플로린 식물성유(proline vegetable oils), 지방산 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시예에 대한 유용한 조합은 글루코오스와 리신의 혼합물일 것이다. 다른 적합한 조합은 슈크로스와 리신일 것이다. 바람직하게는, 공급 원료는 주로 하나의 기질, 예를 들어 글루코오스 또는 슈크로스를 포함한다. 적당한 탄수화물 기질은 글루코오스(glucose), 프룩토스(fructose), 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 슈크로스(sucrose), 락토스(lactose) 및 말토스(maltose)로부터 선택되는 하나 이상의 당류를 포함한다. C5 화학품의 생성을 위해, 재조합 유기체는, 세포가 응집(flocculation), 정착(settling), 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)에 의해 제거되고 생성물이 표준 절차에 의해 무세포 매질(cell-free medium)로부터 복구되는 때에 희망하는 말단 생성물이 성장 매질에 누적될 때까지 재생가능한 기질 상에서 성장된다. 이러한 절차는, 젓산(lactic acid), 석신산(succinic acid), 3-히드록시프로피오닌산(hydroxypropionic acid), 1,3-프로판디올(propanediol) 및 1,4-부탄디올(butanediol)과 같은 다른 발효 생성 산 및 디올(fermentation produced acids and diols)의 복구에 대한 분야에서 알려져 있다.
재조합 유기체는, 글루코오스, 리신 등과 같은 재생가능한 카본 소스의 존재 시의 유기체, 및 희망하는 폴리머 또는 공동폴리머를 제공하도록 선택된 다른 기질을 배양함으로써, 호모폴리머 P5HV를 포함하는 PHA 생물폴리머를 함유하는 5HV 및 PHA 공동폴리머를 함유하는 5HV의 발효 생성에 이용될 수 있다. 재조합 유기체는 PHA 폴리머가 당업자에게 알려진 방법들에 의해 세포로부터 추출되는 세포 내부에 축적되었을 때까지 기질 상에서 성장된다. 유기체로부터 얻어진 PHA 폴리머를 포함하는 5HV는 필름, 섬유, 포말(foams), 주입 몰딩 상품, 블로우 용기(blow molded bottle), 종이 코팅 등과 같은 광범위한 산업 플라스틱 응용에 이용될 수 있다. 그들은 또한 조직 증대(augmentation)를 포함하는 생물의학 응용, 심장판막(heart valve)의 생성, 봉합(sutures), 및 인공혈관(vascular grafts) 생성에 이용될 수 있다. 예시적인 공동폴리머는, PHB5HV 및 p(3-히드록시프로피오네이트(hydroxypropionate)-co-5-히드록시발레레이트(hydroxy valerate)) p(4-히드록시부틸레이트(hydroxy butyrate)-co-5-히드록시발레레이트(hydroxy valerate))를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 재조합 유기체는 공동폴리머의 생성에 필요하다면 베타-케토티올라제(beta-ketothiolase) 및 아세토아세틸(acetoacetyl)-CoA 환원효소(reductase)와 같은 추가 유전자를 포함하도록 유전학적으로 처리될 수 있다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 개시된 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
실험예(EXAMPLES)
실험예 1: 소듐 5-히드록시발레레이트로부터의 P(SHV) 호모폴리머 생합성
5HV-함유 PHA를 합성할 능력의 제 1 증명으로서, 소듐 5-히드록시발레레이트(Na5HV)는, 공급된 5HV 모노머가 수용되고 P(SHV) 호모폴리머 내에 직접 통합될 것인지를 판정하기 위해, CoA 트랜스페라제 또는 CoA 합성효소와 PHA 신타아제 양측 모두를 발현시키는 대장균 스트레인으로 공급되었다. NaSHV는 δ-발레로락톤(valerolactone)(DVL)의 염기 가수분해(base hydrolysis)를 통해 합성되었다. 이 절차는 0.1mol NaOH를 50 mL 메탄올을 추가하고 분해될 때까지 휘젓는 것을 수반했다. 이를 위해, 0.1 mol DVL이 강력한 교반(stirring)으로 추가되었다. 최종 생성 침전물이 건조되었고, 물에 분해되었으며, 8.5로 pH-조절되었고, 0.2μM 필터로 여과-살균되었다. 염용액의 분석은 모든 DVL이 감화되었다는 것을 확인하기 위해 Waters Alliance HPLC 상에서 수행되었다.
CoA 트랜스퍼라아제/합성효소와 PHA 신타아제 유전자의 상이한 조합들은 P(SHV) 생성에 적합한 최상의 조합을 찾기 위해 테스트되었다. 테스트된 CoA 트랜스퍼라아제/합성효소는 C. 클루이베리 orfZ였고, P. 올레오보란스 alkK, 및 PHA 신타아제는 R. 유트로파 phaC 및 T. 페니지(pfenigii) phaEC였다(표 1A). 이 실험에 사용된 모든 스트레인은 MGl655 (Jensen, J. Bacteriol, 175(11):3401~ 3407 (1993))로부터 도출되었다. CoA 트랜스퍼라아제/합성효소와 PHA 신타아제의 상이한 조합을 각각 포함하는 4개의 발현 플라스미드(pFS92, pMS96, pMS93, 및 pMS102)는 다음의 단락에서 설명되는 바와 같이 구성되었다.
플라스미드 구성
플라스미드 pFS30은 R. 유트로파 phaC 및 그것의 원시 프로모터(PRe)를 포함하는 프라그먼트를 제거하기 위해 XmaI 및 StuI로 pAET41(Peoples와 Sinskey, J. Biol. Chem. 264(26): 15298-15303 (1989))을 소화시킴으로써 구성되었다. 플라스미드 pAET41은 phaC 유전자를 포괄하는 R. 유트로파 H16으로부터의 염색체 프라그먼트를 포함하는 pUC18 벡터(수납번호 L08752)이다. PTre 프로모터 하에서 C. 클루이베리로부터의 orfZ 유전자를 포함하는 pTrc99a(Pharmacia, Uppsala, Sweden)의 유도체인 플라스미드 pFS16(Skraly와 Peoples, U.S. 특허 제6,323,010호)는 BamHI로 소화되었고, T4 폴리메라제로 둔화되었으며, PRe-phaC XmaI-StuI 프라그먼트와의 결찰 이전에 XmnI로 두 번째 소화되었다. 최종 생성 플라스미드는 pFS30으로 지정되었고, 구조적으로 발현된 PRe 프로모터 하에서 phaC-orfZ 오페론 융합을 포함했다.
플라스미드 pFS92는 다단계 과정으로 만들어졌다. 첫째, T. 페니지(pfenigii) phaE는, 처리된 EcoRI 및 Acc65I 제한 위치를 포함하는 프리머 FS-E5' 및 FS-E3'으로 pMON25893 (Reiser 등의 Appl. Microbiol, Biotechnol 53(2):209-218 (2000))로부터 증폭되었다. 이후, phaE PCR 생성물이 제한 효소 EcoRI 및 Acc65I로 소화되었고, pFS89를 형성하도록 유사하게 소화된 pTrcN (Gerngross 등의 Biochemistry 33:9311-9320 (1994))로 결찰되었다. FS-E5'에 대한 프리머 서열은 (5')- GAATTCAGGAGGTTTTTATGAACGATACGGCCAACAAGACCAGC (SEQ ID NO:1)이고, FS-E3'에 대한 프리머 서열은 (5')-GGGGTACCTCACTGGCCGGTGGTGGGCTTGGTGGTCTTGCGGCG (SEQ ID NO:2)이다. 다음, T. 페니지 phaC는, 처리된 Acc65I 및 BamHI 제한 위치를 포함하는 프리머 FS-C5' 및 FS-C3'로 pMON25894 (Reiser 등의 Appl, Microbiol. Biotechnol. 53(2):209-218 (2000))로부터 증폭되었다. 이후, phaC PCR 생성물은 제한 효소 Acc65I 및 BamHI로 소화되었고, pFS90를 형성하도록 유사하게 소화된 pTrcN로 결찰되었다. FS-C5'에 대한 프리머 서열은 (5')-GGGGTACCAGGAGGTTTTTATGTCCCCATTCCCGATCGACATCCG (SEQ ID NO:3)이고, FS-C3'에 대한 프리머 서열은 (5')-CGGGATCCTCAGCCGCGTTCGTTCAGCCAGCGGCCGATCGCCG (SEQ ID NO:4)이다. T, 페니지 phaE 및 phaC가 각각 pFS89 및 pFS90을 형성하도록 pTrcN으로 개별적으로 클론화된 후, phaE는, MluI 및 Acc65I로 pFS89를 소화시키고, phaE 함유 프라그먼트를 분리시키며, 그것을 pSF90의 유사하게 소화된 프레파라아트로 결찰시킴으로써 phaC의 업스트림으로 클론화되었다. 최종 생성 플라스미드 pFS91는 PTrc 프로모터 하에서 phaEC 오페론 융합을 포함했다. 마지막으로, pFS92는 phaEC를 포함하는 pFS91로부터 MluI 및 BamHI로 소화된 pFS16으로 MluI-BamHI 프라그먼트를 결찰함으로써 생성되었다. 플라스미드 pFS92는 PTrc 프로모터 하에서 phaEC-orfZ 오페론 융합을 포함한다.
플라스미드 pMS96은 phaEC의 다운스트림으로 pFS91 내에 alkK(표 1A 참조)를 클론화함으로써 만들어졌다. 먼저, alkK는, PCR 생성물의 말단 상에 BamHI 지역들을 통합하도록 처리된 프리머 K5-1 및 K3-1를 이용하여 P. 올레오보란스(oleovorance) 게놈 DNA로부터 PCR 증폭되었다. 프리머 K5-1에 대한 서열은 (5')-GCTGAGGATCCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAA TC (SEQ ID NO:5)이고, 프리머 K3-1에 대한 서열은 (5')-CTAGAGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG (SEQ ID NO:6)이다. 증폭에 이어서, alkK PCR 프라그먼트 및 pFS91(위 단락에서 설명됨)는 BamHI로 소화되었고, pMS96를 형성하도록 결찰되었다. pMS96에서의 alkK의 방향은 제한 효소 소화에 의해 phaEC와 동일한 방향인 것을 증명하였고, 그에 따라 PTrc 프로모터 하에서 phaEC-alkK 오페론 융합의 적절한 구조를 보증하였다.
플라스미드 및 pMS102는 칸 표지자를 제거하기 위해 BspHI로 pACYC177(수납 번호 X06402)를 먼저 소화시키고, 탄뎀(tandem) 프로모터 PTrc 및 PRe의 제어 하에 phaC-orfZ를 포함하는 pFS73을 형성하도록 그것을 pFS30의 유일한 BspHI 지역 내로 결찰시킴으로써 구성되었다. PRe 프로모터 영역은 phaC CDS의 5' 말단으로부터의 PRe 및 837 bp를 포함하는 pFS73의 EcoRI-BspEI 프라그먼트를 phaC의 5' 말단으로부터의 837 bp만을 포함한 pKAS4(Peoples 등의 U.S. 특허 제5,480,794호)로부터의 EcoRI-BspEI 프라그먼트로 교체함으로써 제거되었다. 오로지 PTrc 프로모터 하에서 phaC-orfZ를 포함하는 이 최종 생성 플라스미드는 pMS93으로 지정되었다. pMS102를 생성하기 위해, orfZ 유전자는, DraI로 소화하고, pMS74를 형성하도록 플라스미드 백본을 자가-결찰함으로써 pFS73으로부터 제거되었다. alkK 유전자는 프리머 K5-2 및 K3-2를 이용하여 플라스미드 pTrcN-A.eut-AIkK(후술됨)로부터 PCR-증폭되었다. 프리머 K5-2에 대한 서열은 (5')-AATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATC (SEQ ID NO:7)이고, 프리머 K3-2에 대한 서열은 (5')-GATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG (SEQ ID NO; 8). 이후, 플라스미드 pMS74는 SpeI 및 SbfI로 소화되었고, 이어서 pMS92를 형성하도록 둔화된 pMS74 백본으로 결찰된 Klenow fill-in(필링-인) 및 alkK PCR 프라그먼트을 통해 둔화-말단으로 만들어졌다. 따라서, 플라스미드 pMS92는 탄뎀 프로모터 PTrc 및 PRe의 제어 하에 phaC-alkK 오페론 융합을 포함한다. IPTC-유도성 PTrc 프로모터로부터 배타적으로 오페론을 발현시키기 위해, PRe 프로모터 영역은 phaC CDS의 5' 말단으로부터의 PRe 및 837 bp를 모두 포함하는 pMS92의 EcoRI-BspEI 프라그먼트를 phaC의 5' 말단으로부터의 837 bp만을 포함한 pMS93으로부터의 EcoRI-BspEi 프라그먼트로 교체함으로써 제거되었다. 오로지 PTrc 프로모터 하에서 phaC-alkK를 포함하는 이 최종 생성 플라스미드는 pMS102로 지정되었다.
플라스미드 pTrcN-A.eut-AlkK는 먼저 프리머 Posynrbs.c(5')-GGAATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATCAG) (SEQ ID NO:9) 및 Posynrbs.r (5'- CGGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTGCG) (SEQ ID NO: 10)을 이용하여 P. 올레오보란스 게놈 DNA로부터 alkK를 PCR-증폭함으로써 생성되었다. 최종 생성 PCR 생성물은 EcoRI 및 BamHI로 소화되었고, pTrcN-AlkK를 생성하도록 유사하게 소화된 pTrcN로 결찰되었다. 이후, PRe 프로모터는 프리머 A.eutPhaG.c (5'- GGAATTCGGATCCCAAGTACCTTGCCGACATCTATGCGCTGGC) (SEQ ID NO:11) 및 A.eut.EcoRI.r (5'- GGAATTCCCGGCTCCGGGATTGCCCTGGCCGGACT) (SEQ ID NO: 12)를 이용하여 랄스토니아 유트로파 게놈 DNA로부터 PCR-증폭되었다. 최종 생성 PCR 생성물은 EcoRI로 소화되었고, pTrcN-A.eut-AlkK를 생성하기 위해 유사하게 소화된 pTrcN-AlkK로 결찰되었다.
플라스미드 pFS92, pMS96, pMS93, 및 pMS102는 MGl 655 (Jensen, J. Bacteriol. 175(11):3401-3407 (1993)) 로 각각 형질변환되어, CoA 트랜스퍼라아제/합성효소(orfZ 또는 alkK)와 PHA 신타아제(phaC 또는 phaEC)의 상이한 조합을 포함한 4개의 플라스미드-함유 스트레인을 생성하였다. 이러한 스트레인들은, 다음의 섹션에서 설명되는 바와 같이, P(5HV) 호모폴로머 생성물을 특성화하도록 250 mL 진탕 플라스크에서 성장되었다.
진탕 플라스크 배양에서 P(SHV) 호모폴리머의 생성을 위한 매질, 성장 조건 및 테스팅
각각의 플라스미드-함유 MG1655 스트레인은 야간에 250 rpm 진동으로 37℃에서 적절한 항생물질로 보충된 3 mL LB(Sambrook과 Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (2001))를 포함하는 시험관에서 성장되었다. 각 스트레인에 적절한 항생물질은 다음과 같다: 100㎍/mL 암피실린이 pFS92- 및 pMS96-함유 MGl655 스트레인의 야간 배양에 추가되었고, 50㎍/mL Km이 pMS93- 및 pMS102-함유 MG1655 스트레인의 야간 배양에 추가되었다. 다음날, 0.5 mL의 각각의 야간 배양은 적절한 항생물질로 보충된 50 mL의 후레시 LB를 포함하는 진탕 플라스크를 접종하는 데 사용되었고, 250rpm 진동으로 37℃에서 성장되었다. 3.5 시간에, 0.1 mN IPTG는 액체 배양에 추가되었으며, 5시간에, 배양은 4150 rpm(Sorvall Legend RT benchtop 원심분리법)으로 스피닝되었고, 0.1 mM IPTG 및 동일한 항생물질을 포함하는 50 mL의 생성 매질에서 재부유되었다. 생성 매질은 10 g/L 글루코오스, 2.5 g/L LB, 10 g/L NaSHV5 2mM MgSO4, 및 Ix 트레이스 염용액을 포함하는 1x E2 최소 염용액으로 구성된다. 50x E2 공급 용액은 1.275 M NaNH4HPO4·4H2O, 1.643 M K2HPO4, 및 1.36 M KH2PO4로 구성된다. 1000x 공급 트레이스 염용액은 1L의 1.5 N HCL: 50 g FeSO4-7H20, 11 g ZnSO4·7H2O, 2.5 g MnSO4·4H2O, 5 g CuSO4·5H2O, 0.5 g (NH4)6Mo7O24·4H20, 0.1 g Na2B4O7, 및 10 g CaCl2-2H2O마다 추가함으로써 마련된다.
재부유된 배양은 250 mL 진탕 플라스크로 전사되었고, 24 내지 72 시간 동안 진동으로 30℃에서 인큐베이트되었다. 실험 말미에, 배양은 4150 rpm으로 스피닝되었고, 증류수로 한 번 세척되었으며, 적어도 30분 동안 -80℃에서 냉동되었고, 야간에 동결 건조되었다. 다음날, 측정된 양의 동결건조 세포 펠릿은 유리관에 추가되었고, 이어서 내부 표준으로서 2 mg/mL 디페닐메칸(diphenylmethane)을 갖는 디옥산에 99.9% n-부탄올 및 4.0 N HCl의 동등한 부피의 혼합물로 구성되는 3 mL의 부탄올리시스 시약이 추가되었다. 튜브를 캡핑(capping)한 후, 그들은 간단히 와동되었고, 주기적인 와동으로 6시간 동안 93℃로 설정된 열 차단제(heat block) 상에 놓였다. 이후, 튜브는 3 mL 증류수를 추가하기 전에 실온으로 냉각되었다. 튜브는 2분 동안 620 rpm(Sorvall Legend RT benchtop 원심분리)으로 스피닝하기 전에 대략 10s 동안 와동되었다. 1 mL의 유기층(organic phase)이 GC 유리병(vial) 내로 피펫되었고, 이어서 가스 크로마토그래피-프레임 이온화 검출(GC-FID)(Hewlett-Packard 5890 Series II)에 의해 분석되었다. 세포 펠릿에서 P(SHV) 호모폴리머의 양은 정의된 양의 DVL을 별도의 부탄올리시스 시약에 추가함으로써 만들어진 표준 곡선에 대비함으로써 판정되었다. 2-6mg의 범위에 있는 3개의 DVL 표준은 표준 곡선을 생성하는 데 이용되었다.
실험 결과
표 2는 모든 구조가 P(5HV)를 생성할 수 있다는 것을 보여 준다. 그러나, MGl655 [pMS93]는 P(5HV)를 폴리머화하는 최적의 유전자 조합이 phaC 및 orfZ라는 것을 증명하는 다른 스트레인들 중 임의의 것보다 현저히 더 많은 P(5HV)를 생성했다.
[표 2] P(5HV) 호모폴리머 생성
Figure pat00029
실험예 2: 소듐 5-히드록시발레레이트로부터의 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머 생합성
다음 실험은 3HB-CoA 및 5HV-CoA 모노머를 합성하고 그들을 PHA 내로 통합할 수 있는 대장균 스트레인에서의 P(3HB-co-5HV) 생성을 증명하는 것이었다.
스트레인 구조
이 실험예에서 이용되는 스트레인은 염색체 내에 랜덤하게 통합된 R. 유트로파 H16 bktB-B. 메가테리움(megaterium) phaB-칸으로 구성되는 오페론을 포함하는 MG1655 유도체인 MBX2641이었다. 오페론 통합을 실행하기 위해, pCJ022(후술됨)를 포함하는 스트레인 S17-1λpir(Miller and Mekalanos, J Bacteriol 170(6):2575-2583 (1988))은, 문헌(De Lorenzo and Timmis, Methods Enzymol 235:386-405 (1994))으로부터 취해지는 프로토콜을 이용하여, MG1655의 날리딕스 산-내성 뮤턴트인 MBX1987로 메이트되었다. 염색체 내의 bktB-phaB-kan 카세트를 전달하는 MBX1987의 유도체는 30㎍/mL 날리딕스 산(N1) 및 50㎍/mL 카나마이신(kanamycin: Km)을 포함하는 LB 플레이트 상에서 선택되었다. N1R KmR 형질형(phenotype)을 디스플레이하는 이러한 통합체는 MBX2079로서 저장되었다. 이어서, phaEC-cat는 통합 벡터 pUT-C16-cat(후술됨)를 전달하는 S17-1λpir 스트레인과의 메이트에 의해 MBX2079의 염색체 내로 랜덤하게 통합되었다. 염색체의 phaEC-cat 카세트를 전달하는 MBX2079의 통합은 25㎍/mL 클로람페니콜(Cm)을 포함하는 LB 플레이스 상에서 선택되었다. N1R KmR CmR 형질형을 가지는 여러 개의 통합체는 풀링되었고, 니트로소구아니딘 뮤터제네시스(nitrosoguanidine mutagenesis)(Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)) 처리되었으며, 100㎍/mL Cm을 포함하는 LB 플레이트 상에서 선택되었다. 하나의 뮤턴트는 분리되었고, MBX2114로 지정되었다. 마지막으로, MBX2641은, MBX2114 상에 P1 용해물(lysate)을 올리고 Miller(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972))에 의해 설명된 바와 같이 KmR을 선택안으로 이용하여 MG1655 내로 형질도입함으로써 생성되었다. 이러한 형질도입은 저장되었고, 게놈 내로 랜덤하게 통합된 bktB-phaB-kan 유전자 카세트를 갖는 MG1655인 MBX2641로 지정되었다.
플라스미드 pFS92(실험예 1 참조) 및 pJB84(후술되는 구조)는 염색체 내로 랜덤하게 통합된 bktB- phaB-kan을 포함하는 MBX2641로 개별적으로 형질변환되었다.
플라스미드 구조
플라스미드 pCJ022는 칸 표지자의 bktB-phaB 업스트림을 포함하는 최소-Tn5 통합 벡터를 생성함으로써 만들어졌다. 이를 위해, bktB-phaB 오페론이 먼저 pMON25765로부터 프리머 MS069 및 MS070로 bktB를 증폭함으로써 pSE380 상에서 어셈블리되었다(Slater 등의 J. Bacteriol 180(8): 1979- 1987 (1998)). 프리머 MS069에 대한 서열은 (5')-GGTGGATCCTTAAGAGGAGGTTTTTATGACGCGTGAAGTGGTAGT GG (SEQ ID NO: 13)이고, 프리머 MS070에 대한 서열은 (5')-GGTGCTAGCTCAGATACGCTCGAAGATGGCG (SEQ ID NO: 14)이다. 최종 생성 PCR 프라그먼트는 BamHI 및 NheI로 소화되었고, 동일한 효소로 처리된 pSE380-bktB로 결찰되었다. 최종 생성 플라스미드는 pSE380-bktBphaB19로 지정되었다. 다음, phaB는 프리머 MS071 및 MS072로 pGM10 (McCool와 Cannon, J Bacterial 181(2):585-592 (1999))로부터 PCR-증폭되었다. 프리머 MS071에 대한 서열은 (5')- GGTCCTAGGTTAAGAGGAGGTTTTTATGACAACATTACAAGGTAA AG (SEQ ID NO: 15) T이고, 프리머 MS072에 대한 서열은 (5')-GGTGCGGCCGCTTACATGTATAAGCCGCCGTTAAT (SEQ ID NO; 16)이다. 최종 생성 PCR 프라그먼트는 AvrII 및 NotI로 소화되었고, 동일한 효소로 처리된 pSE380-bktB로 결찰되었다. 최종 생성 플라스미드는 pSE380-bktBphaB19로 지정되었다. 오페론이 어셈블리된 후, 그것은 EcoRI 및 SpeI로 pSE380-phaB를 소화시키고, bktB-phaB를 포함하는 프라그먼트를 EcoRI 및 XbaI로 절개된 pTrcN-kan으로 결찰함으로써 pTrcN-kan(결핍 유전자(lean gene)로 교체된 bla 유전자를 가진 pTrcN의 유도체)으로 이동되었다. 최종 생성 플라스미드는 pMS115로 지정되었다. 이어서 bktB-phaB 오페론은, BamHI로 pMSl15 및 pBSLl18을 소화시키고, bktB-phaB를 MG1655의 염색체 내로 통합하는 데 이용된 플라스미드 pCH022를 생성하도록 함께 결찰시킴으로써 pMS115로부터 pBSL118 통합 벡터(Alexeyev 등의 Can. J. Microbiol. 41: 1053-1055 (1995))로 전사될 수 있다.
플라스미드 pUT-C16cat은 EcoRI 및 XbaI로 pFS91로부터 phaEC를 제거하고, Klenow를 이용하여 변동이 없는 말단(sticky ends)을 둔화시킴으로써 만들어졌다. 통합 벡터 pUT-cat (De Lorenzo와 Timmis, Methods Enzymol. 235:386-405 (1994))는 AvrII로 소화되었고, Klenow 필링-인을 이용하여 둔화되었으며, 이어서 phaEC 프라그먼트로 결찰되었다. phaEC가 다운스트림 cat 표지자와 동일한 방향이었다는 것을 입증한 후, 플라스미드는 pUT-C16cat으로 지정되었다.
플라스미드 pJB84는 5' 측면위치 말단 상에서 BspHI 지역을 포함하도록 처리된 프리머 JB123b 및 JB124a를 이용하여 pBSL202 (Alexeyev 등의 Can. J, Microbiol 41 : 1053-1055 (1995))로부터 aacC(GmR)을 PCR-증폭함으로써 구성되었다. 프리머 JB123b에 대한 서열은 (5')-TT ATTTCATGAACCCTCGAATTGACGCGCTC (SEQ ID NO: 17)이고, 프리머 JB124a에 대한 서열은 (5')-TTATTTCATGAGCTTATCGATACCGTCGACC (SEQ ID NO: 18)이다. aacC 유전자를 포함하는 최종 생성 PCR 프라그먼트는 BspHI로 소화되었고, pJB84를 형성하도록 동일한 효소로 소화된 pMS93으로 결찰되었다. 이 마지막 단계는 동일한 방향으로 aacC(GmR)을 갖는 pMS93 상에 오리지널 bla(ApR) 표지자를 배치함으로써 이루어졌다.
실험 결과
플라스미드 pFS92(실험예 1에서 설명됨) 또는 pJB84를 운반하는 MBX2641 스트레인은 실험예 1에서 설명된 바와 같은 GC-FID 분석을 위해 성장되고 마련되었다. MBX2641 [pJB84]는, 표 3에 도시된 바와 같이, 보다 많은 공동폴리머(copolymer)(69.5%dcw)를 만들었고 더 많은 5HV를 공동폴리머(82.3%PHA) 내로 통합하였다.
[표 3] P(3HB-co-5HV) 생성
Figure pat00030

실험예 3: P(3HB-co-5HV) 공동폴리머 내의 동조가능 5HV 모노머 조성과 물질 특성에 미치는 효과
공동폴리머 조성은 생성 매질에 추가된 NaSHV 및 글루코오스의 양을 변경함으로써 조절되었다. 이것을 달성하는 대안의 방법들은, (1) 실험예 6에 도시된 바와 같이 L-리신으로부터 5HV를 생성할 수 있는 재조합 세포로의 성장 매질에 상이한 양의 L-리신을 공급하는 것, 또는 (2) 실험예 9 및 10에 도시된 바와 같이 L-리신을 통해 글루코오스로부터 5HV를 생성할 수 있는 재조합 세포 내의 L-리신 경로 유전자를 분해하는 것을 포함한다.
P(3HB-co- 5HV) 공동폴리머의 동조가능 5HV 모노머 조성을 증명하기 위해, CoA-트랜스퍼라아제(orfZ) 및 PHA 신타아제(phaC) 외에도 3HB 경로(bktB 및 phaB)에 대한 효소를 발현하는 스트레인 MBX2641 [pFS30]이 이용되었다. MBX2641 [pFS30]의 평행 배양(parallel cultures)은 감소하는 농도의 글루코오스(10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0 g/L) 또는 NaSHV (10, 5, 1, 0.5, 0.I5 0 g/L)에서 성장하였고, 실험예 1에서 설명된 바와 같은 폴리머 콘텐츠에 대해 분석되었다. 표 4는 다양한 양의 5HV가 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머 내로 통합될 수 있음을 보여 준다.
[표 4] P(3HB-co-5HV) 내로의 5HV 통합에 대한 코-피드(co-feed)의 효과
Figure pat00031

다른 실험에서, 광범위한 5HV 조성을 가진 총 10개의 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머 샘플들이 생성되었고, 이후에 시차 주사 열량 측정법(differential scanning calorimetry: DSC) 분석을 위해 추출되었다. 표 5는 5HV의 퍼센트 조성이 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머에서 증가함에 따라 유리 전이 온도(Tg)가 감소하였다는 것을 보여 준다. 이것은 광범위한 물질 특성이 5HV 코모노머(comonomer) 조성을 조절함으로써 얻어질 수 있다는 것을 증명한다.
[표 5] 추출된 폴리머의 물질 특성
Figure pat00032
실험예 4: 지방산 분해 시스템을 통한 NaSHV로부터의 3-히드록시프로피오네이트의 합성
대장균의 지방산 분해(FAD) 시스템이 5HV를 아세틸-CoA(acetyl-CoA) 및 3-히드록시프로피오닐-CoA(3-hydroxypropkmyl-CoA: 3HP-CoA)로 분해할 수 있는지를 판정하기 위해, 프라스미드 pMS93(Ptrc 프로모터로부터 phaC-orfZ를 발현시킴; 실험예 1 참조)은 fadR+ 및 atoC+(재발현된 FAD)이나 또는 fadR- 및 atoCconst(발현활성화된 FAD(derepressed FAD))인 대장균 K12 스트레인으로 형질변환되었다. MGl655 [pMS93] 및 LS5218 [pMS93]은 실험예 1에서 설명된 바와 같이 진탕 플라스크(shake flasks)에 NaSHV를 공급함으로써 테스트되었다. GC-FID 및 GC-질량 분석기(Mass Spectroscopy: MS)는 LS5218[pMS93]이 P(5HV-co-3HP)를 생성하는 반면에 MG1655 [pMS93]은 그렇지 않았다는 것을 증명하였다(표 6). 이것은 활성 지방산 분해가 5HV로부터 3HP를 생성할 것이라는 것을 보여 준다.
[표 6] P(5HV-co-3HP) 내로의 3HP 통합
Figure pat00033

실험예 5: L-리신으로부터 P(SHV) 호모폴리머의 생합성(biosynthesis)
L-리신을 P(SHV)로 전환하도록 고안된 경로는 도 2b에 개략적으로 도식화되며, 대장균에서 클론화되고 발현될 6개의 이종기원(heterologous) 유전자 P. 푸티다 davB, P. 푸티다 davA, P. 푸티다 davT, A, 탈리아나(thaliana) gsaRAT, C. 클루이베리(kluyveri) orfZ, 및 R. 유트로파(eutropha) phaC를 요구한다(표 1A 참조). 클론화 전략은 davBAT 유전자가 pACYC184로 클론화되고(Chang과 Cohen의 J. Bacteriol. 134: 1141-1156 (1978)), gsaRdt, orfZ, 및 phaC가 pSE380으로 클론화되도록 설계되었다. 이러한 플라스미드는 각각 pJB91 및 pMZ28로 지정되며, 그들의 어셈블리는 다음 섹션에서 설명된다.
플라스미드 구성(Plasmid construction)
플라스미드 pSE380의 다중 클론화 위치는 프리머 JB134 (5'- TGAGCGGATAACAATTTCAC) (SEQ ID NO: 19) 및 JBl 35 (5'- AATAACACGTCAACGCAAAAAGGCCATCCGT) (SEQ ID NO:20)로 PCR-증폭되었다. 최종 생성 PCR 생성물은 BmgBI로 소화되었고, pJB78을 생성하도록 EcoRV 및 NruI로 소화된 플라스미드 pACYC184로 클론화되었다.
플라스미드 pJB91은 3단계 과정으로 구성되었다. 첫째, P. 푸티다로부터의 davBA 유전자는, NdeI 및 BsrGI 제한 위치를 davBA PCR 생성물의 5' 및 3' 말단 상에 통합하도록 각각 처리된 프리머 JB136 및 JB137을 이용하여 게놈 DNA 프레파라트로부터 PCR-증폭되었다. 프리머 JB136에 대한 서열은 (5')- TTTTTCATATGAGGAGGTTTTTATGAACAAGAAGAACCGCCA (SEQ ID NO:21)이고, 프리머 JB137에 대한 서열은 (5')-TTTTTTGTACATCAGCCTTTACGCAGGTGCA (SEQ ID NO:22)이다. 최종 생성 PCR 생성물은 NdeI 및 BsrGI로 소화되었고, 동일한 효소로 처리되어 플라스미드 pJB79를 제공한 pJB78로 결찰(ligate)되었다. 다음, P. 푸티다로부터의 davT 유전자는, SpeI 및 ApaLI 제한 위치를 davT PCR 생성물의 5' 및 3' 말단 상에 통합하도록 각각 처리된 프리머 JB138 및 JB139를 이용하여 게놈 DNA로부터 PCR-증폭되었다. 프리머 JB138에 대한 서열은 (5')- TATATACTAGTAGGAGGATAATATGAGCAAAACCAACGAATC (SEQ ID NO:23)이고, 프리머 JB139에 대한 서열은 is (5')-TTTTTGTGCACTCAGGCGATTTCAGCGAAGC (SEQ ID NO:24)이다. 최종 생성 PCR 생성물은 SpeI 및 ApaLI로 소화되었고, 동일한 효소로 소화되어 pJB80을 생성한 pJB79로 결찰되었다. 마지막으로, ompA 프로모터는, BmgBI 및 AseI 제한 위치를 5' 및 3' 말단 상에 통합하도록 각각 처리된 프리머 JB141 및 JB142를 이용하여 대장균 K12 게놈 DNA로부터 PCR-증폭되었다. 최종 생성 PCR은 BmgBI 및 AseI로 소화되었고, 플라스미드 pJB82를 형성하도록 SnaBI 및 NdeI로 소화된 pJB80로 결찰되었다. 프라스미드 pJB91은, DraIII로 프리머 JB136 및 JB137로 (전술된 바와 같이) 생성된 davBA PCR 생성물을 소화함으로써, 또한 동일한 효소로 소화되어 플라스미드 pJB91을 생성한 pJB82로 507 bp 프라그먼트를 결찰함으로써 구성되었다. 이 구성은 pJB82의 davB CDS에서 발견된 무의미한 돌연변이(nonsense mutation)를 정정하기 위해 이루어졌다. 플라스미드 pJB80은 구조적인 Ptet 프로모터 하에서 davBAT 오페론(operon)을 함유하고, 그 반면에 pJB91은 강한 PompA 프로모터 하에서 동일한 오페론을 함유한다.
*플라스미드 pMZ28은 DNA 2.0()에 의해 생성된 구조인 플라스미드 pJ31:7950를 소화함으로써 구성되었고, BsrGI로 대장균 K12d서의 발현을 위해 코돈(codon)-최적화되는 sgaRAt를 함유하였다. sgaRAt를 함유하는 최종 생성 프라그먼트는 BsrGI로 또한 절개된 pFS30으로 결찰되었다. sgaRAt의 방향이 제한 효소 소화에 의해 phaC-orfZ와 동일한 방향이었다는 것을 증명한 후, 최종 생성 플라스미드는 pMZ28로 지정되었다.
실험 결과
P(5HV) 경로로의 불완전한 L-리신을 발현하는 MGl655 [pMZ28] 및 P(5HV) 경로로의 전체 L-리신을 발현하는 MGl655 [pMZ28, pJB91]는 적절한 항생물질(pJB91에 대해 25㎍/mL 클로람페니콜; pMZ28에 대해 100㎍/mL 암피실린(ampicillin))로 보충되고 야간에 37℃에서 250 rpm 진동(shaking)으로 성장된 3mL LB를 함유하는 시험관에서 접종되었다. 다음날, 0.5mL의 각 야간 배양은 적절한 항생물질(들)로 보충되고 37℃에서 250 rpm 진동으로 성장된 50mL의 후레시 LB를 함유하는 진탕 플라스크를 접종하는 데 이용되었다. 3.5 시간에, 0.1 mM IPTG가 배양액에 추가되었고, 5시간에, 배양이 4150 rpm(Sorvall Legend RT benchtop 원심분리기)으로 스피닝되었고, 10 g/L 글루코오스, 2.5 g/L LB, 10 g/L L-리신, 2mM MgSO4, 1x 트레이스 염용액(1x Trace Salts Solution), 및 0.1 mM IPTG를 함유하는 1x E2 최소 염용액으로 구성되는 50 mL의 생성 매질에 재부유되었다. E2 염용액 및 트레이스 염용액에 대한 레시피가 실험예 1에 제공된다.
진탕 플라스크 성장 조건 및 PHA 콘텐츠에 대한 분석 프로토콜은 실험예 1에 설명된 바와 같다. 표 7은 8겹 이상의 P(SHV)가 davBAT 오페론의 도입 후에 생성 이후에 생성되었다는 것을 보여 준다.
[표 7] L-리신으로부터의 P(5HV) 생성
Figure pat00034
실험예 6: L-리신으로부터의 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머 생합성
L-리신을 P(SHV)로 전환하도록 고안된 경로는 또는 L-리신으로부터 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머를 생성하고 결국 글루코오스를 생성하기 위해 bktB 및 phaB를 발현하는 스트레인 MBX2641 내로 도입되었다.
플라스미드 구조
이 실험예에서 경로를 포함하는 유전자는, P. 푸티다 davB, P. 푸티다 davA, P. 푸티다 davT, C. 클루이베리(kluyveri) orfZ, R. 유트로파(eutropha) phaC, 및 A. 탈리아나(thaliana) gsaRAT 와 A. 테레우스(terreus) gsaRAT 중 하나를 포함한다(표 1A 참조).
gsaRAT2, phaC 및 orfZ 유전자로 구성되는 대안의 경로를 포함하는 플라스미드 pJB90은 다음의 방법으로 생성되었다. 대장균 K12에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 테레우스 gsaRAT2 유전자는 프리머 JB145 및 JB146을 이용하여 pSG40(DNA 2.0에 의해 생성된 구조(Menlo Park, CA))으로부터 PCR-증폭되었다. 양측의 프리머는 5' 말단에서 BglII 지역을 함유하였다. 프리머 JB145에 대한 서열은 (5')-TTTTTAGATCTAGGAGGTTTTTATGCTGCGTGCTGCTTCTCG (SEQ ID NO;25)이고, 프리머 JB146의 서열은 is (5')-TTTTTAGATCTTTAGCGGAAATAGTTTGGAC (SEQ ID NO:26)이다. 최종 생성 PCR 프라그먼트는 Bg1II로 소화되었고, pJB90을 생성하도록 pJB84의 대응하는 위치로 결찰되었다.
실험 결과
스트레인 MBX2641 [pJB78, pJB84], MBX2641 [pJB91, pMZ28], 및 MBX2641 [pJB91, pJB90]은 진탕 플라스크에서 성장되었고, L-리신 및 글루코오스로부터 P(3HB-co-5HV)의 생성을 특성화하기 위해 실험예 1 및 실험예 2에서 설명된 바와 같은 PHA 콘텐츠 및 조성에 대해 분석되었다. MBX2641 [pJB78, pPB84], MBX2641 [pJB91, pMZ28], 및 MBX2641 [pJB91, pJB90]은 25 ㎍/mL 클로람페니콜 및 100㎍/mL 암피실린으로 보충되고 야간에 37℃에서 250 rpm 진동으로 성장된 3mL LB를 포함하는 시험관에서 접종되었다. 다음날, 0.5 mL의 각 야간 배양은 동일한 항생물질로 보충되고 37℃에서 250 rpm 진동으로 성장된 50 mL의 후레시 LB를 포함하는 진탕 플라스크를 접종하는 데 이용되었다. 3.5 시간에, 0.1 mM IPTG가 배양액에 추가되었고, 5 시간에, 배양이 4150 rpm(Sorvall Legend RT benchtop 원심분리기)으로 스피닝되었고, 10 g/L 글루코오스, 2.5 g/L LB, 10 g/L L-리신, 2mM MgSO4, Ix 트레이스 염용액, 및 0.1 mM IPTG를 포함하는 1x E2 최소 염용액으로 구성되는 50 mL의 생성 매질에 재부유되었다. E2 염류 및 트레이스 염용액에 대한 레시피는 실험예 1에 제공된다.
표 8에 도시된 바와 같이, L-리신을 5HV로 전환하는 유전자를 갖지 않는 스트레인 MBX2641 [pJB785 pJB84]은 L-리신으로부터 5HV를 생성할 수 없고, P(3HB) 만을 생성하였다. L-리신으로부터 5HV-CoA까지의 전체 경로를 포함하는 스트레인 MBX2641 [pJB91, [pMZ28] 및 MBX2641 [pJB91, pJB90]은 각각 5HV를 2.5%wt 및 5%wt까지 포함하였다. 이것은 davBAT 및 gsaR 유전자가 L-리신으로부터 5HV-함유 공동폴리머를 생성하기 위해 발현될 필요가 있다는 것을 입증한다.
[표 8] L-리신으로부터의 P(3HB-co-5HV) 생성
Figure pat00035
실험예 7: L-리신으로부터의 개선된 5HV-함유 PHA 폴리머 생합성(Improved biosynthesis of 5HV-containing PHA polymers from L-lysine)
5HV가 예상외로 낮은 레벨에서 포함되었다는 사실로 인해, 경쟁 경로의 존재가 고려되었다. 글루타레이트가 L-리신으로부터 생성될 수 있는지를 보기 위해, 플라스미드로부터 davBAT 유전자를 발현하는 MGl655 [pJB91]는 25 ㎍/L 클로람페니콜을 포함하는 LB 매질에서 30℃에 6h 동안의 진동으로 성장되었다. 25μL 미드-로그기 배양(mid-log phase cultures)의 부분표본(aliquots)은 475 μL E0 최소 매질 내로 접종되었고, 30℃에서 48h 동안의 250 rpm 진동으로 인큐베이트되었다. E0 최소 매질은 10 g/L 글루코오스, 4 g/L 리신, 58 mM K2HPO4, 27 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 25 ㎍/mL 클로람페니콜, 0.1 mM IPTG, 및 트레이스 요소로 구성되었다. 상청액(supernatant)에 존재하는 글루타레이트는 하기에서 약술되는 GC-MS에 의해 측정되었다: 발효 배양액(fermentation broth)으로부터의 상청액이 원심분리에 의해 얻어졌고, 1μL의 샘플이 내부 표준으로서 1g/L 4-아미노뷰티레이트(GABA)를 포함하는 후레시 Eppendorf 튜브로 피펫되었다. 샘플들은 Labconco centrivap에서 건조되었고, 3h 동안 음파처리(sonication)에 의해 100 μL 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN): N-(t-뷰틸디메틸실릴)-N-메틸트리플루오로아세타미드(MTBSTFA) 1 :1 용액에서 재부유되었다. 이후, 샘플들은 65℃에서 30min 동안 유도체-합성되었고, 용해되지 않은 물질 및 PH-5ms 컬럼을 구비한 Agilent 5975 GC-MS 내로 주입된 상청액을 다음의 수집 파라미터를 이용하여 제거하도록 원심분리되었다: 전달 가스 헬륨 유속 2ml/min, 스캔 모드 m/z 65-700, 3.5min 동안의 용매 지연, 오븐 프로그램(oven program): 2분 동안 150℃, 이후에 3℃/min로 280℃까지 상승시킴, 이온 소스 온도(ion source temperature) 230℃, 4중극자(quadrupole) 질량 필터 온도 150℃.
흥미롭게도, 0.6g/L 4중극자는 davBAT 오페론이 MG1655에서 과도발현되었을 때 L-리신으로부터 생성되었다. davBAT 오페론은 L-리신은 GSA로 전환하는 효소를 인코딩하는 유전자를 발현시킨다. 글루타레이트는 인코딩된 효소가 GSA를 글루타레이트로 산화시킬 수 있는 내생 대장균(endogenous E. coli) 유전자에 의해 생성될 수 있다.
GSA로부터 글루타레이트로의 가능한 효소 반응의 검사는 2개의 가능한 내생 대장균 GSA 디하이드로제나아제 유전자들, gabD 및/또는 yneI의 식별을 인도하였다(표 1A 참조). 이러한 2개의 유전자는 석신 세미알데히드를 석신 산으로 산화시키도록 일직 식별되었지만(Dennis와 Valentin, U.S. 특허 제6,117,658호), GSA를 글루타레이트로 산화시키는 것을 보여 주지는 않았다. gabD- 및 yneI-음성 스트레인이 여전히 L-리신으로부터 글루타레이트를 생성하는지를 테스트하기 위해, 다음의 스트레인이 구성되었다.
단일 널 gabD 및 yneI 뮤턴트는 Datsenko와 Wanner(Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 97:6640-6645 (2000))에 의해 설명된 Red/ET 리컴비니어링 방법에 의해 구성되었다. MG1655의 염색체로부터 gabD를 삭제하는 과정은 PCR-중재된 상동 재조합을 통해 FRT-측면위치된 칸 표지자(FRT-flanked kan marker)와의 gabD 재조합을 포함했다. FRT-측면위치된 칸 표지자는 프리머 RF314 5'- GCAAGCCAGAGTAACCCCGGACGCACGCTGCGAGCGGCACGTAG TGTGGATGCCTTACACGCCGCATTTAATCAATAACCTTGAGCGAT TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO:27) 및 RF315 5'- GAATTTGCCCAACGCCACGGGGAATCGCCTGACTGCGGCGCTGCA TTAACTCTTTATTGCTGTTCATTCGCATTCTCCAGATGGGAATTAG CCATGGTCCATATGAATAT (SEQ ID NO:28)를 이용하여 플라스미드 pKD4 (Datsenko와 Warmer, Proc. Natl. Acad. ScL USA. 97:6640-6645 (2000)로부터 PCT-증폭되었다.
yneI 유전자는 FRT-측면위치된 칸 표지자와의 교체에 의해 MG1655의 염색체로부터 삭제되었다. 이 표지자는 상동관계의 50개의 pb 측면위치 영역을 삭제될 유전자에 도입한 프리머 MS220 5'- GCAAGAGTAAATCTGCGTATCTTCATACCATGACTCATAAAGGAG ATACCCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO:29) 및 MS217 5'- ACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGTATATCAGAGCTGAATATG TCGCGCATATGAATATCCTCCTTAGT (SEQ ID NO:30)를 이용하여 플라스미드 pKD4로부터 PCR-증폭되었다. 이 DNA 프라그먼트와의 yneI의 교체는 작용하지 않으며, 그에 따라 유전자 교체를 위한 상동관계의 영역을 증가시킨 다른 PCR 프라그먼트가 생성되었다. 이것을 달성하기 위해, PCR의 추가 라운드가 주형(template)으로서 위에서 생성된 PCR 프라그먼트 및 프리머 MS223 5'- TCGATTCGTGAATAAGTGGCTTAATATTATTCATTTTAAAGCAAG AGTAAATCTGCGTATC (SEQ ID NO:31) 및 MS224 5'- GCCACTTTCTACTCCTGGACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGT ATATCAGAGCTG (SEQ ID NO:32)로 수행되었다. FRT-칸-FRT와의 yneI의 성공적인 교체가 달성되었다. 이후, 칸 표지자는 Datsenko 및 Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640- 6645 (2000))에서 설명된 바와 같이 제거되었다.
MG1655 ΔgabD::FRT-칸-FRT, ΔyneI::FRT는 MG1655ΔgabD::FRT-칸-FRT로부터 MG1655ΔyneI::FRT로의 P1-중재된 트랜스덕션에 의해 구성되었고, 나머지 칸 표지자는 전술된 바와 동일한 방법을 이용하여 더 제거되었다. 최종 생성 스트레인 MGl655ΔgabD::FRT, ΔyneI::FRT는 pJB91로 형질변환되었고, 플라스미드로부터 davBAT 유전자를 발현하는 MG1655[pJB91]과 함께 전술된 것과 유사한 실험에서 L-리신으로부터의 글루타레이트 생성물에 대해 분석되었다.
L-리신으로부터 0.6 g/L 글루타레이트를 생성한 MG1655 [pJB91]와는 대조적으로, 스트레인 MGl655ΔgabD::FRT, ΔyneI::FRT[pJB91]은 대장균 내생 gabD 및/또는 yneI가 GSA를 글루타레이트로 전환하는 것에 대하여 책임을 질 수 있다는 것을 입증하는 L-리신으로부터 어떠한 글루타레이트도 생성하지 않았다.
L-리신으로부터의 개선된 P(3HB-co-5HV) 생성
L-리신으로부터의 개선된 5HV 플럭스는 3HB-co-5HV 공동폴리머를 생성한 스트레인 내의 유전자 gabD 및 yneI를 인코딩하는 내생 GSA 디하이드로제나아제를 삭제함으로써 달성되었다.
MBX2855는 플라스미드 pJB91 및 pJB90을 스트레인 MBX2641로 형질변환함으로써 구성되었다. 이 스트레인은 글루코오스 및 L-리신으로부터 P(3HB-co-5HV)를를 생성하도록 하는 모든 유전자를 갖는다.
MG1655ΔgabD::FRT, ΔyneI::FRT는 실험예 2에서 설명된 바와 같은 능력을 생성하는 PHB를 수여한 도너 스트레인 MBX2114와 P1-트랜스덕트되었다. 이 스트레인은, 실험예 6 및 5에서 설명된 바와 같이, 각각 L-리신을 P(5HV) 경로 유전자로 발현시킨 pJB90 및 pJB91로 더 형질발현되었다. 최종 생성 스트레인은 MBX3378로 지정되었고, 글루코오스 및 L-리신으로부터 P(3HB-co-5HV)를 생성하도록 하는 모든 유전자를 구비하지만, MBX2855와 달리, gabD 및 yneI 유전자 양측 모두가 게놈으로부터 제거되게 한다.
진탕-플레이트 발효(shake-plate fermentation)는 스트레인 MBX2855 및 그것의 GSA 디하이드로제나아제-부족 카운터파트(GSA dehydrogenase-deficient counterpart) MBX3378을 이용하여 이행되었다. 세포들은 전술된 바와 동일한 조건(30℃에서 300 rpm으로 진동) 하에서 인큐베이트되고 분석되었다. E0 최소 매질은 이전의 실험예에서 설명된 바와 같이 10 g/L 글루코오스, 2 g/L L-리신, 58 mM K2HPO4, 27 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 25 ㎍/mL 클로람페니콜, 5 ㎍/mL 겐타마이신(gentamicin), 0.1 mM IPTG, 및 트레이스 5 요소들로 구성되었다. L-리신으로부터 5HV로의 카본 플럭스는 표 9에 도시된 바와 같이 와일드형 GSA 디하이드로제나아제 활성도를 포함한 MBX2855에 비해 GSA 디하이드로제나아제-부족 스트레인 MBX3378에서 극적으로 개선되었다. PHA를 포함하는 5HV의 생성을 현저하게 개선하기 위해, gabD 및 yneI와 같은 GSA 디하이드로제나아게 유전자는 생성 호스트의 게놈으로부터 제거될 필요가 있다.
[표 9] L-리신으로부터의 개선된 P(3HB-co-5HV) 생성
Figure pat00036
실험예 8: 글루코오스로부터의 L-리신 생합성
알로스테릭 피드백 조절(allosteric feedback regulation)은 유전자 lysC 및 dapA를 통해 L-리신 경로에서 발생한다. 따라서, 이 제어는 글루코오스로부터 증가된 L-리신 생성을 가능하게 하기 위해 제거될 필요가 있다. 이를 위한 절차는 잘 확립되어 있고, 양측의 유전자에 대해 설명되었다(Kojima 등의 U.S. 특허 제6,040,160호). 해제된 lysC 및 dapA를 소유하고 있는 대장균 뮤턴트들은 먼저 대장균으로부터 metL 및 thrA을 삭제함으로써 얻어질 수 있다. LysC, MetL 및 ThrA는 모두가 동일한 아스파르테이트 키나아제 반응을 촉진시키는 동질효소이며, 따라서, lysC 내의 돌연변이가 긍정적으로 선택될 수 있기 전에 후자의 2개를 제거하는 것이 필수적일 것이다. 일단 ΔmetL ΔthrA 스트레인이 만들어지면, 그것은 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(nitrosoguanidine: NTG)으로 돌연변이될 수 있다. 이후, 최종 생성 뮤턴트 풀은 lysC 및 dapA 상에 압력을 가하기 위해, S-2-아미노데틸시스테인(aminoethylcysteine: AEC), L-리신의 비대사성 유사체(non-metabolizable analog)를 포함하는 최소 매질에서 성장될 것이다. metL 및 thrA가 빠져 있으므로, lysC 및 dapA를 L-리신(또는 그것의 AEC 유사체)으로 둔화시키는 돌연변이는 세포가 L-리신, 트레오닌, 및 메티오닌을 합성하게 하고 그에 따라 생존하게 할 것이다. 또한, 플럭스 용량을 증가시키고 전자 조절(transcriptional regulation)을 제거하기 위해, 해지된 lysC, 해지된 dapA, 및 재조합 프로모터로부터의 다른 경로 유전자를 과도발현시킴으로써 조작이 실행될 수 있다.
실험예 9: 글루코오스로부터의 P(SHV) 호모폴리머 생합성
P(SHV)는 글루코오스로부터 5HV-CoA 모노머를 합성하고 그들을 PHA 내로 통합시킬 수 있는 대장균 스트레인 내의 유일한 카본 소스로서 글루코오스로부터 생성되었다. 이를 위해, L-리신으로부터의 pP(5HV) 호포폴리머를 생성하는 데 요구되는 유전자를 발현시켰을 뿐 아니라 L-리신 피드백-내성 디하이드로디피콜린이트 신타아제를 인코딩하는 돌연변이 dapA 유전자, 소위 dapAfbr를 발현한 스트레인이 구성되었다. 이 실험예의 제 1 부분은 이 능력을 입증하는 데 요구되는 플라스미드의 구성을 설명할 것이다.
플라스미드 구성
대장균에서, 알로스테릭 조절은 lysC 및 dapA 유전자에 의해 각각 인코딩된 아스파르테이트 키나아제 III 및 디하이드로디피콜린에이트 신타아제를 통해 L-리신 경로에서 발생한다(도 6). 글루코오스로부터 L-리신 및 마침내는 P(SHV) 호모폴리머의 생성을 증가시키기 위해, 알로스테릭 조절은 감소되거나 전체적으로 제거될 필요가 있다. 이를 하기 위한 절차는 잘 확립되어 있으며, 양측의 유전자에 대해 설명되어 있다(Kojima 등의 U.S. 특허 제6,040,160호). 시토신으로부터 티민(dapAC352T)로 변경된 352번째 뉴클레오티드 잔기를 가진 L-리신 피드백 내성 dapAfbr 유전자가 구성되었다. 이것은 희망 염기 변화를 도입한 프리머를 이용하여 2개의 DNA 프라그먼트를 생성하는 염색체 대장균 dapA 유전자의 PCR 증폭 및 그 뒤에 이어서 2개의 DNA 프라그먼트를 융합하도록 하는 오버랩 확장 PCR (SOE-PCR)에 의해 접합함으로써 얻어졌다. 상세히 말해, 하나의 DNA 프라그먼트는 프리머 DE081 (5'- AAAAGAATTCTTAATTAATTCTAGAAGGAGGTTTCATATGTTCAC GGGAAGTATT GTC) (SEQ ID NO:33) 및 DE082 (5'- AGCGATGGCTTTGAAATACTGATACAAACCTTC) (SEQ ID NO:34)로 증폭된 dapA 유전자의 1번째 내지 366번째 뉴클레오티드 쌍을 포함하였고, 다른 DNA 프라그먼트는 프리머 DE083 (5 ' - GAAGGTTTGTATCAGTATTTCAAAGCCATCGCT) (SEQ ID NO:35) and DE084 (5'- CCCGAGCTCGTTTAAACTTAATTAAGACTAGTTTTACAGCAAACC GGCATGCTT) (SEQ ID NO:36)로 증폭된 dapA의 337번째 내지 879번째 뉴클레오티드 쌍을 포함하였다. 프리머 DE082 및 DE083은 역상보물이며, 352번째 뉴클레오티드 잔기에서 시토신을 티민 염기 변화에 도입하도록 설계되었다. PCR의 제 1 라운드로부터의 2개의 DNA 프라그먼트는 프리머 DE081 및 DE084를 이용하여 SOE-PCR에 의해 융합되었다. 최종 생성 PCR 생성물은 XbaI 및 ScaI로 소화되었고, SpeI 및 SacI로 소화되어 플라스미드 pDE035를 생성한 pDE035로 결찰되었다. 합성 구조적 프로모터(PsynI)를 포함하는 플라스미드 pDE031은 XbaI 및 PmeI로 합성 36 bp 이중-가닥 DNA 프라그먼트 (5'- TTTTTCTAGATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCA CTAGTGTTTAAACCCCC ) (SEQ ID NO:37)를 소화시킴으로써 구성되었고, 동일한 제한 효소 지역들을 포함하도록 이전에 처리된 pBluescript II SK(+) 플라스미드 (Stratagene, La Jolla, CA)의 그 지역들 내로 결찰되었다. pDE035에서의 PsynI-dapAC352T 유전자 구조는 Xho1 및 PmeI로 소화되었고, 이어서 BsrGi로 소화되고 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제로 둔화되었으며, Xho1로 두 번째 소화되어 Ptre 프로모터로부터 phaC-gsaRAt-orfZ 오페론을 발현시키고 PsynI 프로모터로부터 dapAC352T를 발현시킨 플라스미드 pJG22를 생성한 플라스미드 pJB90(실험예 6에서 설명됨)과의 결찰이 이어졌다.
실험 결과
플라스미드 pJG22는 플라스미드 pJB91(실험예 5에서 설명됨)과 함께 스트레인 MBX3342(MG1655ΔgabD::FRTΔynI::FRT)로 형질변화되어 스트레인 [pJB91, pJG22]을 형성하였다. 플라스미드 pSE380 및 pACYC184, pjG22 및 pJB91를 구성하는 데 각각 이용된 엠프티 벡터(empty vectors)는 또한 음성 제어 스트레인 MBX3342 [pSE380, pACYC184]를 생성하도록 스트레인 MBX3342로 형질변환되었다. 이러한 스트레인은 2x E2 매질에서 30℃로 300 rpm의 48h 동안의 진동으로 인큐베이트되었고, 앞선 실험예들에서 설명된 바와 같이 분석되었다. 매질은 5 g/L 글루코오스, 52 mM NaNH4HPO4, 66 mM K2HPO4, 54 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0.1 mM IPTG, 및 전술된 바와 같은 트레이스 요소들로 구성되었다. MBX3342 [pJB91, pJG22]에 대한 배양 매질에 대해, 25㎍/mL 클로람페니콜 및 5㎍/mL 겐타마이신이 보충되었고, 한편으로 25㎍/mL 클로람페니콜 및 100㎍/mL 암피실린이 MBX3342[pSE380, pACYC184]에 대해 추가되었다. 표 10의 데이터는 MBX3342 [pJB9, pJG22]가 2.60% 건조 세포 질량(dry cell weight: DCW) P(5HV) 호모폴리머를 생성한 반면, 스트레인 MBX3342 [pSE380, pACYC184]가 어떠한 PHAh 생성하지 않았음을 보여 준다. 이러한 결과는 P(5HV0 경로 유전자로의 L-리신외에도 피드백 내성 dapA 유전자를 발현하는 스트레인이 유일한 카본 소스로서 글루코오스로부터 P(5HV)를 생성할 수 있다는 것을 입증한다.
[표 10] 글루코오스로부터의 P(SHV) 생성
Figure pat00037
실험예 10: 글루코오스로부터의 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머 생합성
다음 실험은 3HB-co-5HV 및 5HV-CoA 모노머를 합성하고 그들을 PHA 내로 통합할 수 있는 대장균 스트레인에서 글루코오스로부터의 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머 생성을 입증하는 것이었다.
실험 결과
스트레인 MBX2114로부터의 btkB-phaB-kan 유전자는 스트레인 MBX3344를 생성하는 MBX3342로 P1-형질도입되었다. MBX3344는 플라스미드 pJB91 및 pJG22로 형질변환되어 스트레인 MBX3344 [pJB91, pJG22]를 생성하였다. 플라스미드 pSE380 및 pACYC1845, pJG22 및 pJB91을 각각 구성하는 데 이용된 엠프티 벡터는 또한 MBX3344로 형질변환되어 음성 제어 스트레인 MBX3344 [pSE38O, pACYC184]를 생성하였다. 이러한 스트레인은 2x E2 매질에서 30℃로 300 rpm으로 48h 동안 진동으로 인큐베이트되었고, 앞선 실험예들에서 설명된 바와 같이 분석되었다. 매질은 15 g/L 글루코오스, 52 mM NaNH4HPO4, 66 mM K2HPO4, 54 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0.1 mM IPTG, 및 전술된 트레이스 요소들로 구성되었다.
MBX3344 [pJB91, pJG22]에 대한 배양 매질에 대해, 25㎍/mL 클로람페니콜 및 5㎍/mL 겐타마이신이 보충되었고, 한편으로 25㎍/mL 클로람페니콜 및 100㎍/mL 암피실린이 MBX3344 [pSE380, pACYC184]에 대해 추가되었다. 배양액은 24시간 인큐베이션 이후에 10 g/L 글루코오스로 보충되었다. 표 11은 5HV가 단일 카본 소스로서 글루코오스로부터 모든 P(3HB-co-5HV) 대사성 경로 유전자를 포함하는 스트레인으로 통합될 수 있다는 것을 보여 준다.
[표 11] 글루코오스로부터의 P(3HB-co-5HV) 생성
Figure pat00038
다음, 스트레인 MBX3824 (W3110 AgabD::FRT AyneliiFRT AcadA::FRT AldcCr.FR[Upsilon] AargOv.FRT bktB-phaB-kan)는 글루코오스로부터 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머를 생성하도록 호스트 스트레인으로서 테스트되었다. 이 스트레인에서, L-리신을 5HV-CoA 공동모노머로부터 전환할 수 있는 경쟁 경로들이 대장균 게놈으로부터 제거되었다.
제 1 경쟁 경로는 L-리신을 카다베린으로 전환할 수 있고, cadA(Meng와 Bennett의 J. Bacteriol. 174(8):2659- 2669 (1992); EcoCyc 수납번호 : EG10131) 및 ldcC(표 1A 참조; Yamamoto 등의 Genes Genet. Syst. 72(3):167-72 (1997))에 의해 인코딩되는 2개의 L-리신 데카르복실라아제(decarboxylase) 효소(EC 번호 4.1.1.18)로 구성된다.
제 2 경쟁 경로는 미생물 세포로부터 L-리신을 이출(export)할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)에서, L-리신 이출 단백질은 LysE(Table 1A 참조; Vrljic 등의 Mol. Microbiol. 22 (5): 815-826 (1996))로서 식별되었다. 대장균에서 추정 L-리신 이출 유전자를 식별하기 위해, 질의로서 C. 글루타미컴 LysE를 이용한 BLAST 및 Psi-BLAST 검색뿐 아니라 여러 개의 문헌 및 특허 검색이 이행되었다. 6개의 단백질이 세포 외부로부터 L-리신 이출을 방지하기 위해 대장균 게놈으로부터의 제거를 위한 표적이라는 것이 밝혀졌다. 그들은, (1) ArgO (YggA라고도 알려짐, Nandineni, Gowrishankar의 J. Bacteriol 186:3539-3546 (2004)), (2) YfiK (EamB라고도 알려짐; Franke 등의 J. Bacterial 185:1161-1166 (2003)), (3) RlitB (이전에 YigK라고 호칭됨; Zakataeva 등의 FEBS Lett. 452(3):228-32 (1999)), (4) YahN (Kutukova 등의 Mol. Biol. (Mosk.) 39(3);374-378 (2005)), (5) RhtC (이전에 YigJ라고 호칭됨; Zakataeva 등의 FEBS Lett, 452(3):228-32 (1999)), 및 (6) YeaS (LeuE라고도 알려짐; Kutukova 등의 FEBS Lett. 579(21):4629-34 (2005))을 포함한다. ArgO는 질의로서 C. 글루타미컴으로부터 LysE를 이용하여 BLSATP 검색에서 2e-22의 최저 e-값에 기초하여 대장균 세포로부터 L-리신을 이출하도록 하는 가장 가능성있는 후보인 것으로 보였고, 가장 가까운 것은 argO가 벡터 전용 제어 스트레인에 비해 과도발현되었을 때 38% 더 높은 L-리신 축적뿐 아니라, C. 글루타미컴 LysE 및 6개의 대장균 상동성과 L-리신에 대한 보고된 3-겹 증가 저항(reported 3-fold increased resistance)을 갖는 클러스탈X(Thompson 등의 Nucleic Acids Res. 25: 4876-4882 (1997)) 후의 이웃 조인 트리(join tree)에서 LysE로 클러스터링되었다. 그러나, 다른 식별된 단백질은 L-리신을 지나치게 이출할 수 있으므로, 유전자 삭제를 위한 표적이 된다.
다른 경쟁 경로는 대장균의 yjeK에 의해 인코딩된 L-리신을 리신 2,3-아미노뮤타아제(EC 번호 5.4.3.-)에 의해 촉진되는 (R)-β-리신으로 변환할 수 있다(EcoCyc 수납번호: G7836; Behshad 등의 Biochemistry 45(42): 12639-46 (2006)).
단일 널 cadA 및 ldcC 뮤탄트는 ΔcadA::FRT-kan-FRT 돌연변이에 대해 다음의 프리머 DE1l8 (5'- TGTCCCATGTGTTGGGAGGGGCCTTTTTTACCTGGAGATATGACTG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:38) 및 DE119 (5'- GAGCAAAAAAGGGAAGTGGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTA AATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:39)를 이용하고 ΔldcC::FRT-cat-FRT 돌연변이에 대해 DE122 (5'- GTTTGAGCAGGCTATGATTAAGGAAGGATTTTCCAGGAGGAACAC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:40) 및 DE123 (5'- TATTTGTTAACAGCACGTTACTCGCCCGGAAGCCGCTCTGGCAAG ATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:41)를 이용하여 이전에 설명된 바와 같이 유전자 브리지(Gene Bridges)로부터 Red/ET 리콤비니어링 방법에 의해 구성되었다. 단일 널 argO 돌연변이는 프리머 DE106 (5'- GTGTTTTCTTATTACTTTCAAGGTCTTGCACTTGGGGCGGCTATGG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:42) 및 DE107 (5'- CTAACTGAACAAGGCTTGTGCATGAGCAATACCGTCTCTCGCCAG ATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:43)을 이용하여 Red/ET 리콤비니어링 방법에 의해 구성되었다. W3110 ΔgabD::FRTΔyneI::FRTΔcadA::FRT ΔldcC::FRT ΔargO::FRT는, 앞선 실험예들에서 설명된 각각의 P1-중재된 트랜스덕션 후의 칸 또는 캣 표지자의 제거가 이어지는, 스트레인 W3110(Bachmann, Bacteriol. Rev., 36 (4):525-557 (1972))으로의 반복적인 P1-중재된 ΔgabD::FRT-kan-FRT, ΔyneI::FRT-kan-FRT, ΔcadA::FRT-kan-FRT, ΔldcC::FRT-cat-FRT, ΔcadA::FRT-kan-FRT 카세트의 트랜스덕션에 의해 구성되었다. 최종 생성 스트레인 MBX3818은 MBX3824의 구성을 완료하도록 도너 스트레인 MBX2114로 P1-형질 도입되었다. 플라스미드 pJG22 및 pJB91은 MBX3824로 형질변환되었고, 최종 생성 스트레인 MBX3824 [pJG22, pJB91]은 MBX3344 [pJG22, pJB91]와 함께 P(3HB-co-5HV) 공동폴리머의 생성을 위해 테스트되었다. 이러한 스트레인은 1.5x E2 매질에서 30℃로 300 rpm으로 48h 진동 동안 인큐베이트되었고, 앞선 실험예들에서 설명된 바와 같이 분석되었다. 매질은 15 g/L 글루코오스, 39 mM NaNH4HPO4, 49.5 mM K2HPO4, 40.5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0.1 mM IPTG, 및 전술된 트레이스 요소들로 구성되었다. 배양 매질은 25㎍/mL 클로람페니콜 및 5㎍/mL 겐타마이신으로 보충되었다. 표 12는 상이한 유전 배경을 갖는 다양한 스트레인이 폴리머에서 상이한 조성의 5HV를 갖는 글루코오스로부터 P(3HB-co-5HV)를 생성할 능력을 갖는다는 것을 보여 준다. 구체적으로, L-리신 이출 단백질 argO 또는 2개의 리신 디카르복실라아제 유전자 cadA 및 idcC를 제거하는 것과 같이, 5HV-CoA로부터 카본을 전화하는 경쟁 0 경로를 제거하는 것은 PHA 내로의 5HV 통합을 증가시킨다.
[표 12] 글루코오스로부터의 P(3HB-co-5HV) 생성
Figure pat00039
실험예 11: 소듐 4-히드록시뷰틸레이트 및 소듐 5-히드록시발레레이트로부터의 P(4HB-co-5HV) 공동폴리머 생합성
다음 실험은 4HB-CoA 및 5HV-CoA 모노머를 합성하고 그들을 PHA 내로 통합할 수 있는 대장균 스트레인 내의 P(4HB-co-5HV) 공동폴리머의 생성을 증명하는 것이었다. 재조합재조합서 4HB 공동모노머를 처리하기 위한 방법은, 본 명세서에서 전체가 참조로서 인용되는 U.S. 특허 제6,117,658호, U.S. 특허 제6,316,262호, U.S. 특허 제6,689,589, U.S. 특허 제7,081,357호, U.S. 특허 제7,229,804호, U.S. 특허 제6,759,219, 및 U.S. 특허 출원 공개공보 제2004/0253693호에서 상세히 설명되었다. 실험예 1에서 설명된 것과 유사한 실험에서, 소듐 5-히드록시발레레이트(Na5HV)는 소듐 4-히드록시뷰틸레이트(Na4HB)와 함께 스트레인 MG1655 [pMS93]로 공급되었다. MG 1655 [pMS93]은 유전자 orfZ 및 phaC를 포함하는데, 이들 양측 모두는 각각 Na4HB 및 NaSHV로부터 4HB-CoA 및 5HV-CoA를 생성할 뿐 아니라 전구체(precursors)를 P(4HB-co-5HV) 공동폴리머로 폴리머화하는 데 요구된다. 기질로서의 이용을 위한 Na4HB는 DVL 대신에 감마-뷰티롤락톤(butyrolactone)(GBL)의 이용과 함께 실험예 1에서 NaSHV의 마련을 위해 설명된 방법과 유사하게 마련되었다. 공동폴리머 생성물에 이용되는 배양 조건은 또한 실험예 1에서 설명된 바와 동일한 것이었지만, 4 g/L의 Na4HB가 생성 매질에 추가되었다는 차이점이 있다. PHA 생성 주기에 이어서, MG1655[pMS93] 배양의 폴리머 콘텐츠의 분석은 4HB 콘텐츠를 판정하기 위한 표준 곡선이 5HV 콘텐츠를 판정하기 위해 만들어진 표준 곡선 외의 GBL 표준을 이용하여 판들어졌다는 점을 제외하고 실험예 1에서 설명된 바와 같이 진행되었다. 이 분석은 Na4HB 및 NaSHV를 공동 공급받은 MGl655 [pMS93]이 67% dcw를 포함하였고 67% 4HB 및 33% 5HV인 조성을 가진 P(4HB-co-5HV) 공동폴리머를 생성했다는 것을 보여 주었다. 이 폴리머의 추출된 샘플은 DSC를 이용하여 분석되었고, -54.9℃의 Tg를 가지되 어떠한 탈착가능 Tm도 갖지 않는 것으로 판정되었다.
실험예 12: 글루코오스로부터의 글루타레이트 생합성
2개의 유전자 생성물 중 어느 것이 실험예 7에서 식별된 바와 같이 1차적 GSA 디하이드로제나아제였는지를 구별하기 위해, 와일드형 스트레인 MG1655 [pJB91], MG1655ΔyneI::FRT [pJB91], 및 MG1655ΔgabD::FRT [pJB91]이 5-아미노펜타노에이트로부터 글루타레이트, 즉 L-리신과 GSA 사이의 중간 대사 산물(intermediate metabolite)을 생성할 능력에 대해 비교되었다(도 2 참조). 모든 3개의 스트레인은 실험예 5에서 설명된 바와 같이 PompA 프로모터로부터 davBAT를 발현시키는 플라스미드 pJB91을 포함한다. 3개의 스트레인은 먼저 설명된 바와 같은 2 g/L 5-아미노펜타노에이트를 포함하는 E0 최소 매질에서 성장되었고, 글루타레이트는 배양 상충액으로부터 GC-MS 방법에 의해 측정되었다. 인큐베이션 방법 및 조건은 실험예 7에서 설명된 바와 동일하였다.
다른 2개의 스트레인과는 달리, MG1655 ΔgabD [pJB91]는 임의의 탈착가능한 글루타레이트를 축적하지 않았다. 따라서, gabD에 의해 인코딩된 디하이드로제나아제는 GSA를 향해 주요 활동도를 갖는다. 따라서, 많은 양의 글루타레이트가 생성될 것이라면, 생성 호스트는 gabD 또는 그것의 유사체(표 1P 참조)를 발현시킬 필요가 있다. 그러나, MGl655 ΔyneI [pJB91]가 MG1655 [pJB91]에 비해 5-아미노펜타노에이트로부터 약간 더 적은 양의 글루타레이트, 즉 0.75 g/L 대비 1.0 g/L 글루타레이트를 축적하였으므로, yneI에 의해 인코딩된 디하이드로제나아제도 또한 GSA를 향해 알맞은 활동도를 갖는다. 따라서, yneI 또는 상동(표 1Q 참조)의 과도 발현은 또한 GSA, L-리신 또는 글루코오스로부터 많은 양의 글루타레이트를 산출할 수 있다.
코리네박테리움 글루타미컴에 존재하는 2개의 최상 GabD 상동은 (1) NAD-의존적 알데히드 디하이드로제나아제(수납번호 NP_599302) 및 (2) 가설 단백질(hypothetical protein) cgR_0068(수납번호 YP_001136931)을 포함한다. 예상외로, 이들 2개의 C. 글루타미컴 단백질도 대장균 YneI에 대한 2개의 가장 근접한 동종으로 식별되었다.
다음, 글루타레이트가 글루코오스로부터 생성되었다. L-리신-과도생성 스트레인을 제공하기 위해, L-리신 피드백 내성 dapAC352T 유전자를 포함하는 플라스미드 pDE033이 다음과 같이 구성되었다: 실험예 9에서 설명된 dapAC352T 유전자의 제조에 대한 SOE-PCR의 생성물은 EcoRI 및 SacI로 소화되었고, 그 뒤에 동일한 효소 소화되어 플라스미드 pDE033을 생성한 pSE380과의 결찰이 이어졌다. pDE033에서의 dapAC352T 유전자는 IPTG-유도성 프로머터 Ptre 하에 있다. 플라스미드 pDE033 및 pJB91(전술됨)은 MG1655 스트레인으로 형질변환되어 스트레인 MG 1655 [pDE033, pJB91]를 생성하였다. 스트레인 MG1655 및 MG1655 [pDEO33, pJB91]은 25 g/L 글루코오스, 16 g/L (NH4)2SO3, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4, 2 g/L 이스트 추출물(yeast extract), 30 g/L CaCO3, 0.1 mM IPTG, 및 전술된 트레이스 요소들 포함한 매질에서 30℃에서 300 rpm으로 48h 동안의 진동으로 인큐베이트되었다. MG1655 [pDE033, pJB91]에 대한 배양 매질은 100㎍/mL 암피실린 및 25㎍/mL 클로람페니콜로 보충되었다. 글루타레이트는 실험예 7에서 설명된 바와 같이 측정되었다. 표 13에 도시된 데이터는 MG 1655 [pDE033, pJB91]가 0.7 g/L 글루타레이트를 매질 내로 숨겨졌고, 음성 제어 스트레인 MG1655가 어떠한 글루타레이트도 생성하지 않았다는 것을 입증한다. 이 결과는, GSA 디하이드로제나아제를 인코딩하는 호스트 세포에서 L-리신을 GSA로 전환하도록 하는 davBAT 오페론과 함께, 피드백-내생 dapA 유전자를 이용하여 L-리신을 축적하는 것은 단독 카본 소스로서 글루코오스로부터 글루타레이트를 생성하는 데 충분하다는 것을 명백히 보여 준다.
[표 13] 글루코오스로부터의 글루타레이트의 생산
Figure pat00040

실험예 13: 소듐 5-히드록시발레레이트 스트레인 구조로부터의 4,5-펜탄디올 생합성
스트레인 MBX3017 (LS5218 ΔadhE::FRT, ΔldhA::FRT, ΔackA-pta::FRT) 및 K-12 스트레인 MGl655는 1 ,5-펜탄디올(PDO)이 매질 내로 축적되고 숨겨질 수 있다면 액세스할 호스트 스트레인으로서 사용되었다. 각각의 단일 삭제 스트레인은 유전자 브리지로부터 Red/ET 방법에 의해 구성되었다. 3개의 경로에 대한 녹-아웃 카세트를 구성하기 위한 프리머는 표 14에 열거된다. 간단히 말해, 다음의 프리머가 다양한 염색체 삭제의 구성에 이용되었다: ΔadhE 카세트에 대해 MS286 및 MS287; ΔackA-pta 카세트에 대해 MS289 및 MS290; 및 ΔldhA 카세트에 대해 MS292 및 MS293. LS5218 ΔadhE:FRT, ΔldhA::FRT, ΔackA-pta::FRT는 각각의 단일 널 돌연변이를 반복적으로 P1 형질도입하고 앞선 실험예들에서 설명된 바와 같이 표지자를 제거함으로써 얻어졌다.
[표 14] PDO 연구에 이용되는 프리머
Figure pat00041
S. 티피뮤리움(typhimurium)으로부터 pduP를 인코딩하는 CoA-의존 프로피온알데하이드 디하이드로제나아제(able 1A 참조; Leal, Arch. Microbiol. 180:353-361 (2003))는 프리머 JFG47 및 JRG48에 의해 증폭되었다. 클렙시엘라 현상(Klebsiella pneumoniae)으로부터 dhaT를 인코딩하는 1,3-프로만디올 디하이드로제나아제(Table 1A 참조; Tong 등의 Appl. Environ. Microbiol. 57(12):3541-3546 (1991))는 프리머 JRG49 및 JRG50으로 증폭되었다. 2개의 유전자는 프리머 JRG47 및 JRG50을 이용하여 SOE-PCR에 의해 함께 융합되었다. 최종 생성 DNA 프라그먼트는 BamHI 및 BspHI 지역을 통해 pJB78 내로 클론화되었고, 최종 생성 플라스미드는 pJG10으로 지정되었다.
pFS16 또는 pSE380 및 pJGlO 또는 pJB78을 숨기는 스트레인 MBX3017 또는 MG1655는 PDO 연구에 이용되었다.
스트레인은 40h 동안 E2 매질을 포함하는 5HV에서 산소 제한 조건 하에서 성장되었다. 매질은 10g/L 글루코오스글루코오스글루코오스M NaNH4HPO4, 33 mM K2HPO4, 27 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 25 ㎍/mL 클로람페니콜, 100 ㎍/mL 암피실린, 0.1 mM IPTG, 및 전술된 트레이스 요소들로 구성되었다. 야간 배양은 프레시 매질을 대략 0.2의 최종 OD600까지 후레시 매질을 포함하는 밀봉된 배양관 내에 접종되었으며, 배양관의 공간부분은 배양의 산소 한도를 보증할 정도로 작았다. 배양은 30℃에서 인큐베이트되었다. 48h의 인큐베이션 후, 100μL 샘플이 제거되었고, 원심분리되었으며, 최종 생성 상청액은 내부 표준으로서 1,4-뷰탄디올(butanediol) (0.1 g/L)로 스파이크되었고, Labconco centrivap에서 건조되었으며, 3h 동안 음파처리에 의해 100 μL 아세토나이트릴(ACN)에서 재부유되었다. 아세토나이트릴 용액은 불용성 물질을 제거하도록 원심분리되었고, 상청액은 다음의 수집 파라미터를 이용하여 DB-225ms 컬럼을 갖춘 Agilent 5975 GC-MS 내로 주입되었다: 전달 가스 헬륨 유속 1 ml/min, 스캔 모드 m/z 30-400, 오븐 프로그램(oven program): 2분 동안 40℃, 이후에 10℃/min로 220℃까지 상승시킴, 이온 소스 온도(ion source temperature) 230℃, 4중극자(quadrupole) 질량 필터 온도 150℃.
측정된 PDO 결과는 표 14에 도시되어 있다. 호스트 스트레인 MBX3017과 orfZ-dhaT-pduP의 과도발현의 조합은 0.32 g/L의 최고 PDO 수율을 제공하였다. 이러한 3개의 유전자를 숨기는 스트레인 MGl655는, 가능하게는 전자 억셉터(Clark, FEMS Microbiol. Rev. 5:223-34 (1989))로 알려져 있고 NAD(P)H에 대한 5HV 경로와 경쟁할 수 있는 그것의 활성 에탄올, 아세테이트 및 락테이트 경로로 인해, 0.22 g/L의 보다 낮은 수율을 제공하였다. 흥미롭게도, orfZ만을 숨기는 MG1655도 적은 양의 PDO를 생성하였고, 한편으로 MBX3017 호스트는 어떠한 탈착가능 PDO도 산출하지 않았다(표 15). 이것은 내생 알콜 디하이드로제나아제, 예컨대 adhE가 5HV-CoA를 향해 약한 활동도를 갖는다는 것을 나타낸다. 측정된 PDO는 도 8에 도시된 바와 같은 PDO 표준 및 NIST 라이브러리 PDO 기준 스펙트럼에 대비하여 GC-MSd 의해 확인되었다. 이러한 결과는, orfZ 유전자가 5HV-CoA를 생성하도록 발현되고 pduP-dhaT 유전자가 5HV-CoA를 5-히드록시펜테날(hydroxypentenal) 및 PDO로 전환하도록 발현될 때, PDO가 NaSHV로부터 생성될 수 있다는 것을 입증한다.
[표 15] 매질a을 포함하는 5HV에서 성장된 스트레인의 PDO 타이터(titer)
Figure pat00042
a결과는 3개의 독립적 복제 실험의 평균이다
유전자 ID 001 뉴클레오티드 서열: 아스페르질루스 테레우스(Aspergillus terreus) NIH2624 글루타레이트 세미알데히드 환원효소 유전자 gsaRAt2
Figure pat00043
유전자 ID 001 아미노산 서열: 아스페르질루스 테레우스(Aspergillus terreus) NIH2624 글루타레이트 세미알데히드 환원효소 유전자 gsaRAt2
Figure pat00044
유전자 ID 002 뉴클레오티드 서열: Arabidopsis thaliana 글루타레이트 세미알데히드 환원효소 유전자 gsaRAt
Figure pat00045

유전자 ID 002 아미노산 서열: Arabidopsis thaliana 글루타레이트 세미알데히드 환원효소 유전자 gsaRAt
Figure pat00046
유전자 ID 003 뉴클레오티드 서열: Pseudomonas putidaiZoogloea ramigera
20 폴리하이드록시알카노에이트 신타제 혼합 유전자 phaC3/C5
Figure pat00047

유전자 ID 003 아미노산 서열: Pseudomonas putidaiZoogloea ramigera
20 폴리하이드록시알카노에이트 신타제 혼합 유전자 phaC3/C5
Figure pat00048

유전자 ID 004 뉴클레오티드 서열: Thiocapsa phenigii
폴리하이드록시알카노에이트 신타제 subunit phaE
Figure pat00049

유전자 ID 004 아미노산 서열: Thiocapsa phenigii 폴리하이드록시알카노에이트 신타제 subunit phaE
Figure pat00050
유전자 ID 005 뉴클레오티드 서열: Thiocapsa phenigii 폴리하이드록시알카노에이트 신타제 subunit phaC
Figure pat00051

유전자 ID 005 아미노산 서열: Thiocapsa phenigii 폴리하이드록시알카노에이트 신타제 subunit phaC
Figure pat00052
SEQUENCE LISTING <110> FARMER, WILLIAM R BICKMEIER, JEFF LU, CHENFENG CHANG, DONG-EUN SKRALY, FRANK RAMSEIER, TOM M <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING POLY(5HV) AND 5 CARBON CHEMICALS <130> MBX 067 <150> US 61/122,250 <151> 2008-12-12 <160> 65 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic FS-E5' primer <400> 1 ggaattcagg aggtttttat gaacgatacg gccaacaaga ccagc 45 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic FS-E3' Primer <400> 2 ggggtacctc actggccggt ggtgggcttg gtggtcttgc ggcg 44 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic FS-C5' Primer <400> 3 ggggtaccag gaggttttta tgtccccatt cccgatcgac atccg 45 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic FS-C3' Primer <400> 4 cgggatcctc agccgcgttc gttcagccag cggccgatcg ccg 43 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic K5-1 5' Primer <400> 5 gctgaggatc caggaggttt ttatgttagg tcagatgatg cgtaatc 47 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer K3-1 <400> 6 ctagaggatc cttattcaca gacagaagaa ctactg 36 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer K5-2 <400> 7 aattcaggag gtttttatgt taggtcagat gatgcgtaat c 41 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer K3-2 <400> 8 gatccttatt cacagacaga agaactactg 30 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer Posynrbs.c <400> 9 ggaattcagg aggtttttat gttaggtcag atgatgcgta atcag 45 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer Posynrbs.r <400> 10 cgggatcctt attcacagac agaagaacta ctgcg 35 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer A.eut.PhaG.c <400> 11 ggaattcgga tcccaagtac cttgccgaca tctatgcgct ggc 43 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer A.eut.EcoRI.r <400> 12 ggaattcccg gctccgggat tgccctggcc ggact 35 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS069 <400> 13 ggtggatcct taagaggagg tttttatgac gcgtgaagtg gtagtgg 47 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS070 <400> 14 ggtgctagct cagatacgct cgaagatggc g 31 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS071 <400> 15 ggtcctaggt taagaggagg tttttatgac aacattacaa ggtaaag 47 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS072 <400> 16 ggtgcggccg cttacatgta taagccgccg ttaat 35 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB123b <400> 17 ttatttcatg aaccctcgaa ttgacgcgct c 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB124a <400> 18 ttatttcatg agcttatcga taccgtcgac c 31 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB134 <400> 19 tgagcggata acaatttcac 20 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB135 <400> 20 aataacacgt caacgcaaaa aggccatccg t 31 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB136 <400> 21 tttttcatat gaggaggttt ttatgaacaa gaagaaccgc ca 42 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB137 <400> 22 ttttttgtac atcagccttt acgcaggtgc a 31 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB138 <400> 23 tatatactag taggaggata atatgagcaa aaccaacgaa tc 42 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB139 <400> 24 tttttgtgca ctcaggcgat ttcagcgaag c 31 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JB145 <400> 25 tttttagatc taggaggttt ttatgctgcg tgctgcttct cg 42 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer JB146 <400> 26 tttttagatc tttagcggaa atagtttgga c 31 <210> 27 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer RF314 <400> 27 gcaagccaga gtaaccccgg acgcacgctg cgagcggcac gtagtgtgga tgccttacac 60 gccgcattta atcaataacc ttgagcgatt gtgtaggctg gagctgctt 109 <210> 28 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer RF315 <400> 28 gaatttgccc aacgccacgg ggaatcgcct gactgcggcg ctgcattaac tctttattgc 60 tgttcattcg cattctccag atgggaatta gccatggtcc atatgaatat 110 <210> 29 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS220 <400> 29 gcaagagtaa atctgcgtat cttcatacca tgactcataa aggagatacc ccggtgtagg 60 ctggagctgc ttc 73 <210> 30 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS217 <400> 30 accgcaggtc tgaaaagacc tgcgagtata tcagagctga atatgtcgcg catatgaata 60 tcctccttag t 71 <210> 31 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS223 <400> 31 tcgattcgtg aataagtggc ttaatattat tcattttaaa gcaagagtaa atctgcgtat 60 c 61 <210> 32 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS224 <400> 32 gccactttct actcctggac cgcaggtctg aaaagacctg cgagtatatc agagctg 57 <210> 33 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE081 <400> 33 aaaagaattc ttaattaatt ctagaaggag gtttcatatg ttcacgggaa gtattgtc 58 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE082 <400> 34 agcgatggct ttgaaatact gatacaaacc ttc 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE083 <400> 35 gaaggtttgt atcagtattt caaagccatc gct 33 <210> 36 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer DE084 <400> 36 cccgagctcg tttaaactta attaagacta gttttacagc aaaccggcat gctt 54 <210> 37 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA fragment <400> 37 tttttctaga ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcactag tgtttaaacc 60 ccc 63 <210> 38 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE118 <400> 38 tgtcccatgt gttgggaggg gcctttttta cctggagata tgactgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 39 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE119 <400> 39 tgtcccatgt gttgggaggg gcctttttta cctggagata tgactgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 40 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE122 <400> 40 gtttgagcag gctatgatta aggaaggatt ttccaggagg aacacgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 41 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE123 <400> 41 tatttgttaa cagcacgtta ctcgcccgga agccgctctg gcaagatggg aattagccat 60 ggtcc 65 <210> 42 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE106 <400> 42 gtgttttctt attactttca aggtcttgca cttggggcgg ctatggtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer DE107 <400> 43 ctaactgaac aaggcttgtg catgagcaat accgtctctc gccagatggg aattagccat 60 ggtcc 65 <210> 44 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS286 <400> 44 ccgtttatgt tgccagacag cgctactgat taagcggatt ttttcgcttt catatgaata 60 tcctccttag t 71 <210> 45 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS287 <400> 45 cgagcagatg atttactaaa aaagtttaac attatcagga gagcattatg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 46 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS289 <400> 46 tggctccctg acgttttttt agccacgtat caattatagg tacttccatg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 47 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS290 <400> 47 gcagcgcaaa gctgcggatg atgacgagat tactgctgct gtgcagactg catatgaata 60 tcctccttag t 71 <210> 48 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS292 <400> 48 ctcccctgga atgcagggga gcggcaagat taaaccagtt cgttcgggca catatgaata 60 tcctccttag t 71 <210> 49 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer MS293 <400> 49 tatttttagt agcttaaatg tgattcaaca tcactggaga aagtcttatg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 50 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer FS011 <400> 50 tcccctagga ttcaggaggt ttttatggag tgggaagaga tatataaa 48 <210> 51 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer FS008 <400> 51 ccttaagtcg acaaattcta aaatctcttt ttaaattc 38 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JRG047 <400> 52 ttcaggatcc tgcgcatgct agctatagtt ctagaggta 39 <210> 53 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JRG048 <400> 53 catacgatag ctcataaaaa cctcctcgca gttagcgaat agaaaagccg ttg 53 <210> 54 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syntheti Primer JRG049 <400> 54 gaggaggttt ttatgagcta tcgtatgagc tatcgtatgt ttgattatct ggtgc 55 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer JRG050 <400> 55 tctttcatga actcagaatg cctggcggaa aatcg 35 <210> 56 <211> 1053 <212> DNA <213> Aspergillus terreus <400> 56 atgccactgg ttgctcaaaa tccactgcca cgtgctattc tgggtctgat gactttcggt 60 ccgagcgaaa gcaaaggtgc gcgtatcact tccctggatg agtttaacaa gtgcctggat 120 tacttccagc agcagggctt ccaggaaatc gataccgcgc gcatctacgt cggcggtgaa 180 caggaggcat tcacggcgca ggcaaagtgg aaagaacgcg gcctgacgct ggcgactaag 240 tggtatccgc agtacccggg tgcgcacaaa ccggatgtcc tgcgtcagaa cctggagctg 300 tccctgaaag aactgggcac gaaccaggtc gatatcttct atctgcacgc cgcggatcgt 360 tctgtgccgt tcgcggaaac tctggaaact gttaacgaac tgcacaaaga aggcaaattt 420 gttcagctgg gtctgtctaa ctacaccgct ttcgaagtag ctgaaatcgt gaccctgtgt 480 aacgagcgtg gttgggttcg tccgactatc taccaggcga tgtataacgc tatcacccgt 540 aacatcgaaa ctgaactgat cccggcgtgc aagcgttacg gtattgacat tgttatctac 600 aacccactgg cgggtggcct gttcagcggc aaatacaaag cacaggacat cccggctgaa 660 ggtcgttaca gcgaccaatc ttccatgggc cagatgtacc gcaaccgtta ctttaaggac 720 gcaacctttg acgctctgcg cctgatcgaa ccggttgttg cgaagcacgg cctgacgatg 780 ccggaaaccg cgttccgctg ggtccaccac cactccgcac tgaacatgga agatggcggc 840 cgtgacggca tcattctggg tgtaagcagc ctggctcagc tggaaaacaa cctgaaagac 900 attcagaaag gtccgctgcc gcaggaggtt gtagacgtcc tggatcaggc ttggctggtg 960 gctaagccga cggctccaaa ctactggcat ctggacctga aatacacgta cgacacccag 1020 gaagctctgt tcaaaccgaa atctaaggcg taa 1053 <210> 57 <211> 350 <212> PRT <213> Aspergillus terreus <400> 57 Met Pro Leu Val Ala Gln Asn Pro Leu Pro Arg Ala Ile Leu Gly Leu 1 5 10 15 Met Thr Phe Gly Pro Ser Glu Ser Lys Gly Ala Arg Ile Thr Ser Leu 20 25 30 Asp Glu Phe Asn Lys Cys Leu Asp Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Phe Gln 35 40 45 Glu Ile Asp Thr Ala Arg Ile Tyr Val Gly Gly Glu Gln Glu Ala Phe 50 55 60 Thr Ala Gln Ala Lys Trp Lys Glu Arg Gly Leu Thr Leu Ala Thr Lys 65 70 75 80 Trp Tyr Pro Gln Tyr Pro Gly Ala His Lys Pro Asp Val Leu Arg Gln 85 90 95 Asn Leu Glu Leu Ser Leu Lys Glu Leu Gly Thr Asn Gln Val Asp Ile 100 105 110 Phe Tyr Leu His Ala Ala Asp Arg Ser Val Pro Phe Ala Glu Thr Leu 115 120 125 Glu Thr Val Asn Glu 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Ala Leu Phe Lys Pro Lys Ser Lys Ala 340 345 350 <210> 58 <211> 870 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 58 atggaagtag gttttctggg tctgggcatt atgggtaaag ctatgtccat gaacctgctg 60 aaaaacggtt tcaaagttac cgtgtggaac cgcactctgt ctaaatgtga tgaactggtt 120 gaacacggtg caagcgtgtg cgagtctccg gctgaggtga tcaagaaatg caaatacacg 180 atcgcgatgc tgagcgatcc gtgtgcagct ctgtctgttg ttttcgataa aggcggtgtt 240 ctggaacaga tctgcgaggg taagggctac atcgacatgt ctaccgtcga cgcggaaact 300 agcctgaaaa ttaacgaagc gatcacgggc aaaggtggcc gttttgtaga aggtcctgtt 360 agcggttcca aaaagccggc agaagacggc cagctgatca tcctggcagc aggcgacaaa 420 gcactgttcg aggaatccat cccggccttt gatgtactgg gcaaacgttc cttttatctg 480 ggtcaggtgg gtaacggtgc gaaaatgaaa ctgattgtta acatgatcat gggttctatg 540 atgaacgcgt ttagcgaagg tctggtactg gcagataaaa gcggtctgtc tagcgacacg 600 ctgctggata ttctggatct gggtgctatg acgaatccga tgttcaaagg caaaggtccg 660 tccatgacta aatccagcta cccaccggct ttcccgctga aacaccagca gaaagacatg 720 cgtctggctc tggctctggg cgacgaaaac gctgttagca tgccggtcgc tgcggctgcg 780 aacgaagcct tcaagaaagc ccgtagcctg ggcctgggcg atctggactt ttctgctgtt 840 atcgaagcgg taaaattctc tcgtgaataa 870 <210> 59 <211> 289 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 59 Met Glu Val Gly Phe Leu Gly Leu Gly Ile Met Gly Lys Ala Met Ser 1 5 10 15 Met Asn Leu Leu Lys Asn Gly Phe Lys Val Thr Val Trp Asn Arg Thr 20 25 30 Leu Ser Lys Cys Asp Glu Leu Val Glu His Gly Ala Ser Val Cys Glu 35 40 45 Ser Pro Ala Glu Val Ile Lys Lys Cys Lys Tyr Thr Ile Ala Met Leu 50 55 60 Ser Asp Pro Cys Ala Ala Leu Ser Val Val Phe Asp Lys Gly Gly Val 65 70 75 80 Leu Glu Gln Ile Cys Glu Gly Lys Gly Tyr Ile Asp Met Ser Thr Val 85 90 95 Asp Ala Glu Thr Ser Leu Lys Ile Asn Glu Ala Ile Thr Gly Lys Gly 100 105 110 Gly Arg Phe Val Glu Gly Pro Val Ser Gly Ser Lys Lys Pro Ala Glu 115 120 125 Asp Gly Gln Leu Ile Ile Leu Ala Ala Gly Asp Lys Ala Leu Phe Glu 130 135 140 Glu Ser Ile Pro Ala Phe Asp Val Leu Gly Lys Arg Ser Phe Tyr Leu 145 150 155 160 Gly Gln Val Gly Asn Gly Ala Lys Met Lys Leu Ile Val Asn Met Ile 165 170 175 Met Gly Ser Met Met Asn Ala Phe Ser Glu Gly Leu Val Leu Ala Asp 180 185 190 Lys Ser Gly Leu Ser Ser Asp Thr Leu Leu Asp Ile Leu Asp Leu Gly 195 200 205 Ala Met Thr Asn Pro Met Phe Lys Gly Lys Gly Pro Ser Met Thr Lys 210 215 220 Ser Ser Tyr Pro Pro Ala Phe Pro Leu Lys His Gln Gln Lys Asp Met 225 230 235 240 Arg Leu Ala Leu Ala Leu Gly Asp Glu Asn Ala Val Ser Met Pro Val 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Asn Glu Ala Phe Lys Lys Ala Arg Ser Leu Gly Leu 260 265 270 Gly Asp Leu Asp Phe Ser Ala Val Ile Glu Ala Val Lys Phe Ser Arg 275 280 285 Glu <210> 60 <211> 1680 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Pseudomonas putida/Zoogloea ramigera polyhydroxyalkanoate synthase fusion gene phaC3/C5 <400> 60 atgagtaaca agaacaacga tgagctgcag tggcaatcct ggttcagcaa ggcgcccacc 60 accgaggcga acccgatggc caccatgttg caggatatcg gcgttgcgct caaaccggaa 120 gcgatggagc agctgaaaaa cgattatctg cgtgacttca ccgcgttgtg gcaggatttt 180 ttggctggca aggcgccagc cgtcagcgac cgccgcttca gctcggcagc ctggcagggc 240 aatccgatgt cggccttcaa tgccgcatct tacctgctca acgccaaatt cctcagtgcc 300 atggtggagg cggtggacac cgcaccccag caaaagcaga aaatacgctt tgccgtgcag 360 caggtgattg atgccatgtc gcccgcgaac ttcctcgcca ccaacccgga agcgcagcaa 420 aaactgattg aaaccaaggg cgagagcctg acgcgtggcc tggtcaatat gctgggcgat 480 atcaacaagg gccatatctc gctgtcggac gaatcggcct ttgaagtggg ccgcaacctg 540 gccattaccc cgggcaccgt gatttacgaa aatccgctgt tccagctgat ccagtacacg 600 ccgaccacgc cgacggtcag ccagcgcccg ctgttgatgg tgccgccgtg catcaacaag 660 ttctacatcc tcgacctgca accggaaaat tcgctggtgc gctacgcggt ggagcagggc 720 aacaccgtgt tcctgatctc gtggagcaat ccggacaagt cgctggccgg caccacctgg 780 gacgactacg tggagcaggg cgtgatcgaa gcgatccgca tcgtccagga cgtcagcggc 840 caggacaagc tgaacatgtt cggcttctgc gtgggcggca ccatcgttgc caccgcactg 900 gcggtactgg cggcgcgtgg ccagcacccg gcggccagcc tgaccctgct gaccaccttc 960 ctcgacttca gcgacaccgg cgtgctcgac gtcttcgtcg atgaaaccca ggtcgcgctg 1020 cgtgaacagc aattgcgcga tggcggcctg atgccgggcc gtgacctggc ctcgaccttc 1080 tcgagcctgc gtccgaacga cctggtatgg aactatgtgc agtcgaacta cctcaaaggc 1140 aatgagccgg cggcgtttga cctgctgttc tggaattcgg acagcaccaa tttgccgggc 1200 ccgatgttct gctggtacct gcgcaacacc tacctggaaa acagcctgaa agtgccgggc 1260 aagctgacgg tggccggcga aaagatcgac ctcggcctga tcgacgcccc ggccttcatc 1320 tacggttcgc gcgaagacca catcgtgccg tggatgtcgg cgtacggttc gctcgacatc 1380 ctcaaccagg gcaagccggg cgccaaccgc ttcgtgctgg gcgcgtccgg ccatatcgcc 1440 ggcgtgatca actcggtggc caagaacaag cgcagctact ggatcaacga cggtggcgcc 1500 gccgatgccc aggcctggtt cgatggcgcg caggaagtgc cgggcagctg gtggccgcaa 1560 tgggccgggt tcctgaccca gcatggcggc aagaaggtca agcccaaggc caagcccggc 1620 aacgcccgct acaccgcgat cgaggcggcg cccggccgtt acgtcaaagc caagggctga 1680 <210> 61 <211> 559 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Amino Acid Sequence: Pseudomonas putida/Zoogloea ramigera polyhydroxyalkanoate synthase fusion gene PhaC3/C5 <400> 61 Met Ser Asn Lys Asn Asn Asp Glu Leu Gln Trp Gln Ser Trp Phe Ser 1 5 10 15 Lys Ala Pro Thr Thr Glu Ala Asn Pro Met Ala Thr Met Leu Gln Asp 20 25 30 Ile Gly Val Ala Leu Lys Pro Glu Ala Met Glu Gln Leu Lys Asn Asp 35 40 45 Tyr Leu Arg Asp Phe Thr Ala Leu Trp Gln Asp Phe Leu Ala Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Ala Val Ser Asp Arg Arg Phe Ser Ser Ala Ala Trp Gln Gly 65 70 75 80 Asn Pro Met Ser Ala Phe Asn Ala Ala Ser Tyr Leu Leu Asn Ala Lys 85 90 95 Phe Leu Ser Ala Met Val Glu Ala Val Asp Thr Ala Pro Gln Gln Lys 100 105 110 Gln Lys Ile Arg Phe Ala Val Gln Gln Val Ile Asp Ala Met Ser Pro 115 120 125 Ala Asn Phe Leu Ala Thr Asn Pro Glu Ala Gln Gln Lys Leu Ile Glu 130 135 140 Thr Lys Gly Glu Ser Leu Thr Arg Gly Leu Val Asn Met Leu Gly Asp 145 150 155 160 Ile Asn Lys Gly His Ile Ser Leu Ser Asp Glu Ser Ala Phe Glu Val 165 170 175 Gly Arg Asn Leu Ala Ile Thr Pro Gly Thr Val Ile Tyr Glu Asn Pro 180 185 190 Leu Phe Gln Leu Ile Gln Tyr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Val Ser Gln 195 200 205 Arg Pro Leu Leu Met Val Pro Pro Cys Ile Asn Lys Phe Tyr Ile Leu 210 215 220 Asp Leu Gln Pro Glu Asn Ser Leu Val Arg Tyr Ala Val Glu Gln Gly 225 230 235 240 Asn Thr Val Phe Leu Ile Ser Trp Ser Asn Pro Asp Lys Ser Leu Ala 245 250 255 Gly Thr Thr Trp Asp Asp Tyr Val Glu Gln Gly Val Ile Glu Ala Ile 260 265 270 Arg Ile Val Gln Asp Val Ser Gly Gln Asp Lys Leu Asn Met Phe Gly 275 280 285 Phe Cys Val Gly Gly Thr Ile Val Ala Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala 290 295 300 Ala Arg Gly Gln His Pro Ala Ala Ser Leu Thr Leu Leu Thr Thr Phe 305 310 315 320 Leu Asp Phe Ser Asp Thr Gly Val Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Thr 325 330 335 Gln Val Ala Leu Arg Glu Gln Gln Leu Arg Asp Gly Gly Leu Met Pro 340 345 350 Gly Arg Asp Leu Ala Ser Thr Phe Ser Ser Leu Arg Pro Asn Asp Leu 355 360 365 Val Trp Asn Tyr Val Gln Ser Asn Tyr Leu Lys Gly Asn Glu Pro Ala 370 375 380 Ala Phe Asp Leu Leu Phe Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Leu Pro Gly 385 390 395 400 Pro Met Phe Cys Trp Tyr Leu Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Asn Ser Leu 405 410 415 Lys Val Pro Gly Lys Leu Thr Val Ala Gly Glu Lys Ile Asp Leu Gly 420 425 430 Leu Ile Asp Ala Pro Ala Phe Ile Tyr Gly Ser Arg Glu Asp His Ile 435 440 445 Val Pro Trp Met Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Asp Ile Leu Asn Gln Gly 450 455 460 Lys Pro Gly Ala Asn Arg Phe Val Leu Gly Ala Ser Gly His Ile Ala 465 470 475 480 Gly Val Ile Asn Ser Val Ala Lys Asn Lys Arg Ser Tyr Trp Ile Asn 485 490 495 Asp Gly Gly Ala Ala Asp Ala Gln Ala Trp Phe Asp Gly Ala Gln Glu 500 505 510 Val Pro Gly Ser Trp Trp Pro Gln Trp Ala Gly Phe Leu Thr Gln His 515 520 525 Gly Gly Lys Lys Val Lys Pro Lys Ala Lys Pro Gly Asn Ala Arg Tyr 530 535 540 Thr Ala Ile Glu Ala Ala Pro Gly Arg Tyr Val Lys Ala Lys Gly 545 550 555 <210> 62 <211> 1152 <212> DNA <213> Thiocapsa phenigii <400> 62 atggctggtg accacgtcgt ggaatgcctt cgaattcagg aggtttttat gaacgatacg 60 gccaacaaga ccagcgactg gctggacatc caacgcaagt actgggagac ctggtcggag 120 ctcggccgca agaccttggg tctggagaag accccggcca atccttgggc cggcgccctc 180 gatcattggt ggcagacggt ctcgcccgcc gcccccaacg acctggttcg cgacttcatg 240 gagaagctcg ccgagcaggg caaggccttc ttcggcctca ccgactactt cacgaagggc 300 ctcggcggca gtagcggtac gcagggctgg gacaccctct cgaagaccat cgacgacatg 360 caaaaggcct tcgccagcgg ccggatcgaa ggcgacgaga ccttccgccg cctgatggcc 420 ttctgggaga tgccgctcga caactggcag cgcaccatgt cctcgctgtc cccggtgccc 480 ggcgacctgc tgcgcaacat gccgcacgac caagtcaggg acagcgtcga ccgcatcctc 540 tcggcacccg ggctcggcta cacgcgcgag gagcaggccc gctaccagga tctgatccgc 600 cgctcgctgg agtaccagtc ggccctgaac gaatacaacg gcttcttcgg ccagctcggt 660 gtcaagtccc tcgagcggat gcgcgccttc ctgcagggac aggccgagaa gggcgtcgcc 720 atcgagtcgg cgcgcaccct ctacgacgcc tgggtcggct gctgcgaaga ggtctatgcc 780 gaggaggtca gctccgccga ctacgcgcac atccacggcc gcctcgtcaa cgcccagatg 840 gccctcaagc agcgcatgtc gaccatggtc gacgaggtcc tcggcgcgat gccgctgccg 900 acccgcagcg agctgcgcac gctccaggat cggctccagg agtcgcgcgg cgagggcaag 960 cgccagcgcc aagagatcga gacgctgaag cggcaggtcg cggccttggc cggcggcgcc 1020 cagcccgcgc cccaggcctc cgcccagccc agcacccggc ccgcgccggc gacggccccg 1080 gcggcgagcg cggcgcccaa gcgcagcacc acgacccgcc gcaagaccac caagcccacc 1140 accggccagt ga 1152 <210> 63 <211> 367 <212> PRT <213> Thiocapsa phenigii <400> 63 Met Asn Asp Thr Ala Asn Lys Thr Ser Asp Trp Leu Asp Ile Gln Arg 1 5 10 15 Lys Tyr Trp Glu Thr Trp Ser Glu Leu Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu 20 25 30 Glu Lys Thr Pro Ala Asn Pro Trp Ala Gly Ala Leu Asp His Trp Trp 35 40 45 Gln Thr Val Ser Pro Ala Ala Pro Asn Asp Leu Val Arg Asp Phe Met 50 55 60 Glu Lys Leu Ala Glu Gln Gly Lys Ala Phe Phe Gly Leu Thr Asp Tyr 65 70 75 80 Phe Thr Lys Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Thr Gln Gly Trp Asp Thr 85 90 95 Leu Ser Lys Thr Ile Asp Asp Met Gln Lys Ala Phe Ala Ser Gly Arg 100 105 110 Ile Glu Gly Asp Glu Thr Phe Arg Arg Leu Met Ala Phe Trp Glu Met 115 120 125 Pro Leu Asp Asn Trp Gln Arg Thr Met Ser Ser Leu Ser Pro Val Pro 130 135 140 Gly Asp Leu Leu Arg Asn Met Pro His Asp Gln Val Arg Asp Ser Val 145 150 155 160 Asp Arg Ile Leu Ser Ala Pro Gly Leu Gly Tyr Thr Arg Glu Glu Gln 165 170 175 Ala Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Arg Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Ser Ala 180 185 190 Leu Asn Glu Tyr Asn Gly Phe Phe Gly Gln Leu Gly Val Lys Ser Leu 195 200 205 Glu Arg Met Arg Ala Phe Leu Gln Gly Gln Ala Glu Lys Gly Val Ala 210 215 220 Ile Glu Ser Ala Arg Thr Leu Tyr Asp Ala Trp Val Gly Cys Cys Glu 225 230 235 240 Glu Val Tyr Ala Glu Glu Val Ser Ser Ala Asp Tyr Ala His Ile His 245 250 255 Gly Arg Leu Val Asn Ala Gln Met Ala Leu Lys Gln Arg Met Ser Thr 260 265 270 Met Val Asp Glu Val Leu Gly Ala Met Pro Leu Pro Thr Arg Ser Glu 275 280 285 Leu Arg Thr Leu Gln Asp Arg Leu Gln Glu Ser Arg Gly Glu Gly Lys 290 295 300 Arg Gln Arg Gln Glu Ile Glu Thr Leu Lys Arg Gln Val Ala Ala Leu 305 310 315 320 Ala Gly Gly Ala Gln Pro Ala Pro Gln Ala Ser Ala Gln Pro Ser Thr 325 330 335 Arg Pro Ala Pro Ala Thr Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg 340 345 350 Ser Thr Thr Thr Arg Arg Lys Thr Thr Lys Pro Thr Thr Gly Gln 355 360 365 <210> 64 <211> 1074 <212> DNA <213> Thiocapsa phenigii <400> 64 atgtccccat tcccgatcga catccggccc gacaagctga ccgaggagat gctggagtac 60 agccgcaagc tcggcgaggg tatgcagaac ctgctcaagg ccgaccagat cgacacaggc 120 gtcaccccca aggacgtcgt ccaccgcgag gacaagctgg tcctctaccg ctaccggcgc 180 ccggcgcagg tggcgaccca gacgatcccg ctgctgatcg tctacgccct cgtcaatcgg 240 ccctacatga ccgacatcca ggaggatcgc tcgacgatca agggcctgct cgccaccggt 300 caggacgtct atctgatcga ctggggctac ccggatcagg ccgaccgggc gctgaccctc 360 gatgactaca tcaacggcta catcgaccgc tgcgtcgact acctgcgcga gacccacggc 420 gtcgaccagg tcaacctgct cgggatctgc cagggcgggg ccttcagcct ctgctacacg 480 gccctgcact ccgagaaggt caaaaacctc gtcaccatgg tcacgccggt cgacttccag 540 accccgggca acctgctctc ggcctgggtc cagaacgtcg acgtcgacct ggccgtcgac 600 accatgggca acatcccggg cgaactgctc aactggacct tcctgtcgct caagcccttc 660 agcctgaccg gccagaagta cgtcaacatg gtcgacctgc tcgacgacga ggacaaggtc 720 aagaacttcc tgcggatgga gaagtggatc ttcgacagcc cggaccaggc cggcgagacc 780 ttccgccagt tcatcaagga cttctaccag cgcaacggct tcatcaacgg cggcgtcctg 840 atcggcgatc aggaggtcga cctgcgcaac atccgctgcc cggtcctgaa catctacccg 900 atgcaggacc acctggtgcc gccggatgcc tccaaggccc tcgcgggact gacctccagc 960 gaggactaca cggagctcgc cttccccggc gggcacatcg gcatctacgt cagcggcaag 1020 gcgcaggaag gagtcacccc ggcgatcggc cgctggctga acgaacgcgg ctga 1074 <210> 65 <211> 357 <212> PRT <213> Thiocapsa phenigii <400> 65 Met Ser Pro Phe Pro Ile Asp Ile Arg Pro Asp Lys Leu Thr Glu Glu 1 5 10 15 Met Leu Glu Tyr Ser Arg Lys Leu Gly Glu Gly Met Gln Asn Leu Leu 20 25 30 Lys Ala Asp Gln Ile Asp Thr Gly Val Thr Pro Lys Asp Val Val His 35 40 45 Arg Glu Asp Lys Leu Val Leu Tyr Arg Tyr Arg Arg Pro Ala Gln Val 50 55 60 Ala Thr Gln Thr Ile Pro Leu Leu Ile Val Tyr Ala Leu Val Asn Arg 65 70 75 80 Pro Tyr Met Thr Asp Ile Gln Glu Asp Arg Ser Thr Ile Lys Gly Leu 85 90 95 Leu Ala Thr Gly Gln Asp Val Tyr Leu Ile Asp Trp Gly Tyr Pro Asp 100 105 110 Gln Ala Asp Arg Ala Leu Thr Leu Asp Asp Tyr Ile Asn Gly Tyr Ile 115 120 125 Asp Arg Cys Val Asp Tyr Leu Arg Glu Thr His Gly Val Asp Gln Val 130 135 140 Asn Leu Leu Gly Ile Cys Gln Gly Gly Ala Phe Ser Leu Cys Tyr Thr 145 150 155 160 Ala Leu His Ser Glu Lys Val Lys Asn Leu Val Thr Met Val Thr Pro 165 170 175 Val Asp Phe Gln Thr Pro Gly Asn Leu Leu Ser Ala Trp Val Gln Asn 180 185 190 Val Asp Val Asp Leu Ala Val Asp Thr Met Gly Asn Ile Pro Gly Glu 195 200 205 Leu Leu Asn Trp Thr Phe Leu Ser Leu Lys Pro Phe Ser Leu Thr Gly 210 215 220 Gln Lys Tyr Val Asn Met Val Asp Leu Leu Asp Asp Glu Asp Lys Val 225 230 235 240 Lys Asn Phe Leu Arg Met Glu Lys Trp Ile Phe Asp Ser Pro Asp Gln 245 250 255 Ala Gly Glu Thr Phe Arg Gln Phe Ile Lys Asp Phe Tyr Gln Arg Asn 260 265 270 Gly Phe Ile Asn Gly Gly Val Leu Ile Gly Asp Gln Glu Val Asp Leu 275 280 285 Arg Asn Ile Arg Cys Pro Val Leu Asn Ile Tyr Pro Met Gln Asp His 290 295 300 Leu Val Pro Pro Asp Ala Ser Lys Ala Leu Ala Gly Leu Thr Ser Ser 305 310 315 320 Glu Asp Tyr Thr Glu Leu Ala Phe Pro Gly Gly His Ile Gly Ile Tyr 325 330 335 Val Ser Gly Lys Ala Gln Glu Gly Val Thr Pro Ala Ile Gly Arg Trp 340 345 350 Leu Asn Glu Arg Gly 355

Claims (13)

  1. 5-아미노펜타노에이트를 폴리하이드록시 알카노에이트(PHA), 5-탄소 모노머를 포함하는 폴리머, 또는 코폴리머로 변환시키도록 유전공학적으로 처리된 인간을 제외한 재조합 유기체이고,
    상기 재조합 유기체는, 리신을 PHA로 변환하기 위한 완전한 PHA 생합성 경로를 발현하도록 유전공학적으로 처리되고, 상기 재조합 유기체는, 리신에서 PHA를 생산하기 위한 하나 또는 하나 이상의 효소를 암화화하는 하나 또는 하나 이상의 유전자를 발현하도록 유전공학적으로 처리되고, 상기 효소는 리신 2-모노옥시게나제, EC 1.13.12.2; 5-아미노펜탄아미다제(델타-아미노발레르아미다제),EC 3.5.1.30; 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제(δ-아미노발레레이트 트랜스아미나제), EC 2.6.1.48; 숙시네이트 세미알데히드 환원효소(a.k.a.글루타레이트 세미알데히드 환원효소), EC 1.1.1.61; CoA-트랜스페라제, EC 2.8.3.14 ; 아실-CoA 합성효소,EC 6.2.1.3; 및 PHA 신타제;로 이루어진 군에서 선택되며,
    상기 5-아미노펜타노에이트는 5 탄소 모노머로 변환되며, 상기 5 탄소 모노머는 상기 재조합 유기체에 의해, 폴리머, 또는 코폴리머로 변환되는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 완전한 PHA 생합성 경로는 리신 2-모노옥시게나제, EC 1.13.12.2; 5-아미노펜탄아미다제(델타-아미노발레르아미다제),EC 3.5.1.30; 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제(δ-아미노발레레이트 트랜스아미나제), EC 2.6.1.48; 숙시네이트 세미알데히드 환원효소(a.k.a.글루타레이트 세미알데히드 환원효소), EC 1.1.1.61; CoA-트랜스페라제, EC 2.8.3.14; 아실-CoA 합성효소,EC 6.2.1.3; 및 PHA 신타제;를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 유기체는, β-케토아실-CoA티올라제, EC 2.3.1.9; 및 아세토아세틸-CoA 환원효소,EC 1.1.1.36;에서 선택된 하나 또는 하나 이상의 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 5 탄소 모노머는 5-하이드록시발레레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 PHA는 5-하이드록시발레레이트의 폴리머 또는 5-하이드록시발레레이트의 폴리머의 코폴리머인 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 유기체는 리신을 5-아미노펜타노에이트로 변환시키는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 유기체를 구성하는 데 사용된 유기체는 변형되지 않은 유기체에 비하여 상대적으로 리신을 과다생산하도록 변형된 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 유기체는 독성 리신 유사체 S-(2-아미노에틸) 시스테인에 대하여 저항성이 있고, 상기 재조합 유기체는 리신 피드백-내성 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 발현하고, 상기 재조합 유기체는 리신 피드백-저항성 아스파르테이트 키나아제 III을 발현하며, 상기 재조합 유기체는 리신 수송(export)을 억제하는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 유기체는 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소 활성을 감소시키거나 제거하기 위하여 변형되고, 상기 5 탄소 모노머는 글루타레이트가 아니며, 상기 글루타레이트 세미알데히드 탈수소효소는, davD, yneI, 및 gabD, 또는 그들의 상동체들로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 삭제하거나 방해함으로써 감소되거나 제거되는 것을 특징으로 하는 것을 재조합 유기체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 유기체는 5-하이드록시발레레이트를 5-하이드록시발레레이트 CoA 또는 1,5-펜탄디올로 변환시키고, 5-하이드록시발레레이트 CoA를, 폴리(5-하이드록시발레레이트) 또는 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-co-5HV), 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-5HV) 및 폴리(4-하이드록시부티레이트-co-5HV)에서 선택된 코폴리머로 변환시키는 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 유기체는 E.coli이거나 진핵생물의 유기체인 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  12. 리신에서 5-하이드록시벨레이트 모노머를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위한 인간을 제외한 재조합 유기체에 있어서,
    상기 재조합 유기체는,
    5-하이드록시벨레이트 모노머를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 생산하기 위하여, 리신 2-모노옥시게나제, EC 1.13.12.2; 5-아미노펜탄아미다제(델타-아미노발레르아미다제),EC 3.5.1.30; 5-아미노펜타노에이트 트랜스아미나제(δ-아미노발레레이트 트랜스아미나제), EC 2.6.1.48; 리신 다카르복실라아제, EC 4.1.1.18; 숙시네이트 세미알데히드 환원효소(a.k.a.글루타레이트 세미알데히드 환원효소), EC 1.1.1.61; CoA-트랜스페라제, EC 2.8.3.14; 아실-CoA 합성효소,EC 6.2.1.3; PHA 신타제; 로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 효소를 발현하기 위하여 유전공학적으로 처리된 것을 특징으로 하는 재조합 유기체.
  13. 5-탄소 기반 폴리하이드록시알카노에이트(PHA),그의 폴리머 또는 코폴리머를 생산하기 위한 방법이고,
    상기 방법은,
    제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 유전공학적으로 처리된 유기체에 리신 또는 다른 재생가능한 탄소공급원을 제공하는 단계를 포함하고,
    (i) 상기 재생가능한 탄소공급원은 녹말, 수크로오스, 글루코오스, 락토오스, 프럭토오스, 크실로오스, 말토오스, 아라비노오스 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고;
    (ii) 상기 폴리하이드록시알카노에이트는, 폴리(5-하이드록시벨레레이트), 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-co-5HV), 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-5HV),및 폴리(4-하이드록시부티레이트-co-5HV)를 포함하고,
    상기 방법은 용매 추출 또는 수성공정에 의해 폴리하이드록시알카노에이트, 그 폴리머 또는 코폴리머를 회복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
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