JP2006217883A - グリオキシル酸製造用酵素及びそれを用いたグリオキシル酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 グリオキサールをグリオキシル酸への変換し、生成物であるグリオキシル酸には作用しない酵素を提供すること。
【解決手段】 シュードモナス(Pseudomonas)属細菌が生産するグリオキサールをグリオキシル酸へ変換し、グリオキシル酸には作用しないグリオキシル製造用酵素を提供する。また、本発明は、該グリオキシル酸製造用酵素をグリオキサールに接触させ、グリオキシル酸へと変換することによるグリオキシル酸の製造方法である。
【選択図】 なし
【解決手段】 シュードモナス(Pseudomonas)属細菌が生産するグリオキサールをグリオキシル酸へ変換し、グリオキシル酸には作用しないグリオキシル製造用酵素を提供する。また、本発明は、該グリオキシル酸製造用酵素をグリオキサールに接触させ、グリオキシル酸へと変換することによるグリオキシル酸の製造方法である。
【選択図】 なし
Description
本発明は、Pseudomonas属細菌が産生するグリオキサールに作用する新規な酸化酵素および当該酵素を用いて医薬品の原料として有用なグリオキシル酸を製造する方法に関する。
現在グリオキシル酸は化学的な方法で製造されているが、その製造方法は煩雑で、多量の副産物が生成されるため、グリオキシル酸の収率が低い欠点を有する。この化学的な製造方法の欠点を解決するために、グリコール酸を原料としてグリコール酸酸化酵素や微生物を用いる方法が開発された。例えば特許文献1、非特許文献1〜5などが挙げられる。しかし、これらの方法はいずれも高価なグリコール酸を原料として使用しなければならない問題点を有し、またこれら方法では、グリオキシル酸にも作用する植物由来の酵素が用いられているなどの問題点を有する。最近、安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を製造する方法が報告されたが、当該方法は、グリオキサールを化学的な方法でグリコール酸に変換し、生成されたグリコール酸に上記と同様の植物由来のグリコール酸酸化酵素を作用させる方法であり、この方法も化学的方法と酵素を組み合わせた煩雑である欠点を有する (非特許文献6)。一方、グリオキサールに対し活性を有する酸化酵素として、Phanerochate chrysosporium由来のグリオキサールオキシダーゼ(非特許文献7−9)が報告されている。 しかし、Phanerochate chrysosporium由来のグリオキサールオキシダーゼは、グリオキサールだけでなく、グリオキシル酸にも作用する酵素であり、本発明の目的であるグリオキシル酸の製造に使用することは困難である。また、Pseudomonas属細菌からアルデヒド基をカルボン酸へと変換するアルデヒドオキシダーゼが報告されている(特許文献2、非特許文献10−11)。しかし、当該酵素のグリオキサールに対する作用については全く検討されておらず、Pseudomonas属細菌がグリオキサールに作用しグリオキシル酸に全く作用しない酸化酵素を産生することは、本発明を持って初めて明らかにされた。さらに、本発明の酵素は、分子量や蛋白質の構造において、既報のアルデヒドオキシダーゼとは明らかに異なり、本発明の微生物が従来報告されていない全く新しいアルデヒド酸化酵素を産生し、当該酸化酵素がグリオキシル酸の製造に有効であることは、本発明を持って初めて明らかにされた。
特開平5-501800
特開昭58-179489
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本発明の目的は、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物および/または当該活性を有する酵素、および当該酸化酵素を製造する方法、更に当該酵素を用いて安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を効率的に製造する方法を提供することにある。また、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物を提供する。
本発明者は、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素をPseudomonas属細菌に見出した。そして、当該微生物から本酸化酵素を単離、精製し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の(1)〜(4)の性質を有する新規なアルデヒドオキシダーゼを提供するものである。
(1)作用:グリオキサールに存在する2個のアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキサールをグリオキシル酸に変換する
(2)基質特異性:グリオキサール、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、1−ペンタナール、2−ペンタナールに対して強い活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さず、また、メチルグリオキサールには作用せず、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどの一級アルコールや2-プロパノール、2-ブタノールなどの二級アルコール、あるいはエチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオールなどの二価アルコールおよびグリコール酸、乳酸などにも活性を示さない。
(3)作用最適pH:5.5−6.5
(4)作用最適温度:35−50℃
また、本発明は、更に以下(5)〜(7)
(5)分子量:ゲル濾過分析で約95,000の分子量を示し、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析で約28,000の分子量を示す。
(6)pH安定性:30℃、2時間加温した場合、pH6.0からpH8.5の範囲で80%以上の活性が残存する。
(7)阻害剤:フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化カリウムにより阻害される。
即ち、本発明は、以下の(1)〜(4)の性質を有する新規なアルデヒドオキシダーゼを提供するものである。
(1)作用:グリオキサールに存在する2個のアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキサールをグリオキシル酸に変換する
(2)基質特異性:グリオキサール、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、1−ペンタナール、2−ペンタナールに対して強い活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さず、また、メチルグリオキサールには作用せず、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどの一級アルコールや2-プロパノール、2-ブタノールなどの二級アルコール、あるいはエチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオールなどの二価アルコールおよびグリコール酸、乳酸などにも活性を示さない。
(3)作用最適pH:5.5−6.5
(4)作用最適温度:35−50℃
また、本発明は、更に以下(5)〜(7)
(5)分子量:ゲル濾過分析で約95,000の分子量を示し、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析で約28,000の分子量を示す。
(6)pH安定性:30℃、2時間加温した場合、pH6.0からpH8.5の範囲で80%以上の活性が残存する。
(7)阻害剤:フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化カリウムにより阻害される。
また、本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には作用しない酸化酵素を産生する微生物を提供する。さらに、本発明は、当該微生物を培養して、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化し、反応生成物であるグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の製造法も提供する。
更に本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが反応生成物であるグリオキシル酸に作用しない上記の酸化酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキサールに存在する2つのアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキシル酸に変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法も提供する。
本発明のシュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物より得られた新規なアルデヒドオキシダーゼは、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には全く作用しない特異性の高い酸化酵素であり、本発明の酸化酵素を使用すれば、安価なグリオキサールからグリオキシル酸を効率的に製造することができる。
本発明は、従来報告されていないグリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物を自然界から見出し、当該酵素の諸性質を明らかにし、グリオキシル酸の製造に有効であることを明らかにすることにより完成された。このような微生物は、土壌サンプルをエチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、2−メトキシエタノールなどを炭素源とした培地に添加し、培養を行った後、生育してきた微生物について、グリオキサールに対する酸化活性を調べる事により得ることが出来る。本発明の酵素の起源となる微生物は特に限定しないが、細菌などが好適であり、好ましくはシュードノナス属に属する微生物が挙げられ、特に好ましくは岩手大学農学部校内の土壌から分離されたシュードモナス・スピーシーズ (Pseudomonas sp.)AIU 362が挙げられる。当該AIU 362株は独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にFERM P−20363 として寄託されている。 AIU 362株の菌学的諸性質を表1に示す。また、AIU 362株の同定には、該菌株の16SリボゾーマルRNA遺伝子(16SrDNA)のうち5‘末端側約1500bpの領域をPCRで増幅して、塩基配列を決定し、MicroSeq Bacterial Full Gene Library v.0001(Applied Biosystems社、CA、USA)データベース及び国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)に対し相同性検索を行い、分子系統樹を作製する方法で行った。
本発明の酸化酵素は、該酵素を産生する微生物より、下記のようにして取得することができる。例えば、本活性を有する微生物を好適な条件で培養し、培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕、ガラスビーズを用いた破砕などの方法により、菌体を破砕し、粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液から塩析、各種クロマトグラフィーなどの方法により精製し、本発明の酵素を得ることができる。
至適反応pHまたは至適温度は、反応条件のpHまたは温度を変えて活性を測定することにより決定される。
分子量は例えばTSK−G3000SW(7.8mm × 30cm)(東ソー株式会社製)カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質との相対溶出時間から算出することができ、サブユニット分子量はSDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から算出することができる。
また、N末端アミノ酸配列は、上記方法により精製した酵素、またはさらに逆相HPLCにより精製したものをプロテインシークエンサーにて決定することができる。
本発明において、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する酸化酵素を産生する微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロースなどの糖類、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、2−メトキシエタノールなどのアルコール類、グリオキサールなどのアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、菜種油および大豆油などの油類;窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスチープリカーなど;無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウムなど;その他に麦芽エキス、肉エキスなどを有する通常の液体培地が使用され得る。
本発明によるグリオキシル酸の製造方法は、本発明の酸化酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へと変換蓄積せしめることを特徴とする。本発明で使用する酸化酵素としては、単一または部分的に精製された酵素であってもよいし、これら酵素を産生する微生物の培養液またはその処理物を使用することも可能である。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば粗酵素液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの破砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、酵素自体または菌体のまま公知の手段(例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など)で固定化されて使用できる。
反応条件は使用する酵素により異なるが、温度は5℃〜80℃、好ましくは5〜60℃の範囲、pHは4〜12、好ましくはpH5〜9の範囲である。反応は、酸素条件下で行うことが好ましい。また酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行なわれることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応を行うことにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより進む場合もある。
(実施例1:グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素を産生する能力を持つ微生物の分離)
スクリーニングのための培地は、120℃で15分間加圧殺菌した表2に示す80mlの基礎培地に、5% 2−メトキシエタノール溶液20mlをメンブランフィルターで除菌して添加して調製した(培地中の2-メトキシエタノール濃度は1%)。この1% 2−メトキシエタノール含有培地5mlを分注した試験管に少量の土壌を添加し、30℃で3〜7日間振盪培養した。微生物の生育が確認された培養液について、その培養液50mlを上記と同一組成の培地に植菌し、同様に30℃で3〜7日間振盪培養した。この操作をもう一度繰り返した後、培養液を上記液体培地と同一組成に2%寒天を加えて調製した寒天平板培地にプレートアウトし、30℃で培養した。そして微生物の生育が確認された後、この寒天平板培地にグリオキサールと過酸化水素の生成を確認するための発色液を摘下して、30℃で反応させた。この方法で、過酸化水素の生成が認められた微生物を、この平板培地と同一組成の斜面培地に植菌し、30℃で培養して保存した。次に、斜面培地に分離した微生物を再度1% 2−メトキシエタノール含有液体培地で振盪培養した。そして培養液から遠心分離で集菌し、集めた菌体を0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、10mMのグリオキサールおよびグリオキシル酸と反応させた。この菌体懸濁液を用いた反応で、グリオキサールから過酸化水素の生成が確認されるが、グリオキシル酸から過酸化水素の生成がほとんど確認されない微生物を選抜した。続いて、選抜した微生物を、1% 2−メトキシエタノールを含む上記組成の液体培地150mlを入れた坂口フラスコを用いて30℃で振盪培養した。この培養で得られた900ml分の菌体を遠心分離で集め、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁してガラスビーズを用いて菌体を破砕した。そして、菌体破砕残渣を遠心分離で除去し、得られた上清液をDEAE−Toyopearlカラクムクロマトグラフィーに供した。即ち、菌体破砕残渣を除去して集めた上清液を10mMリン酸緩衝液と同程度の塩濃度まで脱塩した後、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化した20mlのDEAE−Toyopearlカラムに通液し、このカラムを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した。吸着した酵素は、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)と0.5MNaClを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いた直線濃度勾配法で溶出し、全ての画分についてグリオキサールおよびグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を調べた。そして、グリオキサールに良く作用してグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を示さない酵素を産生する微生物を選抜した。このような方法で得られた菌株は、上記の菌学的性質を示す微生物であり、Pseudomonas sp. AIU 362と命名した。
尚、寒天平板培地上でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表3に示す発色液を用い、溶液でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表4に示す発色液を用いた。
スクリーニングのための培地は、120℃で15分間加圧殺菌した表2に示す80mlの基礎培地に、5% 2−メトキシエタノール溶液20mlをメンブランフィルターで除菌して添加して調製した(培地中の2-メトキシエタノール濃度は1%)。この1% 2−メトキシエタノール含有培地5mlを分注した試験管に少量の土壌を添加し、30℃で3〜7日間振盪培養した。微生物の生育が確認された培養液について、その培養液50mlを上記と同一組成の培地に植菌し、同様に30℃で3〜7日間振盪培養した。この操作をもう一度繰り返した後、培養液を上記液体培地と同一組成に2%寒天を加えて調製した寒天平板培地にプレートアウトし、30℃で培養した。そして微生物の生育が確認された後、この寒天平板培地にグリオキサールと過酸化水素の生成を確認するための発色液を摘下して、30℃で反応させた。この方法で、過酸化水素の生成が認められた微生物を、この平板培地と同一組成の斜面培地に植菌し、30℃で培養して保存した。次に、斜面培地に分離した微生物を再度1% 2−メトキシエタノール含有液体培地で振盪培養した。そして培養液から遠心分離で集菌し、集めた菌体を0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、10mMのグリオキサールおよびグリオキシル酸と反応させた。この菌体懸濁液を用いた反応で、グリオキサールから過酸化水素の生成が確認されるが、グリオキシル酸から過酸化水素の生成がほとんど確認されない微生物を選抜した。続いて、選抜した微生物を、1% 2−メトキシエタノールを含む上記組成の液体培地150mlを入れた坂口フラスコを用いて30℃で振盪培養した。この培養で得られた900ml分の菌体を遠心分離で集め、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁してガラスビーズを用いて菌体を破砕した。そして、菌体破砕残渣を遠心分離で除去し、得られた上清液をDEAE−Toyopearlカラクムクロマトグラフィーに供した。即ち、菌体破砕残渣を除去して集めた上清液を10mMリン酸緩衝液と同程度の塩濃度まで脱塩した後、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化した20mlのDEAE−Toyopearlカラムに通液し、このカラムを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した。吸着した酵素は、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)と0.5MNaClを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いた直線濃度勾配法で溶出し、全ての画分についてグリオキサールおよびグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を調べた。そして、グリオキサールに良く作用してグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を示さない酵素を産生する微生物を選抜した。このような方法で得られた菌株は、上記の菌学的性質を示す微生物であり、Pseudomonas sp. AIU 362と命名した。
尚、寒天平板培地上でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表3に示す発色液を用い、溶液でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表4に示す発色液を用いた。
(実施例2:グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の製造)
実施例1で分離した微生物を、1% 2−メトキシエタノールを含む実施例1と同一組成の液体培地を用いて、試験管で30℃,2日間振盪培養して種培養液を調製した。次に、この種培養液1.5mlを、種培養と同一組成の液体培地150mlを入れた500ml容フラスコに植菌し、30℃で振盪培養して、培養時間と酵素生産量との関係を調べた。その結果、グリオキサールに作用する酸化酵素の生産量は培養時間とともに増大し、当該酸化酵素の活性は培養6日付近でも高い値を維持した。
(実施例3:グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の精製)
実施例2の結果を基に、1% 2−メトキシエタノールを含む実施例1と同一組成の液体培地を用いて試験管で30℃,2日間振盪培養して一次種培養液を調製した。この一次種培養液1.5mlを同一組成の液体培地を150ml分注した500ml容フラスコに植菌し、30℃で2日間振盪培養して二次種培養液を調製した。続いて、この二次種培養液20mlを一次種培養と同一組成の液体培地2 Lを入れた3 L容フラスコに植菌し、30℃で5日間振盪培養した。このようにして培養した20Lの培養液から菌体を集めて、以下の方法で酵素を精製した。尚、酵素の精製にはリン酸緩衝液 pH7.0を用いた。
実施例2の結果を基に、1% 2−メトキシエタノールを含む実施例1と同一組成の液体培地を用いて試験管で30℃,2日間振盪培養して一次種培養液を調製した。この一次種培養液1.5mlを同一組成の液体培地を150ml分注した500ml容フラスコに植菌し、30℃で2日間振盪培養して二次種培養液を調製した。続いて、この二次種培養液20mlを一次種培養と同一組成の液体培地2 Lを入れた3 L容フラスコに植菌し、30℃で5日間振盪培養した。このようにして培養した20Lの培養液から菌体を集めて、以下の方法で酵素を精製した。尚、酵素の精製にはリン酸緩衝液 pH7.0を用いた。
1)粗酵素液の調製
20L培養液から集菌した菌体(湿重量:25.5g)を10mMリン酸緩衝液に懸濁し、10℃以下の温度で0.5mmガラスビーズを用いて12分間(2分x6回)細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清画分を粗酵素液として酵素の精製に用いた。
2)硫安塩析
上述の方法で遠心分離して集めた上清液(1,000ml)に35%飽和になるように硫安209gを添加した後、1時間攪拌放置し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。続いて、この上清画分に45%飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた後、さらに65%飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。各硫安濃度で生成した沈殿物を溶解して酵素活性を調べた結果、35−45%飽和と45−65%飽和の沈殿画分に目的の酵素活性が認められたので、両画分に硫安を添加して塩濃度を130ms/cmに調整した。
上述の方法で遠心分離して集めた上清液(1,000ml)に35%飽和になるように硫安209gを添加した後、1時間攪拌放置し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。続いて、この上清画分に45%飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた後、さらに65%飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。各硫安濃度で生成した沈殿物を溶解して酵素活性を調べた結果、35−45%飽和と45−65%飽和の沈殿画分に目的の酵素活性が認められたので、両画分に硫安を添加して塩濃度を130ms/cmに調整した。
3)Phenyl−Topopearlカラムクロマトグラフィー
硫安塩析で得られた300mlの粗酵素液に1.0M硫安を含む10mMリン酸緩衝液で平衡化した150ml分のPhenyl−Topopearlを添加して、4℃で一夜攪拌した後、目的の酵素が吸着しているPhenyl−Topopearl樹脂を濾過で集めた。このPhenyl−Topopearl樹脂を1.0M硫安を含む10mMリン酸緩衝液(1L)に懸濁して攪拌して濾過する方法で洗浄した。この操作を2回繰り返した後、洗浄した樹脂を同一の緩衝液に懸濁してカラムに充填し、このカラムをさらに0.7M硫安を含む10mMリン酸緩衝液2Lで洗浄した。次に目的とする酵素を0.26M硫安を含む10mMリン酸緩衝液で溶出した。
硫安塩析で得られた300mlの粗酵素液に1.0M硫安を含む10mMリン酸緩衝液で平衡化した150ml分のPhenyl−Topopearlを添加して、4℃で一夜攪拌した後、目的の酵素が吸着しているPhenyl−Topopearl樹脂を濾過で集めた。このPhenyl−Topopearl樹脂を1.0M硫安を含む10mMリン酸緩衝液(1L)に懸濁して攪拌して濾過する方法で洗浄した。この操作を2回繰り返した後、洗浄した樹脂を同一の緩衝液に懸濁してカラムに充填し、このカラムをさらに0.7M硫安を含む10mMリン酸緩衝液2Lで洗浄した。次に目的とする酵素を0.26M硫安を含む10mMリン酸緩衝液で溶出した。
4)DEAE−Toyopearlカラムクロマトグラフィー
Phenyl−Topopearlカラムから溶出された酵素活性画分を限外濾過膜で2ms/cmまで脱塩濃縮した後、10mMリン酸緩衝液で平衡化したDEAE−Toyopearlカラム(2.5 × 12cm)に吸着させた。本カラムを40mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液1Lで洗浄した後、酵素を40mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液(300ml)と0.25M NaClを含む10mMリン酸緩衝液(300ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
Phenyl−Topopearlカラムから溶出された酵素活性画分を限外濾過膜で2ms/cmまで脱塩濃縮した後、10mMリン酸緩衝液で平衡化したDEAE−Toyopearlカラム(2.5 × 12cm)に吸着させた。本カラムを40mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液1Lで洗浄した後、酵素を40mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液(300ml)と0.25M NaClを含む10mMリン酸緩衝液(300ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
5)Hydroxyapatiteカラムクロマトグラフィー
DEAE−Toyopearlカラムからの溶出液を限外濾過膜で脱塩濃縮し、Hydroxyapatiteカラム(1.5 × 10cm)に吸着させた。本カラムを10mMリン酸緩衝液100mlで洗浄した後、目的とする酵素を10mMリン酸緩衝液(100ml)と100mMリン酸緩衝液(100ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
DEAE−Toyopearlカラムからの溶出液を限外濾過膜で脱塩濃縮し、Hydroxyapatiteカラム(1.5 × 10cm)に吸着させた。本カラムを10mMリン酸緩衝液100mlで洗浄した後、目的とする酵素を10mMリン酸緩衝液(100ml)と100mMリン酸緩衝液(100ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
6)DEAE−Toyopearlカラムクロマトグラフィー
Hydroxyapatiteカラムからの溶出液を2ms/cmに希釈した後、10mMリン酸緩衝液, pH7.0で平衡化したDEAE−Toyopearlカラム(1 × 18cm)に吸着させた。本カラムを40mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液50mlで洗浄した後、酵素を40mM NaClを含む10mMン酸緩衝液(75ml)と0.25M NaClを含む10mMリン酸緩衝液(75ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
Hydroxyapatiteカラムからの溶出液を2ms/cmに希釈した後、10mMリン酸緩衝液, pH7.0で平衡化したDEAE−Toyopearlカラム(1 × 18cm)に吸着させた。本カラムを40mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液50mlで洗浄した後、酵素を40mM NaClを含む10mMン酸緩衝液(75ml)と0.25M NaClを含む10mMリン酸緩衝液(75ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
7)Toyopearl HW−55によるゲル濾過
Hydroxyapatiteカラムからの溶出液を限外濾過膜で0.2mlまで濃縮した後、50mMリン酸緩衝液で平衡化したToyopearl HW−55カラム(1 × 45cm)でゲル濾過を行った。
Hydroxyapatiteカラムからの溶出液を限外濾過膜で0.2mlまで濃縮した後、50mMリン酸緩衝液で平衡化したToyopearl HW−55カラム(1 × 45cm)でゲル濾過を行った。
以上の方法で得られた上記7) の酵素標品をNativeおよびSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法で分析した結果、電気泳動的に単一であった。尚、本精製法による酵素の精製収率は、表6の通りであった。
(実施例4:グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の性質)
実施例3の方法で精製した酵素標品は、NativeおよびSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて分析した結果、いずれの分析でも蛋白的に単一であった。よって、本精製酵素標品を用いて諸性質を検討した。
1. 作用
酵素活性測定用発色液2の組成を0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解して調製した発色液を用いて、酵素活性測定と同様に、精製酵素を20mMグリオキサールに作用させた結果、反応時間と共に555nmの吸光度が増大し、グリオキサールと本酵素の反応によって、過酸化水素が生成されることが明らかになった。 また、反応生成物をIsobe and Nishiseの方法 [Biosci. Biotech. Biochem., 58, 170-173, (1994)] に従ってN-methylbenzothiazolone hydrazone (MBTH)と反応させ、その吸収スペクトルおよびC18の逆相カラムからの溶出時間を分析した。その結果、反応1では、グリオキシル酸とMBTHを反応させた場合と同様に、350nm付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られ、反応2では620付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られた。そしてC18の逆相カラムで分析した場合も、グリオキシル酸と同じ溶出位置に新たなピークが得られた。よって、本酵素は、下記の式に従ってグリオキサールをグリオキシル酸に酸化することが明らかになった。次に、20mMグリオキシル酸を用いてグリオキサールと同様に精製酵素を作用させ、過酸化水素の生成を調べた。その結果、555nmの吸光度の増大は認められなかった。よって、本酵素は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には作用しないことが明らかになった。
OHCCHO + O2 + H2O → OHCCOOH + H2O2
2. 基質特異性
酵素活性測定用発色液2の組成を0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解して調製した発色液を用いて、酵素活性測定と同様に30℃で、20mMのアルデヒド類、有機酸類、およびアルコール類に精製酵素を作用させた。その結果、表7に示すように、本酵素は、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸には作用しなかった。そして、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、1-ペンタナール、2-ペンタナールなどのアルデヒド類に良く作用し、ホルムアルデヒドやグリコールアルデヒドにも作用した。しかし、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどの一級アルコール、2-プロパノール、2-ブタノールなどの二級アルコール、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオールなどの二価アルコール類には作用せず、2-メトキシエタノール、メチルグリオキサール、グリコール酸、乳酸にも作用しなかった。
3.グリオキサールに対するKm値
酵素活性測定用発色液2の組成を0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解して調製した発色液を用いて、グリオキサールの濃度を0.5mMから20mMの範囲で変えて、グリオキサールに対するKm値を測定した。その結果、グリオキサールに対するKm値は約5mMであった。
4.分子量
本酵素の分子量は、ゲル濾過法で約95,000、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法で約28,000であった。
本酵素の分子量は、ゲル濾過法で約95,000、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法で約28,000であった。
5.各種化合物の影響
酵素活性測定と同様にpH6.0で20mMグリオキサールに精製酵素を作用させ、この反応液に1.0mMの各種化合物を添加して、本酵素のグリオキサール酸化に対する各種化合物の影響を調べた。その結果、表8に示すように、本酵素は、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、シアン化カリウムで強く阻害され、ヒドロキシアミンでも阻害された。そしてキレート化合物で若干活性化されることが明らかになった。
酵素活性測定と同様にpH6.0で20mMグリオキサールに精製酵素を作用させ、この反応液に1.0mMの各種化合物を添加して、本酵素のグリオキサール酸化に対する各種化合物の影響を調べた。その結果、表8に示すように、本酵素は、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、シアン化カリウムで強く阻害され、ヒドロキシアミンでも阻害された。そしてキレート化合物で若干活性化されることが明らかになった。
酵素活性測定と同じ組成の発色液をpH5.5からpH8.5で調製し、これらの発色液を用いて、活性測定と同様に30℃で20mMグリオキサールと精製酵素を反応させ、グリオキサール酸化反応の最適pHを調べた。その結果、図1に示すように、本酵素は酸性領域から弱アルカリ性領域の広い範囲で活性を示し、反応の最適pHは6付近であった。
7.最適温度
酵素活性測定と同様にpH6.0の発色液を用いて、20mMグリオキサールと精製酵素を25℃から70℃の範囲で反応させ、反応の最適温度を調べた。その結果、図2に示すように、本酵素は測定したいずれの温度でも活性を示し、反応の最適温度は35−50℃の範囲であった。
8.pH安定性
pH5.5からpH8.5で酵素液を30℃,2時間加温した後、上記の酵素活性測定法を用いて、残存酵素活性を測定した。その結果、図3に示すように、酵素活性は、酸性領域からアルカリ性領域の広い範囲で残存しており、特にpH6.0からpH8.5の範囲では、80%以上の活性が残存した。よって、本酵素は、酸性領域からアルカリ性の領域領域の広い範囲で安定であることが明らかになった。
pH5.5からpH8.5で酵素液を30℃,2時間加温した後、上記の酵素活性測定法を用いて、残存酵素活性を測定した。その結果、図3に示すように、酵素活性は、酸性領域からアルカリ性領域の広い範囲で残存しており、特にpH6.0からpH8.5の範囲では、80%以上の活性が残存した。よって、本酵素は、酸性領域からアルカリ性の領域領域の広い範囲で安定であることが明らかになった。
9.N末端アミノ酸配列
精製酵素を用いて、本酵素のN末端アミノ酸配列を調べた。本精製酵素のN末端は図4(配列番号1)に示す。
精製酵素を用いて、本酵素のN末端アミノ酸配列を調べた。本精製酵素のN末端は図4(配列番号1)に示す。
(実施例5)
実施例2記載の方法で得たAIU 362株培養液250mlから集菌した菌体を10mMリン酸緩衝液5mlに懸濁し、10℃以下の温度で0.5mmガラスビーズを用いて10分間(1分 x 10回)細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清分画を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液0.8mlに500mMグリオキサール水溶液0.1ml、50,000U/mlカタラーゼ溶液0.1mlを添加し、試験管中で28℃、10時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に7mMのグリオキシル酸が生成していた。
[HPLC分析条件]
カラム:バイオラッド社製アミネックスHPX−87H(7.8mm × 300mm)
カラム温度:25℃
溶離液:5mM H2SO4水溶液
流速:0.4ml/分
溶離時間:グリオキサール−16分、 グリオキシル酸−15分
検出:230mMの吸光度および示差屈折率
(実施例6)
実施例3で得た精製酵素0.1U、グリオキサール50mM、カタラーゼ5000Uを含む100mMリン酸緩衝液(pH7.0)1mlを試験管に加え、30℃、5時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に27mMのグリオキシル酸が生成していた。
Claims (8)
- 下記(1)〜(4)の性質を有する酸化酵素
(1)作用:
酸素存在下、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸と過酸化水素を生成する、
(2)基質特異性:
グリオキサール、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、1−ペンタナール、2−ペンタナールに対して強い活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さない、
(3)作用最適pH: 5.5−6.5、
(4)作用最適温度: 35−50℃。 - 更に、下記(5)〜(7)の性質を有する酸化酵素
(5)分子量: ゲル濾過分析で約95,000、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析 において約28,000、
(6)pH安定性: 30℃、2時間加温した場合、pH6〜8.5で80%以上の活性が残 存する、
(7)阻害剤: フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化カリウムにより阻害される。 - 配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列をN末端に有する請求項1〜2いずれか記載の酸化酵素。
- シュードモナス(Pseudomonas)属細菌が産生する請求項1〜3いずれか記載の酸化酵素
- シュードモナス(Pseudomonas)属細菌がシュードモナス・スピーシーズ(Pseudomonas sp.)AIU 362(FERM P−20363)である請求項4記載の酸化酵素
- 請求項4−5のいずれか記載の微生物を培養して請求項1の酵素を製造する方法
- 請求項1〜5のいずれか記載の酸化酵素をグリオキサールに接触させてグリオキシル酸へと変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法
- 反応時にカタラーゼを共存させることを特徴とする請求項7記載のグリオキシル酸の製造方法。
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