CN102317437B - 用于制备聚(5-羟基戊酸)和5碳化合物的绿色工艺和组合物 - Google Patents

用于制备聚(5-羟基戊酸)和5碳化合物的绿色工艺和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于产生聚羟基烷酸的重组宿主以及由可再生碳基质产生聚羟基烷酸的方法。还提供产生例如5-氨基戊酸(5AP)、5-羟基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5戊二醇(PDO)等5碳化合物的某些重组宿主。一个实施例提供一种重组宿主，其表达编码选自由聚羟基烷酸合成酶和5-羟基戊酸辅酶A(5HV-CoA)转移酶组成的群组的异源酶的基因，其中所述宿主产生含有5-羟基戊酸的聚合物。优选所述宿主表达聚羟基烷酸合成酶和5HV-CoA转移酶二者。所述宿主可以是原核宿主或真核宿主。优选的原核宿主是大肠杆菌。由所述重组宿主产生的聚合物可为5-羟基戊酸的均聚物或共聚物。优选的共聚物为聚(3-羟基丁酸-共-5-羟基戊酸)。

Description

用于制备聚(5-羟基戊酸)和5碳化合物的绿色工艺和组合物
技术领域
本发明大体上涉及产生含有5-羟基戊酸的聚羟基烷酸和其共聚物以及含有5个碳原子的化学中间物(C5化合物)的转基因生物体。
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2008年12月12日申请的美国临时专利申请案第61/122,250号的权益和优先权，且容许该案按全文引用并入本文中。
背景技术
聚羟基烷酸(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是可用于制备(但不限于)以下各物的生物可降解塑料：膜(例如包装膜、农用膜、覆膜(mulch film))、高尔夫球球座、球帽和盖板、农用支座和支柱、纸和纸板涂层(例如用于杯子、盘子、盒子等)、热成形产品(例如托盘、容器、乳酪罐、花盆、面碗、模具等)、外壳(例如用于电子物品)、袋子(例如垃圾袋、食品杂货袋、食品袋、堆肥袋等)、卫生用品(例如尿布、女用卫生产品、失禁产品、一次性擦拭片等)和用于丸粒状产品(例如丸粒状肥料、除草剂、杀虫剂、种子等)的涂层。
PHA也已用于开发生物医疗装置，包括缝合线、修复装置、修复补片(repair patch)、吊带、心血管补片、整形外科用针(orthopedic pin)、粘附阻隔膜(adhesion barrier)、支架、引导组织修复/再生装置、关节软骨修复装置、神经导管、肌腱修复装置、骨髓支架和伤口敷料。
聚羟基烷酸可由发酵工艺制造。现有的用于制造聚羟基烷酸的发酵方法利用在特定基质上培养的野生型或转基因微生物来产生所需的PHA聚合物组合物。在许多情况下，相关聚合物是3-羟基丁酸的(D)-异构物与另一种3-、4-或5-羟基酸共聚合得到的共聚物。产生的这些共聚物是以颗粒形式包括在细胞内，并且是无规共聚物。共聚物聚(3-羟基丁酸-共-5-羟基戊酸)(poly(3-hydroxybutyrate-co-5-hydroxyvalerate)，PHB5HV)和均聚物聚(5-羟基戊酸)(poly(5-hydroxyvalerate)，P5HV)适用作工业材料和塑料，且其优点在于，其为生物可降解且可生物再吸收的材料。迄今为止，已经通过将如5-羟基戊酸(5HV)或1，5-戊二醇等石油来源的5碳基质馈给微生物来产生这些材料，这种微生物能够将这些基质代谢成活化的单体5HV辅酶A，并使其在PHA聚合酶的作用下聚合形成PHB5HV或P5HV聚合物，由这些方法产生的PHB5HV和P5HV聚合物只是部分由可再生资源制得，并且因5碳石油基质的成本很高而相当昂贵。亟需使用非石油性可再生碳基质作为产生PHV5HV和P5HV聚合物的原料，从而降低成本并提供完全由可再生资源制成的材料。还需要开发用于产生这些聚合物且减少温室气体产生的工艺。适合的可再生资源包括由农业得到的碳水化合物原料，包括一种或一种以上选自以下各物的原料：淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖，以及氨基酸原料，包括赖氨酸和脯氨酸。
因此，本发明的一个目的是提供能在野生型或遗传工程改造过的聚羟基烷酸制造者中引入基因，以产生可合成例如5-羟基戊酸等单体的新品系的重组生物体和工艺，这些新品系合成的单体都是由非石油来源的基质制造。
本发明另一目的是提供稳定工程改造可合成含有5-羟基戊酸作为唯一成分或作为共聚单体的PHA的重组生物体的技术和程序。
本发明另一目的是提供稳定工程改造可合成例如5-氨基戊酸(5AP)、戊二酸和1，5戊二醇(1，5 pentanediol，PDO)等5碳化合物的重组生物体的技术和程序。
发明内容
含5HV的PHA生物聚合物
本发明提供用于产生包含5-羟基戊酸(5HV)单体的聚羟基烷酸(PHA)的重组宿主，以及由可再生碳基质产生包含5HV单体的PHA的方法。还提供产生例如5-氨基戊酸(5AP)、5HV、戊二酸和1，5戊二醇(PDO)等5碳化合物的某些重组宿主。
一个实施例提供一种重组宿主，其表达编码聚羟基烷酸(PHA)合成酶和5-羟基戊酸辅酶A(5HV-CoA)转移酶或5HV-CoA合成酶的基因，以及至少一个编码赖氨酸分解代谢路径中涉及的异源酶的转基因，其中当向所述生物体提供选自赖氨酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖或其组合的可再生碳基质时，宿主将产生含有5HV单体的PHA聚合物；并且产生的5HV单体的量高于不存在所述转基因表达的情形。示范性宿主表达一个或一个以上编码赖氨酸2-单加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸转氨酶、戊二酸半醛还原酶、5-羟基戊酸辅酶A转移酶和聚羟基烷酸合成酶的基因，以产生含有5HV单体的PHA聚合物。优选所述宿主在编码戊二酸半醛脱氢酶的基因和/或编码赖氨酸输出蛋白的基因中具有缺失或突变。特别适合的宿主还能够过量产生赖氨酸，并对如S-(2-氨基乙基)半胱氨酸等有毒赖氨酸类似物具有抗性。
在另一实施例中，还由转基因表达一个或一个以上编码PHA合成酶、5HV-CoA转移酶或5HV-CoA合成酶的基因。
在另一实施例中，将赖氨酸与一种或一种以上选自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖或其组合的可再生碳基质的组合馈给重组生物体，由此产生含有5HV的PHA聚合物，并由细胞回收得到所述聚合物。
在另一实施例中，将一种或一种以上选自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖或其组合的可再生碳基质馈给重组生物体，由此产生含有5HV的PHA聚合物，并由细胞回收得到所述聚合物。
由重组宿主产生的聚合物可为5HV单体的均聚物或共聚物。优选的共聚物为PHB5HV。由重组宿主产生的其它有用聚合物为共聚物聚(3-羟基丙酸-共-5-羟基戊酸)和聚(4-羟基丁酸-共-5-羟基戊酸)，以及均聚物P5HV。
所述宿主可以是原核宿主或真核宿主。优选的原核宿主为大肠杆菌、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、产碱弧菌(Alcaligenes latus)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)。
还提供由赖氨酸，或一种或一种以上选自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖或其组合的可再生碳基质产生PHA聚合物的重组宿主。示范性宿主表达赖氨酸2-单加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸转氨酶、戊二酸半醛还原酶、5-羟基戊酸辅酶A转移酶和聚羟基烷酸合成酶，由此产生包括5HV的聚合物。这种聚合物是使用赖氨酸和一种或一种以上选自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖和阿拉伯糖的可再生碳基质作为原料产生。优选所述宿主在编码戊二酸半醛脱氢酶和赖氨酸输出蛋白的基因中具有缺失。
1，5-戊二醇的产生
另一重组宿主经遗传工程改造成过量表达5-羟基戊酸辅酶A转移酶、辅酶A依赖性丙醛脱氢酶和1，3-丙二醇脱氢酶，由此产生1，5戊二醇。1，5戊二醇是单独使用5-羟基戊酸、赖氨酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖和阿拉伯糖或使用其组合作为原料产生。优选重组宿主在adhE、ldhA和ackA-pta中具有缺失，并表达编码赖氨酸2-单加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸转氨酶以及一个或一个以上戊二酸或琥珀酸半醛还原酶的基因。特别适合的宿主还能够过量产生赖氨酸，并对如S-(2-氨基乙基)半胱氨酸等有毒赖氨酸类似物具有抗性。这种生物体优选具有较低或无戊二酸半醛脱氢酶活性。
本发明提供一种由可再生碳基质产生1，5-戊二醇的方法，其中重组生物体被馈以可再生碳基质，并产生1，5-戊二醇，将其分泌到培养基中，且由培养基回收1，5-戊二醇。
在另一实施例中，本发明提供由可再生资源产生的1，5-戊二醇。
戊二酸的产生
本发明还提供由赖氨酸，或一种或一种以上选自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖和阿拉伯糖或其组合的可再生碳基质过量产生戊二酸的重组宿主。示范性宿主表达编码赖氨酸2-单加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸转氨酶和一个或一个以上戊二酸半醛脱氢酶的基因。特别适合的宿主还能够过量产生赖氨酸，并对如S-(2-氨基乙基)半胱氨酸等有毒赖氨酸类似物具有抗性。
本发明提供一种由可再生碳基质过量产生戊二酸的方法，其中重组生物体被馈以选自赖氨酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖和阿拉伯糖或其组合的可再生碳基质，并过量产生戊二酸，将其分泌到培养基中，并由培养基回收戊二酸。
附图说明
图1是绘示可由可再生资源以生物方式产生的各种5碳分子的示意图，在一些实例中，这些基于可再生资源的分子可使用标准化学方法相互转变并用以借助化学聚合方法制备聚合物等。
图2A是绘示合成含有5-羟基戊酸的聚羟基烷酸聚合物，以及例如5-氨基戊酸(5-APO)、戊二酸、δ-戊内酯(δ-valerolactone，DVL)和1，5戊二醇等5碳化合物的生物化学路径的示意图。还绘示可能需要去除或降低活性(如十字形(X)所指示)以使上文所列所需产物达到最佳碳通量的竞争性代谢路径。图2B绘示催化以下生物合成反应的酶：(1)赖氨酸2-单加氧酶，EC 1.13.12.2；(2)5-氨基戊酰胺酶(也称为δ-氨基戊酰胺酶)，EC 3.5.1.30；(3)5-氨基戊酸转氨酶(也称为δ-氨基戊酸转氨酶)，EC 2.6.1.48；(4)琥珀酸半醛还原酶(也称为5-氧代戊酸还原酶)，EC 1.1.1.61；(5)辅酶A转移酶，EC 2.8.3.n；(6)酰基辅酶A合成酶，EC 6.2.1.3；(7)PHA合成酶，EC 2.3.1.n；(8)β-酮酰基辅酶A硫解酶，EC 2.3.1.9；(9)乙酰乙酰基辅酶A还原酶，EC 1.1.1.36；(10)戊二酸-半醛脱氢酶，EC 1.2.1.20。
图3是绘示由L-赖氨酸经由尸胺和5-氨基戊醛合成5-氨基戊酸的替代途径的生物化学路径的示意图。
图4是绘示由L-脯氨酸合成5-氨基戊酸的生物化学路径的示意图。
图5是绘示由α-酮戊二酸合成戊二酸半醛(用以产生5-羟基戊酸和其衍生物以及戊二酸的代谢中间物)的生物化学路径的示意图。
图6是绘示由草酰乙酸(TCA循环的中间物)合成L-赖氨酸的生物化学路径的示意图。
图7是绘示合成1，5戊二醇的生物化学路径的示意图。
图8A是绘示时间(分钟)与经处理的菌株3291的细胞培养物的总离子丰度的关系的色谱图。图8B是经处理的菌株3291的细胞培养物的离子谱图，其绘示质荷比“m/z”与所述细胞培养物的离子丰度(相对单位)的关系。
具体实施方式
I.定义
下一节中将定义和阐明本文中使用的多个术语。
术语“PHA共聚物”是指由至少两种不同的羟基烷酸单体构成的聚合物。
术语“PHA均聚物”是指由单一羟基烷酸单体构成的聚合物。
本文中使用的“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体或柯斯质粒(cosmid)，其中可插入另一DNA区段以引起插入的区段的复制。载体可以是表达载体。
本文中使用的“表达载体”是包括一个或一个以上表达控制序列的载体。
本文中使用的“表达控制序列”是控制和调控另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。
本文中使用的“可操作地连接”是指并入遗传构建体中以使表达控制序列能有效地控制相关编码序列的表达。
本文中使用的“转化”和“转染”涵盖借助此项技术中已知的多种技术将核酸引入细胞中。
本文中使用的“过量产生”是指与未工程改造过的生物体相比较，工程改造过的生物体产生更多量的特定化合物。
本文中使用的术语“可再生原料”、“可再生碳基质”和“可再生基质”都可互换使用。
“质粒”是通过在前面加小写字母“p”和/或在后面加大写字母和/或数字表示。
本文中使用的术语“异源”是指来自另一宿主。所述另一宿主可为相同或不同物种。
II.用于产生聚羟基烷酸和5碳化合物的代谢路径
本发明提供的重组生物体具有用于产生含有5-羟基戊酸的聚羟基烷酸聚合物，以及例如5-氨基戊酸(5AP)、5-羟基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5戊二醇(PDO)等5碳化合物的生物化学路径的酶。原核或真核宿主经遗传工程改造成表达由基于可再生资源的原料产生5-羟基戊酸、其聚合物或所揭示的5碳化合物所需的酶。下文将提供产生所需产物的酶促路径。
A.5-氨基戊酸
5-氨基戊酸(5AP)可由L-赖氨酸(一种α-氨基酸)按两个酶促步骤产生，其中5-氨基戊酰胺作为中间物(图2)。这些酶中的第一个酶赖氨酸2-单加氧酶是各种假单胞菌(pseudomonad)菌株的赖氨酸降解路径中的第一个酶促步骤(武田(Takeda)和早石(Hayaishi)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)241：2733-2736；(1966)；早石，细菌学评述(Bacteriol.Rev.)30：720-731(1966)；瑞兹(Reitz)和洛德维尔(Rodwell)，生物化学杂志(J.Biol Chem.)245：3091-3096(1970)；弗拉西纳(Flashner)和马希(Massey)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)249：2579-2586(1974))。在恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中鉴别出了编码赖氨酸2-单加氧酶的基因，且将所述基因称为davB(雷维勒(Revelles)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)187：7500-7510(2005))。第二个酶促步骤将5-氨基戊酰胺转变成5AP，并由5-氨基戊酰胺酶催化(瑞兹(Reitz)等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)28：269-272(1969)；瑞兹和洛德维尔(Rodwell)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)245：3091-3096(1970))，这种酶是由恶臭假单胞菌中的davA所编码(雷维勒(Revelles)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)187：7500-7510(2005))。
如图3中所示，可利用替代性路径，经3个酶促反应将L-赖氨酸转变成5AP，这3个酶促反应包括赖氨酸脱羧酶，用以产生尸胺；腐胺转氨酶，用以形成5-氨基戊醛；和γ-氨基丁醛脱氢酶，用以生物合成5AP。
如图4中所略述，也可由L-脯氨酸代替L-赖氨酸，经2个酶促反应产生5AP，这2个酶促反应包括脯氨酸消旋酶，用以生物合成D-脯氨酸；和脯氨酸还原酶，用以形成5AP。
B.5-羟基戊酸
如图2中所略述，另一5碳化合物5HV的生物合成可由5AP经2个酶促步骤进行。5AP经5AP转氨酶(瑞兹(Reitz)和洛德维尔(Rodwell)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)245：3091-3096(1970))和经鉴别且名为davT的来自恶臭假单胞菌的基因(埃斯派诺-优吉尔(Espinosa-Urgel)和拉莫斯(Ramos)，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)67：5219-5224(2001))转变成戊二酸半醛。如实例7中所略述，克隆数个重组半醛还原酶基因，并进行测试以研究哪一基因编码的酶将戊二酸半醛有效转变成5HV。人们发现，假定蛋白ATEG 00539可有效催化此反应，并由此将其重新命名为针对戊二酸半醛还原酶的gsaR。
在一些嗜热细菌和包括酵母在内的低级真菌中，赖氨酸是经由α-氨基酮己二酸路径合成(许(Xu)，细胞生物化学与生物物理学(Cell Biochem.Biophys.)46：43-64(2006))，其中2-酮己二酸是第四个中间物且因此是例如戊二酸和5HV等C5化合物以及含5HV的PHA聚合物的潜在前体。如图5中所示，这一路径由α-酮戊二酸和乙酰辅酶A开始以生物合成2-酮己二酸。经显示，表达这4种酶的重组大肠杆菌宿主菌株可产生2-酮己二酸(安迪(Andi)等人，生物化学(Biochem.)43：11790-11795(2004)；贾(Jia)等人，生物化学杂志(Biochem.J.)396：479-485(2006)；宫崎(Miyazaki)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)278：1864-1871(2003))。由于α-酮戊二酸与2-酮己二酸的结构类似，故2-酮己二酸可在α-酮戊二酸脱氢酶作用下转变成戊二酰辅酶A。又因为琥珀酰辅酶A与戊二酰辅酶A的结构类似，使得戊二酰辅酶A可在例如琥珀酰辅酶A合成酶(SucD)等琥珀酸半醛(succinic semialdehyde，SSA)脱氢酶作用下发生转变(索林
Figure BPA00001422629600071
和古特差克(Gottschalk)细菌学杂志(J.Bacteriol.)178：871-880(1996))。
C.戊二酸
如图2中所略述，5碳化合物戊二酸的生物合成是由戊二酸半醛经由脱氢酶反应进行(伊斯奇赫(Ischihara)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(东京(Tokyo))49：154-157(1961)；瑞兹(Reitz)和洛德维尔(Rodwell)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)245：3091-3096(1970))。经鉴别，在恶臭假单胞菌中，davD基因编码此戊二酸半醛脱氢酶活性(埃斯派诺-优吉尔(Espinosa-Urgel)和拉莫斯(Ramos)，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)67：5219-5224(2001)；雷维勒(Revelles)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)186：3439-3446(2004))。戊二酸可用于制备例如聚酯、聚酯多元醇和聚酰胺等聚合物。奇数个碳原子(即5个)可用于例如减少聚合物的弹性。另外，1，5-戊二醇是一种常用塑化剂，并且是通过戊二酸和其衍生物氢化来制造聚酯的前体(维勒(Werle)和莫拉维兹(Morawietz)，″多元醇(Alcohols，Polyhydric)″，乌尔曼工业化学百科全书(Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry)：2002，威立出版公司(Wiley-VCH)：魏恩海姆(Weinheim.)，DOI 10.1002/14356007.a01_305)。
D.聚(5-羟基戊酸)
由聚(5-羟基戊酸)(又称为P(5HV))PHA组成的均聚物的生物合成可由5HV经由5-羟基戊酸辅酶A进行。两种不同的酶促反应可催化第一步骤，即如休斯曼(Huisman)等人(美国专利第7,229,804号)、索林
Figure BPA00001422629600072
和古特差克(Gottschalk)(细菌学杂志(J.Bacteriol.)178：871-880(1996))以及艾克曼斯(Eikmanns)和布克尔(Buckel)(霍佩-赛勒生物化学(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)371：1077-1082(1990))所述的辅酶A转移酶；或如范贝伦(van Beilen)等人(分子微生物学(Molec.Microbiol.)6：3121-3136(1992))所述的辅酶A合成酶。由例如富养罗尔斯通氏菌phaC1所编码的PHA聚合酶可催化5-羟基戊酸辅酶A聚合(皮普斯(Peoples)和辛斯凯(Sinskey)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：15298-15303(1989))。或者，可如休斯曼(Huisman)等人(美国专利第6,316,26号)所述使用PhaC3/C5合成酶融合蛋白。
E.聚(3-羟基丁酸-共-5-羟基戊酸)
包括聚(3-羟基丁酸-共-5-羟基戊酸)(又称为P(3HB-共-5HV))在内的共聚物的生物合成可通过供应3-羟基丁酰辅酶A(3-hydroxybutyryl-CoA，3HB-CoA)和5-HV-CoA单体前体分子来进行。如图2中所略述，3HB-CoA可由乙酰辅酶A经2个酶促步骤生物合成：(i.)β-酮酰基辅酶A硫解酶反应，其使用适合的基因，例如(但不限于)来自富养罗尔斯通氏菌的bktB(斯拉特(Slater)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)180(8)：1979-1987(1998))，将乙酰辅酶A转变成乙酰乙酰基辅酶A(西村(Nishimura)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)116：21-27(1978))；和(ii.)乙酰乙酰基辅酶A还原酶反应，其使用适合的基因，例如(但不限于)来自巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的phaB(麦克库尔(McCool)和坎侬(Cannon)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)181(2)：585-592(1999))，将乙酰乙酰基辅酶A转变成3HB-CoA(福井(Fukui)等人，生物化学与生物物理学论文集(Biochim.Biophys.Acta)917：365-371(1987))。如上文所略述，可利用多种PHA合成酶合成PHA共聚物。
F.赖氨酸
图6略述大肠杆菌中赖氨酸代谢的生物合成路径。图中心的虚线和实线分别表示L-赖氨酸的变构反馈抑制和转录阻遏，其为增加重组宿主细胞(例如大肠杆菌)中L-赖氨酸产量所需的遗传修饰提供目标。
G.1，5-戊二醇
图7提供由5HV产生1，5-戊二醇(PDO)的综述。5HV可在如休斯曼(Huisman)等人(美国专利第7,229,804号)、索林
Figure BPA00001422629600081
和古特差克(Gottschalk)(细菌学杂志(J.Bacteriol.)178：871-880(1996))以及艾克曼斯(Eikmanns)和布克尔(Buckel)(霍佩-赛勒生物化学(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)371：1077-1082(1990))所述的辅酶A转移酶；或如范贝伦(van Beilen)等人(分子微生物学(Molec.Microbiol.)6：3121-3136(1992))所述的辅酶A合成酶作用下转变成5HV-CoA。5HV可在丙醛脱氢酶或醇脱氢酶，例如来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的pduP(利尔(Leal)，微生物学年鉴(Arch.Microbiol.)180：353-361(2003))或来自大肠杆菌的eutE(斯卡利(Skraly)，WO专利第2004/024876号)作用下转变成5-羟基戊醛。5-羟基戊醛可在1，3-丙二醇脱氢酶或醇脱氢酶，例如来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的dhaT(童(Tong)等人，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)57(12)：3541-3546(1991))作用下转变成PDO。
H.5-羟基戊酸-共-3-羟基丙酸
含有5-羟基戊酸-共-羟基丙酸的共聚物可由5HV制备。用表达聚羟基烷酸和5-羟基戊酸辅酶A转移酶的核酸转染fadR+型(脂肪酸降解(fatty acid degradation，FAD)受阻遏)或fadR-型(组成性FAD)大肠杆菌K12菌株。优选大肠杆菌菌株包括MG1655和LS5218(斯帕特(Spratt)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)146(3)：1166-1169(1981))。如表6中所示，GC-FID分析表明，LS5218[pMS93]产生6.4％dcw PHA，且聚合物组成为52％5HV和48％3HP。另一方面，MG1655[pMS93]产生63.1％dcw PHA，这种PHA只由5HV组成。此外，LS5218[pMS93]的GC-MS分析证实了聚合物样品中3HP的存在。因此，LS5218中的活性FAD系统能够由Na5HV合成3HP。
III.用于产生聚羟基烷酸和5碳化合物的转基因生物体的产生
用于产生聚羟基烷酸和5碳化合物的转基因生物体是使用此项技术中已知的常规技术产生。
A.用于产生转基因P(5HV)制造者的基因
下表1A中提供了宿主菌株中经克隆和/或评估的产生含5HV的PHA和5碳化合物的基因，以及适宜的酶学委员会编号(Enzyme Commission number，EC编号)和参考资料。如下文进一步论述，一些基因是针对密码子优化合成，而其它基因是由天然或野生型生物体的基因组DNA经由PCR克隆。
表1A.微生物宿主菌株中产生含5HV的PHA和5碳化合物的基因。
Figure BPA00001422629600091
Figure BPA00001422629600101
能够催化表1A中所列反应的其它蛋白质可通过查阅科技文献、专利，或通过BLAST搜索例如NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)的核苷酸或蛋白质数据库发现。接着可以产生合成基因以提供由序列数据库得到实际DNA的简单路径。这些合成基因是使用增强异源蛋白质表达的密码子，优化表达系统和宿主所需的特征，从头设计和制造而成。多家公司，例如DNA 2.0(美国加利福尼亚州门洛帕克94025(Menlo Park，CA 94025，USA))，将提供这些常规服务。表1B到表1AA中提供了可催化表1A中所列生物化学反应的蛋白质。
表1B.DavB蛋白(赖氨酸2-单加氧酶，来自恶臭假单胞菌KT2440，EC编号1.13.12.2，其作用于L-赖氨酸以产生5-氨基戊酰胺；蛋白质收录号：BAG54787(雷维勒(Revelles)等人，细菌学杂志(J Bacteriol.)187：7500-10(2005)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600111
表1C.DavA蛋白(5-氨基戊酰胺酶，来自恶臭假单胞菌KT2440，EC编号3.5.1.30，其作用于5-氨基戊酰胺以产生5-氨基戊酸；蛋白质收录号：BAG54788(雷维勒(Revelles)等人，细菌学杂志(J Bacteriol.)187：7500-10(2005)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600112
表1D.DavT蛋白(5-氨基戊酸转氨酶，来自恶臭假单胞菌KT2440，EC编号2.6.1.48，其作用于5-氨基戊酸以产生戊二酸半醛；蛋白质收录号：AAK97868(埃斯派诺-优吉尔(Espinosa-Urgel)和拉莫斯(Ramos)，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)67(11)，5219-5224(2001)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600113
表1E.GabT蛋白(4-氨基丁酸转氨酶，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，EC编号2.6.1.48(或EC编号2.6.1.19)，其作用于5-氨基戊酸(或4-氨基丁酸)以产生戊二酸半醛(琥珀酸半醛)；蛋白质收录号：NP_417148(瑞利(Riley)等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)34(1)，1-9(2006)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600122
表1F.GsaRAt2蛋白(戊二酸半醛还原酶，来自土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624，EC编号1,1.1.61，其作用于戊二酸半醛(或琥珀酸半醛)以产生5-羟基戊酸(或4-羟基戊酸)；蛋白质收录号：XP_001210625(拜恩(Birren)，布诺德研究所基因组测序平台(The Broad Institute Genome Sequencing Platform)，直接提交到NCBI))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600123
Figure BPA00001422629600131
表1G.GsaRAt蛋白(戊二酸半醛还原酶，来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，EC编号1.1.1.61，其作用于戊二酸半醛(或琥珀酸半醛)以产生5-羟基戊酸(或4-羟基丁酸)；蛋白质收录号：AAK94781(布雷克鲁兹(Breitkreuz)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)278(42)，41552-41556(2003)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600132
表1H.OrfZ蛋白(辅酶A转移酶，来自科氏梭菌(Clostridium kluyveri)DSM 555，EC编号2.8.3.n，其作用于5-羟基戊酸以产生5-羟基戊酰基辅酶A；蛋白质收录号：AAA92344(休斯曼(Huisman)等人，美国专利第7,229,804号；索林
Figure BPA00001422629600133
和古特差克(Gottschalk)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)178：871-880(1996)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600134
表1I.AlkK蛋白(酰基辅酶A合成酶，来自食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)；EC编号6.2.1.3，其作用于5-羟基戊酸以产生5-羟基戊酰基辅酶A；蛋白质收录号：Q00594(范贝伦(van Beilen)等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)6(21)，3121-3136(1992)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600141
表1J.PhaC蛋白(聚羟基烷酸合成酶，来自富养罗尔斯通氏菌，EC编号：2.3.1.n，其作用于(R)-3-羟基丁酰基辅酶A+[(R)-3-羟基丁酸]n以产生[(R)-3-羟基丁酸](n+1)+辅酶A；蛋白质收录号：YP_725940(皮普斯(Peoples)和辛斯凯(Sinskey)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：15298-15303(1989)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600142
表1K.PhaE蛋白(PhaEC PHA合成酶的PhaE亚单元，来自普氏荚硫菌(Thiocapsapfenigii)，其作用于(R)-3-羟基丁酰基辅酶A+[(R)-3-羟基丁酸]n以产生[(R)-3-羟基丁酸](n+1)+辅酶A)的适合同系物。
Figure BPA00001422629600151
表1L.PhaC蛋白(PhaEC PHA合成酶的PhaC亚单元，来自普氏荚硫菌，其作用于(R)-3-羟基丁酰基辅酶A+[(R)-3-羟基丁酸]n以产生[(R)-3-羟基丁酸](n+1)+辅酶A)的适合同系物。
表1M.BktB(PhaA)蛋白(β-酮酰基辅酶A硫解酶，来自富养罗尔斯通氏菌H16，EC编号2.3.1.9，其作用于乙酰辅酶A以产生乙酰乙酰基辅酶A；蛋白质收录号：CAJ92573(皮普斯(Peoples)和辛斯凯(Sinskey)，生物化学杂志(J Biol Chem.)1989年9月15日；264(26)：15293-7。普哈曼(Pohlmann)等人，自然—生物技术(Nature Biotech)24(10)，1257-1262(2006)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600153
表1N.PhaB蛋白(乙酰乙酰基辅酶A还原酶，来自巨大芽孢杆菌，EC编号1.1.1.36，其作用于乙酰乙酰基辅酶A以产生(R)-3-羟基丁酰基辅酶A；蛋白质收录号：AAD05259(麦克库尔(McCool)和坎侬(Cannon)，细菌学杂志(J.Bacteriol.).183(14)，4235-4243(2001)))的适合同系物。
表10.DavD蛋白(戊二酸-半醛脱氢酶，来自恶臭假单胞菌KT2440，EC编号1.2.1.20，其作用于戊二酸半醛以产生戊二酸；蛋白质收录号：NP_742381(埃斯派诺-优吉尔(Espinosa-Urgel)和拉莫斯(Ramos)，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)67(11)，5219-5224(2001)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600162
表1P.GabD蛋白(NADP+依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，EC编号1.2.1.20，其作用于戊二酸半醛(或琥珀酸半醛)以产生戊二酸(或琥珀酸)；蛋白质收录号：NP_417147(瑞利(Riley)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)34(1)，1-9(2006)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600171
表1Q.YneI(Sad)蛋白(NAD+依赖性琥珀酸半醛脱氢酶，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，EC编号1.2.1.24，其作用于戊二酸半醛(琥珀酸半醛)以产生戊二酸(琥珀酸)；蛋白质收录号：NP_416042(弗雷尔(Fuhrer)等人，细菌学杂志(J Bacteriol.)2007年11月；189(22)：8073-8。丹尼斯(Dennis)和沃伦亭(Valentin)，美国专利第6,117,658号))的适合同系物。
表1R.PduP蛋白(辅酶A依赖性丙醛脱氢酶，来自鼠伤寒沙门氏菌LT2，EC编号1.2.1.3，其作用于5-羟基戊酰基辅酶A以产生5-羟基戊醛；蛋白质收录号：NP_460996(利尔(Leal)等人，微生物学年鉴(Arch.Microbiol.)180：353-361(2003)；麦克克兰德(McClelland)等人，自然(Nature)413：852-856(2001)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600173
Figure BPA00001422629600181
表1S.EutE蛋白(预测的醛脱氢酶，乙醇胺利用蛋白，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，EC编号1.2.1.3，其作用于5-羟基戊酰基辅酶Atp以产生5-羟基戊醛；蛋白质收录号：NP_416950(瑞利(Riley)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)34(1)，1-9(2006)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600182
表1T.DhaT蛋白(1，3-丙二醇脱氢酶，来自肺炎克雷伯氏菌342，EC编号1.1.1.202，其作用于5-羟基戊醛以产生1，5-戊二醇；蛋白质收录号：YP_002236499(福茨(Fouts)等人，公共科学图书馆—遗传学(PLoS Genet.)4(7)，E1000141(2008)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600183
表1U.EutG蛋白(乙醇胺利用中预测的醇脱氢酶，来自大肠杆菌菌株K-12亚株W3110，EC编号1.1.1.202，其作用于5-羟基戊醛以产生1，5-戊二醇；蛋白质收录号：AP_003038(瑞利(Riley)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)34(1)，1-9(2006)))的适合同系物。
表1V.ArgO(YggA)蛋白(精氨酸输出蛋白，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，其作用于L-赖氨酸(细胞质)并产生L-赖氨酸(外部)；蛋白质收录号：NP_417398(南迪伦尼(Nandineni)和古韦夏卡(Gowrishankar)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)186：3539-3546(2004)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600192
表1W.LysE蛋白(赖氨酸外排透膜酶，来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032，其作用于L-赖氨酸(细胞质)以产生L-赖氨酸(外部)；蛋白质收录号：NP_600485(东京研究实验室(Tokyo Research Laboratories)，工业株式会社(Kogyo Co.Ltd.)，日本(Japan)，直接提交给NCBI))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600201
表1X.LysP蛋白(LysP赖氨酸APC转运蛋白，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，其作用于L-赖氨酸(外部)并产生L-赖氨酸(细胞质)；蛋白质收录号：NP_416661(斯蒂夫斯(Steffes)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)174(10)：3242-9(1992)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600202
表1Y.CadA蛋白(赖氨酸脱羧酶1，来自大肠杆菌菌株K-12亚株W3110，其作用于赖氨酸以产生尸胺；蛋白质收录号：AP_004633(瑞利(Riley)等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)34(1)，1-9(2006)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600203
Figure BPA00001422629600211
表1Z.LdcC蛋白(赖氨酸脱羧酶2，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，其作用于赖氨酸以产生尸胺；蛋白质收录号：NP_414728(瑞利(Riley)等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)34(1)，1-9(2006)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600212
表1AA.YjeK蛋白(赖氨酸2，3-氨基变位酶，来自大肠杆菌菌株K-12亚株MG1655，其作用于赖氨酸以产生(R)-b-赖氨酸；蛋白质收录号：NP_418570(瑞利(Riley)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)34(1)，1-9(2006)))的适合同系物。
Figure BPA00001422629600213
一个实施例提供一种用于产生P(5HV)或其它含5HV单体的PHA的转基因或重组生物体。这种生物体可以是原核生物或真核生物。适合的原核生物包括(但不限于)细菌，例如大肠杆菌。
B.用于产生重组生物体或细胞的方法和材料
1.待修饰的生物体或细胞
可经修饰以产生含5HV的PHA生物聚合物、5-氨基戊酸(5AP)、5-羟基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5-戊二醇(PDO)的生物体或细胞包括真核生物和原核生物。适合的原核生物包括细菌。多种细菌可经过遗传工程改造以产生聚羟基烷酸。实例包括大肠杆菌、产碱弧菌、真养产碱菌(Alcaligenese eutrophus)、固氮菌(Azotobacter)、恶臭假单胞菌、富养罗尔斯通氏菌、沙门氏菌(Salmonella)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、谷氨酸棒杆菌、红球菌(Rhodoccocus)和乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)。其它原核生物包括(但不限于)真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，如肠杆菌(Enterobacteriaceae)，例如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株都公开可用，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31.537)；(ATCC 27,325)和K5772(ATCC 53,635)。
这些生物体包括已经产生聚羟基烷酸、经修饰以利用替代性基质或并入其它单体，或经修饰以增加产量的生物体，以及不产生聚羟基烷酸，但不表达或表达某些产生聚羟基烷酸所需的酶的生物体。假气单胞菌(R.eutropha)是天然产生PHA的生物体的一个实例。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是需要引入编码产生PHA的酶的转基因的生物体的实例。
对于产生C5化合物5-氨基戊酸(5AP)、5-羟基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5-戊二醇，如果这些C5化合物不聚合成含5-羟基戊酸的PHA，而是分泌到生长培养基中，那么宜使用可用来制造赖氨酸的工业微生物。已经用于工业生产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，包括其亚种黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)和二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(微生物学专论(Microbiol.Monogr.)5：39-70(2007))，是可开发用于产生戊二酸、1，5-戊二醇、5-羟基戊酸以及可由赖氨酸经由本发明中所述的赖氨酸降解路径产生的其它产物的微生物的实例。工程改造过的大肠杆菌也已用于赖氨酸生产。获得用于产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株的程序，例如随机诱变随后选择对如S-(2-氨基乙基)半胱氨酸等有毒赖氨酸类似物具抗性的突变体，以及引入基因目标的突变等位基因，例如lysC和hom(分别编码天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶)，都已得到确立和描述(现代微生物学观点(Curr.Opin.Microbiol.)9：268-274(2007))。天冬氨酸激酶受到苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制，且这种酶由反馈抑制的释放被认为是开发赖氨酸生产菌株的一个关键特征。开发能够产生来源于赖氨酸降解路径的化合物的工程改造的另一目标是赖氨酸输出蛋白，例如谷氨酸棒杆菌中的LysE。产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株中lysE基因的诱变将阻止细胞质排出赖氨酸，并因此通过设计用于将赖氨酸转变成产物的路径而增加产物的产率。此项技术中也已知构建用于产生PHA(例如PHB)的谷氨酸棒杆菌菌株的方法(乔(Jo，S-J)等人，2006.生物科学与生物工程杂志(J.Bioscience and Bioengineering)102：233-236)。
适合的真核生物体或细胞包括真菌，例如丝状真菌或酵母。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低级真核宿主微生物。
2.用于产生转基因生物体的方法
i.染色体外转染
可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文中使用的术语“转化”和“转染”是指用于将外来核酸(例如DNA)引入宿主细胞中的多种技术公认的技术，包括化学转化法，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染法或电穿孔法。常规转化技术描述于撒布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，NY)，2001中。在酵母中进行的转化通常是根据范索林格(Van Solingen)等人，细菌学杂志(J.Bact)，130：946(1977)和萧(Hsiao)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))，76：3829(1979)的方法进行。
ii.染色体整合
所属领域技术人员众所周知用于将工程改造过的基因构建体并入革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的染色体DNA中的方法。典型的整合机制包括在recBC或recD菌株中使用线性DNA进行同源重组，随后P1转导(米勒(Miller)1992，细菌遗传学短期课程：有关大肠杆菌和相关细菌的实验指南和手册(A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual & Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria).冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.))；特定质粒(汉密尔顿(Hamilton)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171：4617(1989)；米特卡夫(Metcalf)等人，质粒(Plasmid)35：1(1996)；美国专利第5,470,727号，玛斯卡恩哈斯(Mascarenhas)等人)，或使用基于转座子的系统进行随机插入(赫勒罗(Herrero)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)172：6557(1990)；皮雷德查克(Peredelchuk)和本纳特(Bennett)，基因(Gene)187：231(1997)；美国专利第5,595,889号，理查德(Richaud)等人；美国专利第5,102,797号，图科尔(Tucker)等人)。一般说来，含有插入的微生物菌株是根据由整合的构建体所提供的获得性抗生素抗性基因选择。然而，也可以使用营养缺陷型突变体互补法。这些方法可用于引入编码本文所述各种代谢路径的任一转基因。这些方法中有一些将于下文中关于pha基因更详细地描述。
供染色体整合的相关基因的表达可通过在待整合的DNA构建体中包括转录活化序列(启动子)实现。如英格拉姆(Ingram)等人的美国专利第5,000,000号中所述，定点同源重组可与相关基因表达的扩增组合。
也可通过达森克(Datsenlco)和维纳(Wanner)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)97：6640-6645(2000))的如下文实例7中所使用的方法进行染色体整合。
已经开发出一系列表达盒来将异源基因插入细菌染色体中。这些表达盒是基于赫勒罗(Herrero)等人，细菌学杂志(J.Bacterial.)172：6557-67(1990)；德洛伦佐(de Lorenzo)等人，细菌学杂志，172：6568(1990)所述的转座子传递系统。尽管这些系统指定RP4介导的接合转移，并且只使用转座子Tn10和Tn5，但转座子各端与传递系统的任何组合都可能适用于所述技术，从而持续且均匀地产生PHA。
以下通用方法可用于产生转基因大肠杆菌PHB制造者：(1)将无启动子抗生素抗性(abr)基因克隆到例如pUC18NotI或pUC18SfiI等适合质粒的多接头中，以使多接头的大部分在abr的上游；(2)随后将pha基因，即编码GABA转氨酶、琥珀酸半醛还原酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶的基因克隆到abr基因的上游并与该基因成相同定向；(3)切除pha-abr盒作为NotI或AvrII片段(AvrII识别pUC18SfiI中的SfiI位点)，并克隆到任何质粒(如来自pUT或pLOF系列的质粒)的相应位点中；(4)所得质粒保持在大肠杆菌λpir菌株中，并进行电穿孔或结合到这些质粒不能复制的所选大肠杆菌菌株中；和(5)在针对宿主(例如当宿主为萘啶酮酸抗性时为萘啶酮酸)和针对pha-abr盒(例如氯霉素(chloramphenicol)、卡那霉素(kanamycin)、四环素(tetracyclin)、氯化汞、双丙氨磷(bialaphos))的选择性培养基上选择pha-abr盒已经成功整合到染色体中的新菌株。在存在葡萄糖的基本培养基上，针对生长和PHB形成筛选所得pha整合体。
可对这一程序进行数次修改。如果不使用无启动子的抗生素抗性标记物，那么根据载体中存在的标记物选择PHA基因的插入，并通过筛选PHA的产生来检测产生所需量PHA的整合的菌株。pha基因可具有(但不需要)内源转录序列，例如上游活化序列、RNA聚合酶结合位点和/或操纵基因序列。如果pha基因不具有这些序列，那么所述方法局限于使用可通过插入序列进行转录的载体，如pUT系列。这一限制是由RNA聚合酶无法通读(read through)pLOF质粒的Tn10侧翼区所致。必要时，abr基因可携带其自身的表达序列。构建体可设计成当宿主菌株在相应野生型基因中具有突变时，必需基因充当选择性标记物，来代替使用abr基因。此项技术中大体上已知适用于此目的的基因的实例。不同构建体可依序或同时整合到一种宿主中，只要这些构建体携带不同的标记物基因。可使用多次整合事件，分开整合pha基因，例如首先整合呈phaC-cat盒形式的PHB聚合酶基因，随后整合呈phaAB-kan盒形式的硫解酶和还原酶基因。或者，一个盒可含有所有pha基因，而另一盒只含有产生所需PHA聚合物所需的某些pha基因。
在一些情况下，可以使用转座子整合载体，例如pJMS11(潘克(Panke)等人，应用与环境微生物学(Appl.Enviro.Microbiol).64：748-751)，由此可从整合的菌株的染色体中切除选择性标记物。出于多种原因，此举极为有用，包括提供插入使用相同标记物基因的多个转座子构建体，并在每一插入事件后切除所述标记物的机制。
3.pha以及PHA形成中所涉及的其它基因的来源
有关PHA形成所涉及的基因的常见参考文献为麦迪逊(Madison)和休斯曼(Huisman)，1999，微生物学与分子生物学评述(Microbiology and Molecular BiologyReviews)63：21-53。pha基因可来源于不同来源并组合于单一生物体中，或者来自相同来源。
i.编码还原酶的基因
已经从以下各物中分离出编码还原酶的基因：产碱弧菌、假气单胞菌(皮普斯(Peoples)和辛斯凯(Sinskey)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264(26)：15298-303(1989))、不动菌属(Acinetobacter sp.)(斯查波利(Schembri)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.).177(15)：4501-7(1995))、酒色着色菌(C.vinosum)(里伯格塞尔(Liebergesell)和斯坦布查尔(Steinbuchel)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)209(1)：135-50(1992))、嗜酸假单胞菌(P.acidophila)、脱氮假单胞菌(P.denitrificans)(雅布塔尼(Yabutani)等人，FEMS微生物学报(FEMS Microbiol.Lett.)133(1-2)：85-90(1995))、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)(托布里尼(Tombolini)等人，微生物学(Microbiology)141：2553-59(1995))和生枝动胶菌(Z.ramigera)(皮普斯(Peoples)等人，生物化学杂志(J，Biol.Chem.)262(1)：97-102(1987))。美国专利第7,229,804号揭示使用来自克氏梭状芽孢杆菌(C.kluyveri)的编码4-羟基丁酸脱氢酶的4hbD基因产生P4HB的转基因生物体(索林(Sohling)和古特差克(Gottschalk)细菌学杂志(J.Bacteriol.)178，871880(1996))。4hbD需要NADH。优选的还原酶包括(但不限于)不需要NADH的还原酶。示范性还原酶包括来自小家鼠(Mus musculus)的AKR7A5(基因信息标识符(GenInfoIdentifier)：27659727)(海舍伍德(Hinshelwood，A.)等人，FEBS学报(FEBS Letters)523：213-218(2002))、来自拟南芥的GHBDH(GI：145338934)(布雷克鲁兹(Breitkreuz，K.)等人，生物化学杂志(J.Biol Chem.)278：41552-41556)、来自土曲霉的ATEG_00539(GI：115491994)。
ii.辅酶A转移酶和辅酶A合成酶
适合的辅酶A转移酶(EC 2.8.3.n)包括(但不限于)来自科氏梭菌的orfZ。orfZ的序列提供于休斯曼(Huisman)等人的美国专利第7,229,804号中且该案按全文引用并入本文中。另一适合的辅酶A转移酶包括来自氨基丁酸梭菌(C.aminobutyricum)的abfT(杰哈德(Gerhardt)等人，微生物学档案(Arch Microbiol)74：189-199(2000))。其它可产生酰基辅酶A的酶包括辅酶A合成酶(EC 6.2.1.3)。这些酶使用ATP和游离辅酶A来催化辅酶A与羧酸的共价加成，并且描述于范贝伦(van Beilen)等人(分子微生物学(Molec Microbiol)(1992)6：3121-3136)和艾奎恩(Aquin)等人(WO 02/40690 A2)中。
iii.编码PHA聚合酶的基因
已经从以下各物中分离出编码PHA聚合酶的基因：豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)(福井(Fukui)和杜伊(Doi)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)179(15)：4821-30(1997))、产碱弧菌、假气单胞菌(皮普斯(Peoples)和辛斯凯(Sinskey)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264(26)：15298-303(1989))、不动菌(斯查波利(Schembri)等人，细菌学杂志，177(15)：4501-7(1995))、酒色着色菌(里伯格塞尔(Liebergesell)和斯坦布查尔(Steinbuchel)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)209(1)：135-50(1992))、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)(沃伦亭(Valentin)和斯坦布查尔(Steinbuchel)，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol)39(3)：309-17(1993))、珊瑚诺卡氏菌(Nocardia corallina)(基因库收录号AF019964)、鲑色诺卡氏菌(Nocardia salmonicolor)、嗜酸假单胞菌、脱氮假单胞菌(友达(Ueda)等人，细菌学杂志，178(3)：774-79(1996))、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(提姆(Timm)和斯坦布查尔(Steinbuchel)，欧洲生物化学杂志，209(1)：15-30(1992))、食油假单胞菌(休斯曼(Huisman)等人，生物化学杂志，266：2191-98(1991))、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)(柯瓦罗斯(Cevallos)等人，细菌学杂志，178(6)：1646-54(1996))、苜蓿根瘤菌(托布里尼(Tombolini)等人，微生物学(Microbiology)141(第10部分)：2553-59(1995))、红树林细菌(Rhodococcus ruber)(派普(Pieper)和斯坦布查尔(Steinbuchel)，FEMS微生物学报(FEMS Microbiol.Lett.)96(1)：73-80(1992))、深红红螺菌(Rhodospirrilumrubrum)(修斯特(Hustede)等人，FEMS微生物学报，93：285-90(1992))、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(斯坦布查尔(Steinbuchel)等人，FEMS微生物学综述(FEMSMicrobiol.Rev.)9(2-4)：217-30(1992)；修斯特(Hustede)等人，生物技术通讯(Biotechnol.Lett.)15：709-14(1993))、集胞藻属(Synechocystis sp.)(金子(Kaneko)，DNA研究(DNA Res.)3(3)：109-36(1996))、紫囊硫菌(T.violaceae)(里伯格塞尔(Liebergesell)和斯坦布查尔(Steinbuchel)，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol).38(4：493-501(1993))和生枝动胶菌(基因库收录号U66242)。
也可以使用不涉及PHA形成但与pha基因和/或相应基因产物共有显著同源性的其它基因。已经从数种生物体中分离出与编码乙酰乙酰基辅酶A还原酶的phaB基因具有显著同源性的基因，这些生物体包括巴西固氮螺菌(Azospirillum brasiliense)(NCBI收录号X64772、X52913)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)(NCBI收录号U53327、Y00604)、大肠杆菌(NCBI收录号D90745)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)(NCBI收录号U39441)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)(NCBI收录号U32701)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(NCBI收录号U59433)、绿脓杆菌(NCBI收录号U91631)、集胞藻属(NCBI收录号D90907)、幽门螺旋杆菌(H.pylori)(NCBI收录号AE000570)、拟南芥(NCBI收录号X64464)、披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)(NCBI收录号X64566)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(NCBI收录号U66800)。
III.产生含5HV的PHA和C5化合物的方法
本发明提供使用可再生碳源作为原料产生聚羟基烷酸的方法。在优选实施例中，用一个或一个以上编码由可再生资源产生5-氨基戊酸(5AP)、5-羟基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5-戊二醇(PDO)及其聚合物所需的基因的核酸构建体转化或转染细菌。
IV.使用方法
可以使用所揭示的转基因生物体产生C5化合物，例如5-氨基戊酸(5AP)、5-羟基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5-戊二醇(PDO)，以及包含5HV单体的PHA生物聚合物。在产生C5化合物的情况下，使表达适宜转基因且任选包括编码竞争路径的基因已失活或缺失的重组生物体在可再生发酵基质上生长。所述基质选自碳水化合物、赖氨酸、脯氨酸、植物油、脂肪酸或其组合。适用于某些实施例中的组合为葡萄糖与赖氨酸的混合物。另一适合的组合为蔗糖和赖氨酸。原料优选主要包含一种基质，例如葡萄糖或蔗糖。适合的碳水化合物基质包含一种或一种以上选自葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖的糖。对于产生C5化合物，使重组生物体在可再生基质上生长，直到生长培养基中积累所需终产物为止，此时，通过絮凝、沉降、离心或过滤去除细胞，并通过标准程序从无细胞培养基中回收产物。此项技术中已知这些用于回收例如乳酸、琥珀酸、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇和1，4-丁二醇等其它发酵产生的酸和二醇的程序。
可以使用重组生物体，通过在例如葡萄糖、赖氨酸等可再生碳源以及经选择以提供所需聚合物或共聚物的其它基质存在下培养生物体，发酵产生含5HV的PHA生物聚合物(包括均聚物P5HV)，以及含5HV的PHA共聚物。使重组生物体在所述基质上生长，直到PHA聚合物积累于细胞内部为止，此时，通过所属领域技术人员已知的方法从细胞中萃取出PHA聚合物。从生物体获得的含5HV的PHA聚合物可用于多种工业塑料应用中，例如薄膜、纤维、发泡体、注入成型的物品、吹塑成型的瓶子、纸涂层等。其也可用于生物医疗应用，包括组织充填(tissue augmentation)、用以制造心脏瓣膜、作为缝合线以及用以制造血管移植物。示范性共聚物包括(但不限于)PHB5HV和聚(3-羟基丙酸-共-5-羟基戊酸)、聚(4-羟基丁酸-共-5-羟基戊酸)。重组生物体可经过遗传工程改造以包括产生共聚物所需的其它基因，例如β-酮基硫解酶和乙酰乙酰基辅酶A还原酶。
除非另作定义，否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。.
实例
实例1：由5-羟基戊酸钠生物合成P(5HV)均聚物
在首次说明合成含5HV的PHA的能力时，将5-羟基戊酸钠(Na5HV)馈给表达辅酶A转移酶或辅酶A合成酶和PHA合成酶的大肠杆菌菌株，以确定所馈给的5HV单体是否被接受且直接并入P(5HV)均聚物中。Na5HV是通过δ-戊内酯(DVL)的碱水解合成。这一程序涉及将0.1摩尔NaOH添加到50毫升甲醇中，同时搅拌，直到溶解为止。在用力搅拌下，向其中添加0.1摩尔DVL。干燥所得沉淀，将其溶解于水中，将pH值调整到8.5，并用0.2微米过滤器无菌过滤。在沃特世公司(Waters)的艾伦斯高效液相色谱仪(Alliance HPLC)上分析盐溶液，以确定所有DVL都已皂化。
测试辅酶A转移酶/合成酶与PHA合成酶基因的不同组合，以发现适于产生P(5HV)的最佳组合。所测试的辅酶A转移酶/合成酶是科氏梭菌的orfZ和食油假单胞菌的alkK，且PHA合成酶是假气单胞菌的phaC和普氏荚硫菌的phaEC(表1A)。本实验中使用的所有菌株都来源于MG1655(杰森(Jensen)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，175(11)：3401-3407(1993))。根据以下段落中所述，构建四种表达质粒(pFS92、pMS96、pMS93和pMS102)，其各含有辅酶A转移酶/合成酶和PHA合成酶的不同组合。
质粒构建
通过用XmaI和StuI消化pAET41(皮普斯(Peoples)和辛斯凯(Sinskey)，生物化学杂志(J.Biol Chem.)264(26)：15298-15303(1989))，以去除含有假气单胞菌phaC和其天然启动子(PRe)的片段，来构建质粒pFS30。质粒pAET41是含有来自假气单胞菌H16的涵盖phaC基因的染色体片段的pUC18载体(收录号：L08752)。用BamHI消化质粒pFS16(斯卡利(Skraly)和皮普斯(Peoples)，美国专利第6,323,010号)，用T4聚合酶处理成平末端(blunted)，并再次用XmnI消化，随后与PRe-phaC XmaI-StuI片段连接，所述质粒pFS16是pTrc99a(法玛西亚公司(Pharmacia)，瑞士乌普萨拉(Uppsala，Sweden))的衍生物，其含有处于PTrc启动子控制下的来自科氏梭菌的orfZ基因(表1A)。所得质粒称为pFS30，且含有处于组成性表达的PRe启动子的控制下的phaC-orfZ操纵子融合物。
质粒pFS92是按多步骤工艺制备。首先，用含有工程改造过的EcoRI和Acc65I限制性位点的引物FS-E5′和FS-E3′，由pMON25893(雷瑟(Reiser)等人，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol)53(2)：209-218(2000))扩增普氏荚硫菌phaE。随后，用限制性酶EcoRI和Acc65I消化phaE的PCR产物，并将其连接到以类似方式消化的pTrcN(基恩格斯(Gerngross)等人，生物化学(Biochemistry)33：9311-9320(1994))，形成pFS89。FS-E5′的引物序列为(5′)-GGAATTCAGGAGGTTTTTATGAACGATACGGCCAACAAGACCAGC(SEQ IDNO：1)且FS-E3′的引物序列为(5′)-GGGGTACCTCACTGGCCGGTGGTGGGCTTGGTGGTCTTGCGGCG(SEQ IDNO：2)。接下来，用含有工程改造过的Acc65I和BamHI限制性位点的引物FS-C5′和FS-C3′，由pMON25894(雷瑟(Reiser)等人，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol)53(2)：209-218(2000))扩增普氏荚硫菌phaC。随后，用限制性酶Acc65I和BamHI消化phaC的PCR产物，并将其连接到以类似方式消化的pTrcN，形成pFS90。FS-C5′的引物序列为(5′)-GGGGTACCAGGAGGTTTTTATGTCCCCATTCCCGATCGACATCCG(SEQ ID NO：3)且FS-C3′的引物序列为(5′)-CGGGATCCTCAGCCGCGTTCGTTCAGCCAGCGGCCGATCGCCG(SEQ ID NO：4)。在将普氏荚硫菌phaE和phaC单独克隆到pTrcN中，分别形成pFS89和pFS90后，通过用MluI和Acc65I消化pFS89，分离含有phaE的片段，并将其与以类似方式消化的pFS90试样(preparation)连接，来将phaE克隆到phaC上游。所得质粒pFS91含有处于PTrc启动子控制下的phaEC操纵子融合物。最后，通过将来自pFS91的含有phaEC的MluI-BamHI片段与已经用MluI和BamHI消化的pFS16连接，产生pFS92。质粒pFS92含有处于PTrc启动子控制下的phaEC-orfZ操纵子融合物。
质粒pMS96是通过将alkK(参看表1A)克隆到pFS91中phaEC的下游来制备。首先，使用引物K5-1和K3-1，由食油假单胞菌基因组DNA经PCR扩增alkK，这些引物经工程改造以在PCR产物的各端上并入BamHI位点。引物K5-1的序列为(5′)-GCTGAGGATCCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATC(SEQ IDNO：5)且引物K3-1的序列为(5′)-CTAGAGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG(SEQ ID NO：6)。扩增后，用BamHI消化alkK PCR片段和pFS91(如上一段中所述)并将其连接形成pMS96。通过限制性酶消化来验证pMS96中alkK的定向与phaEC方向相同，由此确保处于PTrc启动子控制下的phaEC-alkK操纵子融合物的正确构建。
通过首先用BspHI消化pACYC177(收录号X06402)以去除kan标记物，并将其连接到pFS30的独特BspHI位点中以形成pFS73(含有处于串联启动子PTrc和PRe控制下的phaC-orfZ)，来构建得到质粒pMS93和pMS102。通过用来自pKAS4(皮普斯(Peoples)等人，美国专利第5,480,794号)的只含有phaC 5′端837个碱基对的EcoRI-BspEI片段替换pFS73中含有PRe和phaC CDS 5′端837个碱基对的EcoRI-BspEI片段，来去除PRe启动子区。由此得到的含有只处于PTrc启动子控制下的phaC-orfZ的质粒称为pMS93。为产生pMS102，通过用DraI消化pFS73，并使质粒主链自身连接形成pMS74，来去除orfZ基因。使用引物K5-2和K3-2，由质粒pTrcN-A.eut-AlkK(如下文所述)经PCR扩增alkK基因。引物K5-2的序列为(5′)-AATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATC(SEQ ID NO：7)且引物K3-2的序列为(5′)-GATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG(SEQ ID NO：8)。随后，用SpeI和SbfI消化质粒pMS74，接着经由克列诺片段补平(Klenow fill-in)来制备平末端，并将alkK的PCR片段连接到具有平末端的pMS74主链，形成pMS92。由此，质粒pMS92含有处于串联启动子PTrc和PRe控制下的phaC-alkK操纵子融合物。为了只用IPTG诱导性PTrc启动子表达操纵子，通过用来自pMS93的只含有phaC 5′端837个碱基对的EcoRI-BspEI片段替换pMS92中含有PRe和phaC CDS 5′端837个碱基对的EcoRI-BspEI片段，来去除PRe启动子区。由此得到的含有只处于PTrc启动子控制下的phaC-alkK的质粒称为pMS102。
通过首先使用引物Posynrbs.c(5′-GGAATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATCAG)(SEQ IDNO：9)和Posynrbs.r(5′-CGGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTGCG)(SEQ IDNO：10)经PCR扩增来自食油假单胞菌基因组DNA的alkK，产生质粒pTrcN-A.eut-AlkK。用EcoRI和BamHI消化所得PCR产物，并将其连接到以类似方式消化的pTrcN，产生pTrcN-AlkK。随后，使用引物A.eut.PhaG.c(5′-GGAATTCGGATCCCAAGTACCTTGCCGACATCTATGCGCTGGC)(SEQ IDNO：11)和A.eut.EcoRI.r(5′-GGAATTCCCGGCTCCGGGATTGCCCTGGCCGGACT)(SEQ ID NO：12)，由富养罗尔斯通氏菌基因组DNA经PCR扩增PRe启动子。用EcoRI消化所得PCR产物，并将其连接到以类似方式消化的pTrcN-AlkK，以产生pTrcN-A.eut-AlkK。
将质粒pFS92、pMS96、pMS93和pMS102单独转化到MG1655中(杰森(Jensen)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)175(11)：3401-3407(1993))，以产生含有辅酶A转移酶/合成酶(orfZ或alkK)和PHA合成酶(phaC或phaEC)的不同组合的4种带有质粒的菌株。使这些菌株在250毫升摇瓶中生长，以表征P(5HV)均聚物的产生，如下一节中所述。
用于在摇瓶培养物中产生P(5HV)均聚物的培养基、生长条件和测试
在37℃下，在250转/分钟振荡下，使每一带有质粒的MG1655菌株在含有3毫升补充有适宜抗生素的LB(撒布鲁克(Sambrook)和鲁塞尔(Russell)，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社(Cold Spring HarborPress)(2001))的试管中生长过夜。适于每一菌株的抗生素如下：将100微克/毫升氨比西林(ampicillin)添加到带有pFS92和带有pMS96的MG1655菌株的过夜培养物中；且将50微克/毫升Km添加到带有pMS93和带有pMS102的MG1655菌株的过夜培养物中。次日，使用0.5毫升每一过夜培养物接种含有50毫升补充有适宜抗生素的新鲜LB的摇瓶，并在37℃下，在250转/分钟振荡下生长。3.5小时后，将0.1毫摩尔浓度IPTG添加到液体培养物中，且在5小时后，在4150转/分钟下对培养物进行短暂离心(索沃兰杰德RT系列(Sorvall Legend RT)台式离心机)，并将所得物再悬浮于50毫升含有0.1毫摩尔浓度IPTG和相同抗生素的生产培养基(production medium)中。生产培养基由含有10克/升葡萄糖、2.5克/升LB、10克/升Na5HV、2毫摩尔浓度MgSO4的1×E2基本盐溶液以及1×微量盐溶液(Trace Salts Solution)组成。50×E2储备液由1.275摩尔浓度NaNH4HPO4·4H2O、1.643摩尔浓度K2HPO4和1.36摩尔浓度KH2PO4组成。1000×储备微量盐溶液是通过每1升1.5当量浓度HCL添加以下各物来制备：50克FeSO4·7H2O、11克ZnSO4·7H2O、2.5克MnSO4·4H2O、5克CuSO4·5H2O、0.5克(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.1克Na2B4O7和10克CaCl2·2H2O。
将再悬浮的培养物转移到250毫升摇瓶中，并在30℃下振荡培育24到72小时。实验结束时，以4150转/分钟对培养物进行短暂离心，用蒸馏水洗涤1次，在-80℃下冷冻至少30分钟，并冻干过夜。次日，将一定量的冻干细胞小球添加到玻璃管中，随后添加3毫升由99.9％正丁醇与4.0当量浓度HCl的二噁烷溶液的等体积混合物组成的丁醇分解(butanolysis)试剂，其中2毫克/毫升二苯基甲烷作为内标物。封盖玻璃管后，对其进行短暂涡旋，并放到设置为93℃的加热块上，在周期性涡旋下培育6小时。此后，将管冷却到室温，随后添加3毫升蒸馏水。将管涡旋约10秒，随后以620转/分钟短暂离心(索沃兰杰德RT系列(Sorvall Legend RT)台式离心机)2分钟。将1毫升有机相用滴管吸取到GC小瓶中，随后通过气相色谱-火焰电离检测(gas chromatography-flameionization detection，GC-FID)(霍勒特-帕卡德5890系列II(Hewlett-Packard 5890 SeriesII)气相色谱仪)加以分析。通过针对通过在单独丁醇分解反应中添加定量DVL制得的标准曲线进行比较，来确定细胞小球中P(5HV)均聚物的量。使用在2到6毫克范围内的三种DVL标准品来产生标准曲线。
实验结果
表2显示，所有构建体都能够产生P(5HV)。然而，MG1655[pMS93]产生的P(5HV)明显多于任何其它菌株，说明用于聚合P(5HV)的最佳基因组合是phaC与orfZ。
表2.P(5HV)均聚物产生
Figure BPA00001422629600321
实例2：由5-羟基戊酸钠生物合成P(3HB-共-5HV)共聚物
接下来的实验将说明能够合成3HB-CoA和5HV-CoA单体并将其并入PHA中的大肠杆菌菌株中P(3HB-共-5HV)共聚物的产生。
菌株构建
本实例中使用的菌株是MBX2641，其为MG1655的衍生物，含有由富养罗尔斯通氏菌H16 bktB-巨大芽孢杆菌phaB-kan随机整合到染色体中组成的操纵子。为进行操纵子整合，使用从文献(德洛伦佐(De Lorenzo)和替米斯(Timmis)，酶学方法(MethodsEnzymol)235：386-405(1994))得到的方案，使含有pCJ022(如下文所述)的菌株S17-1λpir(米勒(Miller)和麦卡诺斯(Mekalanos)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)170(6)：2575-2583(1988))与MG1655的萘啶酮酸抗性突变体MBX1987交配。在含有30微克/毫升萘啶酮酸(Nl)和50微克/毫升卡那霉素(Km)的LB板上选择在染色体中带有bktB-phaB-kan盒的MBX1987衍生物。展现NlR KmR表型的一种此类整合体保存为MBX2079。接着，通过使MBX2079与带有整合载体pUT-C16-cat(如下文所述)的S17-1λpir菌株交配，将phaEC-cat随机整合到MBX2079的染色体中。在含有25微克/毫升氯霉素(Cm)的LB板上选择在染色体中带有phaEC-cat盒的MBX2079的整合体。汇集数种具有NlR KmR CmR表型的整合体，并对其进行亚硝基胍诱变处理(米勒(Miller)，分子遗传学实验(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)(1972))，同时在含有100微克/毫升Cm的LB板上选择。分离出一种突变体，并将其称为MBX2114。最后，如米勒(Miller)(分子遗传学实验(Experiments inMolecular Genetics)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1972))所述，使用KmR作为选择，用P1溶解产物喂养MBX2114，并转导到MG1655中，由此产生MBX2641。保存一种此类转导体并将其称为MBX2641，其为基因组中随机整合有bktB-phaB-kan基因盒的MG1655。
将质粒pFS92(参看实例1)和pJB84(如下文所述构建)单独转化到含有随机整合到染色体中的bktB-phaB-kan的MBX2641中。
质粒构建
通过产生在kan标记物上游含有bktB-phaB的mini-Tn5整合载体来制备质粒pCJ022。为此，通过首先用来自pMON25765(斯拉特(Slater)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)180(8)：1979-1987(1998))的引物MS069和MS070经PCR扩增bktB，来将bktB-phaB操纵子组装到pSE380(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))上。引物MS069的序列为(5′)-GGTGGATCCTTAAGAGGAGGTTTTTATGACGCGTGAAGTGGTAGTGG(SEQ IDNO：13)且引物MS070的序列为(5′)-GGTGCTAGCTCAGATACGCTCGAAGATGGCG(SEQ ID NO：14)。用BamHI和NheI消化所得PCR片段，并将其连接到已经用同种酶切割的pSE380。所得质粒称为pSE380-bktB。接下来，用引物MS071和MS072，由pGM10(麦克库尔(McCool)和坎侬(Cannon)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)181(2)：585-592(1999))经PCR扩增phaB。引物MS071的序列为(5′)-GGTCCTAGGTTAAGAGGAGGTTTTTATGACAACATTACAAGGTAAAG(SEQ IDNO：15)且引物MS072的序列为(5′)-GGTGCGGCCGCTTACATGTATAAGCCGCCGTTAAT(SEQ ID NO：16)。用AvrII和NotI消化所得PCR片段，并将其连接到已经用同种酶处理的pSE380-bktB。所得质粒称为pSE380-bktBphaB19。在组装好操纵子后，通过用EcoRI和SpeI消化pSE380-bktBphaB19，并将含有bktB-phaB的片段连接到已经用EcoRI和XbaI切割的pTrcN-kan，将操纵子移到pTrcN-kan(bla基因经kan基因替换的pTrcN的衍生物)。所得质粒称为pMS115。随后，通过用BamHI消化pMS115和pBSL118，并将其连接在一起产生质粒pCJ022，将bktB-phaB操纵子由pMS115转移到pBSL118整合载体(埃里克谢维(Alexeyev)等人，加拿大微生物学志(Can.J.Microbiol.)41：1053-1055(1995))，这一整合载体可用来将bktB-phaB整合到MG1655的染色体中。
通过用EcoRI和XbaI去除pFS91中的phaEC，并使用克列诺片段将粘性末端(stickyend)处理成平末端，来制备质粒pUT-C16cat。用AvrII消化整合载体pUT-cat(德洛伦佐(De Lorenzo)和替米斯(Timmis)，酶学方法(Methods Enzymol.)235：386-405(1994))，使用克列诺片段补平产生平末端，随后连接到phaEC片段。验证phaEC与下游cat标记物为相同定向后，所述质粒称为pUT-C16cat。
通过使用经工程改造成在5′侧翼端包括BspHI位点的引物JB123b和JB124a，经PCR扩增pBSL202(埃里克谢维(Alexeyev)等人，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)41：1053-1055(1995))的aacC(GmR)标记物，来构建质粒pJB84。引物JB123b的序列为(5′)-TTATTTCATGAACCCTCGAATTGACGCGCTC(SEQ ID NO：17)且引物JB124a的序列为(5′)-TTATTTCATGAGCTTATCGATACCGTCGACC(SEQ ID NO：18)。用BspHI消化所得含有aacC基因的PCR片段，并将其连接到已经用同种酶消化的pMS93，形成pJB84。应注意，进行这一最后步骤是为了用相同定向的aacC(GmR)替换pMS93上的初始bla(ApR)标记物。
实验结果
如实例1中所述，使带有质粒pFS92(如实例1中所述)或pJB84的MBX2641菌株生长并准备用于GC-FID分析。MBX2641[pJB84]产生较多共聚物(69.5％dcw)，且将较多5HV并入共聚物(82.3％PHA)中，如表3中所示。
表3.P(3HB-共-5HV)的产生
实例3：P(3HB-共-5HV)共聚物中可调的5HV单体组成及其对材料特性的影响
通过改变添加到生产培养基中的Na5HV和葡萄糖的量来调节共聚物组成。实现此目的的替代方式包括(1)将不同量的L-赖氨酸馈入可由L-赖氨酸产生5HV的重组细胞的生长培养基中，如实例6中所示；或(2)对可经由L-赖氨酸由葡萄糖产生5HV的重组细胞中L-赖氨酸路径基因解除调控，如实例9和10中所示。
为了说明P(3HB-共-5HV)共聚物中可调的5HV单体组成，使用表达3HB路径的酶(bktB和phaB)以及辅酶A转移酶(orfZ)和PHA合成酶(phaC)的菌株MBX2641[pFS30]。使MBX2641[pFS30]的平行培养物在递减浓度的葡萄糖(10、5、1、0.5、0.1、0克/升)或Na5HV(10、5、1、0.5、0.1、0克/升)中生长，并如实例1中所述分析聚合物内含物。表4显示，各种量的5HV都可并入P(3HB-共-5HV)共聚物中。
表4.共馈给对5HV并入P(3HB-共-5HV)中的影响
Figure BPA00001422629600352
Figure BPA00001422629600361
在另一实验中，产生总计10个具有多种5HV组成的P(3HB-共-5HV)共聚物样品，随后萃取用于差示扫描量热(differential scanning calorimetry，DSC)分析。表5显示，玻璃化转变温度(Tg)随P(3HB-共-5HV)共聚物中5HV组成百分比增加而降低。这说明，可通过调节5HV共聚单体组成获得多种材料特性。
表5.萃取的聚合物的材料特性
Figure BPA00001422629600362
实例4：由Na5HV经由脂肪酸降解系统合成3-羟基丙酸
为了确定大肠杆菌的脂肪酸降解(FAD)系统是否能将5HV分解为乙酰辅酶A和3-羟基丙酰基辅酶A(3-hydroxypropionyl-CoA，3HP-CoA)，将质粒pMS93(由Ptrc启动子表达phaC-orfZ，参看实例1)转化到fadR+，atoC+(受阻遏的FAD)或fadR-，atoCconst(解除阻遏的FAD)大肠杆菌K12菌株中。MG1655和LS5218(斯帕特(Spratt)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol)，146(3)：1166-1169(1981))分别用作fadR+，atoC+和fadR-，atoCconst菌株。如实例1中所述，通过在摇瓶中馈入Na5HV来测试MG1655[pMS93]和LS5218[pMS93]。GC-FID和GC-质谱(Mass Spectroscopy，MS)分析说明，LS5218[pMS93]产生P(5HV-共-3HP)，而MG1655[pMS93]不产生(表6)。这显示，活性脂肪酸降解将由5HV产生3HP。
表6.3HP并入P(5HV-共-3HP)中
Figure BPA00001422629600363
Figure BPA00001422629600371
实例5：由L-赖氨酸生物合成P(5HV)均聚物
图2B示意性图示了设计成将L-赖氨酸转变成P(5HV)的路径，并且这一路径需要在大肠杆菌中克隆和表达6种异源基因：恶臭假单胞菌davB、恶臭假单胞菌davA、恶臭假单胞菌davT、拟南芥gsaRAt、科氏梭菌orfZ和假气单胞菌phaC(参看表1A)。设计的克隆策略应将davBAT基因克隆到pACYC184中(常(Chang)和柯汗(Cohen)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)134：1141-1156(1978))，并将gsaRAt、orfZ和phaC克隆到pSE380中。这些质粒分别称为pJB91和pMZ28，且其组装描述于下一节中。
质粒构建
用引物JB134(5′-TGAGCGGATAACAATTTCAC)(SEQ ID NO：19)和JB135(5′-AATAACACGTCAACGCAAAAAGGCCATCCGT)(SEQ ID NO：20)经PCR扩增质粒pSE380的多克隆位点。用BmgBI消化所得PCR产物，并将其克隆到用EcoRV和NruI消化的质粒pACYC184中，产生pJB78。
质粒pJB91是按3个步骤的工艺构建。首先，使用引物JB136和JB137，由基因组DNA试样经PCR扩增恶臭假单胞菌的davBA基因，这些引物经工程改造以在davBA PCR产物的5′和3′端分别并入NdeI和BsrGI限制性位点。引物JB136的序列为(5′)-TTTTTCATATGAGGAGGTTTTTATGAACAAGAAGAACCGCCA(SEQ ID NO：21)且引物JB137的序列为(5′)-TTTTTTGTACATCAGCCTTTACGCAGGTGCA(SEQ IDNO：22)。用NdeI和BsrGI消化所得PCR产物，并将其连接到已经用同种酶处理的pJB78，得到质粒pJB79。接下来，使用引物JB138和JB139，由基因组DNA经PCR扩增恶臭假单胞菌的davT基因，这些引物经工程改造以在davT PCR产物的5′和3′端分别并入SpeI和ApaLI限制性位点。引物JB138的序列为(5′)-TATATACTAGTAGGAGGATAATATGAGCAAAACCAACGAATC(SEQ ID NO：23)且引物JB139的序列为(5′)-TTTTTGTGCACTCAGGCGATTTCAGCGAAGC(SEQ IDNO：24)。用SpeI和ApaLI消化所得PCR产物，并将其连接到已经用同种酶消化的pJB79，从而得到质粒pJB80。最后，使用引物JB141和JB142，由大肠杆菌K12基因组DNA经PCR扩增ompA启动子，这些启动子经工程改造成分别在5′和3′端并入BmgBI和AseI限制性位点。用BmgBI和AseI消化所得PCR产物，并将其连接到已经用SnaBI和NdeI消化的pJB80，形成质粒pJB82。通过用DraIII消化用引物JB136和JB137产生的davBAPCR产物(如上文所述)，并将507个碱基对的片段连接到已经用同种酶消化的pJB82，来构建质粒pJB91，由此产生质粒pJB91。这一构建的进行是为了校正在pJB82的davBCDS中发现的无义突变。质粒pJB80含有处于组成性Ptet启动子控制下的davBAT操纵子，而质粒pJB91含有处于强PompA启动子控制下的同种操纵子。
通过用BsrGI消化质粒pJ31：7950来构建质粒pMZ28，所述质粒pJ31：7950是通过DNA 2.0(加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park，CA))产生且含有经密码子优化以供在大肠杆菌K12中表达的gsaRAt的构建体。将所得含有gsaRAt的片段连接到也已经用BsrGI切割的pFS30。通过限制性酶消化验证gsaRAt的定向与phaC-orfZ方向相同后，所得质粒称为pMZ28。
实验结果
在含有3毫升补充有适宜抗生素(对于pJB91，25微克/毫升氯霉素；对于pMZ28，100微克/毫升氨比西林)的LB的试管中，接种表达不完全的由L-赖氨酸合成P(5HV)的路径的MG1655[pMZ28]以及表达完整的由L-赖氨酸合成P(5HV)的路径的MG1655[pMZ28，pJB91]，并使其在37℃下在250转/分钟振荡下生长过夜。次日，使用0.5毫升每一过夜培养物接种含有50毫升补充有适宜抗生素的新鲜LB的摇瓶，并在37℃下，在250转/分钟振荡下生长。3.5小时后，将0.1毫摩尔浓度IPTG添加到液体培养物中，且在5小时后，在4150转/分钟下对培养物进行短暂离心(索沃兰杰德RT系列(SorvallLegend RT)台式离心机)，并将所得物再悬浮于50毫升生产培养基中，所述生产培养基由含有10克/升葡萄糖、2.5克/升LB、10克/升L-赖氨酸、2毫摩尔浓度MgSO4的1×E2基本盐溶液、1×微量盐溶液和0.1毫摩尔浓度IPTG组成。有关E2盐和微量盐溶液的配方提供于实例1中。
摇瓶生长条件和有关PHA内含物的分析方案如实例1中所述。表7显示在引入davBAT操纵子后产生的P(5HV)是初始的8倍。
表7.由L-赖氨酸产生P(5HV)
Figure BPA00001422629600381
实例6：由L-赖氨酸生物合成P(3HB-共-5HV)共聚物
也将设计成将L-赖氨酸转变成P(5HV)的路径引入表达bktB和phaB的菌株MBX2641中，以由L-赖氨酸且最后由葡萄糖产生P(3HB-共-5HV)共聚物。
质粒构建
构成本实例路径的基因包括：恶臭假单胞菌davB、恶臭假单胞菌davA、恶臭假单胞菌davT、科氏梭菌orfZ、假气单胞菌phaC和拟南芥gsaRAt或土曲霉gsaRAt2(参看表1A)。
按以下方式产生质粒pJB90，其含有由gsaRAt2、phaC和orfZ基因组成的替代路径。使用引物JB145和JB146，由pSG40(由DNA 2.0(加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park，CA))产生的构建体)经PCR扩增密码子优化成在大肠杆菌K12中表达的土曲霉gsaRAt2基因。两种引物在5′端都含有BglII位点。引物JB145的序列为(5′)-TTTTTAGATCTAGGAGGTTTTTATGCTGCGTGCTGCTTCTCG(SEQ ID NO：25)且引物JB146的序列为(5′)-TTTTTAGATCTTTAGCGGAAATAGTTTGGAC(SEQ IDNO：26)。用BglII消化所得PCR片段，并将其连接到pJB84的相应位点中，产生pJB90。
实验结果
如实例1和2中所述，使菌株MBX2641[pJB78，pJB84]、MBX2641[pJB91，pMZ28]和MBX2641[pJB91，pJB90]在摇瓶中生长，并分析PHA内含物和组成，以表征L-赖氨酸和葡萄糖如何产生P(3HB-共-5HV)。在含有3毫升补充有25微克/毫升氯霉素和100微克/毫升氨比西林的LB的试管中接种MBX2641[pJB78，pPB84]、MBX2641[pJB91，pMZ28]和MBX2641[pJB91，pJB90]，并使其在37℃下在250转/分钟振荡下生长过夜。次日，使用0.5毫升每一过夜培养物接种含有50毫升补充有同种抗生素的新鲜LB的摇瓶，并在37℃下，在250转/分钟振荡下生长。3.5小时后，将0.1毫摩尔浓度IPTG添加到液体培养物中，且在5小时后，在4150转/分钟下对培养物进行短暂离心(索沃兰杰德RT系列(Sorvall Legend RT)台式离心机)，并将所得物再悬浮于50毫升生产培养基中，所述生产培养基由含有10克/升葡萄糖、2.5克/升LB、10克/升L-赖氨酸、2毫摩尔浓度MgSO4的1×E2基本盐溶液、1×微量盐溶液和0.1毫摩尔浓度IPTG组成。有关E2盐和微量盐溶液的配方提供于实例1中。
如表8中所示，不具有将L-赖氨酸转变成5HV的基因的菌株MBX2641[pJB78，pJB84]不能由L-赖氨酸产生5HV，并且只产生P(3HB)均聚物。含有由L-赖氨酸合成5HV-CoA的完整路径的菌株MBX2641[pJB91，pMZ28]和MBX2641[pJB91，pJB90]在总共聚物中并入的5HV以重量计分别为2.5％和5％。这说明，为了能由L-赖氨酸产生含5HV的共聚物，需要表达davBAT和gsaR基因。
表8.由L-赖氨酸产生P(3HB-共-5HV)
Figure BPA00001422629600401
实例7：由L-赖氨酸生物合成含5HV的PHA聚合物的改进
由于5HV的并入量极低，故考虑存在竞争路径。为了解是否能由L-赖氨酸产生戊二酸，在30℃下，在振荡下，使表达来自质粒pJB91的davBAT基因的MG1655[pJB91]在含有25毫克/升氯霉素的LB培养基中生长6小时。将25微升处于对数中期的培养物等分试样接种到475微升E0基本培养基中，并在30℃下，在250转/分钟振荡下培育48小时。E0基本培养基由10克/升葡萄糖、4克/升赖氨酸、58毫摩尔浓度K2HPO4、27毫摩尔浓度KH2PO4、2毫摩尔浓度MgSO4、25微克/毫升氯霉素、0.1毫摩尔浓度IPTG和微量元素组成。如下文所略述，借助GC-MS测量上清液中存在的戊二酸：通过离心发酵液获得上清液，并将1微升样品用滴管吸取到含有1微升1克/升4-氨基丁酸(GABA)作为内标物的新艾本多夫管(Eppendorf tube)中。在拉康克森特瓦离心浓缩仪(Labconcocentrivap)中干燥样品，并通过超声处理使其再悬浮于100微升乙腈(acetonitrile，ACN)：N-(叔丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(N-(t-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide，MTBSTFA)的1∶1溶液中，保持3小时。随后，在65℃下使样品衍生化30分钟，离心去除不溶物质，并将上清液注入装配有HP-5ms柱且使用以下采集参数的安捷伦5975气/质联用仪(Agilent 5975 GC-MS)中：载气：氦；流速：2毫升/分钟；扫描模式m/z 65-700；溶剂延迟时间3.5分钟；烘箱程序：150℃，保持2分钟，随后以3℃/分钟匀变到280℃；离子源温度230℃；四极滤质器温度150℃。
有趣的是，当在MG1655中过量表达davBAT操纵子时，由L-赖氨酸产生0.6克/升戊二酸。davBAT操纵子表达编码将L-赖氨酸转变成GSA的酶的基因。戊二酸可由一种内源大肠杆菌基因产生，这种大肠杆菌基因所编码的酶可将GSA氧化成戊二酸。
检查由GSA得到戊二酸的可能酶促反应将鉴别出两个可能的内源大肠杆菌GSA脱氢酶基因：gabD和/或yneI(参看表1A)。先前已经鉴别出这两个基因可将琥珀酸半醛氧化成琥珀酸(丹尼斯(Dennis)和沃伦亭(Valentin)，美国专利第6,117,658号)，但其尚未显示出可将GSA氧化成戊二酸。为了测试gabD-和yneI阴性菌株是否仍能由L-赖氨酸产生戊二酸，构建以下菌株。
根据达森克(Datsenko)和沃纳(Warnner)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl，Acad.Sci.USA.)97：6640-6645(2000))所述的Red/ET重组(Recombineering)方法，构建单一无效的gabD和yneI突变体。缺失MG1655染色体中的gabD的方法涉及用侧接FRT的kan标记物经由PCR介导的同源重组替换gabD。使用引物RF3145′-GCAAGCCAGAGTAACCCCGGACGCACGCTGCGAGCGGCACGTAGTGTGGATGCCTTACACGCCGCATTTAATCAATAACCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO：27)和RF3155′-GAATTTGCCCAACGCCACGGGGAATCGCCTGACTGCGGCGCTGCATTAACTCTTTATTGCTGTTCATTCGCATTCTCCAGATGGGAATTAGCCATGGTCCATATGAATAT(SEQID NO：28)，由质粒pKD4(达森克(Datsenko)和沃纳(Warnner)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl，Acad.Sci.USA.)97：6640-6645(2000))经PCR扩增侧接FRT的kan标记物。
通过用侧接FRT的kan标记物替换yneI基因，使MG1655染色体中缺失yneI基因。使用引物MS2205′-GCAAGAGTAAATCTGCGTATCTTCATACCATGACTCATAAAGGAGATACCCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO：29)和MS2175′-ACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGTATATCAGAGCTGAATATGTCGCGCATATGAATATCCTCCTTAGT(SEQ ID NO：30)，由质粒pKD4经PCR扩增此标记物，所述引物引入与待缺失的基因同源的50个碱基对的侧翼区。用这一DNA片段替换yneI不能起作用，且因此，产生另一PCR片段，其具有同源性较高的区域以供基因替换。为实现此目的，用以上产生的PCR片段作为模板，并使用引物MS2235′-TCGATTCGTGAATAAGTGGCTTAATATTATTCATTTTAAAGCAAGAGTAAATCTGCGTATC(SEQ ID NO：31)和MS2245′-GCCACTTTCTACTCCTGGACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGTATATCAGAGCTG(SEQ ID NO：32)进行另一轮PCR。由此实现用FRT-kan-FRT成功替换yneI。随后，如达森克(Datsenko)和沃纳(Warnner)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl，Acad.Sci.USA.)97：6640-6645(2000))中所述，去除kan标记物。
由MG1655ΔgabD::FRT-kan-FRT通过P1介导的转导法来转导MG1655ΔyneI::FRT，由此构建MG1655ΔgabD::FRT-kan-FRT，ΔyneI::FRT，并使用与上文所述相同的方法，进一步去除残余kan标记物。用pJB91转化所得菌株MG1655ΔgabD::FRT，ΔyneI::FRT，并分析在与上文所述利用表达来自pJB91质粒的davBAT基因的MG1655[pJB91]的实验类似的实验中由L-赖氨酸产生戊二酸的情况。
与MG1655[pJB91]由L-赖氨酸产生0.6克/升戊二酸相比，菌株MG1655ΔgabD::FRT，ΔyneI::FRT[pJB91]由L-赖氨酸不产生任何戊二酸，说明大肠杆菌内源性gabD和/或yneI都不负责将GSA转变成戊二酸。
由L-赖氨酸产生P(3HB-共-5HV)共聚物的改进
通过使产生3HB-共-5HV共聚物的菌株中缺失编码内源性GSA脱氢酶的基因gabD和yneI，来改进由L-赖氨酸合成5HV的通量。
通过将质粒pJB91和pJB90转化到菌株MBX2641中来构建MBX2855。这一菌株具有由葡萄糖和L-赖氨酸产生P(3HB-共-5HV)的所有基因。
如实例2中所述，用赋予PHB产生能力的供体菌株MBX2114经P1转导MG1655ΔgabD::FRT，ΔyneI::FRT。用pJB90和pJB91进一步转化此菌株，这两种质粒分别如实例6和5中所述表达由L-赖氨酸合成P(5HV)的路径的基因。所得菌株称为MBX3378，并且具有由葡萄糖和L-赖氨酸产生P(3HB-共-5HV)的所有基因，但与MBX2855不同，MBX3378的基因组中去除了gabD和yneI基因。
使用菌株MBX2855和其GSA脱氢酶缺陷型对应物MBX3378进行振荡板发酵。在与上文所述相同的条件(在30℃下，以300转/分钟振荡)下，培育和分析细胞。如先前的实例中所述，E0基本培养基由10克/升葡萄糖、2克/升L-赖氨酸、58毫摩尔浓度K2HPO4、27毫摩尔浓度KH2PO4、2毫摩尔浓度MgSO4、25微克/毫升氯霉素、5微克/毫升庆大霉素(gentamicin)、0.1毫摩尔浓度IPTG和微量元素组成。如表9中所示，与含有野生型GSA脱氢酶活性的MBX2855相比较，GSA脱氢酶缺陷型菌株MBX3378中由L-赖氨酸合成5HV的碳通量明显改进。为显著改进含5HV的PHA的产量，需要从生产宿主的基因组中去除GSA脱氢酶基因，例如gabD和yneI。
表9.由L-赖氨酸产生P(3HB-共-5HV)的改进
Figure BPA00001422629600421
Figure BPA00001422629600431
实例8：由葡萄糖生物合成L-赖氨酸
变构反馈调控是在L-赖氨酸路径中通过基因lysC和dapA发生。因此，需要消除这一控制作用以便能使由葡萄糖得到L-赖氨酸的产量增加。实现此目的的程序已经确立且已经针对两种基因加以描述(小岛(Kojima)等人，美国专利第6,040,160号)。首先通过缺失大肠杆菌的metL和thrA获得具有解除调控的lysC和dapA的大肠杆菌突变体。LysC、MetL和ThrA是都催化同一天冬氨酸激酶反应的同工酶，因此，在阳性选择lysC突变之前，需消除后两者。一旦制备出ΔmetL ΔthrA菌株，就可用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)使其突变。接着，使所得突变体库在含有S-2-氨基乙基半胱氨酸(S-2-aminoethylcysteine，AEC)(L-赖氨酸的不可代谢类似物)的基本培养基中生长，以便对lysC和dapA施加压力。由于缺少metL和thrA，只有使lysC和dapA对L-赖氨酸(或其AEC类似物)脱敏的突变将使细胞合成L-赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸，并因此存活下来。可通过由重组启动子过量表达解除调控的lysC、解除调控的dapA和其它路径基因，来进行其它处理，以增加通量并消除转录调控。
实例9：由葡萄糖生物合成P(5HV)均聚物
利用葡萄糖作为唯一碳源，在能够由葡萄糖合成5HV-CoA单体并且将其并入PHA中的大肠杆菌菌株中产生P(5HV)。为此，构建的菌株不仅表达由L-赖氨酸产生P(5HV)均聚物所需的基因，而且还表达编码L-赖氨酸反馈抗性二氢吡啶二羧酸合成酶的突变dapA基因(称为dapAfbr)。本实例的第一部分将描述说明这一能力所需的质粒的构建。
质粒构建
在大肠杆菌中，变构调控是在L-赖氨酸路径中通过分别由lysC和dapA基因编码的天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合成酶发生。为增加由葡萄糖合成L-赖氨酸且最终合成P(5HV)均聚物的产量，需要减少或完全消除变构调控。实现此目的的程序已经确立且已经针对两种基因加以描述(小岛(Kojima)等人，美国专利第6,040,160号)。构建的L-赖氨酸反馈抗性dapAfbr基因中第352位核苷酸残基由胞嘧啶变为胸腺嘧啶(dapAC352T)。这是通过使用引入所需碱基改变的引物，经PCR扩增产生两个DNA片段的染色体大肠杆菌dapA基因，随后借助重叠延伸PCR(SOE-PCR)剪接以融合两个DNA片段来实现。先前已经描述过SOE-PCR方法(霍(Ho)等人，基因(Gene)77(1)：51-9(1989))。详细点说，一个DNA片段含有用引物DE081(5′-AAAAGAATTCTTAATTAATTCTAGAAGGAGGTTTCATATGTTCACGGGAAGTATTGTC)(SEQ ID NO：33)和DE082(5′-AGCGATGGCTTTGAAATACTGATACAAACCTTC)(SEQ ID NO：34)扩增的dapA基因的第1对到第366对核苷酸，且另一DNA片段含有用引物DE083(5′-GAAGGTTTGTATCAGTATTTCAAAGCCATCGCT)(SEQ ID NO：35)和DE084(5′-CCCGAGCTCGTTTAAACTTAATTAAGACTAGTTTTACAGCAAACCGGCATGCTT)(SEQ ID NO：36)扩增的dapA的第337对到第879对核苷酸。引物DE082与DE083反向互补，且设计成在第352位核苷酸碱基处引入胞嘧啶变为胸腺嘧啶的碱基改变。使用引物DE081和DE084，借助SOE-PCR融合由第一轮PCR得到的两个DNA片段。用XbaI和SacI消化所得PCR产物，并将其连接到已经用SpeI和SacI消化的pDE031，由此产生质粒pDE035。通过用XbaI和PmeI消化合成的63个碱基对的双链DNA片段(5′-TTTTTCTAGATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCACTAGTGTTTAAACCCCC)(SEQ ID NO：37)并将其连接到先前工程改造成含有相同限制性酶位点的pBluescript II SK(+)质粒(斯特杰公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla，CA))的这些位点中，来构建含有合成组成性启动子(PsynI)的质粒pDE031。用Xho1和PmeI消化pDE035中的PsynI-dapAC352T基因构建体，随后将其与已经用BsrGI消化的质粒pJB90(如实例6中所述)连接，并用绿豆核酸酶处理成平末端，并再次用XhoI消化，以产生由Ptrc启动子表达phaC-gsaRAt-orfZ操纵子且由PsynI启动子表达dapAC352T基因的质粒pJG22。
实验结果
将质粒pJG22以及质粒pJB91(如实例5中所述)转化到菌株MBX3342(MG1655ΔgabD::FRTΔyneI::FRT)中，形成菌株MBX3342[pJB91，pJG22]。也将分别用于构建pJG22和pJB91的空载体质粒pSE380和pACYC184转化到菌株MBX3342中，以产生阴性对照菌株MBX3342[pSE380，pACYC184]。在30℃下，在2×E2培养基中以300转/分钟振荡培育这些菌株48小时，并如先前的实例中所述进行分析。如上文所述，培养基由15克/升葡萄糖、52毫摩尔浓度NaNH4HPO4、66毫摩尔浓度K2HPO4、54毫摩尔浓度KH2PO4、2毫摩尔浓度MgSO4、0.1毫摩尔浓度IPTG和微量元素组成。对于MBX3342[pJB91，pJG22]的培养基，补充25微克/毫升氯霉素和5微克/毫升庆大霉素，而对于MBX3342[pSE380，pACYC184]，则添加25微克/毫升氯霉素和100微克/毫升氨比西林。表10中的数据显示，MBX3342[pJB9，pJG22]产生以细胞干重(dry cell weight，DCW)计2.60％的P(5HV)均聚物，而菌株MBX3342[pSE380，pACYC184]不产生任何PHA。这些结果说明，除由L-赖氨酸合成P(5HV)的路径的基因外还表达反馈抗性dapA基因的菌株可用葡萄糖作为唯一碳源产生P(5HV)。
表10.由葡萄糖产生P(5HV)
实例10：由葡萄糖生物合成P(3HB-共-5HV)共聚物
接下来的实验将说明能够合成3HB-CoA和5HV-CoA单体并将它们并入PHA中的大肠杆菌菌株中由葡萄糖产生P(3HB-共-5HV)共聚物的情况。
实验结果
将来自菌株MBX2114的btkB-phaB-kan基因经P1转导到MBX3342中，产生菌株MBX3344。用质粒pJB91和pJG22转化MBX3344，产生菌株MBX3344[pJB91，pJG22]。也将质粒pSE380和pACYC184、即分别用于构建pJG22和pJB91的空载体转化到MBX3344中，以产生阴性对照菌株MBX3344[pSE380，pACYC184]。在30℃下，在2×E2培养基中以300转/分钟振荡培育这些菌株48小时，并如先前的实例中所述进行分析。如上文所述，培养基由15克/升葡萄糖、52毫摩尔浓度NaNH4HPO4、66毫摩尔浓度K2HPO4、54毫摩尔浓度KH2PO4、2毫摩尔浓度MgSO4、0.1毫摩尔浓度IPTG和微量元素组成。对于MBX3344[pJB91，pJG22]的培养基，补充25微克/毫升氯霉素和5微克/毫升庆大霉素，而对于MBX3344[pSE380，pACYC184]，则添加25微克/毫升氯霉素和100微克/毫升氨比西林。24小时培育后，向培养液中补充10克/升葡萄糖。表11显示，5HV可并入含有以葡萄糖作为唯一碳源的所有P(3HB-共-5HV)代谢路径基因的菌株中。
表11.由葡萄糖产生P(3HB-共-5HV)
Figure BPA00001422629600452
Figure BPA00001422629600461
接下来，测试菌株MBX3824(W3110ΔgabD::FRTΔyneI::FRTΔcadA::FRTΔldcC::FRTΔargO::FRT bktB-phaB-kan)作为宿主菌株由葡萄糖产生P(3HB-共-5HV)共聚物的情况。在这一菌株中，去除大肠杆菌基因组中可能使L-赖氨酸偏离5HV-CoA共聚单体的竞争路径。
第一个竞争路径可将L-赖氨酸转变成尸胺，并且是由cadA(蒙格(Meng)和贝纳特(Bennett)，细菌学杂志(J.Bacteriol).174(8)：2659-2669(1992)；EcoCyc数据库收录号：EG10131)和ldcC(参看表1A；山本(Yamamoto)等人，基因与遗传系统(GenesGenet.Syst.)72(3)：167-72(1997)；EcoCyc数据库收录号：G6094)所编码的两种L-赖氨酸脱羧酶(EC编号4.1.1.18)组成。
第二个竞争路径可将L-赖氨酸输出到微生物细胞外。在谷氨酸棒杆菌中，L-赖氨酸输出蛋白已经标识为LysE(参看表1A；维基克(Vrljic)等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)22(5)：815-826(1996))。为了鉴别大肠杆菌中推定的L-赖氨酸输出蛋白基因，使用谷氨酸棒杆菌LysE作为查询词来进行数种文献和专利搜索以及BLAST和Psi-BLAST搜索。发现6种蛋白质是从大肠杆菌基因组中去除以防止L-赖氨酸输出到细胞外部的目标。这些蛋白质包括：(1)ArgO(又称为YggA，南迪伦尼(Nandineni)和古韦夏卡(Gowrishankar)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)186：3539-3546(2004))；(2)YfiK(又称为EamB；弗兰克(Franke)等人，细菌学杂志，185：1161-1166(2003))；(3)RhtB(以前称为YigK；扎卡塔瓦(Zakataeva)等人，FEBS通讯(FEBS Lett.)452(3)：228-32(1999))；(4)YahN(库图柯瓦(Kutukova)等人，分子生物学(莫斯科)(Mol Biol.(Mosk.))39(3)；374-378(2005))；(5)RhtC(以前称为YigJ；扎卡塔瓦(Zakataeva)等人，FEBS通讯，452(3)：228-32(1999))；和(6)YeaS(又称为LeuE；库图柯瓦(Kutukova)等人，FEBS通讯，579(21)：4629-34(2005))。鉴于使用谷氨酸棒杆菌LysE作为查询词进行BLASTP搜索时，ArgO的e值(e-value)2e-22最低；用谷氨酸棒杆菌LysE和6种大肠杆菌同系物进行ClustalX多序列比对(汤普森(Thompson)等人，核酸研究(NucleicAcids Res.)25：4876-4882(1997))后，在邻接法构建的进化树(Neighbor Join Tree)中最靠近利用LysE的簇；并且当argO过量表达时，据报告，对L-赖氨酸的抗性是只有载体的对照菌株的3倍且L-赖氨酸积累量相对于只有载体的对照菌株升高38％，因此，ArgO看起来最可能成为将L-赖氨酸输出到大肠杆菌细胞外的候选物(里维特(Livshits)等人，美国专利第6,979,560号)。然而，其它经鉴别的蛋白质也可能输出L-赖氨酸，且因此也是基因缺失的目标。
另一竞争路径可将L-赖氨酸转变成(R)-β-赖氨酸，这一路径是由大肠杆菌yjeK(EcoCyc数据库收录号：G7836；贝哈德(Behshad)等人，生物化学(Biochemistry)45(42)：12639-46(2006))所编码的赖氨酸2，3-氨基变位酶(EC编号5.4.3.-)催化。
如先前所述，由基因桥公司(Gene Bridges)借助Red/ET重组方法，使用以下引物构建单一无效cadA和ldcC突变体：对于ΔcadA::FRT-kan-FRT突变，DE118(5′-TGTCCCATGTGTTGGGAGGGGCCTTTTTTACCTGGAGATATGACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTT)(SEQ ID NO：38)和DE119(5′-GAGCAAAAAAGGGAAGTGGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTAAATGGGAATTAGCCATGGTCC)(SEQ ID NO：39)；且对于ΔldcC::FRT-cat-FRT突变，DE122(5′-TATTTGTTAACAGCACGTTACTCGCCCGGAAGCCGCTCTGGCAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC)(SEQ ID NO：40)和DE123(5′-TATTTGTTAACAGCACGTTACTCGCCCGGAAGCCGCTCTGGCAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC)(SEQ ID NO：41)。使用引物DE106(5′-GTGTTTTCTTATTACTTTCAAGGTCTTGCACTTGGGGCGGCTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)(SEQ ID NO：42)和DE107(5′-CTAACTGAACAAGGCTTGTGCATGAGCAATACCGTCTCTCGCCAGATGGGAATTAGCCATGGTCC)(SEQ ID NO：43)，借助Red/ET重组方法构建单一无效argO突变。通过将ΔgabD::FRT-kan-FRT、ΔyneI::FRT-kan-FRT、ΔcadA::FRT-kan-FRT、ΔldcC::FRT-cat-FRT、ΔcadA::FRT-kan-FRT盒经P1介导的转导法迭代性地转导到菌株W3110中(贝克汉姆(Bachmann)，细菌学研究(Bacterial Rev.)，36(4)：525-557(1972))，随后如先前实例中所述，在每次P1介导的转导后去除kan或cat标记物，来构建W3110ΔgabD::FRTΔyneI::FRTΔcadA::FRTΔldcC::FRTΔargO::FRT。用供体菌株MBX2114经P1转导所得菌株MBX3818，由此完成MBX3824的构建。将质粒pJG22和pJB91转化到MBX3824中，并测试所得菌株MBX3824[pJG22，pJB91]以及MBX3344[pJG22，pJB91]中P(3HB-共-5HV)共聚物的产生。在30℃下，在1.5×E2培养基中以300转/分钟振荡培育这些菌株48小时，并如先前的实例中所述进行分析。如上文所述，培养基由15克/升葡萄糖、39毫摩尔浓度NaNH4HPO4、49.5毫摩尔浓度K2HPO4、40.5毫摩尔浓度KH2PO4、2毫摩尔浓度MgSO4、0.1毫摩尔浓度IPTG和微量元素组成。培养基中补充有25微克/毫升氯霉素和5微克/毫升庆大霉素。表12显示，具有不同遗传背景的各种菌株都能够由葡萄糖产生P(3HB-共-5HV)，且聚合物中5HV的组成不同。具体点说，去除使碳偏离5HV-CoA的竞争路径，例如去除L-赖氨酸输出蛋白argO或两种赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldcC，将使PHA中5HV的并入量增加。
表12.由葡萄糖产生P(3HB-共-5HV)
Figure BPA00001422629600481
实例11：由4-羟基丁酸钠和5-羟基戊酸钠生物合成P(4HB-共-5HV)共聚物
接下来的实验将说明能够合成4HB-CoA和5HV-CoA单体并将其并入PHA中的大肠杆菌菌株中P(4HB-共-5HV)共聚物的产生。用于在重组生物体中工程改造4HB共聚单体的方法详细描述于美国专利第6,117,658号、美国专利第6,316,262号、美国专利第6,689,589号、美国专利第7,081,357号、美国专利第7,229,804号、美国专利第6,759,219号和美国专利申请公开案第2004/0253693号中，这些专利都按全文引用并入本文中。在类似于实例1中所述的实验中，将5-羟基戊酸钠(Na5HV)和4-羟基丁酸钠(Na4HB)馈给菌株MG1655[pMS93]。菌株MG1655[pMS93]含有基因orfZ和phaC，这些基因是分别由Na4HB和Na5HV产生4HB-CoA和5HV-CoA，以及使这些前体聚合成P(4HB-共-5HV)共聚物所需的。用作基质的Na4HB是与关于实例1中Na5HV的制备所述的方法类似，利用γ-丁内酯(GBL)代替DVL制得。用于产生共聚物的培养条件也与实例1中所述相同，不同之处在于，将4克/升Na4HB添加到生产培养基中。在产生PHA期间，如实例1中所述进行MG1655[pMS93]培养物中聚合物内含物的分析，但除制得测定5HV含量的标准曲线外，还使用GBL标准品制得测定4HB含量的标准曲线。这一分析显示，共馈给Na4HB和Na5HV的MG1655[pMS93]培养物产生P(4HB-共-5HV)共聚物，其以细胞干重计占67％，并且具有67％4HB和33％5HV的组成。使用DSC分析此聚合物的萃取样品，并测定其Tg为-54.9℃，并且无可检测出的Tm。
实例12：由葡萄糖生物合成戊二酸
为区分两种基因产物中哪一种是实例7中鉴别的主要GSA脱氢酶，对野生型菌株MG1655[pJB91]、MG1655ΔyneI::FRT[pJB91]与MG1655ΔgabD::FRT[pJB91]由5-氨基戊酸(L-赖氨酸与GSA之间的中间代谢物)(参看图2)产生戊二酸的能力进行比较。全部三种菌株都含有质粒pJB91，其由PompA启动子表达davBAT，如实例5中所述。使三种菌株在含有2克/升5-氨基戊酸的E0基本培养基(如先前所述)中生长，并由培养物上清液通过GC-MS法测量戊二酸。培育方法和条件与实例7中所述相同。
与其它两种菌株不同，MG1655ΔgabD[pJB91]不积累任何可检测出的戊二酸。因此，由gabD编码的脱氢酶主要对GSA具有活性。为此，如果欲产生大量戊二酸，那么生产宿主需要表达gabD或其同系物(参看表1P)。然而，由于MG1655ΔyneI[pJB91]积累的由5-氨基戊酸得到的戊二酸的量略低于MG1655[pJB91]，分别为0.75克/升对1.0克/升戊二酸，故由yneI编码的脱氢酶也对GSA具有适度活性。因此，yneI或其同系物(参看表1Q)过量表达也可以由GSA、L-赖氨酸或葡萄糖产生大量戊二酸。
谷氨酸棒杆菌中存在的两种最佳的GabD同系物包括(1)NAD依赖性醛脱氢酶(收录号：NP_599302)和(2)假定蛋白cgR_0068(收录号：YP_001136931)。出乎意料的是，这两种谷氨酸棒杆菌蛋白也鉴别为两种与大肠杆菌YneI最接近的同系物。
接下来，由葡萄糖产生戊二酸。为了提供过量产生L-赖氨酸的菌株，如下构建含有L-赖氨酸反馈抗性dapAC352T基因的质粒pDE033：用EcoRI和SacI消化实例9中所述的用于制造dapAC352T基因的SOE-PCR产物，随后将其与已经用同种酶消化的pSE380连接，由此产生质粒pDE033。pDE033中的dapAC352T基因是处于IPTG诱导性启动子Ptrc控制下。将质粒pDE033和pJB91(如上文所述)转化到MG1655菌株中，以产生菌株MG1655[pDE033，pJB91]。如上文所述，在30℃下，在含有25克/升葡萄糖、16克/升(NH4)2SO3、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4、2克/升酵母提取物、30克/升CaCO3、0.1毫摩尔浓度IPTG和微量元素的培养基中以300转/分钟振荡培育菌株MG1655和MG1655[pDE033，pJB91]48小时。MG1655[pDE033，pJB91]的培养基中补充有100微克/毫升氨比西林和25微克/毫升氯霉素。如实例7中所述测量戊二酸。表13中所示的数据说明，MG1655[pDE033，pJB91]将0.7克/升戊二酸分泌到培养基中，而阴性对照菌株MG1655不产生任何戊二酸。这一结果清楚地显示，在编码GSA脱氢酶的宿主细胞中使用反馈抗性dapA基因积累L-赖氨酸，同时使用davBAT操纵子将L-赖氨酸转变成GSA，对于以葡萄糖作为唯一碳源产生戊二酸足以。
表13.由葡萄糖产生戊二酸
Figure BPA00001422629600501
实例13：由5-羟基戊酸钠生物合成1，5-戊二醇
菌株构建
使用菌株MBX3017(LS5218ΔadhE::FRT、ΔldhA::FRT、ΔackA-pta::FRT)以及K-12菌株MG1655作为宿主菌株以评估1，5-戊二醇(PDO)是否能积累和分泌到培养基中。由基因桥公司借助Red/ET法构建每一存在单一缺失的菌株。用于构建三种路径的基因敲除盒的引物列于表14中。简单点说，使用以下引物来构建各种染色体缺失：对于ΔadhE盒，MS286和MS287；对于ΔackA-pta盒，MS289和MS290；且对于ΔldhA盒，MS292和MS293。通过将每一单一无效突变迭代性地经P1转导到LS5218中，并如先前实例中所述去除标记物，来获得LS5218ΔadhE::FRT，ΔldhA::FRT，ΔackA-pta::FRT。
表14.用于PDO研究的引物
Figure BPA00001422629600502
Figure BPA00001422629600511
利用引物JRG47和JRG48扩增编码辅酶A依赖性丙醛脱氢酶的鼠伤寒沙门氏菌pduP(参看表1A；利尔(Leal)，微生物学年鉴(Arch.Microbiol.)180：353-361(2003))。用引物JRG49和JRG50扩增编码1，3-丙二醇脱氢酶的肺炎克雷伯氏菌dhaT(参看表1A；童(Tong)等人，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)57(12)：3541-3546(1991))。使用引物JRG47和JRG50，借助SOE-PCR将两个基因融合在一起。经由BamHI和BspHI位点将所得DNA片段克隆到pJB78中，且所得质粒称为pJG10。
在PDO研究中，使用带有pFS16或pSE380以及pJG10或pJB78的菌株MBX3017或MG1655。
在限制氧的条件下，使菌株在含有5HV的E2培养基中生长40小时。如上文所述，培养基由以下各物组成：10克/升葡萄糖、2克/升5HV、26毫摩尔浓度NaNH4HPO4、33毫摩尔浓度K2HPO4、27毫摩尔浓度KH2PO4、2毫摩尔浓度MgSO4、25微克/毫升氯霉素、100微克/毫升氨比西林、0.1毫摩尔浓度IPTG和微量元素。将过夜培养物接种到含有新鲜培养基的密封培养管中，使其生长达到最终OD600值为约0.2，培养管的顶部空间应较小以确保限制培养物的氧。在30℃下培育培养物。培育48小时后，取出100微升样品，离心，并将作为内标物的1，4-丁二醇(0.1克/升)外加到所得上清液中，在拉康克森特瓦离心浓缩仪(Labconco centrivap)中干燥，且通过超声处理再悬浮于100微升乙腈(ACN)中，保持3小时。对乙腈溶液离心以去除不溶物质，并将上清液注入装备有DB-225ms柱且使用以下采集参数的安捷伦5975气/质联用仪中：载气：氦；流速：1毫升/分钟；扫描模式m/z 30-400；烘箱程序：40℃，保持2分钟，随后以10℃/分钟匀变到220℃；离子源温度230℃；四极滤质器温度150℃。
测量的PDO结果显示于表14中。宿主菌株MBX3017与orfZ-dhaT-pduP过量表达的组合得到最高PDO产量：0.32克/升。带有这三种基因的菌株MG1655的产量较低，为0.22克/升，这可能是由其活跃的乙醇、乙酸和乳酸路径所致，乙醇、乙酸和乳酸是已知的电子受体(克拉克(Clark)，FEMS微生物研究(FEMS Microbiol.Rev.)5：223-34(1989))，并且会与5HV路径竞争NAD(P)H。有趣的是，只带有orfZ的MG1655也产生少量PDO，而MBX3017宿主不产生任何可检测出的PDO(表15)。这表明，内源醇脱氢酶，例如adhE，对5HV-CoA具有较弱活性。借助GC-MS，针对PDO标准品以及NIST库PDO参考谱图(如图8中所示)来确定测量的PDO。这些结果说明，利用Na5HV，当表达orfZ基因产生5HV-CoA，并且表达pduP-dhaT基因，将5HV-CoA转变成5-羟基戊醛和PDO时，可产生PDO。
表15.在含有5HV的培养基中生长的菌株的PDO滴度a
a结果是三个独立的重复实验的平均值
基因ID 001核苷酸序列：土曲霉NIH2624戊二酸半醛还原酶基因gsaRAt2
ATGCCACTGGTTGCTCAAAATCCACTGCCACGTGCTATTCTGGGTCTGATG
ACTTTCGGTCCGAGCGAAAGCAAAGGTGCGCGTATCACTTCCCTGGATGAG
TTTAACAAGTGCCTGGATTACTTCCAGCAGCAGGGCTTCCAGGAAATCGAT
ACCGCGCGCATCTACGTCGGCGGTGAACAGGAGGCATTCACGGCGCAGGCA
AAGTGGAAAGAACGCGGCCTGACGCTGGCGACTAAGTGGTATCCGCAGTAC
CCGGGTGCGCACAAACCGGATGTCCTGCGTCAGAACCTGGAGCTGTCCCTG
AAAGAACTGGGCACGAACCAGGTCGATATCTTCTATCTGCACGCCGCGGAT
CGTTCTGTGCCGTTCGCGGAAACTCTGGAAACTGTTAACGAACTGCACAAA
GAAGGCAAATTTGTTCAGCTGGGTCTGTCTAACTACACCGCTTTCGAAGTA
GCTGAAATCGTGACCCTGTGTAACGAGCGTGGTTGGGTTCGTCCGACTATC
TACCAGGCGATGTATAACGCTATCACCCGTAACATCGAAACTGAACTGATC
CCGGCGTGCAAGCGTTACGGTATTGACATTGTTATCTACAACCCACTGGCG
GGTGGCCTGTTCAGCGGCAAATACAAAGCACAGGACATCCCGGCTGAAGGT
CGTTACAGCGACCAATCTTCCATGGGCCAGATGTACCGCAACCGTTACTTT
AAGGACGCAACCTTTGACGCTCTGCGCCTGATCGAACCGGTTGTTGCGAAG
CACGGCCTGACGATGCCGGAAACCGCGTTCCGCTGGGTCCACCACCACTCC
GCACTGAACATGGAAGATGGCGGCCGTGACGGCATCATTCTGGGTGTAAGC
AGCCTGGCTCAGCTGGAAAACAACCTGAAAGACATTCAGAAAGGTCCGCTG
CCGCAGGAGGTTGTAGACGTCCTGGATCAGGCTTGGCTGGTGGCTAAGCCG
ACGGCTCCAAACTACTGGCATCTGGACCTGAAATACACGTACGACACCCAG
GAAGCTCTGTTCAAACCGAAATCTAAGGCGTAA(SEQ ID NO：56)
基因ID 001氨基酸序列：土曲霉NIH2624戊二酸半醛还原酶基因gsaRAt2
MPLVAQNPLPRAILGLMTFGPSESKGARITSLDEFNKCLDYFQQQGFQEID
TARIYVGGEQEAFTAQAKWKERGLTLATKWYPQYPGAHKPDVLRQNLELSL
KELGTNQVDIFYLHAADRSVPFAETLETVNELHKEGKFVQLGLSNYTAFEV
AEIVTLCNERGWVRPTIYQAMYNAITRNIETELIPACKRYGIDIVIYNPLA
GGLFSGKYKAQDIPAEGRYSDQSSMGQMYRNRYFKDATFDALRLIEPVVAK
HGLTMPETAFRWVHHHSALNMEDGGRDGIILGVSSLAQLENNLKDIQKGPL
PQEVVDVLDQAWLVAKPTAPNYWHLDLKYTYDTQEALFKPKSKA(SEQ
ID NO：57)
基因ID 002核苷酸序列：拟南芥戊二酸半醛还原酶基因gsaRAt
ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATGTCCATG
AACCTGCTGAAAAACGGTTTCAAAGTTACCGTGTGGAACCGCACTCTGTCT
AAATGTGATGAACTGGTTGAACACGGTGCAAGCGTGTGCGAGTCTCCGGCT
GAGGTGATCAAGAAATGCAAATACACGATCGCGATGCTGAGCGATCCGTGT
GCAGCTCTGTCTGTTGTTTTCGATAAAGGCGGTGTTCTGGAACAGATCTGC
GAGGGTAAGGGCTACATCGACATGTCTACCGTCGACGCGGAAACTAGCCTG
AAAATTAACGAAGCGATCACGGGCAAAGGTGGCCGTTTTGTAGAAGGTCCT
GTTAGCGGTTCCAAAAAGCCGGCAGAAGACGGCCAGCTGATCATCCTGGCA
GCAGGCGACAAAGCACTGTTCGAGGAATCCATCCCGGCCTTTGATGTACTG
GGCAAACGTTCCTTTTATCTGGGTCAGGTGGGTAACGGTGCGAAAATGAAA
CTGATTGTTAACATGATCATGGGTTCTATGATGAACGCGTTTAGCGAAGGT
CTGGTACTGGCAGATAAAAGCGGTCTGTCTAGCGACACGCTGCTGGATATT
CTGGATCTGGGTGCTATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCC
ATGACTAAATCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAA
GACATGCGTCTGGCTCTGGCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATGCCG
GTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCAAGAAAGCCCGTAGCCTGGGCCTG
GGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGTAAAATTCTCTCGTGAA
TAA(SEQ ID NO：58)
基因ID 002氨基酸序列：拟南芥戊二酸半醛还原酶基因gsaRAt
MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGASVCESPA
EVIKKCKYTIAMLSDPCAALSVVFDKGGVLEQICEGKGYIDMSTVDAETSL
KINEAITGKGGRFVEGPVSGSKKPAEDGQLIILAAGDKALFEESIPAFDVL
GKRSFYLGQVGNGAKMKLIVNMIMGSMMNAFSEGLVLADKSGLSSDTLLDI
LDLGAMTNPMFKGKGPSMTKSSYPPAFPLKHQQKDMRLALALGDENAVSMP
VAAAANEAFKKARSLGLGDLDFSAVIEAVKFSRE(SEQ ID NO：59)
基因ID 003核苷酸序列：恶臭假单胞菌/生枝动胶菌聚羟基烷酸合成酶融合基因phaC3/C5
ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGCTGCAGTGGCAATCCTGGTTCAGCAAG
GCGCCCACCACCGAGGCGAACCCGATGGCCACCATGTTGCAGGATATCGGC
GTTGCGCTCAAACCGGAAGCGATGGAGCAGCTGAAAAACGATTATCTGCGT
GACTTCACCGCGTTGTGGCAGGATTTTTTGGCTGGCAAGGCGCCAGCCGTC
AGCGACCGCCGCTTCAGCTCGGCAGCCTGGCAGGGCAATCCGATGTCGGCC
TTCAATGCCGCATCTTACCTGCTCAACGCCAAATTCCTCAGTGCCATGGTG
GAGGCGGTGGACACCGCACCCCAGCAAAAGCAGAAAATACGCTTTGCCGTG
CAGCAGGTGATTGATGCCATGTCGCCCGCGAACTTCCTCGCCACCAACCCG
GAAGCGCAGCAAAAACTGATTGAAACCAAGGGCGAGAGCCTGACGCGTGGC
CTGGTCAATATGCTGGGCGATATCAACAAGGGCCATATCTCGCTGTCGGAC
GAATCGGCCTTTGAAGTGGGCCGCAACCTGGCCATTACCCCGGGCACCGTG
ATTTACGAAAATCCGCTGTTCCAGCTGATCCAGTACACGCCGACCACGCCG
ACGGTCAGCCAGCGCCCGCTGTTGATGGTGCCGCCGTGCATCAACAAGTTC
TACATCCTCGACCTGCAACCGGAAAATTCGCTGGTGCGCTACGCGGTGGAG
CAGGGCAACACCGTGTTCCTGATCTCGTGGAGCAATCCGGACAAGTCGCTG
GCCGGCACCACCTGGGACGACTACGTGGAGCAGGGCGTGATCGAAGCGATC
CGCATCGTCCAGGACGTCAGCGGCCAGGACAAGCTGAACATGTTCGGCTTC
TGCGTGGGCGGCACCATCGTTGCCACCGCACTGGCGGTACTGGCGGCGCGT
GGCCAGCACCCGGCGGCCAGCCTGACCCTGCTGACCACCTTCCTCGACTTC
AGCGACACCGGCGTGCTCGACGTCTTCGTCGATGAAACCCAGGTCGCGCTG
CGTGAACAGCAATTGCGCGATGGCGGCCTGATGCCGGGCCGTGACCTGGCC
TCGACCTTCTCGAGCCTGCGTCCGAACGACCTGGTATGGAACTATGTGCAG
TCGAACTACCTCAAAGGCAATGAGCCGGCGGCGTTTGACCTGCTGTTCTGG
AATTCGGACAGCACCAATTTGCCGGGCCCGATGTTCTGCTGGTACCTGCGC
AACACCTACCTGGAAAACAGCCTGAAAGTGCCGGGCAAGCTGACGGTGGCC
GGCGAAAAGATCGACCTCGGCCTGATCGACGCCCCGGCCTTCATCTACGGT
TCGCGCGAAGACCACATCGTGCCGTGGATGTCGGCGTACGGTTCGCTCGAC
ATCCTCAACCAGGGCAAGCCGGGCGCCAACCGCTTCGTGCTGGGCGCGTCC
GGCCATATCGCCGGCGTGATCAACTCGGTGGCCAAGAACAAGCGCAGCTAC
TGGATCAACGACGGTGGCGCCGCCGATGCCCAGGCCTGGTTCGATGGCGCG
CAGGAAGTGCCGGGCAGCTGGTGGCCGCAATGGGCCGGGTTCCTGACCCAG
CATGGCGGCAAGAAGGTCAAGCCCAAGGCCAAGCCCGGCAACGCCCGCTAC
ACCGCGATCGAGGCGGCGCCCGGCCGTTACGTCAAAGCCAAGGGCTGA
(SEQ ID NO：60)
基因ID 003氨基酸序列：恶臭假单胞菌/生枝动胶菌聚羟基烷酸合成酶融合基因PhaC3/C5
MSNKNNDELQWQSWFSKAPTTEANPMATMLQDIGVALKPEAMEQLKNDYLR
DFTALWQDFLAGKAPAVSDRRFSSAAWQGNPMSAFNAASYLLNAKFLSAMV
EAVDTAPQQKQKIRFAVQQVIDAMSPANFLATNPEAQQKLIETKGESLTRG
LVNMLGDINKGHISLSDESAFEVGRNLAITPGTVIYENPLFQLIQYTPTTP
TVSQRPLLMVPPCINKFYILDLQPENSLVRYAVEQGNTVFLISWgNPDKSL
AGTTWDDYVEQGVIEAIRIVQDVSGQDKLNMFGFCVGGTIVATALAVLAAR
GQHPAASLTLLTTFLDFSDTGVLDVFVDETQVALREQQLRDGGLMPGRDLA
STFSSLRPNDLVWNYVQSNYLKGNEPAAFDLLFWNSDSTNLPGPMFCWYLR
NTYLENSLKVPGKLTVAGEKIDLGLIDAPAFIYGSREDHIVPWMSAYGSLD
ILNQGKPGANRFVLGASGHIAGVINSVAKNKRSYWINDGGAADAQAWFDGA
QEVPGSWWPQWAGFLTQHGGKKVKPKAKPGNARYTAIEAAPGRYVKAKG
(SEQ ID NO：61)
基因ID 004核苷酸序列：普氏荚硫菌聚羟基烷酸合成酶亚单元phaE
ATGGCTGGTGACCACGTCGTGGAATGCCTTCGAATTCAGGAGGTTTTTATG
AACGATACGGCCAACAAGACCAGCGACTGGCTGGACATCCAACGCAAGTAC
TGGGAGACCTGGTCGGAGCTCGGCCGCAAGACCTTGGGTCTGGAGAAGACC
CCGGCCAATCCTTGGGCCGGCGCCCTCGATCATTGGTGGCAGACGGTCTCG
CCCGCCGCCCCCAACGACCTGGTTCGCGACTTCATGGAGAAGCTCGCCGAG
CAGGGCAAGGCCTTCTTCGGCCTCACCGACTACTTCACGAAGGGCCTCGGC
GGCAGTAGCGGTACGCAGGGCTGGGACACCCTCTCGAAGACCATCGACGAC
ATGCAAAAGGCCTTCGCCAGCGGCCGGATCGAAGGCGACGAGACCTTCCGC
CGCCTGATGGCCTTCTGGGAGATGCCGCTCGACAACTGGCAGCGCACCATG
TCCTCGCTGTCCCCGGTGCCCGGCGACCTGCTGCGCAACATGCCGCACGAC
CAAGTCAGGGACAGCGTCGACCGCATCCTCTCGGCACCCGGGCTCGGCTAC
ACGCGCGAGGAGCAGGCCCGCTACCAGGATCTGATCCGCCGCTCGCTGGAG
TACCAGTCGGCCCTGAACGAATACAACGGCTTCTTCGGCCAGCTCGGTGTC
AAGTCCCTCGAGCGGATGCGCGCCTTCCTGCAGGGACAGGCCGAGAAGGGC
GTCGCCATCGAGTCGGCGCGCACCCTCTACGACGCCTGGGTCGGCTGCTGC
GAAGAGGTCTATGCCGAGGAGGTCAGCTCCGCCGACTACGCGCACATCCAC
GGCCGCCTCGTCAACGCCCAGATGGCCCTCAAGCAGCGCATGTCGACCATG
GTCGACGAGGTCCTCGGCGCGATGCCGCTGCCGACCCGCAGCGAGCTGCGC
ACGCTCCAGGATCGGCTCCAGGAGTCGCGCGGCGAGGGCAAGCGCCAGCGC
CAAGAGATCGAGACGCTGAAGCGGCAGGTCGCGGCCTTGGCCGGCGGCGCC
CAGCCCGCGCCCCAGGCCTCCGCCCAGCCCAGCACCCGGCCCGCGCCGGCG
ACGGCCCCGGCGGCGAGCGCGGCGCCCAAGCGCAGCACCACGACCCGCCGC
AAGACCACCAAGCCCACCACCGGCCAGTGA(SEQ ID NO：62)
基因ID 004氨基酸序列：普氏荚硫菌聚羟基烷酸合成酶亚单元PhaE
MNDTANKTSDWLDIQRKYWETWSELGRKTLGLEKTPANPWAGALDHWWQTV
SPAAPNDLVRDFMEKLAEQGKAFFGLTDYFTKGLGGSSGTQGWDTLSKTID
DMQKAFASGRIEGDETFRRLMAFWEMPLDNWQRTMSSLSPVPGDLLRNMPH
DQVRDSVDRILSAPGLGYTREEQARYQDLIRRSLEYQSALNEYNGFFGQLG
VKSLERMRAFLQGQAEKGVAIESARTLYDAWVGCCEEVYAEEVSSADYAHI
HGRLVNAQMALKQRMSTMVDEVLGAMPLPTRSELRTLQDRLQESRGEGKRQ
RQEIETLKRQVAALAGGAQPAPQASAQPSTRPAPATAPAASAAPKRSTTTR
RKTTKPTTGQ(SEQ ID NO：63)
基因ID 005核苷酸序列：普氏荚硫菌聚羟基烷酸合成酶亚单元phaC
ATGTCCCCATTCCCGATCGACATCCGGCCCGACAAGCTGACCGAGGAGATG
CTGGAGTACAGCCGCAAGCTCGGCGAGGGTATGCAGAACCTGCTCAAGGCC
GACCAGATCGACACAGGCGTCACCCCCAAGGACGTCGTCCACCGCGAGGAC
AAGCTGGTCCTCTACCGCTACCGGCGCCCGGCGCAGGTGGCGACCCAGACG
ATCCCGCTGCTGATCGTCTACGCCCTCGTCAATCGGCCCTACATGACCGAC
ATCCAGGAGGATCGCTCGACGATCAAGGGCCTGCTCGCCACCGGTCAGGAC
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CTCGATGACTACATCAACGGCTACATCGACCGCTGCGTCGACTACCTGCGC
GAGACCCACGGCGTCGACCAGGTCAACCTGCTCGGGATCTGCCAGGGCGGG
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GTCACCATGGTCACGCCGGTCGACTTCCAGACCCCGGGCAACCTGCTCTCG
GCCTGGGTCCAGAACGTCGACGTCGACCTGGCCGTCGACACCATGGGCAAC
ATCCCGGGCGAACTGCTCAACTGGACCTTCCTGTCGCTCAAGCCCTTCAGC
CTGACCGGCCAGAAGTACGTCAACATGGTCGACCTGCTCGACGACGAGGAC
AAGGTCAAGAACTTCCTGCGGATGGAGAAGTGGATCTTCGACAGCCCGGAC
CAGGCCGGCGAGACCTTCCGCCAGTTCATCAAGGACTTCTACCAGCGCAAC
GGCTTCATCAACGGCGGCGTCCTGATCGGCGATCAGGAGGTCGACCTGCGC
AACATCCGCTGCCCGGTCCTGAACATCTACCCGATGCAGGACCACCTGGTG
CCGCCGGATGCCTCCAAGGCCCTCGCGGGACTGACCTCCAGCGAGGACTAC
ACGGAGCTCGCCTTCCCCGGCGGGCACATCGGCATCTACGTCAGCGGCAAG
GCGCAGGAAGGAGTCACCCCGGCGATCGGCCGCTGGCTGAACGAACGCGGC
TGA(SEQ ID NO：64)
基因ID 005氨基酸序列：普氏荚硫菌聚羟基烷酸合成酶亚单元PhaC
MSPFPIDIRPDKLTEEMLEYSRKLGEGMQNLLKADQIDTGVTPKDVVHRED
KLVLYRYRRPAQVATQTIPLLIVYALVNRPYMTDIQEDRSTIKGLLATGQD
VYLIDWGYPDQADRALTLDDYINGYIDRCVDYLRETHGVDQVNLLGICQGG
AFSLCYTALHSEKVKNLVTMVTPVDFQTPGNLLSAWVQNVDVDLAVDTMGN
IPGELLNWTFLSLKPFSLTGQKYVNMVDLLDDEDKVKNFLRMEKWIFDSPD
QAGETFRQFIKDFYQRNGFINGGVLIGDQEVDLRNIRCPVLNIYPMQDHLV
PPDASKALAGLTSSEDYTELAFPGGHIGIYVSGKAQEGVTPAIGRWLNERG
(SEQ ID NO：65)
Figure IPA00001422629100011
Figure IPA00001422629100021
Figure IPA00001422629100031
Figure IPA00001422629100041
Figure IPA00001422629100051
Figure IPA00001422629100061
Figure IPA00001422629100071
Figure IPA00001422629100081
Figure IPA00001422629100091
Figure IPA00001422629100101
Figure IPA00001422629100111
Figure IPA00001422629100131
Figure IPA00001422629100141
Figure IPA00001422629100151
Figure IPA00001422629100161
Figure IPA00001422629100171
Figure IPA00001422629100181
Figure IPA00001422629100201
Figure IPA00001422629100211
Figure IPA00001422629100221
Figure IPA00001422629100231
Figure IPA00001422629100241
Figure IPA00001422629100251

Claims (31)

1.一种重组生物体，其经遗传工程改造成将5-氨基戊酸转变成5碳单体、其聚合物或共聚物，其中所述重组生物体表达至少一种或一种以上编码一种或一种以上选自由以下各物组成的群组的酶的基因：赖氨酸2-单加氧酶，EC1.13.12.2；5-氨基戊酰胺酶(δ-氨基戊酰胺酶)，EC3.5.1.30；5-氨基戊酸转氨酶(δ-氨基戊酸转氨酶)，EC2.6.1.48；赖氨酸脱羧酶，EC4.1.1.18；琥珀酸半醛还原酶(又称为戊二酸半醛还原酶)，EC1.1.1.61；辅酶A转移酶，EC2.8.3.14和EC2.8.3.n；酰基辅酶A合成酶，EC6.2.1.3；PHA合成酶，EC2.3.1.n；β-酮酰基辅酶A硫解酶，EC2.3.1.9；乙酰乙酰基辅酶A还原酶，EC1.1.1.36；戊二酸-半醛脱氢酶，EC1.2.1.20；丙醛脱氢酶，EC1.2.1.3；醇脱氢酶，EC1.1.1.1；1，3-丙二醇脱氢酶，EC1.1.1.202，且其中与未经修饰的生物体相比较，所述重组生物体产生较多的5-氨基戊酸，且其中5-氨基戊酸经所述重组生物体转变成所述5碳单体、其聚合物或共聚物。
2.根据权利要求1所述的重组生物体，其中所述5碳单体选自由戊二酸、1，5戊二醇和5-羟基戊酸组成的群组。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述聚合物或共聚物包含聚羟基烷酸。
4.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中所述单体包含5-羟基戊酸。
5.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体将5-氨基戊酸转变成戊二酸半醛。
6.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体将赖氨酸转变成5-氨基戊酸。
7.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中用于构建所述重组生物体的生物体经过修饰以相对于未经修饰的生物体过量产生赖氨酸。
8.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体对有毒赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸具有抗性，
所述重组生物体表达赖氨酸反馈抗性二氢吡啶二羧酸合成酶，
所述重组生物体表达赖氨酸反馈抗性天冬氨酸激酶III，并且/或者
所述重组生物体经进一步工程改造以抑制或阻断赖氨酸输出。
9.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体表达或过量表达戊二酸半醛脱氢酶且所述5碳单体是戊二酸。
10.根据权利要求9所述的重组生物体，其中所述戊二酸半醛脱氢酶是由选自由davD、yneI和gabD组成的群组的基因编码。
11.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体将戊二酸释放到细胞外环境中。
12.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述生物体经过修饰以降低或消除戊二酸半醛脱氢酶活性，且所述5碳单体不是戊二酸。
13.根据权利要求12所述的重组生物体，其中所述戊二酸半醛脱氢酶是通过缺失或破坏一个或一个以上选自由davD、yneI和gabD或其同系物组成的群组的基因来减少或消除。
14.根据权利要求1至8和12至13中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体将5-羟基戊酸释放到所述细胞外环境中。
15.根据权利要求12至13中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体在所述细胞外环境中释放5-羟基戊酸，且所述5-羟基戊酸与δ-戊内酯相平衡。
16.根据权利要求1至8和12至13中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体将5-羟基戊酸转变成5-羟基戊酸辅酶A或1，5-戊二醇，并且/或者
将5-羟基戊酸辅酶A转变成聚羟基烷酸。
17.根据权利要求1至8和12至13中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体将5-羟基戊酸转变成聚(5-羟基戊酸)或其共聚物。
18.根据权利要求17所述的重组生物体，其中所述共聚物选自由聚(3-羟基丙酸-共-5HV)、聚(3-羟基丁酸-共-5HV)和聚(4-羟基丁酸-共-5HV)组成的群组。
19.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体是原核生物。
20.根据权利要求1至19中任一权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体是大肠杆菌。
21.根据任一前述权利要求所述的重组生物体，其中所述重组生物体是真核微生物。
22.一种由赖氨酸产生聚合物的重组生物体，其中所述重组生物体经过遗传工程改造以表达至少一种选自由以下各物组成的群组的酶以产生包含5-羟基戊酸单体的聚羟基烷酸：赖氨酸2-单加氧酶，EC1.13.12.2；5-氨基戊酰胺酶(δ-氨基戊酰胺酶)，EC3.5.1.30；5-氨基戊酸转氨酶(δ-氨基戊酸转氨酶)，EC2.6.1.48；赖氨酸脱羧酶，EC4.1.1.18；琥珀酸半醛还原酶(又称为戊二酸半醛还原酶)，EC1.1.1.61；辅酶A转移酶，EC2.8.3.14和EC2.8.3.n；酰基辅酶A合成酶，EC6.2.1.3；PHA合成酶，EC2.3.1.n。
23.根据权利要求22所述的重组生物体，其中所述重组生物体不产生赖氨酸，并且或者
不表达功能性戊二酸半醛脱氢酶活性。
24.一种产生基于5碳的单体、其聚合物或共聚物的方法，其包含：
将赖氨酸或其它可再生碳原料提供给根据权利要求1所述的遗传工程改造过的细胞，其中所述遗传工程改造过的细胞经工程改造以产生比未经修饰细胞多的5-氨基戊酸，且其中5-氨基戊酸经所述遗传工程改造过的细胞转变成5碳单体、其聚合物或共聚物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述可再生碳原料选自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖和阿拉伯糖，或其组合。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述单体选自由戊二酸、1，5-戊二醇和5-羟基戊酸组成的群组。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述聚合物包含聚羟基烷酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述聚羟基烷酸包含5-羟基戊酸。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述聚羟基烷酸选自聚(5-羟基戊酸)、聚(3-羟基丙酸-共-5HV)、聚(3-羟基丁酸-共-5HV)和聚(4-羟基丁酸-共-5HV)。
30.根据权利要求27所述的方法，其进一步包含回收所述聚羟基烷酸、其聚合物或共聚物的步骤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中聚羟基烷酸聚合物或共聚物是通过溶剂萃取或水性处理来回收。
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Prediction of missing enzyme genes in a bacterial metabolic network- Reconstruction of lysine-degration pathway of Pseudomonas aeruginosa;Yamanishi et al.;《THE FEBS Journal》;20071231;第274卷(第9期);摘要，第2265页右栏第1段，第2266页图3、右栏第2-3段，第2268页右栏第2段、右栏第1段、图4 *
Vrljic et al..A new type of transporter with a new type of cellular function:L-lysine export from Corynebacterium glutamicum.《Molecular Microbiology》.1996,第22卷(第5期),第815-826页. *
Yamanishi et al..Prediction of missing enzyme genes in a bacterial metabolic network- Reconstruction of lysine-degration pathway of Pseudomonas aeruginosa.《THE FEBS Journal》.2007,第274卷(第9期),第2262-2273页.

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