JP2010279283A - アルカリプロテアーゼ高生産菌 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】グリシン濃度1質量%以上の液体培地で生育可能なバチルス属に属するアルカリプロテアーゼ生産菌。
【選択図】なし
Description
さらに近年、特に衣料用洗剤は、環境問題の面から無リン化あるいは洗剤使用量の省力化が進められているが、これにより低下する洗浄力を強化するためにアルカリプロテアーゼの配合が行われており、ますます高性能なアルカリプロテアーゼの需要が高まっている。
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌の生育度(OD600値)は、15以上であり、好ましくは20以上、より好ましくは30以上である。この生育度(OD600値)は、後記実施例記載の方法によって測定できる。
本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌は、アルカリプロテアーゼの生産性の点から、培地中のグリシン濃度が1〜2.5%、更に1.2〜2.5%、特に1.2〜2%で生育可能なことが好ましい。
pH低下率(%)=[(培養開始前の培地pH)−(培養2日後の培地pH)]/(培地開始前の培地pH)×100 (1)
アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌(以下、「親株」と称する)は、野生株または変異株のいずれでもよく、またアルカリプロテアーゼ生産能を本来的に備えるものやアルカリプロテアーゼ生産能を本来的に有しない細菌に遺伝子導入など公知の人為的な改変を付すことによりアルカリプロテアーゼ生産能を付与したものであってもよい。好ましくはバチルス・エスピーKSM−9865(FERM−P18566)、及びこの菌株を突然変異処理に付して得られたバチルス・エスピーKSM−GLU51(FERM−P21608)やバチルス・エスピーKSM−PH401(FERM−P21609)等が挙げられる。
バチルス・エスピーKSM−GLU51及びバチルス・エスピーKSM−PH401は、バチルス・エスピーKSM−9865に比べ、よりアルカリプロテアーゼ生産性が向上しているため、親株としてバチルス・エスピーKSM−GLU51又はバチルス・エスピーKSM−PH401を用いるのが好ましい。さらに、バチルス・エスピーKSM−PH401は、バチルス・エスピーKSM−GLU51に比べ、よりアルカリプロテアーゼ生産性が向上しているため、親株としてバチルス・エスピーKSM−PH401を用いるのがより好ましい。
グリシン耐性株選択用の培地中のグリシンの含有量は、変異株取得の効率の点から、0.6〜2%が好ましく、特に0.8〜1.2%が好ましい。
使用する培地は、バチルス属細菌が生育可能な培地を用いることができ、例えばスキムミルク含有アルカリ寒天培地が挙げられる。その他、必要に応じて、後記の培地に添加し得る栄養源を適宜組合せて用いてもよい。
アルカリプロテアーゼ生産菌は、スキムミルク選択プレート上でのタンパク分解活性を指標に選抜できる。
ここで、ベクターとしては、アルカリプロテアーゼを安定に発現させることができ、その遺伝子を安定に保持できるベクターであれば特に制限されず、例えば、pHY300PLKシャトルベクター(ヤクルト)、pASP64(特開2000-287687号公報)等が挙げられる。また、形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。
形質転換体の選択は、アルカリプロテアーゼ生産菌の選択と同様の方法で行うことができる。
本発明で用いられるアルカリプロテアーゼ生産用液体培地としては、バチルス属細菌が生育可能なものであれば特に制限されないが、例えば、資化しうる窒素源、炭素源、更にビタミン類、金属塩類等の微量栄養源を適宜組合せた富栄養培地が用いられる。炭素源、窒素源は特に限定されないが、炭素源としては、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉や安価な廃糖蜜、転化等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール、アジプロン、無機窒素化合物等が挙げられる。
培地中にグリシンは、経済性及び生産性の点から、1%以上、特に1〜2%、更に1.2〜2%とするのが好ましく、窒素源全体としては、培地中に2〜6%、特に4〜6%とするのが好ましい。また、炭素源は、培地中に1〜10%、特に5〜10%とするのが好ましい。
また、培地には、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Na+、K+等の無機塩や、ビオチン、パントテン酸、ピリドキサール、チアミン等のビタミン類を添加することもできる。
すなわち、培養物を遠心分離、濾過等によって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液から、通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法(メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等)によってタンパク質を沈殿させたり、また、限外濾過法により濃縮させてアルカリプロテアーゼを得る。塩析法では、例えば硫安(90%飽和画分)、溶媒沈殿では、例えば75%エタノール中で酵素を沈殿させた後、濾過または遠心分離、さらに脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。
実施例において得られたアルカリプロテアーゼの活性測定は次の如くして行った。すなわち、1/15Mリン酸緩衝液(pH7.4)0.9ml、40mMGlt−Ala−Ala−Pro−Leu−p−ニトロアニリド/ジメチルスルホキシド溶液0.05mlを試験管に採り、30℃で5分間保温した。これに酵素液0.05mlを加えて30℃で10分間反応を行った後、5%(w/v)クエン酸水溶液2.0mlを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて420nmにおける吸光度を測定した。なお、酵素1単位は上記反応において1分間に1μmolのp−ニトロアニリンを生成する量とした。
培養液の一部を分取したものを5%(w/v)塩化ナトリウム水溶液を用いて100倍に希釈混合した後、U−2000形日立分光光度計(日立製作所)を用いて波長600nmにおける濁度(OD600値)を測定した。
(1)親株としてバチルス・エスピーKSM−GLU51株(FERM−P21608)を用いて、以下の変異処理を行った。すなわち、凍結保存しておいたバチルス・エスピーKSM−GLU51株を表1の液体培地に接種し(植菌量0.1%)、13時間前培養(30℃、120rpm)を行った後、同じ組成培地に前培養液を接種し(植菌量0.5%)、三角培養フラスコ中にて30℃で振とう培養を行った。菌の生育が対数増殖後期に入った時点(培養約11時間後)の培養液から遠心分離(10000rpm、10分間、4℃)で菌体を集め、表1の液体培地50mに菌を懸濁した後、NTGを最終濃度200μg/mlになるように添加し、30〜37℃で約45分間振とうを行った。遠心分離(2800rpm、30分間、4℃)で菌体を集め、表1の液体培地20mlにて2回洗浄を行った。得られた菌液を生理食塩水で適当に希釈し、表2に示す平板培地に塗布した後、30℃で3日間培養を行った。
生育したコロニーの周辺にスキムミルク溶解斑が明確に認められる菌を選抜し、プロテアーゼ組換え生産プラスミドによる形質転換後、種々のアルカリプロテアーゼ生産用液体培地を用いて、プロテアーゼの生産性を評価した。
得られた変異株をバチルス・エスピーKSM−PH401と命名し、平成20年7月18日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−21609として寄託した(特願2009−095449参照)。
変異剤処理を行った菌液を生理食塩水で適当に希釈し、表3に示す選択用平板培地に塗布した後、30℃で3日間培養を行った。正常な形態を形成し、かつ生育したコロニーの周辺にスキムミルク溶解斑が明確に認められた菌株196株を選抜し、後述の形質転換及び液体培地評価に供した。
バチルス・エスピーKSM−KP43株由来のアルカリプロテアーゼ(特開2004−122号公報)構造遺伝子約2.0kbの増幅DNA断片を、バチルス属細菌内で複製可能な発現ベクターpASP64(特開2000-287687号公報)に組み込んだプラスミドを作製し、以後の形質転換用DNAとして用いた。
形質転換すべき宿主としてバチルス・エスピーKSM−PH401(親株)及び実施例2で選抜した196株を用いた。形質転換法はエレクトロポレーション法により、SSH−10(島津製作所)及びジーンパルサーキュベット(バイオラッド)を用いて形質転換を行った。
形質転換体は、表4に示す平板培地に生育させ、スキムミルク溶解斑の形成状況により目的のプロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。
親株及びその変異株に対して得られた形質転換体を以後の培養に供した。
実施例3で得られた各形質転換体について単集落分離およびコロニー周辺のスキムミルク溶解斑の形成を確認した後、表5に示す液体培地30mlの入った坂口フラスコに一白金耳ずつ植菌を行い、30℃、125rpmで一晩前培養を行った。この培養液0.6mlを表6に示す液体培地30mlに植菌し、培養三角フラスコ中にて30℃、230rpmで2日間(48時間)振とう培養を行った。各菌株の生育度(OD600値)及び培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。
その結果、30株において生育度(OD600値)及びプロテアーゼの生産性が親株より上昇していた。このうち1株をバチルス・エスピーKSM−GLY10と命名し、平成20年7月18日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−21607として寄託した。KSM−GLY10株においては、生育度(OD600値)は親株に対して約4倍、および組換えプロテアーゼの生産性は親株に対して約5倍上昇していることが認められた(図1および図2参照)。また、KSM−GLY10株のpH低下率(前記式(1)より算出)は6%であった。
従って、本発明のバチルス・エスピーKSM−GLY10は、グリシン感受性に関わる遺伝子に変異が起きたとものと推察される。
Claims (8)
- グリシン濃度1質量%以上の培地で生育可能なバチルス属に属するアルカリプロテアーゼ生産菌。
- アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌を突然変異処理に付し、次いで得られた菌株をグリシンを含有する培地中で培養して得られる、請求項1記載のアルカリプロテアーゼ生産菌。
- アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌が、バチルス・エスピーKSM−9865(FERM−P18566)、バチルス・エスピーKSM−GLU51(FERM−P21608)又はバチルス・エスピーKSM−PH401(FERM−P21609)である請求項2記載のアルカリプロテアーゼ生産菌。
- バチルス・エスピーKSM−GLY10と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−21607として寄託されたアルカリプロテアーゼ生産菌。
- アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属に属する細菌を突然変異処理に付し、次いで得られた変異株を、グリシンを含有する培地中で培養して請求項1〜4のいずれかの項記載のアルカリプロテアーゼ生産菌を製造する方法。
- 請求項1〜4いずれかの項記載のアルカリプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物からアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載のアルカリプロテアーゼ生産菌に、アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を導入した組換え細菌。
- 請求項7記載の組換え細菌を用いるアルカリプロテアーゼの製造法。
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