CN110234768A - 用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和微生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和重组微生物。本发明的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物和一步的乙醇酸或乙醛酸的生物学或化学转化，过表达磷酸转酮酶基因的本发明的微生物。

Description

用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和微生物

技术领域

本发明涉及用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和重组微生物。本发明的微生物经以下方式修饰：通过过表达磷酸转酮酶活性增加基于碳源的乙醇酸和/或乙醛酸产率。本发明的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物和一步的乙醇酸或乙醛酸的生物学或化学转化。

背景技术

羧酸是含有至少一个羧基的有机化合物。羧酸广泛存在，并且包括例如氨基酸(其组成蛋白质)和乙酸(其是醋的一部分并且出现在新陈代谢中)。羧酸用于产生聚合物、药物、溶剂和食物添加剂。工业上重要的羧酸包括乙酸(醋的组分，溶剂和涂料的前体)、丙烯酸和甲基丙烯酸(聚合物的前体、粘合剂)、乙二酸(聚合物)、柠檬酸(饮料)、乙二胺四乙酸(EDTA)(螯合剂)、脂肪酸(涂料)、马来酸(聚合物)、丙酸(食品防腐剂)、对苯二甲酸(聚合物)、丁酸(食品添加剂)、琥珀酸(食品添加剂、聚合物)。

乙醇酸(HOCH₂COOH,CAS号:79-14-1)或其共轭碱的乙醇酸盐是羧酸的α羟基酸家族的最简单成员。乙醇酸在非常小的分子上具有醇基和中度强酸官能团二者的双功能。其性质使得它称为广泛的消费者和工业应用的理想选择，包括用于水井复原、皮革工业、石油和天然气产业、洗衣及纺织工业、清洁产品以及作为个人护理用品的成分。其还可用于产生多种聚合物材料，包括具有优异的气体屏障特性的包含聚乙醇酸的热塑性树脂，因此其可用于制造具有相同特性的包装材料(例如饮料容器等)。这些聚酯聚合物在水性环境中以可控的速度逐渐水解。该特性使得它们可用于生物医学应用例如可溶解的缝合线，且可用于其中需要酸受控地释放以降低pH的应用。

虽然乙醇酸作为痕量组分天然存在于甘蔗、甜菜、葡萄和水果中，但是它主要是通过合成产生的。在文献中或在专利应用中描述了产生乙醇酸的其它技术。例如，EP2025759和EP 2025760专利申请描述了一种用于通过使用微生物从在末端具有羟基的脂肪多元醇产生所述羟基羧酸的方法。该方法是生物转化，正如Michihiko Kataoka在关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的文献中所描述的那样(Kataoka等,2001)。乙醇酸还通过生物转化使用具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶从乙醇腈产生，该技术公开在专利申请WO2006/069110、WO 2009/059104和WO 2009/059096中，或通过生物转化从乙二醇、乙醇醛或乙二醛产生，如在专利申请JP 2007/228927或WO 2005/106005中所公开的。WO 2007/141316、WO 2010/108909、WO 2011/036213、WO 2011/157728、WO 2012/025780、CN105647844A、CN106011185A和WO 2016/079440(关于使用大肠杆菌菌株的方法)以及WO2013/050659、WO 2014/162063和WO 2016/193540(使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)菌株)公开了用于通过发酵从可再生资源产生乙醇酸的方法和微生物，其中碳水化合物通过一个直接的发酵步骤被转化为乙醇酸。

乙醇酸或氧乙酸(HCOCOOH,CAS号:298-12-4)或其共轭碱的乙醛酸盐是C2羧酸。乙醛酸是乙醛酸循环的中间物，乙醛酸循环使得生物体(诸如细菌、真菌和植物)能够将脂肪酸转化为碳水化合物。乙醛酸盐是在若干酰胺化肽的生物合成中酰胺化过程的副产物。它是天然存在并在工业上有用的无色固体。其用作清洁剂用于多种工业应用，用作特种化学及可生物降解共聚物原料和用作化妆品中的成分。它是一种对于农业和药物化学有用的化合物。事实上，乙醛酸可用于药物工业，因为其与酚类缩合产生4-羟基苯基乙醇酸，4-羟基苯基乙醇酸与氨反应产生羟苯基甘氨酸，羟苯基甘氨酸是药物阿莫西林(amoxicillin)的前体，或4-羟基扁桃酸经还原产生4-羟基苯乙酸，4-羟基苯乙酸是药物阿替洛尔(atenolo)的前体。此外，乙醛酸与尿素的酸催化的反应导致产生在化妆品、油膏和在治疗一些癌症中使用的尿囊素(Cativiela等,2003)。最后，用愈创木酚代替苯酚的缩合提供获得用作食品、饮料和药物中的调味剂的香草醛的途径。

虽然乙醛酸在未成熟水果和幼嫩的绿叶中作为痕量组分天然存，但它主要是通过合成产生的。产生乙醛酸的其它技术描述于文献中或专利申请中。例如，乙醛酸可以通过用一些水加热二溴乙酸或通过电解还原草酸或通过氮氧化乙二醛而化学合成。一些专利申请描述了通过生物转化产生乙醛酸的方法，例如专利申请WO 1993/14214、US 5,439,813和WO1994/28155公开了使用由微生物产生的乙醇酸氧化酶从乙醇酸生物转化，以及Isobe&Nishise(1999)。专利申请US 2007/0026510公开了使用醛氧化酶从乙二醛生物转化。

乙醇酸和乙醛酸的工业利益，加上化学生产过程中形成的化学副产品引起的环境问题，使得微生物生产这种羧酸具有诱人的前景。

发明人已经鉴定了用于从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的新的方法，该方法涉及至少一个发酵步骤以及其中磷酸转酮酶的活性被增强的经修饰的微生物。

磷酸转酮酶活性和编码具有这样的活性的酶的基因是本领域已知的(Papini等，2012)。已经报道了细菌中的两种不同的磷酸转酮酶活性。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶催化5-磷酸木酮糖消耗磷酸地转化为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，伴随释放水。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶例如由来自戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)的xpkA基因编码(Posthuma等，2002)。6-磷酸果糖磷酸转酮酶催化6-磷酸果糖磷酸消耗磷酸地转化为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸，伴随释放水。一些基因编码同时具有5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性的磷酸转酮酶，例如，由来自乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)(Meile等,2001)或动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)(WO 2006/016705和WO 2016/044713)的基因xfp编码的蛋白质的情况。

磷酸转酮酶用于产生感兴趣的代谢物的用途是已经知晓的，并且已经公开在专利申请WO 2006/016705和WO 2016/044713中。这种感兴趣的代谢物是谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、聚羟基丁酸酯和1,4-丁二醇。磷酸转酮酶用于产生乙醇酸或乙醛酸的用途从未被公开。

本发明的方法和微生物相对于现有技术是新的，因为磷酸转酮酶用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的用途以前从未被公开。发明人已经惊奇地发现，在本发明的微生物中磷酸转酮酶的过量产生改善了乙醇酸和/或乙醛酸的产生。

发明人鉴定的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物和一步的生物学或化学转化乙醇酸或乙醛酸。

发明内容

本发明涉及重组微生物和用于改善从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸并且使用至少一步的发酵和经修饰的微生物的方法，在所述经修饰的微生物中，选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，并且编码5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶的基因的表达被增强。优选地，该编码磷酸转酮酶的基因选自来自戊糖乳杆菌的xpkA基因、来自动物双歧杆菌的xfp基因或来自乳酸双歧杆菌的xfp基因或它们的同源基因。

发明人鉴定的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生乙醇酸或乙醛酸，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生相应的中间物乙醇酸或乙醛酸和一步的分别将中间物乙醇酸或乙醛酸生物学或化学转化为乙醛酸或乙醇酸。

本发明的另一方法涉及使用甘氨酸氧化酶和任选的过氧化氢酶从甘氨酸产生乙醛酸。

本发明的微生物选自细菌，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)，或酵母。更优选地，本发明的微生物来自大肠杆菌的物种。

发明详述

在详细描述本发明之前，应理解，本发明不受限于具体示例性描述的方法，并且当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，并不意图是限制性的，本发明仅通过所附权利要求进行限制。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文或下文，通过提述以其整体并入本文。

此外，除非有另外说明，否则本发明的实践采用本领域技术范围内的常规微生物学和分子生物学技术。此类技术对于熟练的技术人员来说是熟知的，并且在文献中得到了充分说明。

必须注意的是，如在本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文明确指出，否则单数形式“一(a、an)”和“该(the)”包括复数提述。因此，例如，提及“微生物”包括多种此类微生物，提及“内源基因”是提及一种或多种内源基因，等等。除非另有定义，除非本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些材料和方法相似或等同的任何材料和方法可用于实施或测试本发明，但现在描述优选的材料和方法。

在权利要求和本发明的连贯描述中，除非上下文由于明确的语言或必要的含义而另有要求，否则词语“包含”、“含有”、“涉及”或“包括”或变化诸如“包含(comprises、comprising)”“含有(containing)”、“涉及(includes、including)”以包含性含义使用，即指定所述特征的存在但不排除在本发明的各种实施例中存在或添加其他特征。

本发明涉及重组微生物和用于改善乙醇酸和/或乙醛酸的产生的方法。发明人鉴定的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生乙醇酸或乙醛酸，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生相应的中间物乙醇酸或乙醛酸和一步的分别将所述中间物生物转化为乙醛酸或乙醇酸。

术语“乙醇酸”是指化学式为HOCH2COOH且CAS号为79-14-1的羧酸。

术语“乙醛酸”是指化学式为HCOCOOH和CAS号为298-12-4的羧酸。

如本文所使用的，术语“微生物”是指未被人工修饰的细菌、酵母或真菌。优选地，该微生物选自肠杆菌科、梭菌科、棒状杆菌科、芽孢杆菌科、双歧杆菌科、乳酸杆菌科，或酵母。更优选地，该微生物是埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)或酵母菌属(Saccharomyces)。甚至更优选地，本发明的微生物来自大肠杆菌的物种。

如本文所使用的，术语“重组微生物”或“经遗传修饰的微生物”是指未在自然界发现的并且与其在自然界中发现的等同物有遗传差异的细菌、酵母或真菌。其意指其通过引入或通过缺失或通过修饰遗传元件而被修饰。其还可通过在特定的选择压力下通过组合定向诱变和进化而迫使新的代谢途径的开发和进化而被转化(参见例如WO 2004/076659或WO2007/011939)。

微生物可经修饰以表达外源基因，如果这些基因被引入具有允许其在宿主微生物中表达的所有元件的微生物中。用外源DNA修饰或“转化”微生物是本领域技术人员的常规工作。

微生物可经修饰以调节内源基因的表达水平。

术语“内源基因”意指该基因在任何遗传修饰之前存在于该微生物中。内源基因可以通过引入除了内源调控元件之外的异源序列或通过引入异源序列以替换内源调控元件，或通过将一个或多个补充拷贝的该基因引入到该染色体或质粒中而被过表达。内源基因还可经修饰以调节其相应编码的蛋白的表达和活性。例如，可以将突变引入编码序列以修饰基因的产物，或可以引入除了内源调控元件之外的异源序列，或引入异源序列以替代内源调控元件。内源基因的调节可以导致基因产物的活性的上调和/或增强，或者替代性地，该内源基因产物的活性的下调和/或降低。

调节其表达的另一方式是用较强的或较弱的启动子交换基因的内源启动子(例如野生型启动子)，以上调或下调该内源基因的表达。这些启动子可以是同源的或异源的。选择合适的启动子在本领域技术人员的能力范围内。

相反地，“外源基因”意指该基因通过本领域技术人员熟知的方法被引入微生物中，而该基因在该微生物中不是天然存在的。外源基因可以被整合到宿主染色体中，或通过质粒或载体在染色体外表达。在复制起点和其在细胞中的拷贝数方面有差异的多种质粒是本领域熟知的。这些基因可以是同源的。

在本发明的上下文中，术语“同源基因”不被限制为表示具有理论上的常见遗传祖先的基因，但包括可以遗传上不相关依然已经进化为编码具有相似功能和/或具有相似结构的蛋白质的基因。因此，术语“功能上同源”出于本发明的目的涉及以下事实：某一酶学活性可以不仅由具有限定的氨基酸序列的特定蛋白质提供，还由来自其它相关或不相关的微生物的具有相似序列的蛋白质提供。

使用Genbank中给出的已知基因的参考，本领域技术人员能够确定其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等效基因。使用共有序列并且设计简并探针以在另一个生物中克隆相应基因而有利地完成该常规工作，该共有序列通过用衍生自其它微生物的基因进行序列比对而确定。这些常规分子生物学方法对于本领域技术人员来说是熟知的。

如本文所使用的，术语“改善的乙醇酸和/或乙醛酸产生”、“改善乙醇酸和/或乙醛酸产生”和其语法等同表述是指增加的乙醇酸和/或乙醛酸/碳源产量(可以表示为百分比的每克/mol消耗的碳源所产生的g/mol乙醇酸和/或乙醛酸的比率)。用于确定消耗的碳源的量和产生的乙醇酸和/或乙醛酸的量的方法是本领域技术人员熟知的。与相应的未经修饰的微生物相比，重组微生物中的产量更高。

术语“经优化用于发酵产生乙醇酸和/或乙醛酸的微生物”是指经进化和/或经遗传修饰以呈现出与相应的野生型微生物的内源产生相比改善的乙醇酸和/或乙醛酸产生的微生物。此类经“优化”用于乙醇酸和/或乙醛酸产生的微生物是本领域公知的，并且已经具体在专利申请WO 2007/141316、WO 2010/108909、WO 2011/036213、WO 2011/157728和WO2012/025780中公开。

根据本发明，术语“发酵产生”、“培养”、“发酵步骤”或“发酵”用于表示细菌生长。该生长通常在具有适当的培养基的发酵罐中进行，该培养基适合于正在使用的微生物且含有至少一种简单碳源，且如果需要的话含有共基质(co-substrate)。

“适当的培养基”是指包含对于细胞的维持和/或生长必需或有利的营养素的培养基(例如无菌液体培养基)，该营养素诸如碳源或碳基质、氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和和磷酸铵；微量元素(例如金属盐，例如镁盐、钴盐和/或锰盐)；以及生长因子(诸如氨基酸和维生素)。

根据本发明，术语“碳源”或“碳基质”或“碳的来源”是指可由本领域技术人员用于支持微生物正常生长的碳的任何来源。碳源选自碳水化合物，碳水化合物是指单糖(诸如葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖或乳糖)，寡糖，二糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)，糖浆，淀粉或其衍生物，半纤维素，以及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。碳源可以衍生自可再生原料。可再生原料定义为对于某些工业过程所需的原材料，该原材料可以在短暂延迟内再生，并且其量足以允许其转化为所需产物。经处理的或未经处理的植物生物质是令人感兴趣的可再生碳源。

根据本发明，术语“生物转化步骤”或“生物转化”或“生物转换”或“生物催化”或“生物学转化”是指通过由酶产生者微生物(不同于本发明的经修饰的微生物)产生的特定酶将有机材料转化为所需产物。生物转化的反应可以根据该酶、其机制和过程的约束而差异进行，并且它们可以由本领域技术人员知晓：

1.可以通过向有机材料添加纯化的酶使有机材料与酶接触，或

2.可以通过向有机材料添加含有清除了细菌的酶的酶产生者微生物的发酵肉汤，使有机材料与酶接触，或

3.可以通过向有机材料添加酶产生者微生物的裂解的细胞的提取物，而使有机材料与酶接触，或

4.可以通过向有机材料添加酶产生者微生物的活细胞，使有机材料与酶接触，该微生物是先前经处理的以允许酶反应和反应再生所需的所述酶产生者微生物的生存力(特定辅因子利用度)。该系统被称为全细胞生物催化剂系统。

在本发明的一个优选实施方案中，有机材料来源于本发明的方法的发酵的第一步，也就是由本发明的经修饰的微生物产生的乙醇酸或乙醛酸。该来源于发酵的第一步的有机材料可以或多或少从培养肉汤中纯化得到。在本发明的另一个实施方案中，该有机材料是通过化学或生物学方法提供的甘氨酸。

在本发明的第一方面中，本发明涉及使用至少一步的发酵和经修饰的微生物从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法，其中本发明的经修饰的微生物包含选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达的弱化以及编码5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶的至少一种基因的过表达。

如专利申请WO 2007/141316中所公开的，选自编码苹果酸合成酶的aceB、编码苹果酸合成酶的glcB、编码乙醛酸醛连接酶的gcl和编码6-磷酸2-酮-3-脱氧葡糖酸醛缩酶的eda中的至少一种基因的缺失导致乙醛酸的转化降低，这使得乙醛酸(乙醛酸可以从培养基中回收或可以被进一步转化为乙醇酸)的积累。优选地，在本发明的微生物中，基因aceB和glcB和gcl的表达被弱化。

更优选地，如专利申请WO 2010/108909、WO 2011/036213、WO 2011/157728、WO2012/025780中公开的，本发明的经修饰的微生物可以使用以下方式被进一步修饰：

-弱化编码乙醇酸氧化酶的基因glcDEFG和/或编码乙醇醛脱氢酶的基因aldA，这导致不能大幅度代谢乙醇酸

-增加乙醛酸途径流量，这具体地通过弱化编码异柠檬酸脱氢酶的基因icd、编码Icd激酶-磷酸酶的基因aceK、编码磷酸-转乙酰酶的基因pta、编码乙酸激酶的基因ackA、编码丙酮酸氧化酶的基因poxB、编码乙醛酸途径抑制因子的基因iclR或fadR，和/或通过过表达编码异柠檬酸裂解酶的基因aceA实现，

降低异柠檬酸脱氢酶的水平可以通过引入驱动编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因的表达的人工启动子，或通过将降低该蛋白的酶学活性的突变引入icd基因中而实现。

由于蛋白Icd的活性通过磷酸化作用而降低，所以其还可以通过引入具有与野生型AceK酶相比增加的激酶活性或降低的磷酸酶活性的突变的aceK基因而得到控制。

-增加NADPH的利用度，这具体地通过弱化基因pgi、udhA、edd而实现。

术语“弱化”或“弱化的表达”在本文上下文中是指与未经修饰的微生物相比，基因的表达和/或酶的产生被降低或抑制，导致与未经修饰的微生物相比核糖核酸、蛋白或酶的细胞内浓度降低。本领域技术人员知晓用于测量细胞中核糖核酸浓度或蛋白浓度的不同方式和方法，其包括，例如，使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以确定核糖核酸浓度以及使用特异性抗体以确定特定蛋白的浓度。

降低或抑制酶的产生可以通过弱化编码所述酶的基因的表达来实现。

基因的弱化可以通过本领域技术人员已知的方式和方法实现。一般地，基因表达的弱化可以通过以下方式实现：

-突变编码区或启动子区或，或

-缺失基因表达所必需的启动子区的全部或部分，或

-通过同源重组缺失该基因的编码区的全部或部分，或

-将外部元件插入编码区中或插入启动子区中，或

-在弱启动子或诱导型启动子的控制下表达该基因。

本领域技术人员知晓具有不同强度的多种启动子以及用于弱的或可诱导的基因表达的启动子。

在本发明的上下文中，术语酶的“活性”可与术语“功能”互换使用，且是指由该酶催化的反应。本领域技术人员知晓如何测定所述酶的酶学活性。

术语酶的“弱化的活性”或“降低的活性”意指通过氨基酸序列中的突变获得的蛋白的降低的比催化活度和/或通过突变核苷酸序列或通过缺失基因的编码区实现的细胞中蛋白的降低的浓度。

术语酶的“增强的活性”或“增加的活性”是指该酶的增加的比催化活度和/或通过例如过表达编码该酶的基因实现的细胞中酶的增加的量/利用度。

术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”及其语法等同术语在该文本中可以互换使用，并且具有相似的含义。这些术语意指与未经修饰的微生物相比，基因的表达或酶的产生增加，这导致与未经修饰的微生物相比，核糖核酸、蛋白或酶的细胞内浓度增加。本领域技术人员知晓测量细胞中核糖核酸浓度或蛋白浓度的不同方式和方法，其包括例如使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以确定核糖核酸浓度以及使用特异性抗体以确定特定蛋白的浓度。

增加的酶产生通过增加编码该酶的基因的表达来实现。

为了增加基因的表达，本领域技术人员知晓不同的技术，诸如：

-增加该基因在微生物中的拷贝数。该基因在染色体上或在染色体外编码。当该基因位于染色体上时，可以通过本领域技术人员知晓的重组方法(包括基因置换)将若干拷贝的该基因引入染色体上。当基因位于染色体外时，该基因可以由在复制起点方面有差异的不同类型的质粒携带，因此这些质粒在细胞中的拷贝数也不同。这些质粒以1至5个拷贝、或约20个拷贝或最高达500个拷贝存在于微生物中，这取决于该质粒的性质：具有紧密复制的低拷贝数质粒(pSC101、RK2)、低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSKbluescript II)。

-使用导致该基因高水平表达的启动子。本领域技术人员知晓哪种启动子是最便利的。例如，启动子Ptrc、Ptac、Plac或λ启动子PR和PL是广泛使用的。这些启动子可可通过特定化合物或通过特定外部条件例如温度或光“诱导”。这些启动子可以是同源的或异源的。

-弱化该基因特异或非特异的转录抑制子的活性或表达。

-使用稳定相应信使RNA的元件(Carrier和Keasling,1999)或稳定该蛋白的元件(例如GST标签,GE Healthcare).

术语“磷酸转酮酶”通常是指具有5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶活性(EC4.1.2.9)和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性(EC4.1.2.22)的酶。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶活性意指消耗磷酸地将5-磷酸木酮糖转化为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸同时释放水的活性。6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性意指消耗磷酸地将6-磷酸果糖转化为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸同时释放水的活性。这两种活性可以使用Meile等(2001)描述的方法测量。5-磷酸D-木酮糖磷酸转酮酶或其编码基因可以来源于具有5-磷酸D-木酮糖磷酸转酮酶的活性的细菌，包括乳酸细菌、同化甲醇的细菌、同化甲烷的细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌，且更具体地，属于醋菌属(Acetobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、Methylococus、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、纤维杆菌属(Fibrobacter)的细菌和/或属于假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、毛孢子菌属(Trichosporon)、温酵母属(Wingea)的酵母等等。6-磷酸果糖磷酸转酮酶或其编码基因可以来源于具有6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性的属于属醋杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属(Chlorobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、Methylococus、加德纳菌属(Gardnerella)的细菌和/或属于红酵母属、假丝酵母属、酵母菌属的酵母等等。此外，已经报道了一些酶催化5-磷酸D-木酮糖磷酸转酮酶和6-磷酸果糖磷酸转酮酶的活性，诸如来自动物双歧杆菌的Xfp(WO 2006/016705和WO 2016/044713)或来自乳酸双歧杆菌的Xfp(Meile等,2001)。

在本发明的上下文中，经修饰的微生物过表达编码磷酸转酮酶的基因以便增强乙醇酸和/或乙醛酸的产生。如果本发明的微生物天然产生磷酸转酮酶，则编码一种或多种磷酸转酮酶的一种或多种基因使用上文详述的过表达方法而被过表达。与之相反，如果本发明的微生物不天然表达磷酸转酮酶，外源的编码磷酸转酮酶的基因被引入该微生物中。在这种情况下，该基因的引入导致该编码磷酸转酮酶的基因过表达。

编码磷酸转酮酶的基因选自：来自动物双歧杆菌的xfp基因(WO 2006/016705和WO2016/044713)、来自乳酸双歧杆菌的xfp基因(Meile等，2001)、来自戊糖乳杆菌的xpkA(Posthuma et al.,2002)或它们的同源基因：来自植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的xpk1基因、来自植物乳杆菌的xpk2基因、来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)NEM316的xpk基因、来自乳酸乳球菌亚种lactis(Lactococcuslactissubsp.lactis)的ptk基因、来自约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)的xpk基因、来自嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的xpk基因、来自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的xpf基因、来自绿硫菌(Chlorobium tepidum)的xfp基因、来自猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)的xfp基因、来自流产布鲁氏菌(Brucella abortus)的xfp基因。优选地，该微生物过表达来自乳酸双歧杆菌的xfp基因(Meile等,2001)、来自动物双歧杆菌的xfp基因(WO 2006/016705和WO 2016/044713)或来自戊糖乳杆菌的xpkA(Posthuma等,2002)。甚至更优选地，该微生物过表达来自动物双歧杆菌的xfp基因(WO2006/016705和WO 2016/044713)或来自戊糖乳杆菌的xpkA(Posthuma等,2002)。

在本发明的一个优选的实施方案中，经修饰的微生物还过表达ycdW或其同源基因，以便增加乙醛酸到乙醇酸的转化，如专利申请WO 2007/141316中所公开的。本发明的一个目的是提供一种使用经修饰的微生物产生乙醇酸的方法，在该微生物中，选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自乳酸双歧杆菌的xfp基因、来自动物双歧杆菌的xfp基因、或来自戊糖乳杆菌的xpkA的表达以及ycdW基因和/或yiaE基因的表达均被过表达。优选地，在使用经修饰的微生物产生乙醇酸的方法中，选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自动物双歧杆菌的xfp基因、或来自戊糖乳杆菌的xpkA的表达被过表达，且ycdW基因和/或yiaE基因的表达被过表达。

该产生乙醇酸的方法允许通过生物学或化学转化从乙醇酸产生乙醛酸。本发明的该第二种方法包括以下步骤：任选地从发酵肉汤中分离乙醇酸，通过生物转化使用由来自大肠杆菌的基因gldDEFG编码的乙醇酸氧化酶和由来自大肠杆菌的基因katE或katG编码的过氧化氢酶(Loewen&Switala,1986)或通过化学转化例如使用氮氧自由基催化剂诸如AZADO(Furukawa等,2016)将乙醇酸转化为乙醛酸，且从转化介质中回收乙醛酸。

任选的乙醇酸的分离可至少在于从发酵肉汤中回收微生物细胞。乙醇酸可以进一步通过连续蒸馏从发酵肉汤中的其它有机物中纯化，如专利申请WO2012/153041、WO2012/153042和WO2012/153043中公开的。可替换地，乙醇酸可以通过如专利US 7439391中公开的重复结晶步骤或通过使用适当的溶剂的液-液萃取来纯化。可用的溶剂是本领域技术人员熟知的，本领域技术人员能够选择最便利的溶剂。从发酵肉汤中纯化乙醇酸的另一方式是使用发酵提取工艺，其也被称为反应提取工艺或提取发酵工艺。提取发酵可以被认为是一个整合过程，其中反应过程即发酵与纯化操作即液体提取结合，如专利申请WO 2009/042950或WO 1999/54856中公开的。该工艺表现出允许在乙醇酸产生时就将乙醇酸移出的优势，这降低了由于乙醇酸的毒性作用而导致的细胞生长的抑制作用，并因此在一个连续步骤中产生并回收乙醇酸，从而减少下游的处理和回收成本。溶剂选自含有键合碳的氧的溶剂或含有磷键合的氧的溶剂或高分子量脂肪族胺。优选的溶剂是三正辛基氧化膦、磷酸三正丁酯、十二烷基-三烷基甲胺、三正辛胺、三异辛胺、三正(辛基-癸基)-胺、烷基季铵盐、聚乙二醇、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。更优选地，所用的溶剂为三正辛基氧化膦。有利地，提取发酵可以通过随后的结晶或蒸馏步骤完成。

将乙醇酸生物转化为乙醛酸的步骤通过也被称为(S)-2-羟基酸氧化酶(EC编号:1.1.3.15)的乙醇酸氧化酶介导，该酶催化以下反应：

该酶属于氧化还原酶家族，具体是那些以氧气作为受体作用于CH-OH基团的酶。

本发明中使用的乙醇酸氧化酶可以对应于该酶的任何天然存在的形式或表现出更好的稳定性或催化功效的天然存在的酶的任何变体。使用的天然存在的乙醇酸氧化酶可以从菠菜或甜菜叶子中提取或纯化，或者替代性地，编码这些酶的基因可以被插入在产生者微生物中，如专利申请WO 1994/20631和WO 1995/01444中公开的。替代性地，编码乙醇酸氧化酶的来自大肠杆菌的gldDEFG基因在产生者生物中过表达。产生者生物选自毕赤酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或大肠杆菌。最优选地，使用大肠杆菌。由于乙醇酸氧化酶生成H₂O₂，所以将由毕赤酵母、多形汉逊酵母、构巢曲霉或大肠杆菌内源性表达的过氧化氢酶(EC编号:1.11.1.6)与乙醇酸氧化酶结合使用是有利的。在大肠杆菌中，过氧化氢酶由katE或katG基因编码。优选地，乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶在同一微生物中过表达。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的使用在专利申请WO1996/00793、WO 1994/20631或在WO 1995/01444中公开。

为了进行生物转化，通过直接添加纯化的酶至乙醇酸的溶液或添加乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的发酵肉汤或乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的裂解的细胞的提取物，来使乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶与乙醇酸接触。为了提高转化效率，可以如专利US 5,439,813中所公开的，在酶纯化后使用固定化的酶。

然后使用本领域技术人员熟知的方式纯化所形成的乙醛酸，例如结晶或使用氢氧化钙进行沉淀或液-液萃取。

在本发明的另一个优选的实施方案中，经修饰的微生物被进一步工程化，以便弱化至少ycdW基因的表达，以避免乙醛酸转化为乙醇酸。本发明的又一个目的是提供使用经修饰的微生物产生乙醛酸的方法，在该微生物中选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自乳酸双歧杆菌的xfp基因的表达、来自动物双歧杆菌的xfp基因的表达或来自戊糖乳酸菌的xpkA基因的表达被过表达，并且ycdW基因和yiaE基因的表达被弱化或完全消除。优选地，在使用经修饰的微生物产生乙醛酸的方法中，选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自动物双歧杆菌的xfp基因的表达或来自戊糖乳酸菌的xpkA基因的表达被过表达，并且ycdW基因和yiaE基因的表达被弱化或完全消除。

该用于产生乙醛酸的方法允许通过生物学或化学转化从乙醛酸产生乙醇酸。本发明的该第四个方法包括以下步骤：任选地从发酵肉汤中分离乙醛酸、通过生物转化使用乙醛酸还原酶或通过化学转化使用例如硼氢化钠将乙醛酸转化为乙醇酸、且从转化介质中回收乙醇酸。所述乙醛酸还原酶可以由来自大肠杆菌的基因ycdW或由来自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因grxA编码。

任选地分离乙醛酸可以至少在于从发酵肉汤中回收微生物细胞。乙醛酸可以进一步通过离子交换或通过沉淀/结晶方法或通过液-液萃取从发酵肉汤中的其它有机物中纯化。从发酵肉汤中纯化乙醛酸的另一方式是使用提取发酵工艺。提取发酵可以被认为是一个整合过程，其中反应过程即发酵与纯化操作即液体提取结合，如专利申请WO 2009/042950或WO 1999/54856中公开的。该工艺表现出允许在乙醛酸产生时就将乙醛酸移出的优势，这降低了由于乙醛酸的毒性作用而导致的细胞生长的抑制作用，并因此在一个连续步骤中产生并回收乙醛酸，从而减少下游的处理和回收成本。溶剂选自含有键合碳的氧的溶剂或含有键合磷的氧的溶剂或高分子量脂肪族胺。优选的溶剂是三正辛基氧化膦、磷酸三正丁酯、十二烷基-三烷基甲胺、三正辛胺、三异辛胺、三正(辛基-癸基)-胺、烷基季铵盐、聚乙二醇、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。更优选地，所用的溶剂为三正辛基氧化膦。有利地，提取发酵可以通过随后的结晶或蒸馏步骤完成。替代性地，对于提取发酵，为了降低在发酵过程中产生的乙醛酸的毒性，可以在发酵肉汤中添加已知与醛形成络合物的分子诸如氨基脲或碳酰肼或2,4-二硝基苯基肼，以便与乙醛酸络合，并因此降低该醛对于细胞的毒性。这可以产生提高的乙醛酸产率(Sardari等,2014)。

乙醛酸生物转化为乙醇酸的步骤由乙醛酸还原酶介导。乙醛酸还原酶是首次从菠菜叶子中分离的，且是使用辅因子NADH或NADPH催化乙醛酸还原为乙醇酸的酶。乙醛酸还原酶可以是NADH依赖性的(EC号:1.1.1.26)或NADPH依赖性的(EC号:1.1.1.79)。可以使用的NADH依赖性乙醛酸还原酶的实例是：由来自菜豆根瘤菌的gxrA基因编码的GxrA、由来自酿酒酵母的GOR1基因编码的GOR1、由来自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)的hprA基因编码的HprA或由来自极端嗜热菌(Pyrococcus furiosus)的gyaR基因编码的GyaR。NADPH依赖性乙醛酸还原酶的实例是：由来自大肠杆菌的ycdW基因编码的YcdW、由来自大肠杆菌yiaE基因编码的YiaE、由来自大肠杆菌的yjgB基因编码的YjbG、由来自大肠杆菌的yafB基因编码的YafB、由来自大肠杆菌的yqhD基因编码的YqhD或由来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的GLYR1和GLYR2基因编码的GLYR1和GLYR2……。有利的是，乙醛酸还原酶产生者微生物是大肠杆菌。

为了将乙醛酸生物转化为乙醇酸，乙醛酸还原酶需要NADH或NADPH辅因子。在这样的情况下，生物转化需要在特定地酶和能够在反应期间产生和再生辅因子的活细胞的存在下完成。这被称为全细胞生物催化剂系统。因此部分纯化的或未纯化的乙醛酸溶液与乙醛酸还原酶产生者微生物的发酵肉汤接触，该微生物已经过量产生乙醛酸还原酶并且仍有生存力以便产生和再生辅因子。为了提高生物转化效率，可以使用固定的酶，但仍存在预先处理的活的微生物，以帮助反应。

然后使用本领域技术人员熟知的方式诸如蒸馏、结晶、用氢氧化钙沉淀或液-液萃取来纯化形成的乙醇酸。

在本发明的另一个实施方案中，乙醛酸可以通过使用甘氨酸氧化酶通过生物转化甘氨酸(CAS号:56-40-6)来产生。甘氨酸氧化酶(EC号:1.4.3.19)催化以下反应：

本发明中使用的甘氨酸氧化酶可以对应于该酶的任何天然存在的形式或显示出更好的稳定性或催化效率的天然酶的任何变体，如专利申请US2016/0002610所公开的。已经在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中鉴定了甘氨酸氧化酶(Nishiya&Imanaka,1998；Job等,2002)。可以从枯草芽孢杆菌中提取并纯化该酶或者，替代性地，可以将编码该酶的基因插入产生者微生物中。产生者生物优选为大肠杆菌。由于甘氨酸氧化酶生成H₂O₂,，所以将大肠杆菌的katE和katG基因内源表达的过氧化氢酶(EC Number:1.11.1.6)与甘氨酸氧化酶结合使用是有利的。优选地，甘氨酸氧化酶与过氧化氢酶在同一微生物中过表达。

为了进行生物转化，通过向甘氨酸溶液中直接添加纯化的酶或通过添加甘氨酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的发酵肉汤或甘氨酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的裂解细胞的提取物，使甘氨酸氧化酶和/或过氧化氢酶与甘氨酸接触。为了提高生物转化效率，可以如专利US 5,439,813中所公开的，在酶纯化后使用固定的酶。

最后，本发明涉及经修饰用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的微生物，在所述微生物中选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化并且编码磷酸转酮酶的至少一种基因的表达被增强。磷酸转酮酶由来自动物双歧杆菌的xfp基因、来自乳酸双歧杆菌的xfp基因或来自戊糖乳杆菌的xpkA基因编码。

为了产生乙醇酸，本发明的微生物经进一步修饰以过表达来自大肠杆菌的ycdW基因或其同源基因中的至少一种。

为了产生乙醛酸，本发明的微生物经进一步修饰以弱化或完全消除至少基因ycdW的表达。

本发明的微生物选自肠杆菌科、梭菌科、棒状杆菌科、芽孢杆菌科、双歧杆菌科、乳酸杆菌科，或酵母。更优选地，本发明的微生物来自大肠杆菌物种。

实施例

以下实验证明了如何使用经修饰的乙醇酸产生者大肠杆菌重组菌株作为背景产生乙醇酸或乙醛酸。

在以下给出的实施例中，使用了本领域熟知的方法来构建大肠杆菌菌株，该菌株含有复制载体和/或使用同源重组的多种染色体插入、缺失和置换，如Datsenko&Wanner,(2000)详细描述的。

方案

已经使用了一些方案用于构建以下实施例中所述的产生乙醛酸的菌株。

本发明中使用的方案1(通过同源重组的染色体修饰、选择重组子和侧接有FRT序列的抗生素盒切除)和方案2(噬菌体P1的转导)已经在专利申请WO2013/001055中充分描述。

方案3：侧接有LoxP序列的抗生素盒切除

由LoxP序列侧接的抗性基因通过使用携带编码Cre重组酶的基因的质粒pJW168(Palmeros等,2000)去除。简言之，在37℃或42℃在LB上培养携带pJW168质粒的克隆，然后在30℃测试抗生素抗性的丢失。然后通过PCR使用适当的引物验证对抗生素敏感的克隆。

实施例1：在大肠杆菌乙醇酸过量产生重组菌株中过表达ycdW基因的抑制——菌株1的描述和菌株2至3的构建。

菌株1的描述

在专利申请WO 2011/157728的实施例2第2部分中描述的菌株，其对应于AG1413的亲本菌株，即不具有pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01质粒的AG1413菌株，在本专利申请中被命名为菌株1。

菌株2的构建

在使用菌株1之前，分别使用Flp重组酶(根据方案1)和Cre重组酶(根据方案3)从基因座icd(SEQ ID N°01，其编码具有SEQ ID N°02的序列的蛋白质)和aceK(SEQ ID N°03，其编码具有SEQ ID N°04的序列的蛋白质)中去除抗生素抗性盒。然后选择对卡那霉素和氯霉素敏感的转化子，通过PCR分析使用恰当的寡核苷酸验证抗生素标记不存在。将保留的菌株命名为菌株2。

菌株3的构建

通过限制酶和连接酶将由专利申请WO 2010/108909中所述的pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01质粒携带的编码乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶的ycdW基因(SEQ ID N°05，其编码具有SEQ ID N°06的序列的蛋白质)连同其启动子和lacI基因一起从该质粒中去除，得到pAG0094质粒。

将质粒pAG0094导入菌株2中，产生菌株3。

实施例2：通过完全去除大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中的ycdW基因提高乙醛酸产生。

缺失大肠杆菌重组乙醇酸产生者菌株2中ycdW基因的内源拷贝。

为了实现ycdW基因的缺失，使用Datsenko&Wanner,2000中描述的同源重组策略(根据方案1)。

为了进行ycdW缺失，通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增由与ycdW基因的上游区域和下游区域同源的DNA序列侧接的携带抗性标记的片段。用于重组到ycdW基因的上游区域和下游区域中的序列被称为SEQ ID N°09和10。然后通过电穿孔将获得的PCR产物“ΔycdW::Km”导入菌株MG1655(pKD46)中。选择抗生素抗性转化子，并且使用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证具有相关抗性盒的ycdW基因缺失。留下的菌株被指定为MG1655ΔycdW::Km。最后，通过P1噬菌体转导(根据方案2)将ΔycdW::Km缺失从MG1655ΔycdW::Km转移到菌株2中。选择卡那霉素抗性转导子，并且使用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证ΔycdW::Km缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株4。

然后在菌株4中缺失aceA基因(SEQ ID N°11，其编码具有SEQ ID N°12的序列的蛋白质)的内源拷贝。

为了实现aceA基因的缺失，使用由Datsenko&Wanner,2000描述的同源重组策略(根据方案1)。由于aceB(SEQ ID N°13，其编码具有SEQ ID N°14的序列的蛋白质)和aceK(SEQ ID N°03，其编码具有SEQ ID N°04的序列的蛋白质)基因之前已经在菌株4中缺失，所以同源重组策略等同于用于缺失aceBAK操纵子的策略。

对于aceBAK缺失，通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)PCR扩增由与aceBAK操纵子的上游区域和下游区域同源的DNA序列侧接的携带抗性标记的片段。用于重组到aceBAK操纵子的上游区域和下游区域中的序列被称为SEQ ID N°15和16。然后通过电穿孔将获得的PCR产物“ΔaceBAK::Cm”导入菌株MG1655(pKD46)中。选择抗生素抗性转化子，并且使用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证具有相关抗性盒的aceBAK操纵子缺失。保留的菌株被指定为MG1655ΔaceBAK::Cm。最后，通过P1噬菌体转导(根据方案2)将ΔaceBAK::Cm缺失从MG1655ΔaceBAK::Cm转移到菌株4中。选择氯霉素抗性转导子，并且使用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证ΔaceBAK::Cm缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株5。

通过限制酶和连接酶将由pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01质粒携带的编码乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶的ycdW基因(SEQ ID N°05和N°06)在不缺失其启动子和lacI基因的情况下(不同于实施例1中描述的pAG0094)从该质粒中去除，得到pAG0303质粒。因此，在该质粒上，aceA基因表达的一部分由其天然启动子驱动，但也可能通过添加IPTG由ycdW和lacI基因的留下的启动子增加aceA表达水平。

将质粒pAG0303导入菌株5中，产生菌株6。

实施例3：通过用菌株3和菌株6发酵产生乙醇酸和乙醛酸。

评估锥形带挡板烧瓶中的产生菌株。

在37℃在混合培养基(具有2.5g.L^-1葡萄糖和90％基本培养基M1的10％LB培养基(Sigma 25％))中培养5mL预培养物持续16小时。将其用于在培养基M1中接种50mL培养物至OD₆₀₀为0.2。培养基M1的组成在表1中描述。

需要时，在培养基中添加抗生素(终浓度为50mg.L^-1的壮观霉素)，并且IPTG终浓度为100μM。培养物的温度为30℃。

当培养物已经达到OD₆₀₀高达5时，使用HPLC使用折射计检测(有机酸和葡萄糖)分析细胞外代谢产物。

对于每种菌株，进行若干重复。

表1：M1培养基的组成

表2：乙醇酸(GA)和乙醛酸(GxA)滴度和摇瓶中产生菌株消耗每克糖产生的以克计的GA或GxA的产量(Y)。对于GA或GxA/葡萄糖产量的精确定义参见下文。

	菌株3	菌株6
			[GA](g.L<sup>-1</sup>)	1.1	0.4
[GxA](g.L<sup>-1</sup>)	0.2	0.8
			Y GA(g.g<sup>-1</sup>)	0.11	0.03
Y GxA(g.g<sup>-1</sup>)	0.02	0.10

从上表2中可见，缺失ycdW拷贝和受控地诱导aceA基因后，菌株6产生比菌株3高得多的量的乙醛酸。如所预期的，该乙醛酸的产生与菌株6中乙醇酸合成的降低有关联。

GA和GxA产量表示如下：

实施例4：通过在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中过表达编码磷酸转酮酶的异源基因来改善乙醇酸产生——菌株7至12的构建。

菌株7至9的构建：在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中重新构建编码磷酸乙 酰转移酶的大肠杆菌pta基因

在菌株AG1413和其亲本菌株菌株1中，安排在操纵子中的ackA(SEQ ID N°17，其编码具有SEQ ID N°18的序列的蛋白质)和pta(SEQ ID N°19，其编码具有SEQ ID N°20的序列的蛋白质)基因二者先前已经被缺失。为了再次将乙酰磷酸(其由以下菌株中的磷酸转酮酶产生)转化为乙酰-CoA，将pta基因重新构建到菌株1背景中，同时保留ackA基因的缺失。

为了实现pta基因的重新构建，使用来自Keio collection的仅缺失ackA基因并携带野生型pta基因的ΔackA::Km突变体。通过P1噬菌体转导(根据方案2)将与pta野生型基因相关联的ΔackA::Km缺失从ΔackA::Km Keio突变体转移到菌株2中。选择卡那霉素抗性转导子，并且使用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证ΔackA::Km缺失和pta野生型基因二者的存在。保留的菌株被命名为菌株7。

然后使用Flp重组酶(根据方案1)从菌株7中的ΔackA缺失中去除抗生素盒。选择对卡那霉素敏感的转化子，并且使用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证抗生素标记的不存在。保留的菌株被命名为菌株8。

为了磷酸乙酰转移酶活性测定，使用埃尔曼氏硫醇试剂5,5′-二巯基双(2-对硝基苯甲酸)(DTNB)通过在412nm在30℃测量苯硫酚盐的形成，来监测来自乙酰-CoA的CoA的磷酸依赖性释放(ε₄₁₂＝13.6mM^-1cm^-1)。测定混合物(1mL)含有100mM KH₂PO₄(pH 8)、0.5mMDTNB和1mM乙酰-CoA。减去测定中不存在乙酰-CoA的情况下测定的活性值。比活度表示为毫单位(mUI)每毫克蛋白质。

菌株7的磷酸乙酰转移酶活性是菌株8的10倍(菌株7为1100mUI/mg；菌株8为110mUI/mg)。

然后将专利申请WO2010/108909中描述的质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01引入菌株8中，得到菌株9。

菌株10至12的构建：在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中过表达编码磷酸转 酮酶的异源基因

为了增加乙酰-CoA库并因此增加乙醇酸产生，在大肠杆菌乙醇酸过量产生者菌株中过量产生不同的磷酸转酮酶。

编码磷酸转酮酶的三种不同的基因在菌株9中单独过表达：

-来自动物双歧杆菌的xfp(SEQ ID N°21，其编码具有SEQ ID N°22的序列的蛋白质)，

-来自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的fxpk(SEQ ID N°23，其编码具有SEQ ID N°24的序列的蛋白质)，

-来自戊糖乳杆菌的xpk(SEQ ID N°25，其编码具有SEQ ID N°26的序列的蛋白质)。

对于每种基因(由“O1ec”后缀确定)，由来自Thermo Fisher Scientific的GeneArt基因合成服务合成性地合成经优化以用于在大肠杆菌中产生的密码子协调形式。使用适当的寡核苷酸将每种基因连同人工Ptrc启动子(该人工启动子是在专利申请WO2009/043803；Brosius等,1985中描述的用于过表达cysPUWAM操纵子的启动子)一起亚克隆到pBBR1MCS5载体上(Kovach等,1995)，分别得到下表3中详细描述的质粒。

表3：用于过表达磷酸转酮酶基因的质粒

每种质粒单独引入菌株9中，得到下表4中描述的菌株。

表4：包含用于过表达磷酸转酮酶基因的质粒的菌株：

pBBR1质粒以中等拷贝数稳定复制。

为了使磷酸转酮酶基因具有若干水平的过表达，还将这些基因克隆到在细胞中具有已知不同拷贝数的以下质粒中：

-低拷贝数pCL1920载体(Lerner&Inouye,1990)pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01质粒，

-和一个拷贝数的细菌人工染色体pBAC质粒

还将磷酸转酮酶过表达质粒连同pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01质粒一起引入菌株7和菌株8中。

在摇瓶和反应器中的性能

首先，如实施例3中所述的在摇瓶中评估菌株。

表5：在摇瓶中产生菌株消耗每克糖产生的以克计的乙醇酸(GA)的GA产量。对于GA/葡萄糖产量的精确定义参见实施例3。

如表5所示，过表达所有测试的磷酸转酮酶基因后，乙醇酸产生产量增加。在过表达来自动物双歧杆菌和来自戊糖乳杆菌的磷酸转酮酶基因的情况下，产量更高。

在2L发酵罐(Pierre Guerin)中使用分批补料策略评估这些菌株。

在37℃在混合培养基(具有2.5g.L^-1葡萄糖和90％基本培养基M1的10％LB培养基(Sigma 25％))中进行在管中的首次预培养持续10小时。将其用于在培养基M1中接种50mL第二接种物至OD₆₀₀为0.2。该步骤的预培养在37℃在500mL锥形瓶中进行，该三角培养瓶装有补充有40g.L^-1MOPS和10g.L^-1葡萄糖的50mL合成培养基(M1)。在OD_600nm接近9后，该第二预培养物用于接种发酵罐。

以约0.5的初始光密度接种装有补充有20g.L^-1葡萄糖的700mL合成培养基(M2)的反应器。M2培养基的组成在表6中描述。在30℃伴随搅拌进行培养，通过增加搅拌和充气，将溶解氧的浓度值保持在20％饱和与40％饱和之间，优选30％饱和。通过自动添加NH₄OH/NaOH溶液(15/5w/w)将pH调整至6.8。

以分批方式进行培养直到葡萄糖耗尽。此时，添加补充有硫酸镁、微量元素和硫胺素的700g.L^-1葡萄糖溶液，以在反应器中恢复20g.L^-1葡萄糖浓度。一旦葡萄糖再次耗尽进行进一次添加。第五次脉冲后，由于三小时的爬升，pH值增加到7.4。

40至45小时后终止培养。使用HPLC使用折射计检测(有机酸和葡萄糖)分析细胞外代谢产物。

对于每种菌株，进行若干重复。最终性能呈现在表7中。

表6：M2培养基的组成。

表7：菌株9、10和12在2L反应器中的最终性能。

符号～表示与参考菌株相比该参数的变化在-5％和5％之间。符号+表示在5％和10％之间的增加，并且符号++表示在10％和20％之间的增加。

过表达磷酸转酮酶基因后，菌株10和12的生产产量显示出依据被测试的异源基因的性质在5％和20％之间的增加。我们没有见到对滴度或对生产率的任何影响。根据这些结果，证实了磷酸转酮酶活性对GA产生的益处。

磷酸转酮酶的表达水平并不改变结果的趋势。在pCL1920或pBAC上携带的3个基因xfpO1ec、fxpkO1ec、xpkO1e的不同表达水平提高了乙醇酸的产生(结果未显示)。

产量计算如下：

通过初始体积+用于调节pH的和为培养物进料而添加的溶液的量-用于取样的体积-通过蒸发而失去的体积来计算发酵罐体积。

通过称重进料原料连续跟踪分批进料体积。然后基于注射的体积、溶液密度和通过Brix方法([葡萄糖])控制的葡萄糖浓度，计算注射的葡萄糖的量。GA产量表示如下：

GA₀和GA_f分别对应初始GA浓度和最终GA浓度，并且V₀和V_f分别对应初始体积和最终体积。消耗的葡萄糖以g表示。

粗提取物的5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶测定(X5PPK和F6PPK)

根据Racker等,1962和Meile等,2001，采用分光光度法作为乙酰异羟肟酸铁测量磷酸转酮酶活性，乙酰异羟肟酸铁是从酶催化生成的乙酰磷酸产生的。0.075ml的标准反应混合物由33.3mM磷酸钾(pH 6.5)、L-半胱氨酸盐酸盐(1.9mM)、氟化钠(23mM)、碘乙酸钠(8mM)、作为底物的6-磷酸D-果糖(F6P)(100mM)或5-磷酸D-木酮糖(X5P)(27mM)和用于开始反应的粗提取物组成。在37℃温育10分钟或30分钟后，通过添加0.0075ml的盐酸羟胺(2M,pH 6.5)终止酶反应。室温下10分钟后，添加0.05ml的15％(wt/vol)三氯乙酸、0.05ml的4MHCl和0.05ml的FeCl₃x 6H₂O(5％[wt/vol]在0.1M HCl中)用于乙酰异羟肟酸铁的最终显色。在搅拌下在25℃温育5分钟后，将混合物以2250x g离心5分钟，将200μl的上清液转移至一个新的微量板，以测量吸光度。然后在505nm处使用分光光度计法测量，通过与在1.5mM与150mM之间的一系列乙酰磷酸标准品比较，来定量乙酰异羟肟酸铁的形成。一个单位的磷酸转酮酶活性被定义为每分钟从F6P或X5P形成1mmol的乙酰磷酸的提取物的量。减去了在无底物的情况下测定的活性值。比活度表示为毫单位每毫克蛋白。

菌株10至12的5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性在表8中提供。

表8：测量的粗提取物的5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性

ND：未检测到

在大肠杆菌中表达的由来自动物双歧杆菌的xfp和来自青春双歧杆菌的fxpk编码的磷酸转酮酶催化对5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖底物的活性。不过，如表8中可见，这些酶对5-磷酸D-木酮糖比对6-磷酸果糖活性更高。与之相反，在大肠杆菌中表达的由来自戊糖乳杆菌的xpk编码的磷酸转酮酶仅仅对底物5-磷酸木酮糖有活性。

显示与不具有任何PK的参考菌株9相比，携带不同磷酸转酮酶(PK)酶的菌株10、11和12的乙醇酸产生的该实施例的结果，证明了磷酸转酮酶活性改善每消耗的葡萄糖的乙醇酸的产量，不管该酶(X5PPK或F6PPK)的底物专一性。

实施例5：通过在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中抑制ycdW表达和过表达编码磷酸转酮酶的异源基因来改善乙醛酸产生-菌株13至17的构建。

菌株13和14的构建：在ΔackA+pta AG1413菌株中抑制编码乙醛酸/羟基丙酮酸还 原酶的大肠杆菌ycdW基因的表达

菌株AG1413具有两个拷贝的ycdW基因，一个在染色体上，一个在pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01质粒上。

为了缺失菌株AG1413背景中的ycdW的染色体拷贝，通过P1噬菌体转导(根据方案2)将在实施例2中描述的ΔycdW::Km缺失从MG1655ΔycdW::Km转到菌株2中。选择卡那霉素抗性转导子，通过PCR分析使用适当的寡核苷酸验证ΔycdW::Km缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株13。

然后，将实施例2中描述的过表达aceA基因无ycdW基因的质粒pAG0303引入菌株13中，得到菌株14。

菌株15至16的构建：在pta野生型菌株9中抑制编码乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶的 大肠杆菌ycdW基因的表达

菌株9具有两个拷贝的ycdW基因，一个在染色体上，一个在pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01质粒上。

为了缺失菌株9背景中的ycdW的染色体拷贝，通过P1噬菌体转导(根据方案2)将在实施例2中描述的ΔycdW::Km缺失从MG1655ΔycdW::Km转到菌株8中。选择卡那霉素抗性转导子，通过PCR分析使用适当的寡核苷酸验证ΔycdW::Km缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株15。

然后，将在实施例2中描述的过表达aceA基因无ycdW基因的质粒pAG0303引入菌株15中，得到菌株16。

菌株17的构建：在大肠杆菌乙醛酸过量表达者重组菌株中过表达编码磷酸转酮酶 的动物双歧杆菌基因

将编码磷酸转酮酶的动物双歧杆菌xfpO1ec基因的密码子协调形式在菌株16中过表达。

为了将该基因在菌株16中过表达，将实施例4中描述的质粒pBBR1MCS5-Ptrc01-xfpO1ec引入菌株16中，得到菌株17。

为了测试磷酸转酮酶基因的过表达的不同水平，还将xfpO1ec基因克隆进具有比pBBR1更少的拷贝数的质粒：低拷贝数pCL1920载体(Lerner&Inouye,1990)，实施例2中描述的pAG303。

以上所述的所有修饰都是在菌株7背景中进行的。

对于其它两个磷酸转酮酶基因fxpkO1ec和xpkO1ec也进行相同工作。

在摇瓶中的性能

如实施例3中所述的，在摇瓶中评估菌株。

表9：摇瓶中产生菌株消耗每克糖产生的以克计的乙醛酸(GxA)的GxA产量。对于GxA/葡萄糖产量的精确定义参见实施例3。

菌株	GxA产量(g.g<sup>-1</sup>)
		菌株14	0.02
菌株16	0.02
		菌株17	0.03

在上表9中可见，来自动物双歧杆菌的磷酸转酮酶基因的过表达轻微增加乙醛酸的产生(菌株17对比菌株14)。

用其他测试的磷酸转酮酶也获得了相同的结果，即乙醛酸产量的增加(未显示数据)。

粗提取物的5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶测定(X5PPK和F6PPK)

根据在上文中实施例4中所述的方案测量磷酸转酮酶活性。菌株16和菌株17的5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性在表10中提供。

表10：测量的粗提取物的5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性

ND：未检测到

在大肠杆菌中表达的由来自动物双歧杆菌的xfp编码的磷酸转酮酶催化对5-磷酸D-木酮糖和6-磷酸果糖底物的活性。该酶对底物5-磷酸D-木酮糖的活性更高。

参考文献

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-Sardari RRR,Dishisha T,Pyo SH,Hatti-Kaul R,(2014),J.Biotechnol.,192:223-230

序列表

<110> METABOLIC EXPLORER

<120> 用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和微生物

<130> D36902

<150> 17305084.0

<151> 2017-01-26

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

atggaaagta aagtagttgt tccggcacaa ggcaagaaga tcaccctgca aaacggcaaa 60

ctcaacgttc ctgaaaatcc gattatccct tacattgaag gtgatggaat cggtgtagat 120

gtaaccccag ccatgctgaa agtggtcgac gctgcagtcg agaaagccta taaaggcgag 180

cgtaaaatct cctggatgga aatttacacc ggtgaaaaat ccacacaggt ttatggtcag 240

gacgtctggc tgcctgctga aactcttgat ctgattcgtg aatatcgcgt tgccattaaa 300

ggtccgctga ccactccggt tggtggcggt attcgctctc tgaacgttgc cctgcgccag 360

gaactggatc tctacatctg cctgcgtccg gtacgttact atcagggcac tccaagcccg 420

gttaaacacc ctgaactgac cgatatggtt atcttccgtg aaaactcgga agacatttat 480

gcgggtatcg aatggaaagc agactctgcc gacgccgaga aagtgattaa attcctgcgt 540

gaagagatgg gggtgaagaa aattcgcttc ccggaacatt gtggtatcgg tattaagccg 600

tgttcggaag aaggcaccaa acgtctggtt cgtgcagcga tcgaatacgc aattgctaac 660

gatcgtgact ctgtgactct ggtgcacaaa ggcaacatca tgaagttcac cgaaggagcg 720

tttaaagact ggggctacca gctggcgcgt gaagagtttg gcggtgaact gatcgacggt 780

ggcccgtggc tgaaagttaa aaacccgaac actggcaaag agatcgtcat taaagacgtg 840

attgctgatg cattcctgca acagatcctg ctgcgtccgg ctgaatatga tgttatcgcc 900

tgtatgaacc tgaacggtga ctacatttct gacgccctgg cagcgcaggt tggcggtatc 960

ggtatcgccc ctggtgcaaa catcggtgac gaatgcgccc tgtttgaagc cacccacggt 1020

actgcgccga aatatgccgg tcaggacaaa gtaaatcctg gctctattat tctctccgct 1080

gagatgatgc tgcgccacat gggttggacc gaagcggctg acttaattgt taaaggtatg 1140

gaaggcgcaa tcaacgcgaa aaccgtaacc tatgacttcg agcgtctgat ggatggcgct 1200

aaactgctga aatgttcaga gtttggtgac gcgatcatcg aaaacatgta a 1251

<210> 2

<211> 416

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Glu Ser Lys Val Val Val Pro Ala Gln Gly Lys Lys Ile Thr Leu

1 5 10 15

Gln Asn Gly Lys Leu Asn Val Pro Glu Asn Pro Ile Ile Pro Tyr Ile

20 25 30

Glu Gly Asp Gly Ile Gly Val Asp Val Thr Pro Ala Met Leu Lys Val

35 40 45

Val Asp Ala Ala Val Glu Lys Ala Tyr Lys Gly Glu Arg Lys Ile Ser

50 55 60

Trp Met Glu Ile Tyr Thr Gly Glu Lys Ser Thr Gln Val Tyr Gly Gln

65 70 75 80

Asp Val Trp Leu Pro Ala Glu Thr Leu Asp Leu Ile Arg Glu Tyr Arg

85 90 95

Val Ala Ile Lys Gly Pro Leu Thr Thr Pro Val Gly Gly Gly Ile Arg

100 105 110

Ser Leu Asn Val Ala Leu Arg Gln Glu Leu Asp Leu Tyr Ile Cys Leu

115 120 125

Arg Pro Val Arg Tyr Tyr Gln Gly Thr Pro Ser Pro Val Lys His Pro

130 135 140

Glu Leu Thr Asp Met Val Ile Phe Arg Glu Asn Ser Glu Asp Ile Tyr

145 150 155 160

Ala Gly Ile Glu Trp Lys Ala Asp Ser Ala Asp Ala Glu Lys Val Ile

165 170 175

Lys Phe Leu Arg Glu Glu Met Gly Val Lys Lys Ile Arg Phe Pro Glu

180 185 190

His Cys Gly Ile Gly Ile Lys Pro Cys Ser Glu Glu Gly Thr Lys Arg

195 200 205

Leu Val Arg Ala Ala Ile Glu Tyr Ala Ile Ala Asn Asp Arg Asp Ser

210 215 220

Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile Met Lys Phe Thr Glu Gly Ala

225 230 235 240

Phe Lys Asp Trp Gly Tyr Gln Leu Ala Arg Glu Glu Phe Gly Gly Glu

245 250 255

Leu Ile Asp Gly Gly Pro Trp Leu Lys Val Lys Asn Pro Asn Thr Gly

260 265 270

Lys Glu Ile Val Ile Lys Asp Val Ile Ala Asp Ala Phe Leu Gln Gln

275 280 285

Ile Leu Leu Arg Pro Ala Glu Tyr Asp Val Ile Ala Cys Met Asn Leu

290 295 300

Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Asp Ala Leu Ala Ala Gln Val Gly Gly Ile

305 310 315 320

Gly Ile Ala Pro Gly Ala Asn Ile Gly Asp Glu Cys Ala Leu Phe Glu

325 330 335

Ala Thr His Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Ala Gly Gln Asp Lys Val Asn

340 345 350

Pro Gly Ser Ile Ile Leu Ser Ala Glu Met Met Leu Arg His Met Gly

355 360 365

Trp Thr Glu Ala Ala Asp Leu Ile Val Lys Gly Met Glu Gly Ala Ile

370 375 380

Asn Ala Lys Thr Val Thr Tyr Asp Phe Glu Arg Leu Met Asp Gly Ala

385 390 395 400

Lys Leu Leu Lys Cys Ser Glu Phe Gly Asp Ala Ile Ile Glu Asn Met

405 410 415

<210> 3

<211> 1737

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 3

atgccgcgtg gcctggaatt attgattgct caaaccattt tgcaaggctt cgatgctcag 60

tatggtcgat tcctcgaagt gacctccggt gcgcagcagc gtttcgaaca ggccgactgg 120

catgctgtcc agcaggcgat gaaaaaccgt atccatcttt acgatcatca cgttggtctg 180

gtcgtggagc aactgcgctg cattactaac ggccaaagta cggacgcggc atttttacta 240

cgtgttaaag agcattacac ccggctgttg ccggattacc cgcgcttcga gattgcggag 300

agctttttta actccgtgta ctgtcggtta tttgaccacc gctcgcttac tcccgagcgg 360

ctttttatct ttagctctca gccagagcgc cgctttcgta ccattccccg cccgctggcg 420

aaagactttc accccgatca cggctgggaa tctctactga tgcgcgttat cagcgaccta 480

ccgctgcgcc tgcgctggca gaataaaagc cgtgacatcc attacattat tcgccatctg 540

acggaaacgc tggggacaga caacctcgcg gaaagtcatt tacaggtggc gaacgaactg 600

ttttaccgca ataaagccgc ctggctggta ggcaaactga tcacaccttc cggcacattg 660

ccatttttgc tgccgatcca ccagacggac gacggcgagt tatttattga tacctgcctg 720

acgacgaccg ccgaagcgag cattgttttt ggctttgcgc gttcttattt tatggtttat 780

gcgccgctgc ccgcagcgct ggtcgagtgg ctacgggaaa ttctgccagg taaaaccacc 840

gctgaattgt atatggctat cggctgccag aagcacgcca aaaccgaaag ctaccgcgaa 900

tatctcgttt atctacaggg ctgtaatgag cagttcattg aagcgccggg tattcgtgga 960

atggtgatgt tggtgtttac gctgccgggc tttgatcggg tattcaaagt catcaaagac 1020

aggttcgcgc cgcagaaaga gatgtctgcc gctcacgttc gtgcctgcta tcaactggtg 1080

aaagagcacg atcgcgtggg ccgaatggcg gacacccagg agtttgaaaa ctttgtgctg 1140

gagaagcggc atatttcccc ggcattaatg gaattactgc ttcaggaagc agcggaaaaa 1200

atcaccgatc tcggcgaaca aattgtgatt cgccatcttt atattgagcg gcggatggtg 1260

ccgctcaata tctggctgga acaagtggaa ggtcagcagt tgcgcgacgc cattgaagaa 1320

tacggtaacg ctattcgcca gcttgccgct gctaacattt tccctggcga catgctgttt 1380

aaaaacttcg gtgtcacccg tcacgggcgt gtggtttttt atgattacga tgaaatttgc 1440

tacatgacgg aagtgaattt ccgcgacatc ccgccgccgc gctatccgga agacgaactt 1500

gccagcgaac cgtggtacag cgtctcgccg ggcgatgttt tcccggaaga gtttcgccac 1560

tggctatgcg ccgacccgcg tattggtccg ctgtttgaag agatgcacgc cgacctgttc 1620

cgcgctgatt actggcgcgc actacaaaac cgcatacgtg aagggcatgt ggaagatgtt 1680

tatgcgtatc ggcgcaggca aagatttagc gtacggtatg gggagatgct tttttga 1737

<210> 4

<211> 578

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Met Pro Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Ala Gln Thr Ile Leu Gln Gly

1 5 10 15

Phe Asp Ala Gln Tyr Gly Arg Phe Leu Glu Val Thr Ser Gly Ala Gln

20 25 30

Gln Arg Phe Glu Gln Ala Asp Trp His Ala Val Gln Gln Ala Met Lys

35 40 45

Asn Arg Ile His Leu Tyr Asp His His Val Gly Leu Val Val Glu Gln

50 55 60

Leu Arg Cys Ile Thr Asn Gly Gln Ser Thr Asp Ala Ala Phe Leu Leu

65 70 75 80

Arg Val Lys Glu His Tyr Thr Arg Leu Leu Pro Asp Tyr Pro Arg Phe

85 90 95

Glu Ile Ala Glu Ser Phe Phe Asn Ser Val Tyr Cys Arg Leu Phe Asp

100 105 110

His Arg Ser Leu Thr Pro Glu Arg Leu Phe Ile Phe Ser Ser Gln Pro

115 120 125

Glu Arg Arg Phe Arg Thr Ile Pro Arg Pro Leu Ala Lys Asp Phe His

130 135 140

Pro Asp His Gly Trp Glu Ser Leu Leu Met Arg Val Ile Ser Asp Leu

145 150 155 160

Pro Leu Arg Leu Arg Trp Gln Asn Lys Ser Arg Asp Ile His Tyr Ile

165 170 175

Ile Arg His Leu Thr Glu Thr Leu Gly Thr Asp Asn Leu Ala Glu Ser

180 185 190

His Leu Gln Val Ala Asn Glu Leu Phe Tyr Arg Asn Lys Ala Ala Trp

195 200 205

Leu Val Gly Lys Leu Ile Thr Pro Ser Gly Thr Leu Pro Phe Leu Leu

210 215 220

Pro Ile His Gln Thr Asp Asp Gly Glu Leu Phe Ile Asp Thr Cys Leu

225 230 235 240

Thr Thr Thr Ala Glu Ala Ser Ile Val Phe Gly Phe Ala Arg Ser Tyr

245 250 255

Phe Met Val Tyr Ala Pro Leu Pro Ala Ala Leu Val Glu Trp Leu Arg

260 265 270

Glu Ile Leu Pro Gly Lys Thr Thr Ala Glu Leu Tyr Met Ala Ile Gly

275 280 285

Cys Gln Lys His Ala Lys Thr Glu Ser Tyr Arg Glu Tyr Leu Val Tyr

290 295 300

Leu Gln Gly Cys Asn Glu Gln Phe Ile Glu Ala Pro Gly Ile Arg Gly

305 310 315 320

Met Val Met Leu Val Phe Thr Leu Pro Gly Phe Asp Arg Val Phe Lys

325 330 335

Val Ile Lys Asp Arg Phe Ala Pro Gln Lys Glu Met Ser Ala Ala His

340 345 350

Val Arg Ala Cys Tyr Gln Leu Val Lys Glu His Asp Arg Val Gly Arg

355 360 365

Met Ala Asp Thr Gln Glu Phe Glu Asn Phe Val Leu Glu Lys Arg His

370 375 380

Ile Ser Pro Ala Leu Met Glu Leu Leu Leu Gln Glu Ala Ala Glu Lys

385 390 395 400

Ile Thr Asp Leu Gly Glu Gln Ile Val Ile Arg His Leu Tyr Ile Glu

405 410 415

Arg Arg Met Val Pro Leu Asn Ile Trp Leu Glu Gln Val Glu Gly Gln

420 425 430

Gln Leu Arg Asp Ala Ile Glu Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Arg Gln Leu

435 440 445

Ala Ala Ala Asn Ile Phe Pro Gly Asp Met Leu Phe Lys Asn Phe Gly

450 455 460

Val Thr Arg His Gly Arg Val Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Glu Ile Cys

465 470 475 480

Tyr Met Thr Glu Val Asn Phe Arg Asp Ile Pro Pro Pro Arg Tyr Pro

485 490 495

Glu Asp Glu Leu Ala Ser Glu Pro Trp Tyr Ser Val Ser Pro Gly Asp

500 505 510

Val Phe Pro Glu Glu Phe Arg His Trp Leu Cys Ala Asp Pro Arg Ile

515 520 525

Gly Pro Leu Phe Glu Glu Met His Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Tyr

530 535 540

Trp Arg Ala Leu Gln Asn Arg Ile Arg Glu Gly His Val Glu Asp Val

545 550 555 560

Tyr Ala Tyr Arg Arg Arg Gln Arg Phe Ser Val Arg Tyr Gly Glu Met

565 570 575

Leu Phe

<210> 5

<211> 939

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 5

atggatatca tcttttatca cccaacgttc gatacccaat ggtggattga ggcactgcgc 60

aaagctattc ctcaggcaag agtcagagca tggaaaagcg gagataatga ctctgctgat 120

tatgctttag tctggcatcc tcctgttgaa atgctggcag ggcgcgatct taaagcggtg 180

ttcgcactcg gggccggtgt tgattctatt ttgagcaagc tacaggcaca ccctgaaatg 240

ctgaaccctt ctgttccact ttttcgcctg gaagataccg gtatgggcga gcaaatgcag 300

gaatatgctg tcagtcaggt gctgcattgg tttcgacgtt ttgacgatta tcgcatccag 360

caaaatagtt cgcattggca accgctgcct gaatatcatc gggaagattt taccatcggc 420

attttgggcg caggcgtact gggcagtaaa gttgctcaga gtctgcaaac ctggcgcttt 480

ccgctgcgtt gctggagtcg aacccgtaaa tcgtggcctg gcgtgcaaag ctttgccgga 540

cgggaagaac tgtctgcatt tctgagccaa tgtcgggtat tgattaattt gttaccgaat 600

acccctgaaa ccgtcggcat tattaatcaa caattactcg aaaaattacc ggatggcgcg 660

tatctcctca acctggcgcg tggtgttcat gttgtggaag atgacctgct cgcggcgctg 720

gatagcggca aagttaaagg cgcaatgttg gatgttttta atcgtgaacc cttaccgcct 780

gaaagtccgc tctggcaaca tccacgcgtg acgataacac cacatgtcgc cgcgattacc 840

cgtcccgctg aagctgtgga gtacatttct cgcaccattg cccagctcga aaaaggggag 900

agggtctgcg ggcaagtcga ccgcgcacgc ggctactaa 939

<210> 6

<211> 312

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 6

Met Asp Ile Ile Phe Tyr His Pro Thr Phe Asp Thr Gln Trp Trp Ile

1 5 10 15

Glu Ala Leu Arg Lys Ala Ile Pro Gln Ala Arg Val Arg Ala Trp Lys

20 25 30

Ser Gly Asp Asn Asp Ser Ala Asp Tyr Ala Leu Val Trp His Pro Pro

35 40 45

Val Glu Met Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Ala Val Phe Ala Leu Gly

50 55 60

Ala Gly Val Asp Ser Ile Leu Ser Lys Leu Gln Ala His Pro Glu Met

65 70 75 80

Leu Asn Pro Ser Val Pro Leu Phe Arg Leu Glu Asp Thr Gly Met Gly

85 90 95

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100 105 110

Arg Phe Asp Asp Tyr Arg Ile Gln Gln Asn Ser Ser His Trp Gln Pro

115 120 125

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130 135 140

Gly Val Leu Gly Ser Lys Val Ala Gln Ser Leu Gln Thr Trp Arg Phe

145 150 155 160

Pro Leu Arg Cys Trp Ser Arg Thr Arg Lys Ser Trp Pro Gly Val Gln

165 170 175

Ser Phe Ala Gly Arg Glu Glu Leu Ser Ala Phe Leu Ser Gln Cys Arg

180 185 190

Val Leu Ile Asn Leu Leu Pro Asn Thr Pro Glu Thr Val Gly Ile Ile

195 200 205

Asn Gln Gln Leu Leu Glu Lys Leu Pro Asp Gly Ala Tyr Leu Leu Asn

210 215 220

Leu Ala Arg Gly Val His Val Val Glu Asp Asp Leu Leu Ala Ala Leu

225 230 235 240

Asp Ser Gly Lys Val Lys Gly Ala Met Leu Asp Val Phe Asn Arg Glu

245 250 255

Pro Leu Pro Pro Glu Ser Pro Leu Trp Gln His Pro Arg Val Thr Ile

260 265 270

Thr Pro His Val Ala Ala Ile Thr Arg Pro Ala Glu Ala Val Glu Tyr

275 280 285

Ile Ser Arg Thr Ile Ala Gln Leu Glu Lys Gly Glu Arg Val Cys Gly

290 295 300

Gln Val Asp Arg Ala Arg Gly Tyr

305 310

<210> 7

<211> 1083

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 7

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60

tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120

gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180

tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240

gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300

cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 360

gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 420

actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 480

ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag 540

caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc 600

tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 660

agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact 720

gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc 780

gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 840

tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 900

gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 960

gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 1020

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 1080

tga 1083

<210> 8

<211> 360

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 8

Met Lys Pro Val Thr Leu Tyr Asp Val Ala Glu Tyr Ala Gly Val Ser

1 5 10 15

Tyr Gln Thr Val Ser Arg Val Val Asn Gln Ala Ser His Val Ser Ala

20 25 30

Lys Thr Arg Glu Lys Val Glu Ala Ala Met Ala Glu Leu Asn Tyr Ile

35 40 45

Pro Asn Arg Val Ala Gln Gln Leu Ala Gly Lys Gln Ser Leu Leu Ile

50 55 60

Gly Val Ala Thr Ser Ser Leu Ala Leu His Ala Pro Ser Gln Ile Val

65 70 75 80

Ala Ala Ile Lys Ser Arg Ala Asp Gln Leu Gly Ala Ser Val Val Val

85 90 95

Ser Met Val Glu Arg Ser Gly Val Glu Ala Cys Lys Ala Ala Val His

100 105 110

Asn Leu Leu Ala Gln Arg Val Ser Gly Leu Ile Ile Asn Tyr Pro Leu

115 120 125

Asp Asp Gln Asp Ala Ile Ala Val Glu Ala Ala Cys Thr Asn Val Pro

130 135 140

Ala Leu Phe Leu Asp Val Ser Asp Gln Thr Pro Ile Asn Ser Ile Ile

145 150 155 160

Phe Ser His Glu Asp Gly Thr Arg Leu Gly Val Glu His Leu Val Ala

165 170 175

Leu Gly His Gln Gln Ile Ala Leu Leu Ala Gly Pro Leu Ser Ser Val

180 185 190

Ser Ala Arg Leu Arg Leu Ala Gly Trp His Lys Tyr Leu Thr Arg Asn

195 200 205

Gln Ile Gln Pro Ile Ala Glu Arg Glu Gly Asp Trp Ser Ala Met Ser

210 215 220

Gly Phe Gln Gln Thr Met Gln Met Leu Asn Glu Gly Ile Val Pro Thr

225 230 235 240

Ala Met Leu Val Ala Asn Asp Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Arg Ala

245 250 255

Ile Thr Glu Ser Gly Leu Arg Val Gly Ala Asp Ile Ser Val Val Gly

260 265 270

Tyr Asp Asp Thr Glu Asp Ser Ser Cys Tyr Ile Pro Pro Leu Thr Thr

275 280 285

Ile Lys Gln Asp Phe Arg Leu Leu Gly Gln Thr Ser Val Asp Arg Leu

290 295 300

Leu Gln Leu Ser Gln Gly Gln Ala Val Lys Gly Asn Gln Leu Leu Pro

305 310 315 320

Val Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu Ala Pro Asn Thr Gln Thr

325 330 335

Ala Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln

340 345 350

Val Ser Arg Leu Glu Ser Gly Gln

355 360

<210> 9

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于ycdW缺失的引物

<400> 9

atgagaataa atttcgcaca acgcttttcg ggagtcagta tggatatcat cttttatcac 60

ccaacgttcg atacccaatg gg 82

<210> 10

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于ycdW缺失的引物

<400> 10

ttagtagccg cgtgcgcggt cgacttgccc gcagaccctc tccccttttt cgagctgggc 60

aatggtgcga gaaatgtac 79

<210> 11

<211> 1305

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 11

atgaaaaccc gtacacaaca aattgaagaa ttacagaaag agtggactca accgcgttgg 60

gaaggcatta ctcgcccata cagtgcggaa gatgtggtga aattacgcgg ttcagtcaat 120

cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180

tcgaaaaaag gctacatcaa cagcctcggc gcactgactg gcggtcaggc gctgcaacag 240

gcgaaagcgg gtattgaagc agtctatctg tcgggatggc aggtagcggc ggacgctaac 300

ctggcggcca gcatgtatcc ggatcagtcg ctctatccgg caaactcggt gccagctgtg 360

gtggagcgga tcaacaacac cttccgtcgt gccgatcaga tccaatggtc cgcgggcatt 420

gagccgggcg atccgcgcta tgtcgattac ttcctgccga tcgttgccga tgcggaagcc 480

ggttttggcg gtgtcctgaa tgcctttgaa ctgatgaaag cgatgattga agccggtgca 540

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<210> 12

<211> 434

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 12

Met Lys Thr Arg Thr Gln Gln Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu Trp Thr

1 5 10 15

Gln Pro Arg Trp Glu Gly Ile Thr Arg Pro Tyr Ser Ala Glu Asp Val

20 25 30

Val Lys Leu Arg Gly Ser Val Asn Pro Glu Cys Thr Leu Ala Gln Leu

35 40 45

Gly Ala Ala Lys Met Trp Arg Leu Leu His Gly Glu Ser Lys Lys Gly

50 55 60

Tyr Ile Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Gln Ala Leu Gln Gln

65 70 75 80

Ala Lys Ala Gly Ile Glu Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala

85 90 95

Ala Asp Ala Asn Leu Ala Ala Ser Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr

100 105 110

Pro Ala Asn Ser Val Pro Ala Val Val Glu Arg Ile Asn Asn Thr Phe

115 120 125

Arg Arg Ala Asp Gln Ile Gln Trp Ser Ala Gly Ile Glu Pro Gly Asp

130 135 140

Pro Arg Tyr Val Asp Tyr Phe Leu Pro Ile Val Ala Asp Ala Glu Ala

145 150 155 160

Gly Phe Gly Gly Val Leu Asn Ala Phe Glu Leu Met Lys Ala Met Ile

165 170 175

Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val His Phe Glu Asp Gln Leu Ala Ser Val

180 185 190

Lys Lys Cys Gly His Met Gly Gly Lys Val Leu Val Pro Thr Gln Glu

195 200 205

Ala Ile Gln Lys Leu Val Ala Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Thr Gly

210 215 220

Val Pro Thr Leu Leu Val Ala Arg Thr Asp Ala Asp Ala Ala Asp Leu

225 230 235 240

Ile Thr Ser Asp Cys Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Phe Ile Thr Gly Glu

245 250 255

Arg Thr Ser Glu Gly Phe Phe Arg Thr His Ala Gly Ile Glu Gln Ala

260 265 270

Ile Ser Arg Gly Leu Ala Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Cys

275 280 285

Glu Thr Ser Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ala

290 295 300

Ile His Ala Lys Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro

305 310 315 320

Ser Phe Asn Trp Gln Lys Asn Leu Asp Asp Lys Thr Ile Ala Ser Phe

325 330 335

Gln Gln Gln Leu Ser Asp Met Gly Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu

340 345 350

Ala Gly Ile His Ser Met Trp Phe Asn Met Phe Asp Leu Ala Asn Ala

355 360 365

Tyr Ala Gln Gly Glu Gly Met Lys His Tyr Val Glu Lys Val Gln Gln

370 375 380

Pro Glu Phe Ala Ala Ala Lys Asp Gly Tyr Thr Phe Val Ser His Gln

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Gln Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Lys Val Thr Thr Ile Ile Gln

405 410 415

Gly Gly Thr Ser Ser Val Thr Ala Leu Thr Gly Ser Thr Glu Glu Ser

420 425 430

Gln Phe

<210> 13

<211> 1602

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 13

atgactgaac aggcaacaac aaccgatgaa ctggctttca caaggccgta tggcgagcag 60

gagaagcaaa ttcttactgc cgaagcggta gaatttctga ctgagctggt gacgcatttt 120

acgccacaac gcaataaact tctggcagcg cgcattcagc agcagcaaga tattgataac 180

ggaacgttgc ctgattttat ttcggaaaca gcttccattc gcgatgctga ttggaaaatt 240

cgcgggattc ctgcggactt agaagaccgc cgcgtagaga taactggccc ggtagagcgc 300

aagatggtga tcaacgcgct caacgccaat gtgaaagtct ttatggccga tttcgaagat 360

tcactggcac cagactggaa caaagtgatc gacgggcaaa ttaacctgcg tgatgcggtt 420

aacggcacca tcagttacac caatgaagca ggcaaaattt accagctcaa gcccaatcca 480

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ttcagctata tcaaaacgtt gaaaaactat cccgatcgcg tcctgccaga cagacaggca 900

gtgacgatgg ataaaccatt cctgaatgct tactcacgcc tgttgattaa aacctgccat 960

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cacaataacc aggtgctcaa caaagtaaaa gcggataaat cgctggaagc caataacggt 1080

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gacattctcg gctcccgtaa aaatcagctt gaagtgatgc gcgaacaaga cgcgccgatt 1200

actgccgatc agctgctggc accttgtgat ggtgaacgca ccgaagaagg tatgcgcgcc 1260

aacattcgcg tggctgtgca gtacatcgaa gcgtggatct ctggcaacgg ctgtgtgccg 1320

atttatggcc tgatggaaga tgcggcgacg gctgaaattt cccgtacctc gatctggcag 1380

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caggggcgtt ttgacgatgc cgcacgcttg atggaacaga tcaccacttc cgatgagtta 1560

attgatttcc tgaccctgcc aggctaccgc ctgttagcgt aa 1602

<210> 14

<211> 533

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 14

Met Thr Glu Gln Ala Thr Thr Thr Asp Glu Leu Ala Phe Thr Arg Pro

1 5 10 15

Tyr Gly Glu Gln Glu Lys Gln Ile Leu Thr Ala Glu Ala Val Glu Phe

20 25 30

Leu Thr Glu Leu Val Thr His Phe Thr Pro Gln Arg Asn Lys Leu Leu

35 40 45

Ala Ala Arg Ile Gln Gln Gln Gln Asp Ile Asp Asn Gly Thr Leu Pro

50 55 60

Asp Phe Ile Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Asp Ala Asp Trp Lys Ile

65 70 75 80

Arg Gly Ile Pro Ala Asp Leu Glu Asp Arg Arg Val Glu Ile Thr Gly

85 90 95

Pro Val Glu Arg Lys Met Val Ile Asn Ala Leu Asn Ala Asn Val Lys

100 105 110

Val Phe Met Ala Asp Phe Glu Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asn Lys

115 120 125

Val Ile Asp Gly Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Val Asn Gly Thr Ile

130 135 140

Ser Tyr Thr Asn Glu Ala Gly Lys Ile Tyr Gln Leu Lys Pro Asn Pro

145 150 155 160

Ala Val Leu Ile Cys Arg Val Arg Gly Leu His Leu Pro Glu Lys His

165 170 175

Val Thr Trp Arg Gly Glu Ala Ile Pro Gly Ser Leu Phe Asp Phe Ala

180 185 190

Leu Tyr Phe Phe His Asn Tyr Gln Ala Leu Leu Ala Lys Gly Ser Gly

195 200 205

Pro Tyr Phe Tyr Leu Pro Lys Thr Gln Ser Trp Gln Glu Ala Ala Trp

210 215 220

Trp Ser Glu Val Phe Ser Tyr Ala Glu Asp Arg Phe Asn Leu Pro Arg

225 230 235 240

Gly Thr Ile Lys Ala Thr Leu Leu Ile Glu Thr Leu Pro Ala Val Phe

245 250 255

Gln Met Asp Glu Ile Leu His Ala Leu Arg Asp His Ile Val Gly Leu

260 265 270

Asn Cys Gly Arg Trp Asp Tyr Ile Phe Ser Tyr Ile Lys Thr Leu Lys

275 280 285

Asn Tyr Pro Asp Arg Val Leu Pro Asp Arg Gln Ala Val Thr Met Asp

290 295 300

Lys Pro Phe Leu Asn Ala Tyr Ser Arg Leu Leu Ile Lys Thr Cys His

305 310 315 320

Lys Arg Gly Ala Phe Ala Met Gly Gly Met Ala Ala Phe Ile Pro Ser

325 330 335

Lys Asp Glu Glu His Asn Asn Gln Val Leu Asn Lys Val Lys Ala Asp

340 345 350

Lys Ser Leu Glu Ala Asn Asn Gly His Asp Gly Thr Trp Ile Ala His

355 360 365

Pro Gly Leu Ala Asp Thr Ala Met Ala Val Phe Asn Asp Ile Leu Gly

370 375 380

Ser Arg Lys Asn Gln Leu Glu Val Met Arg Glu Gln Asp Ala Pro Ile

385 390 395 400

Thr Ala Asp Gln Leu Leu Ala Pro Cys Asp Gly Glu Arg Thr Glu Glu

405 410 415

Gly Met Arg Ala Asn Ile Arg Val Ala Val Gln Tyr Ile Glu Ala Trp

420 425 430

Ile Ser Gly Asn Gly Cys Val Pro Ile Tyr Gly Leu Met Glu Asp Ala

435 440 445

Ala Thr Ala Glu Ile Ser Arg Thr Ser Ile Trp Gln Trp Ile His His

450 455 460

Gln Lys Thr Leu Ser Asn Gly Lys Pro Val Thr Lys Ala Leu Phe Arg

465 470 475 480

Gln Met Leu Gly Glu Glu Met Lys Val Ile Ala Ser Glu Leu Gly Glu

485 490 495

Glu Arg Phe Ser Gln Gly Arg Phe Asp Asp Ala Ala Arg Leu Met Glu

500 505 510

Gln Ile Thr Thr Ser Asp Glu Leu Ile Asp Phe Leu Thr Leu Pro Gly

515 520 525

Tyr Arg Leu Leu Ala

530

<210> 15

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于aceBAK缺失的引物

<400> 15

ctggctttca caaggccgta tggcgagcag gagaagcaaa ttcttactgc cgaagcggta 60

gaatttctga ctgagctggt 80

<210> 16

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于aceBAK缺失的引物

<400> 16

aacatcttcc acatgccctt cacgtatgcg gttttgtagt gcgcgccagt aatcagcgcg 60

gaacaggtcg gcgtgcatc 79

<210> 17

<211> 1203

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 17

atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcactgaa atttgccatc 60

atcgatgcag taaatggtga agagtacctt tctggtttag ccgaatgttt ccacctgccc 120

gaagcacgta tcaaatggaa aatggacggc aataaacagg aagcggcttt aggtgcaggc 180

gccgctcaca gcgaagcgct caactttatc gttaatacta ttctggcaca aaaaccagaa 240

ctgtctgcgc agctgactgc tatcggtcac cgtatcgtac acggcggcga aaagtatacc 300

agctccgtag tgatcgatga gtctgttatt cagggtatca aagatgcagc ttcttttgca 360

ccgctgcaca acccggctca cctgatcggt atcgaagaag ctctgaaatc tttcccacag 420

ctgaaagaca aaaacgttgc tgtatttgac accgcgttcc accagactat gccggaagag 480

tcttacctct acgccctgcc ttacaacctg tacaaagagc acggcatccg tcgttacggc 540

gcgcacggca ccagccactt ctatgtaacc caggaagcgg caaaaatgct gaacaaaccg 600

gtagaagaac tgaacatcat cacctgccac ctgggcaacg gtggttccgt ttctgctatc 660

cgcaacggta aatgcgttga cacctctatg ggcctgaccc cgctggaagg tctggtcatg 720

ggtacccgtt ctggtgatat cgatccggcg atcatcttcc acctgcacga caccctgggc 780

atgagcgttg acgcaatcaa caaactgctg accaaagagt ctggcctgct gggtctgacc 840

gaagtgacca gcgactgccg ctatgttgaa gacaactacg cgacgaaaga agacgcgaag 900

cgcgcaatgg acgtttactg ccaccgcctg gcgaaataca tcggtgccta cactgcgctg 960

atggatggtc gtctggacgc tgttgtattc actggtggta tcggtgaaaa tgccgcaatg 1020

gttcgtgaac tgtctctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagttga tcatgaacgc 1080

aacctggctg cacgtttcgg caaatctggt ttcatcaaca aagaaggtac ccgtcctgcg 1140

gtggttatcc caaccaacga agaactggtt atcgcgcaag acgcgagccg cctgactgcc 1200

tga 1203

<210> 18

<211> 400

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 18

Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu

1 5 10 15

Lys Phe Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ser Gly

20 25 30

Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met

35 40 45

Asp Gly Asn Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser

50 55 60

Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu

65 70 75 80

Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly

85 90 95

Glu Lys Tyr Thr Ser Ser Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Gln Gly

100 105 110

Ile Lys Asp Ala Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu

115 120 125

Ile Gly Ile Glu Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys

130 135 140

Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Glu Glu

145 150 155 160

Ser Tyr Leu Tyr Ala Leu Pro Tyr Asn Leu Tyr Lys Glu His Gly Ile

165 170 175

Arg Arg Tyr Gly Ala His Gly Thr Ser His Phe Tyr Val Thr Gln Glu

180 185 190

Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr

195 200 205

Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys

210 215 220

Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met

225 230 235 240

Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His

245 250 255

Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu Thr Lys

260 265 270

Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr

275 280 285

Val Glu Asp Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Ala Lys Arg Ala Met Asp

290 295 300

Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Thr Ala Leu

305 310 315 320

Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu

325 330 335

Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu

340 345 350

Gly Phe Glu Val Asp His Glu Arg Asn Leu Ala Ala Arg Phe Gly Lys

355 360 365

Ser Gly Phe Ile Asn Lys Glu Gly Thr Arg Pro Ala Val Val Ile Pro

370 375 380

Thr Asn Glu Glu Leu Val Ile Ala Gln Asp Ala Ser Arg Leu Thr Ala

385 390 395 400

<210> 19

<211> 2145

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 19

gtgtcccgta ttattatgct gatccctacc ggaaccagcg tcggtctgac cagcgtcagc 60

cttggcgtga tccgtgcaat ggaacgcaaa ggcgttcgtc tgagcgtttt caaacctatc 120

gctcagccgc gtaccggtgg cgatgcgccc gatcagacta cgactatcgt gcgtgcgaac 180

tcttccacca cgacggccgc tgaaccgctg aaaatgagct acgttgaagg tctgctttcc 240

agcaatcaga aagatgtgct gatggaagag atcgtcgcaa actaccacgc taacaccaaa 300

gacgctgaag tcgttctggt tgaaggtctg gtcccgacac gtaagcacca gtttgcccag 360

tctctgaact acgaaatcgc taaaacgctg aatgcggaaa tcgtcttcgt tatgtctcag 420

ggcactgaca ccccggaaca gctgaaagag cgtatcgaac tgacccgcaa cagcttcggc 480

ggtgccaaaa acaccaacat caccggcgtt atcgttaaca aactgaacgc accggttgat 540

gaacagggtc gtactcgccc ggatctgtcc gagattttcg acgactcttc caaagctaaa 600

gtaaacaatg ttgatccggc gaagctgcaa gaatccagcc cgctgccggt tctcggcgct 660

gtgccgtgga gctttgacct gatcgcgact cgtgcgatcg atatggctcg ccacctgaat 720

gcgaccatca tcaacgaagg cgacatcaat actcgccgcg ttaaatccgt cactttctgc 780

gcacgcagca ttccgcacat gctggagcac ttccgtgccg gttctctgct ggtgacttcc 840

gcagaccgtc ctgacgtgct ggtggccgct tgcctggcag ccatgaacgg cgtagaaatc 900

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cgtgctttcg ctaccggcct gccggtattt atggtgaaca ccaacacctg gcagacctct 1020

ctgagcctgc agagcttcaa cctggaagtt ccggttgacg atcacgaacg tatcgagaaa 1080

gttcaggaat acgttgctaa ctacatcaac gctgactgga tcgaatctct gactgccact 1140

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atcaaccgtg ttgcagcgtc tcagggtgta gaactgggtg cagggattga aatcgttgat 1380

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atgaccgaaa ccgttgcccg cgaacagctg gaagacaacg tggtgctcgg tacgctgatg 1500

ctggaacagg atgaagttga tggtctggtt tccggtgctg ttcacactac cgcaaacacc 1560

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<210> 20

<211> 714

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 20

Met Ser Arg Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Gly Thr Ser Val Gly Leu

1 5 10 15

Thr Ser Val Ser Leu Gly Val Ile Arg Ala Met Glu Arg Lys Gly Val

20 25 30

Arg Leu Ser Val Phe Lys Pro Ile Ala Gln Pro Arg Thr Gly Gly Asp

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Ala Pro Asp Gln Thr Thr Thr Ile Val Arg Ala Asn Ser Ser Thr Thr

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Thr Ala Ala Glu Pro Leu Lys Met Ser Tyr Val Glu Gly Leu Leu Ser

65 70 75 80

Ser Asn Gln Lys Asp Val Leu Met Glu Glu Ile Val Ala Asn Tyr His

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Ala Asn Thr Lys Asp Ala Glu Val Val Leu Val Glu Gly Leu Val Pro

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Thr Arg Lys His Gln Phe Ala Gln Ser Leu Asn Tyr Glu Ile Ala Lys

115 120 125

Thr Leu Asn Ala Glu Ile Val Phe Val Met Ser Gln Gly Thr Asp Thr

130 135 140

Pro Glu Gln Leu Lys Glu Arg Ile Glu Leu Thr Arg Asn Ser Phe Gly

145 150 155 160

Gly Ala Lys Asn Thr Asn Ile Thr Gly Val Ile Val Asn Lys Leu Asn

165 170 175

Ala Pro Val Asp Glu Gln Gly Arg Thr Arg Pro Asp Leu Ser Glu Ile

180 185 190

Phe Asp Asp Ser Ser Lys Ala Lys Val Asn Asn Val Asp Pro Ala Lys

195 200 205

Leu Gln Glu Ser Ser Pro Leu Pro Val Leu Gly Ala Val Pro Trp Ser

210 215 220

Phe Asp Leu Ile Ala Thr Arg Ala Ile Asp Met Ala Arg His Leu Asn

225 230 235 240

Ala Thr Ile Ile Asn Glu Gly Asp Ile Asn Thr Arg Arg Val Lys Ser

245 250 255

Val Thr Phe Cys Ala Arg Ser Ile Pro His Met Leu Glu His Phe Arg

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Ala Gly Ser Leu Leu Val Thr Ser Ala Asp Arg Pro Asp Val Leu Val

275 280 285

Ala Ala Cys Leu Ala Ala Met Asn Gly Val Glu Ile Gly Ala Leu Leu

290 295 300

Leu Thr Gly Gly Tyr Glu Met Asp Ala Arg Ile Ser Lys Leu Cys Glu

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Arg Ala Phe Ala Thr Gly Leu Pro Val Phe Met Val Asn Thr Asn Thr

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Trp Gln Thr Ser Leu Ser Leu Gln Ser Phe Asn Leu Glu Val Pro Val

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Asp Asp His Glu Arg Ile Glu Lys Val Gln Glu Tyr Val Ala Asn Tyr

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Arg Arg Leu Ser Pro Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Leu Thr Glu Leu Ala

385 390 395 400

Arg Lys Ala Gly Lys Arg Ile Val Leu Pro Glu Gly Asp Glu Pro Arg

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Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Cys Ala Glu Arg Gly Ile Ala Thr Cys

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Val Leu Leu Gly Asn Pro Ala Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Ser Gln

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Leu Gln Tyr Asp Ala Ala Val Met Ala Asp Val Ala Lys Ser Lys Ala

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Pro Asn Ser Pro Val Ala Gly Arg Ala Thr Val Phe Ile Phe Pro Asp

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Leu Asn Thr Gly Asn Thr Thr Tyr Lys Ala Val Gln Arg Ser Ala Asp

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Asp Leu Ser Arg Gly Ala Leu Val Asp Asp Ile Val Tyr Thr Ile Ala

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<210> 21

<211> 2478

<212> DNA

<213> 动物双歧杆菌

<400> 21

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ctgatcgccg atcaccagca gaacaccgtg ttcatcatgg gtcctggcca cggcggccct 300

gcaggtaccg ctcagtccta catcgacggc acctacaccg agtactaccc gaacatcacc 360

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accgcattca tgcctaaggg cgaactgcgc atcggcgcca acccgaacgc caacggtggc 1140

cgcatccgcg aggatctgaa gctccctgag ctcgatcagt acgagatcac cggcgtcaag 1200

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<210> 22

<211> 825

<212> PRT

<213> 动物双歧杆菌

<400> 22

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Leu Ile Ala Asp His Gln Gln Asn Thr Val Phe Ile Met Gly Pro Gly

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Leu Ala Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Asp Phe Phe Arg Gly Met

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Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Ala Ala Gln Thr Asp Asp Met Thr Arg

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Ala Met Ser Asn Glu Asp Phe Thr Glu Leu Phe Thr Ala Asp Lys Pro

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<210> 23

<211> 2478

<212> DNA

<213> 青春双歧杆菌

<400> 23

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cgtcgtttcg ccgagctgtt cgagaccgtc ttcgacgaga tctgcgacat caaggccgcc 840

gctcagaccg acgacatgac tcgtccgttc tacccgatga tcatcttccg taccccgaag 900

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cagatggaag gcttcctcga gggctacctg ctgaccggcc gtcacggcat ctggagctcc 1500

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gtcctgctga acaagtgctt caacaacgat cacgtgatcg gcatctactt cccggtggat 1740

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cagatcgtgc tcgccgccac cggtgatgtt ccgactcagg aaatcatggc cgctgccgac 1980

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<210> 24

<211> 825

<212> PRT

<213> 青春双歧杆菌

<400> 24

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Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met

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Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg

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Leu Ser Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Glu Phe Phe His Gly Met

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Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asn Glu Asp His

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Pro Lys Phe Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His

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Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val

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Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Glu

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Arg Lys Pro Ile Ser Ser Met Asn Leu Leu Val Ser Ser His Val Trp

530 535 540

Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val Thr Ser

545 550 555 560

Val Leu Leu Asn Lys Cys Phe Asn Asn Asp His Val Ile Gly Ile Tyr

565 570 575

Phe Pro Val Asp Ser Asn Met Leu Leu Ala Val Ala Glu Lys Cys Tyr

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Ile Ala Gly Lys Gln Pro Ala

595 600 605

Ala Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Glu Lys Gly

610 615 620

Ala Ala Glu Trp Lys Trp Ala Ser Asn Val Lys Ser Asn Asp Glu Ala

625 630 635 640

Gln Ile Val Leu Ala Ala Thr Gly Asp Val Pro Thr Gln Glu Ile Met

645 650 655

Ala Ala Ala Asp Lys Leu Asp Ala Met Gly Ile Lys Phe Lys Val Val

660 665 670

Asn Val Val Asp Leu Val Lys Leu Gln Ser Ala Lys Glu Asn Asn Glu

675 680 685

Ala Leu Ser Asp Glu Glu Phe Ala Glu Leu Phe Thr Glu Asp Lys Pro

690 695 700

Val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala Arg Asp Val Arg Gly Leu Ile

705 710 715 720

Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn Val His Gly Tyr Glu Glu

725 730 735

Gln Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met Val Arg Val Asn Asn Ile

740 745 750

Asp Arg Tyr Glu Leu Gln Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp

755 760 765

Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asn Glu Leu Glu Ala Phe Arg Gln Glu Ala

770 775 780

Phe Gln Phe Ala Val Asp Asn Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp

785 790 795 800

Trp Val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asn Lys Gln Gly Ala Ile Ser Ala

805 810 815

Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu

820 825

<210> 25

<211> 2367

<212> DNA

<213> 戊糖乳杆菌

<400> 25

atgtctacag attactcatc accagcatat ttgcaaaaag ttgataagta ctggcgtgct 60

gccaactatt tatcagttgg tcaactttat ttaaaagata atcctttatt acaacggcca 120

ttaaaggcta gtgacgttaa ggttcaccca atcggtcact ggggcacgat tgccggccaa 180

aacttcatct atgcgcatct taaccgggtc atcaacaagt acggtttgaa gatgttctac 240

gttgaaggtc caggtcatgg tggccaagtg atggtctcca actcatacct tgatgggact 300

tacacggata tttatcctga aattacgcag gatgttgaag ggatgcaaaa actcttcaag 360

caattctcat tcccaggtgg cgtggcttcc catgctgctc ctgaaacacc aggctcaatc 420

cacgaaggtg gcgaacttgg ttactcaatt tcacacggtg ttggggcaat ccttgacaac 480

cctgatgaaa tcgccgcagt cgttgttggt gatggggaat ccgaaaccgg cccattagca 540

acttcatggc aatcaacgaa gttcatcaac ccaatcaacg atggggcagt gttaccaatc 600

ttgaacctta acggctttaa gatttctaac ccaacgattt ttggtcggac ttctgatgaa 660

aagatcaagc aatacttcga aagcatgaac tgggaaccaa tctttgttga aggtgacgat 720

cctgaaaagg ttcacccagc tttagctaag gccatggatg aagccgtcga aaagatcaaa 780

gccattcaaa agaacgctcg tgaaaacgat gacgctactt taccagtatg gccgatgatc 840

gtcttccgcg cacctaaggg ctggactggt cctaagtcat gggatggcga caagatcgaa 900

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gatgcgttag ttgactggtt ggaatcatat caaccaaagg aactcttcaa tgaagatggt 1020

tctttgaagg atgatatcaa agaaattatc ccaactggcg atgcacggat ggccgctaac 1080

ccaatcacta atggtggggt tgatccaaag gccttgaact tacctaactt ccgtgattac 1140

gccgttgata cgtctaagca tggtgccaac gttaagcaag atatgatcgt ttggtcagac 1200

tacttgcgtg atgttatcaa gaagaaccca gataacttcc ggttatttgg ccctgatgaa 1260

accatgtcaa accggttata tggtgtcttt gaaaccacta accgtcaatg gatggaagat 1320

attcacccag atagtgacca atacgaagca cctgctggcc gggtcttgga tgctcaatta 1380

tctgaacacc aagctgaagg ttggttagaa ggttacgtct taactggtcg tcatggcttg 1440

tttgcaagtt acgaagcctt cttacgggtt gtcgactcaa tgttgacgca acacttcaag 1500

tggttacgta aggccaacga acttgactgg cggaagaagt acccgtcact caacattatc 1560

gcggcttcaa ctgtgttcca acaagaccat aatgggtaca cccaccaaga tccaggtgcc 1620

ttgactcatt tggctgaaaa gaagcctgaa tatatccgcg aatatttacc agccgacgcc 1680

aactccttgt tagctgttgg ggacgtcatc ttccgtagcc aagaaaagat caactacgtg 1740

gttacgtcga agcacccacg tcaacaatgg ttcagcattg aagaagctaa gcaattagtt 1800

gacaacggtc ttggtatcat tgactgggca agcacggacc aaggtagcga accagatatc 1860

gtgtttgctg ctgccggaac ggaaccaacg cttgaaacgt tggctgcaat ccaattgctc 1920

catgatagct tcccagacat gaagattcgt ttcgtgaacg tggtcgacat cttgaagtta 1980

cgtagccctg aaaaggaccc tcgtggcttg tcagatgctg aatttgacca ttacttcact 2040

aaggacaaac cagttgtctt cgccttccat ggttacgaag acctggttcg tgacatcttc 2100

tttgatcgtc acaaccacaa cttacacgtg catggctacc gtgaaaatgg tgacattacg 2160

acaccattcg atgtccgggt catgaaccaa atggaccgtt tcgacttagc aaaatctgca 2220

attgcggcgc aaccagcaat ggaaaacacc ggtgcagcct ttgttcaaga catggataac 2280

atgcttgcaa aacacaacgc atacatccgt gacgccggaa ccgacttgcc agaagttaac 2340

gactggcaat ggaaaggttt gaaataa 2367

<210> 26

<211> 788

<212> PRT

<213> 戊糖乳杆菌

<400> 26

Met Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Pro Ala Tyr Leu Gln Lys Val Asp Lys

1 5 10 15

Tyr Trp Arg Ala Ala Asn Tyr Leu Ser Val Gly Gln Leu Tyr Leu Lys

20 25 30

Asp Asn Pro Leu Leu Gln Arg Pro Leu Lys Ala Ser Asp Val Lys Val

35 40 45

His Pro Ile Gly His Trp Gly Thr Ile Ala Gly Gln Asn Phe Ile Tyr

50 55 60

Ala His Leu Asn Arg Val Ile Asn Lys Tyr Gly Leu Lys Met Phe Tyr

65 70 75 80

Val Glu Gly Pro Gly His Gly Gly Gln Val Met Val Ser Asn Ser Tyr

85 90 95

Leu Asp Gly Thr Tyr Thr Asp Ile Tyr Pro Glu Ile Thr Gln Asp Val

100 105 110

Glu Gly Met Gln Lys Leu Phe Lys Gln Phe Ser Phe Pro Gly Gly Val

115 120 125

Ala Ser His Ala Ala Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly

130 135 140

Glu Leu Gly Tyr Ser Ile Ser His Gly Val Gly Ala Ile Leu Asp Asn

145 150 155 160

Pro Asp Glu Ile Ala Ala Val Val Val Gly Asp Gly Glu Ser Glu Thr

165 170 175

Gly Pro Leu Ala Thr Ser Trp Gln Ser Thr Lys Phe Ile Asn Pro Ile

180 185 190

Asn Asp Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu Asn Leu Asn Gly Phe Lys Ile

195 200 205

Ser Asn Pro Thr Ile Phe Gly Arg Thr Ser Asp Glu Lys Ile Lys Gln

210 215 220

Tyr Phe Glu Ser Met Asn Trp Glu Pro Ile Phe Val Glu Gly Asp Asp

225 230 235 240

Pro Glu Lys Val His Pro Ala Leu Ala Lys Ala Met Asp Glu Ala Val

245 250 255

Glu Lys Ile Lys Ala Ile Gln Lys Asn Ala Arg Glu Asn Asp Asp Ala

260 265 270

Thr Leu Pro Val Trp Pro Met Ile Val Phe Arg Ala Pro Lys Gly Trp

275 280 285

Thr Gly Pro Lys Ser Trp Asp Gly Asp Lys Ile Glu Gly Ser Phe Arg

290 295 300

Ala His Gln Ile Pro Ile Pro Val Asp Gln Thr Asp Met Glu His Ala

305 310 315 320

Asp Ala Leu Val Asp Trp Leu Glu Ser Tyr Gln Pro Lys Glu Leu Phe

325 330 335

Asn Glu Asp Gly Ser Leu Lys Asp Asp Ile Lys Glu Ile Ile Pro Thr

340 345 350

Gly Asp Ala Arg Met Ala Ala Asn Pro Ile Thr Asn Gly Gly Val Asp

355 360 365

Pro Lys Ala Leu Asn Leu Pro Asn Phe Arg Asp Tyr Ala Val Asp Thr

370 375 380

Ser Lys His Gly Ala Asn Val Lys Gln Asp Met Ile Val Trp Ser Asp

385 390 395 400

Tyr Leu Arg Asp Val Ile Lys Lys Asn Pro Asp Asn Phe Arg Leu Phe

405 410 415

Gly Pro Asp Glu Thr Met Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Phe Glu Thr

420 425 430

Thr Asn Arg Gln Trp Met Glu Asp Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Tyr

435 440 445

Glu Ala Pro Ala Gly Arg Val Leu Asp Ala Gln Leu Ser Glu His Gln

450 455 460

Ala Glu Gly Trp Leu Glu Gly Tyr Val Leu Thr Gly Arg His Gly Leu

465 470 475 480

Phe Ala Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Arg Val Val Asp Ser Met Leu Thr

485 490 495

Gln His Phe Lys Trp Leu Arg Lys Ala Asn Glu Leu Asp Trp Arg Lys

500 505 510

Lys Tyr Pro Ser Leu Asn Ile Ile Ala Ala Ser Thr Val Phe Gln Gln

515 520 525

Asp His Asn Gly Tyr Thr His Gln Asp Pro Gly Ala Leu Thr His Leu

530 535 540

Ala Glu Lys Lys Pro Glu Tyr Ile Arg Glu Tyr Leu Pro Ala Asp Ala

545 550 555 560

Asn Ser Leu Leu Ala Val Gly Asp Val Ile Phe Arg Ser Gln Glu Lys

565 570 575

Ile Asn Tyr Val Val Thr Ser Lys His Pro Arg Gln Gln Trp Phe Ser

580 585 590

Ile Glu Glu Ala Lys Gln Leu Val Asp Asn Gly Leu Gly Ile Ile Asp

595 600 605

Trp Ala Ser Thr Asp Gln Gly Ser Glu Pro Asp Ile Val Phe Ala Ala

610 615 620

Ala Gly Thr Glu Pro Thr Leu Glu Thr Leu Ala Ala Ile Gln Leu Leu

625 630 635 640

His Asp Ser Phe Pro Asp Met Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Val Asp

645 650 655

Ile Leu Lys Leu Arg Ser Pro Glu Lys Asp Pro Arg Gly Leu Ser Asp

660 665 670

Ala Glu Phe Asp His Tyr Phe Thr Lys Asp Lys Pro Val Val Phe Ala

675 680 685

Phe His Gly Tyr Glu Asp Leu Val Arg Asp Ile Phe Phe Asp Arg His

690 695 700

Asn His Asn Leu His Val His Gly Tyr Arg Glu Asn Gly Asp Ile Thr

705 710 715 720

Thr Pro Phe Asp Val Arg Val Met Asn Gln Met Asp Arg Phe Asp Leu

725 730 735

Ala Lys Ser Ala Ile Ala Ala Gln Pro Ala Met Glu Asn Thr Gly Ala

740 745 750

Ala Phe Val Gln Asp Met Asp Asn Met Leu Ala Lys His Asn Ala Tyr

755 760 765

Ile Arg Asp Ala Gly Thr Asp Leu Pro Glu Val Asn Asp Trp Gln Trp

770 775 780

Lys Gly Leu Lys

785

<210> 27

<211> 2478

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的动物双歧杆菌的xfp基因(xfpO1ec)

<400> 27

atgacaaatc ccgtaatagg aaccccctgg cagaaactgg atcgtccggt aagcgaggaa 60

gcgattgagg gcatggataa atattggcgc gtggcgaact atatgagcat tggccagatt 120

tatctgcgtt cgaacccgct gatgaaagaa ccctttaccc gcgacgatgt gaaacatcgt 180

ctggtgggcc attggggcac caccccgggc ctgaactttc tactggcgca cattaaccgc 240

ctgattgcgg accatcagca gaacaccgtg tttattatgg gacccggcca tggcggcccc 300

gctggaaccg ctcagagcta tattgatggc acctataccg aatattatcc gaacattacc 360

aaagatgaag ctggcctgca gaaatttttt cgccagttta gctatccggg aggcataccc 420

agccattttg ctccggaaac gcccggcagc attcatgagg gcggcgaact gggctatgcg 480

ctgagccatg cgtatggcgc cattatgaac aacccgtcgc tgtttgtgcc gtgcattatt 540

ggagatggcg aggcggaaac cggccccctg gcgaccggct ggcagagcaa caaactggtg 600

aacccgcgca ccgatggcat tgtgctgccg attctgcatc tgaacggcta taaaattgcg 660

aacccgacgc tgctggcgcg cattagcgat gaagaactgc atgatttttt tcgcggaatg 720

ggatatcatc cgtatgaatt tgtggcgggc tttgataacg aagaccatct gagcattcat 780

cgtcgctttg cggaactgtt tgaaaccatt tttgatgaaa tttgcgacat taaagctgcc 840

gctcagaccg atgatatgac ccgtccgttt tatccgatgc tgatttttcg caccccgaaa 900

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cgcattcgcg aagacctgaa actgcccgaa ctggaccagt atgaaattac cggcgtgaaa 1200

gagtatggcc acggctgggg ccaggtggaa gctccgcgca gcctgggcgc ctattgccgc 1260

gatattatta aaaacaaccc ggacagcttt cgcatttttg ggcccgacga aaccgctagc 1320

aaccgtctga acgccaccta tgaagtgacc aaaaaacagt gggataacgg ctacctgagc 1380

gctctggtgg atgaaaacat ggctgtgacc ggccaggtag tggaacagct gagcgaacac 1440

cagtgcgagg gctttctgga agcgtatctg ctgacgggcc gccatggcat gtggtcgacc 1500

tacgaaagct ttgcgcatgt gattgatagc atgctgaacc agcacgccaa atggctggaa 1560

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agccatgtgt ggcgtcagga tcataacggc tttagccacc aggatccggg agtgaccagc 1680

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atttttagcg gcaaacagcc ggctccgacc tggataaccc tggatgaagc tcgagcggaa 1860

ctggaagcgg gcgcggcgga atggaaatgg gctagcaacg cgaaatcgaa cgatgaagtg 1920

cagatagtgc tggcggcggc tggcgacgtg ccgacccagg aaattatggc ggctagcgac 1980

gcgctgaaca aagacggcat taaatttaaa gtggtgaacg tagtagatct gctgaaactg 2040

cagagcccgg aaaacaacga tgaagcgatg agcaacgagg attttaccga actgtttacc 2100

gcggataagc cggtactgtt tgcgtatcat agctacgcgc aggatgtacg tggactaatt 2160

tatgatcgcc cgaaccatga taactttaac gtagtgggct ataaagaaca gggcagcacg 2220

accacgccgt ttgatatggt gcgcgtgaac gatatggacc gctatgccct ggaggctcag 2280

gctctggaac tgattgatgc ggataaatac gcggataaaa ttgatgaact gaacgccttt 2340

cgcaaaaccg cctttcagtt tgcggtggat aacggctatg atattccgga atttaccgat 2400

tgggtgtatc cggatgtgaa agtggatgaa acgcagatgc tgagcgccac cgccgccacc 2460

gctggcgata acgaataa 2478

<210> 28

<211> 2478

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的青春双歧杆菌的fxpk基因(fxpkO1ec)

<400> 28

atgacgtctc ccgtaatagg caccccctgg aaaaaactga acgctccggt aagcgaagag 60

gctattgagg gcgtggacaa atattggcgc gctgcgaact atctgagcat tggccagatt 120

tacctgcgta gcaacccgct gatgaaagaa ccctttaccc gcgaggatgt gaaacatcgt 180

ctggtgggac attggggcac caccccgggc ctgaactttc tgattggcca tattaaccgt 240

ctgatagctg accatcagca gaacacagtg attattatgg gcccgggcca tggcggcccg 300

gctggaaccg ctcagagcta tctggatggc acctataccg aatattttcc gaacattacc 360

aaagacgaag ctggcctgca gaaatttttt cgccagttta gctatccggg aggcattccg 420

agccattatg ctccggaaac cccgggcagc attcatgagg gcggcgaact gggatatgcg 480

ctgagccatg cgtatggcgc tgtgatgaac aacccgtcgc tgtttgtgcc ggcgattgtg 540

ggcgatggag aggctgaaac cggcccgctg gcgaccggct ggtttagcaa caaactgatt 600

aacccgcgca ccgatggaat tgtgctgccg attctgcatc tgaacggcta taaaattgcg 660

aacccgacca ttctgagccg cattagcgat gaggaactgc atgaattttt tcatggcatg 720

ggctacgaac cgtatgaatt tgtggctggc tttgataacg aagaccatct gtcgattcat 780

cgtcgttttg cggaactgtt tgaaaccgtg tttgatgaaa tttgcgatat taaagcggcg 840

gctcagaccg atgatatgac acgtccgttt tatccgatga ttatttttcg taccccgaaa 900

ggctggacct gcccgaaatt tattgatggc aaaaaaaccg aaggcagctg gcgtagccat 960

caggtgccgc tggctagcgc gcgcgacacc gaagcgcatt ttgaagtgct gaaaaactgg 1020

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gatattatta aaaacaaccc ggatagcttt cgtatttttg ggccggacga aaccgctagc 1320

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gctcaggtgg atgaacacat ggctgtgacc ggccaggtga ccgaacagct aagcgaacat 1440

cagatggagg gctttctgga aggctatctg ctgaccggcc gtcatggcat ttggagcagc 1500

tacgaaagct ttgtgcatgt gattgatagc atgctgaacc agcatgcgaa atggttagaa 1560

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agccatgtgt ggcgtcagga ccataacggc tttagccatc aggacccggg agtgaccagc 1680

gtgctgctga acaaatgctt taacaacgac catgtgattg gcatttattt tccggtggac 1740

agcaacatgc tgttagctgt ggctgaaaaa tgctataaaa gcaccaacaa aattaacgcg 1800

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cagattgtgc tggcggcgac cggagacgta ccgacacagg agattatggc ggctgcggat 1980

aaactggatg cgatgggcat taaatttaaa gtggtgaacg tggtagatct ggtgaaactg 2040

cagagcgcga aagaaaacaa cgaagcgctg agcgacgaag aatttgctga actgtttacc 2100

gaagataaac cggtgctgtt tgcttatcat agctacgcgc gcgacgtgcg tggactgatt 2160

tatgaccgcc cgaaccatga taactttaac gtacatggct atgaagaaca gggcagcacc 2220

accaccccgt atgatatggt acgcgtgaac aacattgacc gctatgaatt acaggctgag 2280

gctctgcgca tgatagatgc tgataaatat gcggataaaa ttaacgaact ggaagcgttt 2340

cgtcaggagg cgtttcagtt tgctgtggat aacggctatg accatccgga ctataccgat 2400

tgggtgtata gcggagtgaa caccaacaaa cagggagcta ttagcgctac cgcggctacc 2460

gctggcgaca acgaataa 2478

<210> 29

<211> 2367

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的戊糖乳杆菌的xpk基因(xpkO1ec)

<400> 29

atgtctacag attatagcag cccggcatac ctgcagaagg tggataaata ttggcgcgcg 60

gccaactacc tgagcgtggg ccagctttac ctgaaggata atcctctgct gcagcgcccg 120

ctgaaagcct cggacgtgaa agtgcatccg attggccatt ggggtaccat tgccggtcag 180

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tataccgata tttaccctga aattacccaa gatgtggaag gaatgcagaa gctctttaaa 360

cagtttagct ttccgggcgg tgtagcctct cacgccgccc ctgaaacacc gggtagcatt 420

catgaaggcg gtgaacttgg ctatagcatt agccatggcg tgggagcaat tcttgacaac 480

cctgatgaaa ttgccgcagt tgtggtgggc gatggagaat ctgaaacggg tccgctggca 540

acgagctggc agagcaccaa atttattaac ccgattaacg atggagcagt actgccgatt 600

ctgaacctta acggtttcaa aatttctaac ccgaccattt tcggccgcac gtctgatgaa 660

aaaattaaac agtattttga atctatgaac tgggaaccga ttttcgtgga aggcgacgat 720

cctgaaaaag tgcatccggc cctggccaaa gccatggatg aagccgttga aaaaattaag 780

gccattcaga aaaacgcccg cgaaaacgat gacgccacgc tgccggtatg gcccatgatt 840

gtttttcgag cacctaaagg ttggacgggc cctaaaagct gggatggtga caaaattgaa 900

ggcagcttta gggcccatca gattccgatt cctgtggacc agacggacat ggaacacgcc 960

gatgctctgg tggactggct ggaaagctac cagccgaaag aactctttaa tgaagatggc 1020

tctctgaaag atgatattaa ggaaattatt ccgacgggtg atgcacgcat ggccgccaac 1080

ccgattacga atggcggagt ggatccgaaa gccctgaacc tgcctaactt tcgcgattat 1140

gccgtggata cctctaaaca cggcgccaac gtgaaacagg atatgattgt gtggagcgac 1200

tatctgcgcg atgtgattaa aaaaaacccg gataactttc gcctgttcgg tcctgatgaa 1260

acgatgagca accgcctgta cggcgttttc gaaacgacga accgccagtg gatggaagat 1320

attcatccgg attcggacca gtatgaagca cctgccggtc gcgttctgga tgcccagctg 1380

tctgaacatc aggccgaagg ctggctggaa ggctatgttc tgacgggccg ccacggtctg 1440

ttcgcatcgt atgaagcctt tctgcgcgtg gttgacagca tgctgaccca gcattttaaa 1500

tggctgcgca aagccaacga acttgactgg cgcaaaaaat atcccagcct caacattatt 1560

gctgccagca cggtatttca gcaggaccac aatggatata cgcatcagga tccgggcgcc 1620

ctgacgcacc tggccgaaaa aaaacctgaa tacattcgag aatacctgcc ggccgacgcc 1680

aactctctgc tggccgtggg agacgttatt tttcgctctc aggaaaaaat taactatgta 1740

gtgacctcta aacatccgcg ccagcagtgg ttttctattg aagaagccaa acagctggtg 1800

gacaacggcc ttggcattat tgactgggca tctaccgacc agggctctga accggatatt 1860

gtattcgccg ccgccgggac cgaaccgacc cttgaaaccc tggccgcaat tcagctgctc 1920

cacgattctt ttccggacat gaaaattcgc tttgtaaacg tagttgacat tctgaaactg 1980

cgctctcctg aaaaagaccc tcgcggtctg agcgatgccg aatttgacca ctattttacg 2040

aaagacaagc cggtggtttt tgcctttcac ggctatgaag acctcgtgcg cgacattttt 2100

ttcgatcgcc ataaccataa cctgcatgta cacggttatc gcgaaaatgg cgacattacc 2160

acaccgtttg atgttcgcgt tatgaaccag atggaccgct ttgacctggc aaagtctgca 2220

attgctgctc agccggcaat ggaaaacacg ggcgcagcct tcgtgcagga catggataac 2280

atgcttgcaa agcataacgc atatattcgc gacgccggga cggacctgcc ggaagtgaac 2340

gactggcagt ggaagggcct gaagtaa 2367

Claims (15)

1.一种用于使用至少一步的发酵和经修饰的微生物从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法，其中在所述经修饰的微生物中：

-选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，并且

-编码5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶的至少一种基因的表达被增强。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码磷酸转酮酶的基因选自：来自戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)的xpkA基因、来自动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)的xfp基因或来自乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)的xfp基因，或它们的异源基因。

3.根据权利要求1或2所述的用于产生乙醇酸的方法，其中所述经修饰的微生物进一步过表达来自大肠杆菌(Escherichia coli)的ycdW基因或其异源基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其用于从乙醇酸产生乙醛酸，所述方法进一步包括以下步骤：

-任选地从发酵肉汤中分离乙醇酸，

-通过乙醇酸的生物转化使用由来自大肠杆菌的gldDEFG基因编码的乙醇酸氧化酶和由来自大肠杆菌的katE或katG基因编码的过氧化氢酶或通过化学转化使用氮氧自由基催化剂将乙醇酸转化为乙醛酸，

-回收乙醛酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶在同一微生物中表达。

6.根据权利要求1或2所述的用于产生乙醛酸的方法，其中在所述经修饰的微生物中，至少来自大肠杆菌的ycdW基因被弱化。

7.根据权利要求6所述的方法，其用于从乙醛酸产生乙醇酸，所述方法进一步包括以下步骤：

-任选地从发酵肉汤中分离乙醛酸，

-通过乙醛酸的生物转化使用由来自大肠杆菌的基因ycdW或由来自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因grxA编码的乙醛酸还原酶或通过化学转化使用硼氢化钠将乙醛酸转化为乙醇酸，

-回收乙醇酸。

8.一种用于通过使甘氨酸与微生物接触从甘氨酸产生乙醛酸的方法，所述微生物过表达来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的编码甘氨酸氧化酶的基因和任选的来自大肠杆菌的编码过氧化氢酶的基因katE或katG。

9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中乙醇酸通过以下步骤纯化：结晶、蒸馏、液-液萃取或提取发酵。

10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中乙醛酸通过以下步骤纯化：离子交换、结晶、沉淀或提取发酵。

11.微生物，其经修饰用于产生乙醇酸或乙醛酸，其中

-选自aceB、glcB、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化；

-至少一种编码磷酸转酮酶的基因的表达被增强。

12.根据权利要求11所述的微生物，其中编码所述编码磷酸转酮酶的基因选自：来自戊糖乳杆菌的xpkA基因、来自动物双歧杆菌的xfp基因或来自乳酸双歧杆菌的xfp基因，或它们的异源基因。

13.根据权利要求11或12所述的微生物，其进一步：

-过表达来自大肠杆菌的ycdW基因或其异源基因，用于产生乙醇酸，或-具有至少来自大肠杆菌的ycdW基因的表达的弱化，用于产生乙醛酸。

14.根据前述权利要求任一项所述的微生物，其中所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)，或酵母。

15.根据权利要求14所述的微生物，其中所述微生物来自大肠杆菌的物种。