JP2007228927A

JP2007228927A - グリコール酸の製造方法

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Publication number: JP2007228927A
Application number: JP2006056945A
Authority: JP
Inventors: Akira Iwasaki; 晃岩崎; Junzo Hasegawa; 淳三長谷川; Akira Shimizu; 昌清水; Kimiyasu Isobe; 公安礒部
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2007-09-13

Abstract

【課題】効率的なグリコール酸の生化学的製造方法を提供する。
【解決手段】グリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させて、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する。
【選択図】なし

Description

本発明は微生物及び／または微生物由来の酵素を用いることによるグリコールアルデヒド又はエチレングリコールからグリコール酸を製造する方法に関する。グリコール酸は化粧品の原料、農薬、更には医薬品の合成の中間体としても有用な化合物である。

グリコール酸は、洗浄剤、生分解性ポリマーへの配合、農薬や医薬品の合成の中間体などへの利用の他に、最近、肌への弾力性の付加、しわ防止効果などがあることが示され化粧品成分や毛髪染色剤への配合などへの利用が拡大している。このようなグリコール酸の製造に関しては、安価に製造することと同時に、化学合成法で得られるグリコール酸にみられるホルムアルデヒドなどの刺激性物質が混入しない製品の製造方法が望まれている。グリコール酸の生化学的製造方法としては、酵母を利用してエチレングリコールからグリコール酸を一工程で生産する方法が知られているが、反応に関与する酵素についての記載はない（特許文献１、２）。
特開平１０−１７４５９３号公報特開平１０−１７４５９４号公報

本発明は、効率的なグリコール酸の生化学的製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素を見出し、当該酸化酵素を用いたグリコール酸の製造について詳細な検討を行うことにより本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、グリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させることにより、グリコール酸へ変換することを特徴とするグリコール酸の製造方法に関する。
更に、本発明は、下記第１反応および第２反応からなる酸化反応を連続して行うことを特徴とするエチレングリコールからのグリコール酸の製造方法に関する。
（第１反応）エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる。
（第２反応）第一反応で生じたグリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコール酸へ変換する。
以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明のグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素としては、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有するものであれば特に限定されない。我々は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素（アルデヒドオキシダーゼ）を産生することを見出したが（国際公開第０４／０７２２８１号パンフレット）、更にこれら酸化酵素について詳細な検討を行った結果、これら酸化酵素はグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有することを今回明らかにした。

本発明のグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する酸化酵素としては、例えば、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属等に属する微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼが挙げられる。

上記微生物の代表的なものとして、国際公開第２００４／０７２２８１号パンフレット記載のステノトロフォモナス・スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭＰ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭＰ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）ＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）ＮＢＲＣ１３４９５、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＪＣＭ２４７１、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ１３５０６、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ１５０１２、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ１５０１４、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ１５０１５、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＮＢＲＣ１５０１３、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＮＢＲＣ１５５１６、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＪＣＭ６２０１、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａｍｏｒｇａｎｉｉ）ＮＢＲＣ３８４８等が挙げられる。

そのほか、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＡＩＵ３６２（ＦＥＲＭＰ−２０３６３）、バークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｓｐ．）ＡＩＵ１２９（ＦＥＲＭＰ−２０７８７）等も挙げることが出来る。

尚、上記微生物ＫＮＫ２３５、ＫＮＫ２６９、ＫＮＫ０５８、ＫＮＫ２５４、ＫＮＫ０１１、ＡＩＵ３６２、ＡＩＵ１２９は本発明者らにより土壌から分離・同定され、前記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託されている。ＮＢＲＣ１３４９５、ＮＢＲＣ１３５０６、ＮＢＲＣ１５０１２、ＮＢＲＣ１５０１４、ＮＢＲＣ１５０１５、ＮＢＲＣ１５０１３、ＮＢＲＣ１５５１６およびＮＢＲＣ３８４８は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ；〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されており、同機関より入手可能である。ＪＣＭ２４７１およびＪＣＭ６２０１は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ；〒３５１−０１９８埼玉県和光市広沢２−１）に保存されており、同機関より入手可能である。

本発明では、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素として、グリコール酸に対する活性を実質的に持たないものを使用することが好ましい。

一方、本発明のもう一つの大きな特徴は、エチレングリコールに作用してグリコールアルデヒドに変換する能力を有する酸化酵素と上記グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素を組合せて用いることによりエチレングリコールからグリコール酸を製造することである。すなわち、エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる第１反応を行い、グリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコール酸へ変換する第２反応を行うことを特徴とするグリコール酸の製造方法である。

尚、本発明は、反応に使用する酵素が酸化酵素（オキシダーゼという場合もある）であることも大きな特徴の一つである。酸化酵素（オキシダーゼ）の反応様式を以下の化学反応式に示すが、本反応では、基質以外には酸素または酸素と水があれば反応は進行する。一方、同様な酸化反応を脱水素酵素（デヒドロゲナーゼとも言う場合もある）を用いて行うことも可能な場合もあるが、この場合、反応にはＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋などの高価な補酵素が必要であるが、酸化酵素（オキシダーゼ）を用いれば、このような補酵素を必要としない点で有利である。

上記第１反応、すなわちエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素としては、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼが挙げられる。

アルコールオキシダーゼの起源としては特に限定されないが、酵母、カビ、細菌が産生するアルコールオキシダーゼが挙げられ、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、トルロプシス（Ｔｏｌｕｒｏｐｓｉｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属に属する酵母が産生するアルコールオキシダーゼが挙げられる。
グリセロールオキシダーゼとしては、酵母、カビ、細菌が産生するグリセロールオキシダーゼが挙げられ、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属が産生するグリセロールオキシダーゼが挙げられる。

上記以外の酵素では、アスペルギルス属に属する微生物、例えばアスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ）、その一例としてアスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＡＩＵ０３１株（ＦＥＲＭＰ−２０７８５）が産生するエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素が挙げられる。同該ＡＩＵ０３１株は本発明者らにより土壌から分離・同定され、前記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託されている。

本発明では、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素として、グリコールアルデヒド又はグリコール酸に対する活性を実質的に持たないものを使用することが好ましい。しかし、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する活性を有する酸化酵素がグリコールアルデヒドにも作用し、グリオキサールへ変換する活性を有する場合も、反応条件を好適に設定することにより、これらの酵素も本発明に使用することが可能である。好適な条件の一つとして、これら第１反応に使用する酵素に比べ、第２反応に使用する酵素の量を多くし、反応の流れをグリコールアルデヒドからグリコール酸へ傾けること挙げられる。

上記第２反応、すなわちグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素としては、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有するものであれば特に限定されないが、先に述べた、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物から得られる酸化酵素（アルデヒドオキシダーゼ）を挙げることが出来る。

本発明で使用する「酸化酵素」は、単一にまたは部分的に精製された酵素であってもよい。本発明で使用する微生物は、これら酵素の産生能を有する微生物の培養物またはその処理物を使用することも可能である。「微生物の培養液」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらに上記酸化酵素又は微生物は、公知の方法で固定化されて用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。上記酸化酵素の産生能を有する微生物としては、野生株または変異株、あるいは上記酵素のＤＮＡをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる形質転換体（組替え体）であってもよい。また、本発明で使用する酸化酵素の産生能を有する形質転換体は、酸化酵素をコードするＤＮＡを宿主のゲノムに安定的に組み込むことによっても製造できる。一方で、本発明で使用する複数の酸化酵素を同一宿主細胞内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物を用いれば、別々に両酵素を発現する微生物を培養する必要はないため、より低コストでグリコール酸が製造できる。このような形質転換体は、使用する酸化酵素をコードするＤＮＡを、同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより製造できるし、また、それぞれのＤＮＡを不和合性の異なったベクターにそれぞれ組込み、それらを同一の宿主に導入することによっても製造できる。一方、宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、カビ、放線菌などを使用することが可能である。

本発明のエチレングリコールからグリコール酸を製造する方法において、第１および第２の各々の反応をそれぞれ別々の反応容器中で行うことによりバッチ方式で実施することも出来るが、各反応を行う酵素又は微生物を単一容器中に添加し、ワン・ポット方式で両反応を同時進行させることにより実施することが可能である。その場合、第１および第２反応を行う酵素又は微生物の量を調整することにより、第１反応により生成するグリコールアルデヒドを速やかに変換することが可能であり、グリコールアルデヒドが反応系に高濃度に蓄積することがないため、酵素の失活が押さえられ好ましく、また、生産工程の効率化においても好ましい。

第一反応及び第二反応の反応条件は使用する酵素、基質濃度により異なるが、反応は酸素存在下で行い、反応温度は１０〜７０℃、熱安定性の観点から１０〜５０℃が好ましく、ｐＨは４〜１２、酵素の最適反応ｐＨ、ｐＨ安定性の観点からｐＨ５〜９が好ましい。基質であるエチレングリコールは、第一反応のエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する酵素を効率的に働かせるために、高く設定した方かよく、１００ｍＭ以上、更に１Ｍ以上が好ましい。また酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行なわれることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応を行うことにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより進む場合もある。

尚、酸化酵素による酸化反応によって、過酸化水素が生成するが、この過酸化水素は酵素を失活させる場合がある。しかし、反応系にカタラーゼを添加することにより生成した過酸化水素を分解、除去することが可能である。使用するカタラーゼは、過酸化酵素を速やかに分解、除去するという観点から、使用する酸化酵素の活性の１０倍以上、好ましくは１００倍以上、さらに好ましくは１０００倍以上の活性量を使用する事が望ましい。また、さきに述べた形質転換体に酸化酵素と共にカタラーゼを組換え発現させることにより効率良く過酸化水素を分解することが可能である。一方、形質転換体の宿主として、もともとカタラーゼを産生する能力を有する微生物を使用することが好ましい。メタノール酵母は、もともと菌体内にカタラーゼを産生すると同時に、本発明のエチレングリコールからグリコール酸を製造する方法において、第１反応、すなわちエチレングリコールをグリコール酸へ変換する能力を有するアルコールオキシダーゼを菌体内に高濃度に産生することが知られており、これらメタノール酵母を形質転換体の宿主として利用することは、反応の効率化の点で好ましい。

本発明に使用する酸化酵素の活性（オキシダーゼ活性）の検出、定量は、以下の化学反応式に示すように、酸化反応により生成する過酸化水素を４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡ）とＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（以下ＴＯＯＳ）を反応させ、生成するキノンイミン色素を検出、定量することにより行うことができる。

具体的には、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、基質（エチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、グリコール酸、又は、グリオキシル酸；エチレングリコールは１０００ｍＭ、それ以外は２０ｍＭ）、０．６９ｍＭ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、１．０９ｍＭＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）および酸化酵素を含む１．０ｍｌの反応液を３０℃でインキュベートし、反応液の色の変化（紫色へ変化）の目視による確認または、５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。尚、本発明において、１分間に１μｍｏｌのＨ_２Ｏ_２を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義する。

本発明の方法によれば、安価な原料であるエチレングリコール又はグリコールアルデヒドからグリコール酸を効率的に製造することが可能となる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する酸化酵素の取得
酵母エキス５ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム・２水和物１．３ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ７）１０ｍｌを大型試験管に分注し、高圧滅菌後、表１記載の微生物を１白金耳植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。このようにして得られた無細胞抽出液について、グリコールアルデヒド、グリオキサールに対する酸化活性（オキシダーゼ活性）を測定した。その結果を表１にまとめる。その結果、これら菌株の無細胞抽出液には、グリオキサールと共にグリコールアルデヒドに対して酸化活性（オキシダーゼ活性）が存在することが明らかとなった。

［酸化活性測定方法］
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２０ｍＭ基質（無添加、グリコールアルデヒド、又は、グリオキサール）、０．６９ｍＭ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、１．０９ｍＭＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、２Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および０．２ｍｌの上記無細胞抽出液を含む１．０ｍｌの反応液を試験管中で、３０℃で振とうし、目視で生成するキノンイミン色素を検出した。

（実施例２）グリコールアルデヒドからのグリコール酸の合成
３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、２０ｍＭグリコールアルデヒド、５０００Ｕ／ｍｌカタラーゼ（ＢｏｖｉｖｅＬｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）および０．２ｍｌの実施例１で得た無細胞抽出液を含む１．０ｍｌの反応液を試験管中で、３０℃で６時間振とうしながら反応を行った後、反応液１００μｌに２００μｌの２００ｍＭ過塩素酸水溶液を添加し、遠心分離後（１５０００ｒｐｍ、１０分間）、上清をＨＰＬＣにより分析した。その結果を表２に示す。いずれの無細胞抽出液においても、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する活性が見出された。本反応では、反応系にＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋などの補酵素を添加していないことからデヒドロゲナーゼタイプの酵素では反応が進行しないこと、更に実施例１で示したように、反応に使用した無細胞抽出液中にはグリコールアルデヒドに対するオキシダーゼ活性が存在することより、本実施例におけるグリコール酸の生成は、オキシダーゼすなわち酸化酵素によるものであると推測される。

［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：ＳｈｏｄｅｘＲｓｐａｋＫＣ−８１１（昭和電工社製）を二本連結
検出：ＲＩ（エチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリコール酸、グリオキサール、グリオキシル酸）
ＵＶ（グリコール酸、グリオキシル酸）
カラム温度：４０℃
溶離液：５０ｍＭ過塩素酸水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出時間：エチレングリコール；２２．６分、グリコールアルデヒド；１７．９分、グリオキサール；１５．７分、グリコール酸；１８．５分、グリオキシル酸；１５．７分

（実施例３）セルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株が産生するグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する酸化酵素の粗酵素液の調製
酵母エキス１０ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム１．３ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ（いずれも１リットル当たり）の組成からなる培地（ｐＨ７．０）６０ｍｌを５００ｍｌ坂口スラスコに入れ（３本）、高圧蒸気滅菌後、同培地で予め培養したセルロモナス・セルランスＮＢＲＣ１５５１６の培養液１．２ｍｌを植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。得られた培養液を集め、遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した（５０ｍｌ）。この菌体懸濁液を超音波破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、３０ｍｌ無細胞抽出液を得た。本無細胞抽出液をセントリプラスＹＭ−１０（ミリポア社製）を用いて濃縮し、４ｍｌの濃縮液（粗酵素液）を得た。

（実施例４）セルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株からの、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する酸化酵素の精製
酵母エキス１０ｇ、硫酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．１ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ７．０）６０ｍｌを５００ｍｌ坂口フラスコに入れ高圧蒸気滅菌後、ＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｃｅｌｌｕｌａｎｓＮＢＲＣ１５５１６株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、５Ｌミニジャーに上記組成の培地３Ｌを入れ、高圧蒸気滅菌後、前培養液６０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌４００ｒｐｍで２７時間培養を行った。同様の培養を繰返して得た合計４５Ｌの培養液のｐＨを７に調整し、遠心分離により、菌体と４５Ｌの培養液上清を得た。菌体と培養液上清に、グリオキサールおよびグリコールアルデヒドに対する酸化活性が検出されたが、精製の容易さを考慮し、培養液上清から目的の酸化酵素を精製することとした。

得られた培養液上清を攪拌型ウルトラホルダーＵＨＰ１５０（アドバンテック東洋社製）を用いて２．４Ｌに濃縮後、氷冷下、攪拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム０〜６０％飽和の範囲で沈澱する蛋白質を遠心分離により集めた。得られた蛋白質を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、充分量の同緩衝液に対して透析を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（３００ｍｌ）にアプライし、塩化ナトリウム０〜０．５Ｍの濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウムを終濃度１Ｍとなるよう添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（６０ｍｌ）にアプライし、硫酸アンモニウム１〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７に透析し、次いで、予め同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）カラム（６ｍｌ）にアプライし、塩化ナトリウム０．３５Ｍを含む同緩衝液で洗浄後、塩化ナトリウム０．３５〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を限外濾過濃縮し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（２４ｍｌ）（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にアプライし、同緩衝液で溶出し、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。活性フラクションを集めることにより、電気泳動的に単一な酵素標品を得た。

（実施例５）セルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株から得た精製酵素を用いたグリコール酸の合成反応
２０ｍＭグリコールアルデヒド、０．１Ｕ（グリコールアルデヒドオキシダーゼ活性）／ｍｌの実施例４で得たセルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株由来の酸化酵素、１００００Ｕ／ｍｌカタラーゼ（ＢｏｖｉｖｅＬｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例２と同様な方法でＨＰＬＣ分析を行った。その結果、１８ｍＭグリコール酸が生成していた。

（実施例６）セルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株粗酵素液を用いたグリコール酸の合成反応
２０ｍＭグリコールアルデヒド、０．１Ｕ（グリコールアルデヒドオキシダーゼ活性）／ｍｌの実施例３で得たセルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株由来の酸化酵素の粗酵素液、１００００Ｕ／ｍｌカタラーゼ（ＢｏｖｉｖｅＬｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例２と同様な方法でＨＰＬＣ分析を行った。その結果、１７ｍＭグリコール酸が生成していた。

（実施例７）エチレングリコールからのグリコール酸の合成反応
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア属酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、０．１Ｕ（グリコールアルデヒドオキシダーゼ活性）／ｍｌの実施例３で得たセルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株由来の酸化酵素（グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換）の粗酵素液、１００００Ｕ／ｍｌカタラーゼ（ＢｏｖｉｖｅＬｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例２と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、３０ｍＭのグリコール酸が生成しており、上記２種の酸化酵素によりエチレングリコールからグリコール酸が合成されることがわかった。

（実施例８）エチレングリコールからのグリコール酸の合成反応
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア属酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、０〜０．５Ｕ（グリコールアルデヒドオキシダーゼ活性）／ｍｌの実施例３で得たセルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６株から得た酸化酵素の粗酵素液（グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換）、１００００Ｕ／ｍｌカタラーゼ（ＢｏｖｉｖｅＬｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例２と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果を表３に示す。

（実施例９）アスペルギルス・スピーシーズ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．）ＡＩＵ０３１（ＦＥＲＭＰ−２０７８５）株からのエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する酸化酵素の粗酵素液の調製
コレステロール２ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム２ｇ、リン酸二水素ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、酵母エキス１ｇ、ＴｒｉｔｎＸ−１００１ｇ（いずれも１Ｌ当り）の組成よりなる培地（ｐＨ６．５）を調整し、５００ｍｌ容坂口フラスコに１５０ｍｌ分注し、高圧蒸気滅菌を行った（１２０℃、２０分）。これら培地に予め同培地で前培養しておいたアスペルギルス・スピーシーズ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．）ＡＩＵ０３１の培養液を１ｍｌ植菌し、３０℃で２日間振盪培養を行った。このようにして得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、同緩衝液５ｍｌに懸濁し、０．５ｍｍガラスビーズを用いて細胞破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、約５ｍｌの無細胞抽出液を得た。本無細胞抽出液をセントリプラスＹＭ−１０（ミリポア社製）を用いて濃縮し、０．５ｍｌの濃縮液（粗酵素液）を得た。

（実施例１０）エチレングリコールからのグリコール酸の合成反応
１Ｍエチレングリコール、１Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌの実施例９で得たアスペルギルス・スピーシーズ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．）ＡＩＵ０３１の酸化酵素の粗酵素液（エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換）、０．５Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例３で得たセルロシミクロビウム・セルランスＮＢＲＣ１５５１６由来の酸化酵素の粗酵素液（グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換）、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（ＢｏｖｉｖｅＬｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭトリス−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例２と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、６７ｍＭのグリコール酸が生成していた。

（比較例１）
グルコース１０ｇ、酵母エキス２ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｂｒｏｔｈ８ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ７）１０ｍｌを大型試験管に入れ高圧蒸気滅菌後、カンジダ・ボイディニー（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）ＮＢＲＣ１００３５、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｎｏｒｐｈａ）ＮＢＲＣ１０２４、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｒｉｓ）ＮＢＲＣ１０１３を１白金耳植菌し、２８℃、４０時間振盪培養し、前培養液を得た。次いで、酵母エキス１０ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．５ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ６．５）５０ｍｌを５００ｍｌ坂口フラスコに入れ高圧蒸気滅菌後、０．６ｇ（６０ｍｌ培地当り）のメタノールを添加後、上記前培養液０．５ｍｌを添加し、２８℃、１３０ｒｐｍで３０時間振盪培養を行った。得られた、培養液（５０ｍｌ）から、遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した（５ｍｌ）。この菌体懸濁液の一部（２．５ｍｌ）をミニビートビーター（ＢＩＯＳＰＥＣ社製）で破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。

次いで、以下に示す方法により、上記菌体懸濁液又は無細胞抽出液をエチレングリコールに作用させ、実施例２と同様な方法でＨＰＬＣ分析を行い、生成物を調べた。
（菌体懸濁液を用いた反応）
１Ｍエチレングリコール、０．２ｍｌの上記菌体懸濁液を含む３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌを、試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応。
（無細胞抽出液を用いた反応）
１Ｍエチレングリコール、５０００Ｕ／ｍｌのカタラーゼおよび０．２ｍｌの上記無細胞抽出液を含む３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌを、試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応。

その結果を表４に示す。いずれの菌株においても、菌体懸濁液での反応では、エチレングリコールからグリコール酸が主生成物として生成したが、無細胞抽出液での反応では、グリコールアルデヒドが主生成物である。これは、これらメタノール酵母によるエチレングリコールの酸化反応においては、エチレングリコールからグリコールアルデヒドへの酸化は従来から知られているように、アルコールオキシダーゼにより進行するが、グリコールアルデヒドからグリコール酸への酸化は酸化酵素（オキシダーゼ）タイプの酵素ではなく、反応に何らかの補酵素を必要とする脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）タイプの酵素が関与していると考えられる。

Claims

グリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させて、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換することを特徴とするグリコール酸の製造方法。
エチレングリコールをグリコール酸へ変換するグリコール酸の製造方法であって、下記第１反応、第２反応からなる酸化反応を連続して行うことを特徴とする製造方法：
（第１反応）エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる。
（第２反応）第一反応で生じたグリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコール酸へ変換する。
グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素が、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、及び、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られる酸化酵素である請求項１又は２記載のグリコール酸の製造方法。
エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素が、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、及び、アスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ）から得られる酸化酵素からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸化酵素である請求項２又は３記載のグリコール酸の製造方法。
前記アルコールオキシダーゼがピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、トルロプシス（Ｔｏｌｕｒｏｐｓｉｓ）属、及び、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られるアルコールオキシダーゼであり、前記グリセロールオキシダーゼがアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から得られるグリセロールオキシダーゼである請求項４記載のグリコール酸の製造方法。
エチレングリコールを含む反応液に、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物、及び、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を添加して、同一反応容器中、第１反応及び第２反応を同時進行させて行うことからなる請求項２〜５いずれか記載のグリコール酸の製造方法。