JP2007228926A - グリオキシル酸製造用酵素及びそれを用いたグリオキシル酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない酸化酵素又は微生物を提供し、安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を効率的に製造すること。
【解決手段】 酸素存在下、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸と過酸化水素を生成し、基質特異性が、グリオキサール、グリコールアルデヒド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及び、イソブチルアルデヒドに対して活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さないものであり、作用最適ｐＨ：４．５−５．５であり、作用最適温度：６５−７５℃である酸化酵素。
【選択図】 なし

Description

本発明は、グリオキサールに作用する新規な酸化酵素および当該酵素を用いて医薬品の原料として有用なグリオキシル酸を製造する方法に関する。

現在グリオキシル酸は化学的な方法で製造されているが、その製造方法は煩雑で、多量の副産物が生成されるため、グリオキシル酸の収率が低い欠点を有する。この化学的な製造方法の欠点を解決するために、グリコール酸を原料としてグリコール酸酸化酵素や微生物を用いる方法が開発された。例えば特許文献１、非特許文献１〜５などが挙げられる。しかし、これらの方法はいずれも高価なグリコール酸を原料として使用しなければならない問題点を有し、またこれら方法では、グリオキシル酸にも作用する植物由来の酵素が用いられているなどの問題点を有する。

最近、安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を製造する方法が報告されたが、当該方法は、グリオキサールを化学的な方法でグリコール酸に変換し、生成されたグリコール酸に上記と同様の植物由来のグリコール酸酸化酵素を作用させる方法であり、この方法も化学的方法と酵素を組み合わせた煩雑である欠点を有する（非特許文献６）。

一方、グリオキサールに対し活性を有する酸化酵素として、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のグリオキサールオキシダーゼ（非特許文献７−９）が報告されている。しかし、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のグリオキサールオキシダーゼは、グリオキサールだけでなく、グリオキシル酸にも作用する酵素であり、本発明の目的であるグリオキシル酸の製造に使用することは困難である。一方、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプロミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属微生物が産生する酸化酵素がグリオキサールをグリオキシル酸へ変換することが報告されている（特許文献２）。
グリオキシル酸の製造において、効率的にグリオキサールをグリオキシル酸へ変換し、生成物であるグリオキシル酸には作用しない酸化酵素が望まれており、更には、グリオキシル酸の生成により反応系のｐＨが低下するため、そのような条件、すなわち比較的低いｐＨでも活性を発現する酸化酵素の取得が望まれていた。
特開平５−５０１８００号公報 国際公開第２００４／０７２２８１号パンフレット Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８，２２５３−２２５９（１９９３） Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄｉｃｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２，３７１−３７８（１９９４） Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０，３９５７−３９６３（１９９５） Ｇｅｎｅ，１９４，１７９−１８２（１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７５，２６５−２７１（１９９９） Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６，７３−７８（２０００） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２９３６−２９４０（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７４１１−７４１３（１９９３） Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，７５１−７５６（１９９５）

したがって、本発明の目的は、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素、当該酸化酵素を産生する微生物、当該酸化酵素を製造する方法、及び、当該酸化酵素又は上記微生物を用いて安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を効率的に製造する方法を提供することにある。

本発明者は、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用せず、最適作用ｐＨを５付近に持ち、低ｐＨ条件下でも高い活性を有する新規な酸化酵素をＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌に見出した。そして、当該微生物から本酸化酵素を単離、精製し、グリオキシル酸の製造に有効であること、および既報のアルデヒドオキシダーゼとは明らかに異なる全く新しいアルデヒド酸化酵素であることを明らかにして、本発明を完成した。

即ち、本発明は、以下の（１）、（２）、（３）及び（４）の性質を有する新規な酸化酵素を提供するものである。
（１）作用：
グリオキサールに作用し、グリオキシル酸と過酸化水素を生成する。
（２）基質特異性：
グリオキサール、グリコールアルデヒド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及び、イソブチルアルデヒドに対して活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さない。（なお本願明細書において、「実質的に活性を示さない」とは、その化合物に対する活性が、グリオキサールに対する活性の５％未満であることをいう。）
また、好ましくは、エタノール、グリコール酸、乳酸などにも活性を示さない。
（３）作用最適ｐＨ：４．５−５．５。
（４）作用最適温度：６５−７５℃。
また、好ましくは本発明の酵素は、更に以下（５）及び（６）の性質を有する。
（５）分子量：ゲル濾過分析で１．５×１０^５。
（６）阻害剤：フェニルヒドラジン、ＣｕＣｌ_２、及び、ＣｏＣｌ_２により阻害される。
また、本発明は、上記酸化酵素を産生する微生物を提供する。さらに、本発明は、上記酸化酵素の製造法も提供する。
更に本発明は、上記酸化酵素又は上記微生物をグリオキサールに作用させ、グリオキサールに存在する２つのアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキシル酸に変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法も提供する。
以下に本発明を詳述する。

本発明は、従来報告されていないグリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生するバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌を自然界から見出し、当該酵素の諸性質を明らかにし、グリオキシル酸の製造に有効であることを明らかにすることにより完成された。このような微生物は、土壌サンプルをエチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、２−メトキシエタノールなどを炭素源とした培地に添加し、培養を行った後、生育してきた微生物について、グリオキサールに対する酸化活性を調べる事により得ることが出来る。

本発明の酵素の起源となる微生物は特に限定されないが、細菌などが好適であり、好ましくはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物が挙げられ、特に好ましくは北海道常呂郡佐呂間町の土壌から分離されたバークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＡＩＵ １２９株が挙げられる。当該ＡＩＵ １２９株は独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−２０７８７として寄託されている。ＡＩＵ １２９株の菌学的諸性質を表１に示す。

また、ＡＩＵ １２９株の同定には、該菌株の１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）のうち５′末端側約１５００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅して、塩基配列を決定し、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．０００１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）データベース及び国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対し相同性検索を行い、分子系統樹を作製する方法で行った。

本発明の酸化酵素は、該酵素を産生する微生物より、下記のようにして取得することができる。例えば、本活性を有する微生物を好適な条件で培養し、培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕、ガラスビーズを用いた破砕などの方法により、菌体を破砕し、粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液から塩析、各種クロマトグラフィーなどの方法により精製し、本発明の酵素を得ることができる。

本発明の酸化酵素の作用最適ｐＨまたは作用最適温度は、反応条件のｐＨまたは温度を変えて活性を測定することにより決定される。
本発明の酸化酵素の分子量は例えばＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）（東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質との相対溶出時間から算出することができる。

本発明において、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する酸化酵素を産生する微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロースなどの糖類、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、２−メトキシエタノールなどのアルコール類、グリオキサールなどのアルデヒド類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、菜種油および大豆油などの油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスチープリカーなど；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウムなど；その他に麦芽エキス、肉エキスなどを有する通常の液体培地が使用され得る。

本発明によるグリオキシル酸の製造方法は、本発明の酸化酵素、又は、当該酸化酵素を産生する微生物をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へと変換蓄積せしめることを特徴とする。本発明で使用する酸化酵素としては、単一または部分的に精製された酵素であってもよい。本発明で使用する微生物としては、当該微生物の培養物またはその処理物を使用することも可能である。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば粗酵素液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの破砕物、これらの混合物などを意味する。更に上記酸化酵素又は上記微生物は、公知の手段（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で固定化されて使用できる。本発明の微生物としては、上記酸化酵素の産生能を有している限り、野生株または変異株、あるいは本発明の酸化酵素をコードするＤＮＡをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる形質転換体（組替え体）であってもよい。また、本発明で使用する酸化酵素の産生能を有する形質転換体は、酸化酵素をコードするＤＮＡを宿主のゲノムに安定的に組み込むことによっても製造できる。

本発明の酸化酵素をグリオキサールに反応させる際の条件は、温度は５℃〜８０℃、好ましくは５〜７０℃の範囲、ｐＨは４〜１２、好ましくはｐＨ５〜８の範囲である。反応は、酸素条件下で行うことが好ましい。また酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行なわれることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応を行うことにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより進む場合もある。

尚、本発明の酸化酵素による酸化反応により、過酸化水素が生成するが、この過酸化水素は酵素を失活させる場合がある。しかし、反応系にカタラーゼを添加することにより、生成した過酸化水素を分解、除去することが可能である。また、上述した形質転換体に酸化酵素と共にカタラーゼを組換え発現させることにより、効率良く過酸化水素を分解することが可能である。一方、形質転換体の宿主として、もともとカタラーゼを産生する能力を有する微生物を使用することが好ましい。使用するカタラーゼは、過酸化酵素を速やかに分解、除去するという観点から、使用する酸化酵素の活性の１０倍以上、好ましくは１００倍以上、さらに好ましくは１０００倍以上の活性量を使用する事が望ましい。

本発明の新規な酸化酵素は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には全く作用しない特異性の高い酸化酵素であり、本発明の酸化酵素を使用すれば、安価なグリオキサールからグリオキシル酸を効率的に製造することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素を産生する能力を持つ微生物の分離
スクリーニングのための培地は、１２０℃で１５分間加圧殺菌した表２に示す８０ｍｌの基礎培地に、５％ ２−メトキシエタノール溶液２０ｍｌをメンブランフィルターで除菌して添加して調製した（培地中の２−メトキシエタノール濃度は１％）。この１％ ２−メトキシエタノール含有培地５ｍｌを分注した試験管に少量の土壌を添加し、３０℃で２〜７日間振盪培養した。微生物の生育が確認された培養液について、その培養液０．１ｍｌを上記と同一組成の培地に植菌し、同様に３０℃で２〜７日間振盪培養した。この操作をもう一度繰り返した後、培養液を上記液体培地と同一組成に２％寒天を加えて調製した寒天平板培地にプレートアウトし、３０℃で培養した。そして微生物の生育が確認された後、この寒天平板培地にグリオキサールと過酸化水素の生成を確認するためのグリオキサールを５０ｍＭ添加した表３に示す発色液を摘下して、３０℃で反応させた。この方法で、過酸化水素の生成が認められた微生物を、この平板培地と同一組成の斜面培地に植菌し、３０℃で培養して保存した。

次に、斜面培地に分離した微生物を再度１％ ２−メトキシエタノール含有液体培地で振盪培養した。そして培養液から遠心分離で集菌し、集めた菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、グリオキサールまたはグリオキシル酸を２０ｍＭになるように添加した表４に示す酵素活性測定用発色液に添加し、反応を行った。この反応で、グリオキサール存在下で反応液が紫色に着色し（過酸化水素が生成した）、グリオキシル酸存在下では、反応液の色がほとんど変化しない（過酸化水素が生成しない）微生物を選抜した。

続いて、選抜した微生物を、１％ ２−メトキシエタノールを含む上記組成の液体培地１５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて３０℃で振盪培養した。この培養で得られた９００ｍｌ分の菌体を遠心分離で集め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁してガラスビーズを用いて菌体を破砕した。そして、菌体破砕残渣を遠心分離で除去し、得られた上清液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに通液し、このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。吸着した酵素は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と０．５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた直線濃度勾配法で溶出し、全ての画分についてグリオキサールおよびグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を調べた。そして、グリオキサールに良く作用してグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を示さない酵素を産生する微生物を選抜した。このような方法で得られた菌株は、上記の菌学的性質を示す微生物であり、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＡＩＵ １２９ と命名した。

（実施例２）グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の製造
実施例１で分離した微生物を、１％ ２−メトキシエタノールを含む実施例１と同一組成の液体培地を用いて、試験管で３０℃，２日間振盪培養して種培養液を調製した。次に、この種培養液１．５ｍｌを、種培養と同一組成の液体培地１５０ｍｌを入れた５００ｍｌ容フラスコに植菌し、３０℃で振盪培養して、培養時間と酵素生産量との関係を調べた。その結果、グリオキサールに作用する酸化酵素の生産量は培養時間とともに増大し、当該酸化酵素の活性は培養５日付近でも高い値を維持した。

（実施例３）グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の精製
実施例２の結果を基に、１％ ２−メトキシエタノールを含む実施例１と同一組成の液体培地を用いて試験管で３０℃，２日間振盪培養して一次種培養液を調製した。この一次種培養液１．５ｍｌを同一組成の液体培地を１５０ｍｌ分注した５００ｍｌ容フラスコに植菌し、３０℃で２日間振盪培養して二次種培養液を調製した。続いて、この二次種培養液２０ｍｌを一次種培養と同一組成の液体培地２Ｌを入れた３Ｌ容フラスコに植菌し、３０℃で５日間振盪培養した。このようにして培養した１０Ｌの培養液から菌体を集めて、以下の方法で酵素を精製した。尚、酵素の精製にはｐＨ７．５のリン酸緩衝液を用いた。
１）粗酵素液の調製
１０Ｌ培養液から集菌した菌体（湿重量：２５．５ｇ）を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、１０℃以下の温度で０．５ｍｍガラスビーズを用いて１６分間（２分ｘ８回）細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清画分を粗酵素液として酵素の精製に用いた。

２）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
細胞破砕液から菌体残渣を除去して調製した粗酵素液を、１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（２．５×２０ｃｍ）に吸着させた。本カラムを５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液１Ｌで洗浄した後、酵素を５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）と０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
３）Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムから溶出された酵素液に１Ｍ量の固形の硫安を添加し、生成した不溶物を除去した。この酵素液を１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した５０ｍｌのＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（２．５ｘ１１ｃｍ）に通液した後、カラムを０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄した。次に目的とする酵素を０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）と１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。

４）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムから溶出された酵素活性画分を限外濾過膜で２ｍｓ／ｃｍまで脱塩濃縮した後、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１．５×２０ｃｍ）に吸着させた。本カラムを５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄した後、酵素を５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍｌ）と０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
５）硫安塩析
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムからの溶出液を限外濾過膜で濃縮し、この濃縮酵素液に４５％飽和になるように硫安を添加した後、１時間攪拌放置し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。続いて、この上清画分に５５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集め、さらに６５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。そして５５％飽和と６５％飽和の沈殿画分の酵素を０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶解した。

６）Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
上述の硫安塩析で得た酵素液を１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した５０ｍｌのＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（２．５ｘ１１ｃｍ）に通液し、カラムを０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄した。次に目的とする酵素を０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）と１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
７）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５によるゲル濾過
Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラムからの溶出液を限外濾過膜で０．２ｍｌまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５カラム（１×４５ｃｍ）でゲル濾過を行った。
以上の方法で得られた上記７）の酵素標品をスラブ電気泳動法で分析した結果、単一の蛋白バンドが得られた。尚、本精製法による酵素の精製収率は、表５の通りであった。

（実施例４）グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の性質
実施例３の方法で精製した酵素標品は、電気泳動法を用いて分析した結果、蛋白的に単一であった。よって、本精製酵素標品を用いて諸性質を検討した。

１．作用
グリオキサールを５３ｍＭになるように添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の替わりに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて調製した表４に示す酵素活性測定用発色液０．９５ｍｌに精製酵素液０．０５ｍｌを添加し、３０℃で反応を行い、５５５ｎｍの吸光度の増加を経時的に測定した。その結果、時間の経過と共に５５５ｎｍの吸光度が増大し、グリオキサールと本酵素の反応によって、過酸化水素が生成されることが明らかになった。
また、反応生成物をＩｓｏｂｅ ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｓｅの方法 ［Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１７０−１７３，（１９９４）］ に従ってＮ−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ ｈｙｄｒａｚｏｎｅ（ＭＢＴＨ）と反応させ、その吸収スペクトルおよびＣ１８の逆相カラムからの溶出時間を分析した。まず、反応生成物を０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ４．０）０．７５ｍｌに溶解し、それに１．０％（ｗ／ｖ）ＭＢＴＨ液を０．３ｍｌ添加した（反応１）。さらに、前記反応液の一部（０．２ｍｌ）に０．２％ＦｅＣｌ_３液を０．７５ｍｌ添加した（反応２）。その後、反応１および反応２で得られた反応液について吸収スペクトルを測定した。その結果、グリオキシル酸の反応１および反応２で得られる反応液の吸収スペクトルと同様に、上記反応生成物の反応１の反応液では、３５０ｎｍ付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られ、反応２では６２０ｎｍ付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られた。そして、反応１および反応２の反応液をＣ１８の逆相カラムで分析した場合も、グリオキシル酸の反応１および反応２で得られる生成物と同じ溶出位置にピークが得られた。よって、本酵素は、下記の式に従ってグリオキサールをグリオキシル酸に酸化することが明らかになった。次に、２０ｍＭグリオキシル酸を用いてグリオキサールと同様に精製酵素を作用させ、過酸化水素の生成を調べた。その結果、５５５ｎｍの吸光度の増大は認められなかった。よって、本酵素は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には作用しないことが明らかになった。
ＯＨＣＣＨＯ＋Ｏ_２＋Ｈ_２Ｏ→ＯＨＣＣＯＯＨ＋Ｈ_２Ｏ_２

２．基質特異性
表６に示すアルデヒド類、有機酸類又はアルコール類を５３ｍＭになるように添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の替わりに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用いて調製した表４に示す酵素活性測定用発色液０．９５ｍｌに精製酵素液０．０５ｍｌを添加し、３０℃で反応を行い、５５５ｎｍの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの５５５ｎｍの増加量を算出し、各化合物に対する活性を調べた。
その結果、表６に示すように、本酵素は、グリオキサール、グリコールアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドに良く作用し、ホルムアルデヒドやイソブチルアルデヒドにも作用した。しかし、グリコール酸、グリオキシル酸、エタノール、乳酸には作用しなかった。

３．グリオキサールに対するＫｍ値
酵素活性測定用発色液２の組成を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解して調製した発色液を用いて、グリオキサールの濃度を１ｍＭから８０ｍＭの範囲で変えて、グリオキサールに対するＫｍ値を測定した。その結果、グリオキサールに対するＫｍ値は約１５ｍＭであった。

４．分子量
本酵素の分子量は、ゲル濾過法で約１５０，０００であった。
精製酵素を高速液体クロマトグラフィーによるＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）（東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過に供し、標準タンパクとの相対移動度より、その分子量を推定した。その結果、ゲル濾過法で約１５０，０００であった
［ゲル濾過法による分子量測定条件］
カラム：ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）（東ソー株式会社製）
溶離液：０．１Ｍリン酸緩衝液＋０．３Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）
流 速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温 度：室温
検 出：２２０ｎｍ

５．各種化合物の影響
酵素活性測定と同様にｐＨ５．５で５０ｍＭグリオキサールに精製酵素を作用させ、この反応液に１．０ｍＭの各種化合物を添加して、本酵素のグリオキサール酸化に対する各種化合物の影響を調べた。その結果、表７に示すように、本酵素は、フェニルヒドラジンで強く阻害され、ＣｕＣｌ_２ および ＣｏＣｌ_２でも阻害された。

６．最適ｐＨ
グリコールアルデヒドを２１ｍＭになるように添加し、緩衝液の種類を変更してｐＨ５．５からｐＨ８．５で調製した表４に示す酵素活性測定用発色液０．９５ｍｌに精製酵素液０．０５ｍｌを添加し、３０℃で反応を行い、５５５ｎｍの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの５５５ｎｍの増加量を算出し、活性を調べた。
その結果、図１に示すように、本酵素は酸性領域から弱アルカリ性領域の広い範囲で活性を示し、反応の最適ｐＨは５付近であった。

７．最適温度
グリコールアルデヒドを２１ｍＭになるように添加し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の替わりに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて調製した表４に示す酵素活性測定用発色液０．９５ｍｌに精製酵素液０．０５ｍｌを添加し、２５℃から７０℃の範囲で反応を行い、５５５ｎｍの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの５５５ｎｍの増加量を算出し、活性を調べた。
その結果、図２に示すように、本酵素は測定したいずれの温度でも活性を示し、反応の最適温度は７０℃付近であった。

８．等電点
アンフォラインｐＨ３．３−１０．０を用いて、４００Ｖで４８時間通電して本酵素の等電点を測定した。電気泳動終了後、泳動液を１ｍｌずつ分画し、各分画液のｐＨと酵素活性を測定した。その結果、本酵素の等電点は４．２であることが明らかになった。

（実施例５）
実施例２記載の方法で得たＡＩＵ １２９株培養液２５０ｍｌから集菌した菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液５ｍｌに懸濁し、１０℃以下の温度で０．５ｍｍガラスビーズを用いて１６分間（２分×８回）細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清分画を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液０．８ｍｌに１００ｍＭグリオキサール水溶液０．１ｍｌ、５０００Ｕ／ｍｌカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）溶液０．１ｍｌを添加し、試験管中で２８℃、２４時間、振盪反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。その結果、反応液中に１５ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。

［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：バイオラッド社製アミネックスＨＰＸ−８７Ｈ（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）
カラム温度：２５℃
溶離液：５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４水溶液
流速：０．４ｍｌ／分
溶離時間：グリオキサール−１６分、 グリオキシル酸−１５分
検出：２３０ｍＭの吸光度および示差屈折率

（実施例６）
実施例３で得た精製酵素０．１Ｕ、グリオキサール５０ｍＭ、カタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）５００Ｕを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを試験管に加え、３０℃、５時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に２７ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。

実施例３で取得した酸化酵素の作用最適ｐＨを示すグラフ 実施例３で取得した酸化酵素の作用最適温度を示すグラフ

Claims (8)

1. 下記（１）、（２）、（３）及び（４）の性質を有する酸化酵素。
   （１）作用：
   酸素存在下、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸と過酸化水素を生成する。
   （２）基質特異性：
   グリオキサール、グリコールアルデヒド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、及び、イソブチルアルデヒドに対して活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さない。
   （３）作用最適ｐＨ：４．５−５．５。
   （４）作用最適温度：６５−７５℃。
2. 更に、下記（５）及び（６）の性質を有する請求項１記載の酸化酵素。
   （５）分子量：ゲル濾過分析で１．５×１０^５。
   （６）阻害剤：フェニルヒドラジン、ＣｕＣｌ_２、及び、ＣｏＣｌ_２により阻害される。
3. バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌が産生する請求項１〜２いずれか記載の酸化酵素。
4. バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌がバークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）ＡＩＵ １２９（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７８７）である請求項３記載の酸化酵素。
5. 請求項１〜４いずれか記載の酸化酵素を産生する微生物。
6. 請求項５記載の微生物を培養して請求項１〜４いずれか記載の酸化酵素を製造する方法。
7. 請求項１〜４のいずれかに記載の酸化酵素、又は、請求項５記載の微生物の培養物若しくはその処理物をグリオキサールに接触させてグリオキシル酸へと変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法。
8. 反応時にカタラーゼを共存させることを特徴とする請求項７記載のグリオキシル酸の製造方法。

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