JP4997420B2

JP4997420B2 - 変異微生物

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Publication number: JP4997420B2
Application number: JP2006086932A
Authority: JP
Inventors: 泰影山; 善弘高木; 繁島村; 真郎西; 徹小林; 進伊藤; 弘毅掘越
Original assignee: Kao Corp; Japan Agency for Marine Earth Science and Technology
Current assignee: Kao Corp; Japan Agency for Marine Earth Science and Technology
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2026-03-28
Also published as: JP2007259725A

Description

本発明は、プロテアーゼの生産に有用な微生物、及びこれを用いたプロテアーゼの生産方法に関する。

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。
例えば、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）やバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrpoB遺伝子によりコードされるＲＮＡ−ポリメラーゼのβ−サブユニットにおける特定のアミノ酸を置換した突然変異体において、プロテアーゼやアミラーゼの生産性が向上することが報告されている（特許文献１）。

特表２００５−５１２５９５号公報

本発明は、プロテアーゼの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を用いたプロテアーゼの製造方法を提供することに関する。

本発明者らは、界面活性剤に対する安定性の高いアルカリプロテアーゼＫ−１６を産生するバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）について、アルカリプロテアーゼの高生産化を検討したところ、RpoBタンパク質他、特定のタンパク質のアミノ酸変異を含む変異体が、変異前の親株と比較して、高いアルカリプロテアーゼ生産性を有することを見出した。

すなわち本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列における４７９番目のアラニン残基、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異を含むことを特徴とするバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）の変異株に係るものである。

また本発明は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２０７６１として寄託されたバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株に係るものである。

また本発明は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２０７６２として寄託されたバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−３Ｍ−３０株に係るものである。

また本発明は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrsbU遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異、及び、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrph遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異を含むバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）変異株に係るものである。

また本発明は、配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換される変異を含むバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）の変異株に係るものである。

また本発明は、上記変異株をアルカリ性培地で培養し、その培養物よりアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法に係るものである。

本発明の微生物変異株によれば、洗剤酵素として有用なアルカリプロテアーゼを効率よく生産することができる。

本明細書においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ａ」はアデニン、「Ｔ」はチミンをそれぞれ示す。

本発明の変異株を構築するための親微生物（以下、「親株」という）としては、例えばバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株又はその変異株、あるいはバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）に属する上記以外の菌株が挙げられる。

バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６は、栃木県芳賀郡の土壌より採取したアルカリプロテアーゼＫ−１６生産菌（ＦＥＲＭＢＰ−３３７６）である（特開平４−２８１７８２号公報、特開平４−３４９８８２号公報）。

本発明の変異株における変異は、（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列における４７９番目のアラニン残基、又はこれに相当する位置のアミノ酸がバリン残基に置換される変異、（ｂ）バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrsbU遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異及び（ｃ）バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrph遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異、から選ばれる１又は２以上の変異を含むものである。このうち、（ａ）〜（ｃ）の変異を全て含むものが好ましい。

上記（ａ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株における、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］βサブユニット（RpoB）のアミノ酸配列であり、（ａ）の変異は、当該アミノ酸配列における４７９番目のアラニン残基、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換されたものである。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列における４７９番目のアラニン残基に相当する位置のアミノ酸残基とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）由来のRpoBにおける対応アミノ酸残基を意味する。

（ａ）で示されるアミノ酸の変異は、例えば、当該RpoBをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号１）において、１４３６番目のＣをＴに置換することにより起こすことができる。

上記（ｂ）のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrsbU遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）における、シグマ−Ｂ活性の間接的な正の制御因子であるRsbUの機能を変化させる変異である。
ここで、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrsbU遺伝子としては、例えば、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株のrsbU遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が挙げられる。rsbU遺伝子に相当する遺伝子とは、ＫＳＭ−Ｋ１６株のrsbU遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、ＫＳＭ−Ｋ１６株のrsbU遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）由来の遺伝子が挙げられる。

斯かる変異としては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列における１７６番目のアスパラギン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基に置換され、且つ２３４番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンでフレームシフトし、２５１番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異が挙げられる。

ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株におけるRsbUのアミノ酸配列である。また、当該アミノ酸配列における１７６番目のアスパラギン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基、同アミノ酸配列における２３４番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンとは、配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）由来のRsbUにおける対応アミノ酸残基又は対応コドンを意味する。

尚、上記及び後記の「相当する位置のアミノ酸残基又はコドン」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各蛋白質のアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。これにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各タンパク質における配列中の位置を決めることが可能である。

（ｂ）で示される上記アミノ酸の変異は、例えば、rsbUをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号３）において、５２７番目のＡをＧに置換すること、及び６９３番目〜７００番目の連続したＴのうち何れか１つのＴを欠失することにより起こすことができる。

上記（ｃ）のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrph遺伝子の不活性化又は欠失により生じるアミノ酸変異は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）における、リボヌクレアーゼＰＨであるRphの機能を変化させる変異である。
ここで、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrph遺伝子としては、例えば、また、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株のrph遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が挙げられる。rph遺伝子に相当する遺伝子とは、ＫＳＭ−Ｋ１６株のrph遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、ＫＳＭ−Ｋ１６株のrph遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）由来の遺伝子が挙げられる。

斯かる変異としては、例えば、配列番号６で示されるアミノ酸配列における１４９番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンでフレームシフトし、１５１番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異が挙げられる。

ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株における、リボヌクレアーゼＰＨ（EC 2.7.7.56）（Rph）のアミノ酸配列である。また、当該アミノ酸配列における１４９番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンとは、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）由来のRphにおける対応コドンを意味する。

（ｃ）で示される上記のアミノ酸の変異は、例えば、RphをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号５）において、４３９番目から４４５番目の何れか１ヶ所へＡを挿入することにより起こすことができる。

上記（ａ）〜（ｃ）の変異を有する微生物株としては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２０７６１として寄託されたバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株が挙げられる。

また、本発明においては、上記の変異に加えて、又はこれとは別に、（ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換される変異を有するものが包含される。このうち、好ましくは、（ａ）〜（ｄ）の変異を全て有するものである。
ここで、配列番号８で示されるアミノ酸配列は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株における、ユビキノン生合成タンパク質のアミノ酸配列であり、その変異は、当該アミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換したものである。

ここで、配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基に相当する位置のアミノ酸残基とは、配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）由来のユビキノン生合成タンパク質における対応アミノ酸残基を意味する。

上記アミノ酸の変異は、ユビキノン生合成タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号７）において、１５８６番目のＣをＴに置換することにより起こすことができる。

また、配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株における、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２（RpsB）のアミノ酸配列であり、その変異は、当該アミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換したものである。
ここで、配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基に相当する位置のアミノ酸残基とは、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する、ＫＳＭ−Ｋ１６株以外のバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）由来のｒｐｓＢにおける対応アミノ酸残基を意味する。

上記アミノ酸の変異は、RpsBをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号９）において、２８番目のＣをＴに置換することより起こすことができる。

斯かる（ａ）〜（ｄ）の変異を有する微生物株としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２０７６２として寄託されたバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−３Ｍ−３０株が挙げられる。

本発明の、微生物変異株は、例えば以下に示す方法により得ることができる。
第１の方法として、例えば親株に突然変異剤を作用させるか、又は紫外線若しくは放射線等を照射する等の一般的な変異誘発法、あるいは、自然突然変異の利用が挙げられる。
上記（ａ）〜（ｃ）の変異を含む変異株を得るには、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株（ＦＥＲＭＢＰ−３３７６）若しくはその変異株又はバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）に属する上記以外の菌株をリファンピシンを含有する培地で培養し、当該リファンピシン耐性を有する菌株を選択することにより行うことができる。ここで、用いられる突然変異剤としては、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン等の塩基類似物質、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸、アクリジン類等が挙げられる。また放射線としては、電離放射線等が挙げられる。

また、上記（ｄ）の変異を含む変異株を得るには、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株又はその変異株又は上記（ａ）〜（ｃ）の変異を施した変異株（例えばバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株（ＦＥＲＭＰ−２０７６１）又はバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）に属する上記以外の菌株をバンコマイシンを含有する培地で培養し、当該バンコマイシン耐性を有する菌株を選択することにより行うことができる。ここで、用いられる突然変異剤としては、例えば５−ブロモウラシル、２−アミノプリン等の塩基類似物質、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸、アクリジン類等の突然変異剤が挙げられる。また放射線としては、電離放射線等が挙げられる。

第２の方法としては、ランダム変異や部位特異的変異等の遺伝子変異手段により、所望のアミノ酸置換又はフレームシフトを生ずるようなRpoB、RsbU、Rph、ユビキノン生合成タンパク質又はRpsBの変異と適当な相同領域を含むＤＮＡを作製し、必要に応じてこれをプラスミドＤＮＡにクローン化し、親株のゲノムＤＮＡとの相同的組換え反応を利用して導入する方法が挙げられる。

例えば前記バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株のゲノム配列はすでに公知であり、その塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースにＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ００６５８２として登録されている。RpoB、RsbU、Rph、ユビキノン生合成タンパク質、RpsBのコード領域に対応する塩基配列が上述した配列番号１、３、５、７及び９に示されるものである。従って、ゲノム配列情報を利用して、当該ＫＳＭ−Ｋ１６株の染色体ＤＮＡまたは必要に応じてクローン化した所望のＤＮＡに対して、例えば、部位特異的変異やSOE（splicing by overlap extension）−PCR法などを用いることによって、各ＤＮＡにおける所望の変異を導入し、かつ、適当な相同領域を有するDNA断片を構築することができる。導入する変異には、アミノ酸置換をもたらすコドンの変異、塩基又は塩基配列の挿入、欠失、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子の挿入、５’側の発現制御領域での変異などが含まれる。

更に必要に応じて、相同組換え用のＤＮＡを構築するため、所望の変異が導入されたＤＮＡ断片、あるいは、上記ＤＮＡ断片に例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡが付加された断片を相同的組換え用プラスミドベクターにクローン化することができる。このベクターは、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子等を選択マーカーとして有する。

構築した相同組換え用ＤＮＡあるいはプラスミドをバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株、又はその変異体にプロトプラスト形質転換法などの形質転換法により導入し、相同的組換えにより変異を導入した配列と親株配列とが置換した変異体を得ることができる。

斯くして得られた本発明の変異株を適当な培地に接種し、常法に従って培養すれば、アルカリプロテアーゼを効率良く生産することができる。
使用される培地としては、通常の微生物の培養に用いられ本菌株に利用可能なものであれば何れをも使用することができるが、該培地中には資化しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ましい。

この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてはアミノ酸液、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベーター、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックス等が挙げられる。また、炭素源としては、資化しうる炭素源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗糖、マルトース、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転化糖等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。

斯くして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。
すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させたり、また、限外濾過（例えばダイアフローメンブレンＹＣ、アミコン社製）により濃縮させてアルカリプロテアーゼを得る。塩析法では、例えば硫安（３０〜７０％飽和画分）、溶媒沈澱では、例えば７５％エタノール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。ここで脱塩の方法としては、透析又は、セファデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が用いられる。

得られた酵素液は、そのまま使用することもできるが、更に公知の方法により精製結晶化して用いることも出来る。更に酵素を精製するには、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロースやＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びセファデックスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製すればよい。

斯くして得られたアルカリプロテアーゼは、親株であるバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６の産生するアルカリプロテアーゼＫ−１６と同一の酵素学的性質を有する（特開平４−２８１７８２号公報、特開平４−３４９８８２号公報）。

実施例１
バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６（ＦＥＲＭＢＰ−３３７６）を、培地Ａに接種し、３０℃で１８時間好気的に振盪培養したところで、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を３０〜１００μｇ／ｍＬになるように添加した後、同温度で３０〜６０分間振盪を継続した。その後、新たに培地Ａへ１％上記処理液を接種し、３０℃で２４時間振盪培養を行った。この培養液をリファンピシン０．１μｇ／ｍＬ以上添加した培地Ｂに塗布し、３０℃で３日間培養した。生育したコロニーを取り、同培地で３回純化を繰り返しリファンピシン耐性株であるバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２（ＦＥＲＭＰ−２０７６１）を得た。

実施例２
親株としてバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２（ＦＥＲＭＰ−２０７６１）を培地Ａに接種し、３４℃で約１８時間好気的に振盪培養した後、遠心分離を行い得られた菌体を、ＮＴＧを１０〜２００μｇ／ｍＬ含有する培地Ａに懸濁し、３０℃で３０分間放置した。次に遠心分離により菌体を集め、培地Ａで数回洗浄した後、この処理液を新たに培地Ａに１％接種し、３４℃で２０時間振盪培養を行った。この培養液をバンコマイシン６．８μｇ／ｍＬ以上添加した培地Ｃに塗布し、３０℃で３日間培養した。生育したコロニーを取り、同培地、次いで、培地Ｃにて純化を繰り返し、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−３Ｍ−３０（ＦＥＲＭＰ−２０７６２）を得た。バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−３Ｍ−３０（ＦＥＲＭＰ−２０７６２）のバンコマイシン耐性は、親株であるバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２（ＦＥＲＭＰ−２０７６１）と同程度にまで低下していた。

実施例４バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のゲノムの塩基配列決定
バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株、同ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株、同ＫＳＭ−３Ｍ−３０株を染色体ＤＮＡ調製に使用した。染色体ＤＮＡのライブラリー構築に使用する宿主菌には、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α（タカラバイオ）を使用した。

（１）ホールゲノムショットガンライブラリーの作製
バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）の菌株を、１０％炭酸ナトリウムでｐＨ８．５に調整したＴＳＢ培地（BD BBL Trypticase Soy BrothTM ;BD Diagnostic Systems）１００ｍＬ中で３０℃において培養した。対数増殖期の菌体から、斉藤と三浦（Saito & Miura）の方法（フェノール法；サイトウ（Ｓａｉｔｏ）ら、 Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)）により染色体ＤＮＡを得た。
２０μｇの染色体ＤＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）を超音波破砕により断片化した。断片化ＤＮＡは、３０℃、５分間のＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（タカラバイオ）処理により、突出末端を平滑化した後、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製した。次にDNA Blunting Kit（タカラバイオ）でＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製した。続いて、精製ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動を行い、１−２ｋｂの画分をQiaquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて回収した。

このＤＮＡ画分と等量のベクターpUC18/SmaI/BAP（Amersham Pharmacia Biotech）を１：１の比率で混合し、DNA Ligation Kit Ver.1（タカラバイオ）を用いて、１６℃で一晩、ライゲーションを行った。その後、このＤＮＡにてコンピテントセル大腸菌E.coli DH5αを形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。この方法により、約１ｘ１０⁶クローン／μｇベクターの形質転換効率のホールゲノムショットガンライブラリーを作製した。

（２）ショットガンシーケンシング用鋳型ＤＮＡの増幅
ショットガンクローンは、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含むＬＢ液体培地を用いて、３７℃で１８時間培養した。この培養液を鋳型として、インサートＤＮＡをTaKaRa Ex TaqTM（タカラバイオ）を用いたＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲには、ベクターの塩基配列より設計したプライマーＬＦ（5'-CAAGGCGATTAAGTTGGGTAACG-3'）（配列番号１１）とＬＲ（5'-CTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3'）（配列番号１２）を使用した。

（３）鋳型ＤＮＡの精製
ＰＣＲ産物に残存する未反応のプライマーを、exonuclease I（Amersham Pharmacia Biotech）により分解し、その分解物をshrimp alkaline phosphatase(Amersham Pharmacia Biotech）により脱リン酸化することでＰＣＲ産物の精製を行った。

（４）ショットガンクローンのシーケンシング
ショットガンクローンのシーケンシングは、インサートＤＮＡの精製ＰＣＲ産物を鋳型とし、ＬＦまたはＬＲをプライマーとして、DYEnamic ET terminator（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して行った。反応産物は、エタノール沈殿により精製後、キャピラリー型ＤＮＡシーケンサーを用いてシーケンシングを行った。

（５）アセンブル（配列結合編集）
ショットガンクローンより得た配列データは、大型アセンブルソフトPhred/Phrap（Ewingら、Genome Res. 8, 186-194 (1998)）を使用してアセンブルした。

実施例５ＫＳＭ−Ｋ１６株とＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株の間における変異点の抽出
バチルスクラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株とＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株の塩基配列を比較したところ、以下に示す様に、２遺伝子に各１ヶ所、および、１遺伝子に２ヶ所の変異が検出された。

第１に、本発明の配列番号２に示すＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ[EC:2.7.7.6]βサブユニット（RpoB）をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号１）において、１４３６番目のＣからＴへの変異を検出した。この変異は、配列番号２に示すアミノ酸配列において４７９番目のアラニン残基がバリン残基に置換された（Ａ４７９Ｖ）変異を生ずる。

第２に、配列番号４に示すシグマ−Ｂ活性の間接的な正の制御因子（RsbU）をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号３）において、５２７番目のＡからＧへの変異および６９３番目〜７００番目の連続したＴのうち何れか１塩基のＴの欠失を検出した。前者の変異は、配列番号４に示すアミノ酸配列において１７６番目のアスパラギン残基がグリシン残基に置換された（Ｄ１７６Ｇ）変異をもたらす。後者の欠失変異は、配列番号４に示すアミノ酸配列においてフレームシフトを起こし、コドン２３４からコドン２５０までに異なるアミノ酸配列をコードするコドンを生じ、コドン２５１に終止コドンを生ずる。

第３に、配列番号６に示すリボヌクレアーゼＰＨ[EC 2.7.7.56)(rph)をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号５）において、４３９番目から４４５番目の何れか１ヶ所へのＡの挿入を検出した。この変異は、配列番号６に示すアミノ酸配列においてフレームシフトを起こし、コドン１４９とコドン１５０に異なるアミノ酸配列をコードするコドンを生じ、コドン１５１に終止コドンを生ずる。

実施例６ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株と３Ｍ−３０株の間における変異点の抽出
バチルスクラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株とＫＳＭ−３Ｍ−３０株の間で配列を比較したところ、以下に示す様に、２遺伝子において各１ヶ所の変異が検出された。
第１に、配列番号８に示すユビキノン生合成蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号７）において、１５８６番目のＣからＴへの変異を検出した。この変異は、配列番号８に示すアミノ酸配列において５２９番目のアラニン残基がバリン残基に置換された（Ａ５２９Ｖ）変異を生ずる。

第２に、配列番号１０に示す３０Ｓリボソーム蛋白質Ｓ２（RpsB）をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号９）において、２８番目のＣからＴへの変異を検出した。本変異は、配列番号１０に示すアミノ酸配列において１０番目のロイシン残基がフェニルアラニン残基に置換された（Ｌ１０Ｆ）変異を生ずる。

実施例７ＫＳＭ−Ｋ１６株からのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（RpoB）変異株の構築
バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株の培養液を、０．１μｇ／ｍＬリファンピシン、０．１％炭酸ナトリウム、１．５%精製寒天を含むＴＳＢ固体培地に塗布して、３０℃でインキュベーションした。形成したコロニーからゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（RpoB）βサブユニット（RpoB）をコードする配列を決定することにより、ＲｐｏＢの４７９番目のアラニン残基がバリン残基に置換された（Ａ４７９Ｖ）変異株を取得した。この変異株をＫ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株とした。

実施例８ＳｋｉｍＭｉｌｋ含有固体培地における透明帯形成によるプロテアーゼ分泌量の検定
Ｋ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株の２菌株を、１０％炭酸ナトリウムでｐＨ８．５に調整した１％ＳｋｉｍＭｉｌｋ(BD Diagnostic Systems)、１．５％Ａｇａｒを含むＴＳＢ（BD BBL Trypticase Soy BrothTM ;BD Diagnostic Systems）培地で調製した１枚の固体培地上で３０℃において培養した。培養２日目に、分泌されたアルカリプロテアーゼによるＳｋｉｍＭｉｌｋの分解のために生じた透明帯の直径を測定した（表４）。
その結果、透明帯の直径（ｎ＝４）は、ｒｐｏＢ遺伝子にＡ４７９Ｖの変異を有する変異株Ｋ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株における１１．１±１．１ｍｍよりも、さらに変異が導入されているＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株における１２．５±０．６ｍｍの方が有意に大きかった（ｐ＜０．００３）。このことから、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株においてｒｐｏＢ遺伝子のＡ４７９Ｖ変異の他に更に導入された変異によるアルカリプロテアーゼ分泌の向上が固体培地上で確認された。

実施例９評価培養
1.５％(v/v) アミノ酸液（アスパラギン酸２％、トレオニン０．８％、セリン１．１％、グルタミン酸３％、グリシン０．９％、アラニン１．２％、バリン０．８％、メチオニン０．１％、イソロイシン０．３％、ロイシン０．６％、チロシン０．１％、フェニルアラニン０．６％、リジン１．２％、ヒスチジン０．５％、アルギニン１．１％、プロリン１．２％）、０．２％酵母エキス、１．２％魚肉エキス、０．３％リン酸２カリウム、０．００６％チアミン塩酸塩、１％グルタミン酸ナトリウム、０．３％アルギニン塩酸塩、０．６％ヒスチジン塩酸塩、０．２％メチオニン、２００ｐｐｍ硫酸マグネシウム、４０ｐｐｍ硫酸マンガン、１０ｐｐｍ硫酸第２鉄、６ｐｐｍ硫酸亜鉛、２ｐｐｍ硫酸ニッケル、０．６ｐｐｍ硫酸銅、１２％マルトース１水和物、０．３％炭酸ナトリウムからなる培地（記述のない限り重量％）を、５００ｍＬ容ひだ付三角フラスコに２０ｍＬ仕込み、ＫＳＭ−Ｋ１６株、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株、ＫＳＭ−３Ｍ−３０株、Ｋ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株の各培養液を０．４ｍＬ接種後、２１０ｒ／ｍｉｎで３４℃にて２日間培養した。得られた培養液を２５００ｒ／ｍｉｎ、１５分間遠心分離し培養上清のプロテアーゼ活性を測定した。すなわち、水酸化ナトリウムでｐＨ１０．５に調整した０．１Ｍほう酸／０．１Ｍ塩化カリウムの緩衝液０．５ｍＬ、脱イオン水０．４ｍＬ及び０．１ＭＮ-succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanyl-p-nitroanilide(ペプチド研究所製)０．０５ｍＬからなる反応液を３０℃で３分間恒温した後、０．０５ｍＬの酵素液を加え反応を開始した。３０℃で５分間恒温した後、２ｍＬの５％（ｗ／ｖ）クエン酸を加え反応を停止した。４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。尚、プロテアーゼ活性はＫＳＭ−Ｋ１６株のｐ−ニトロアニリン生成量を１００とした相対値で示した。表５に示したように、ＫＳＭ−Ｋ１６株よりもＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株でプロテアーゼの生産量は増大し、ＫＳＭ−３Ｍ−３０株では更にプロテアーゼの生産量は増大した。Ｋ１６ｒｐｏＢ−Ａ４７９Ｖ株は、ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株と同等のプロテアーゼ生産量であった。

Claims

配列番号２で示されるアミノ酸配列における４７９番目のアラニン残基、又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異を含み、且つバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrsbU遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異、及びバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrph遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異を含むことを特徴とするバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）の変異株。
バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrsbU遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異が、配列番号４で示されるアミノ酸配列における１７６番目のアスパラギン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がグリシン残基に置換され、且つ２３４番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンでフレームシフトし、２５１番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異である請求項１記載の変異株。
配列番号４で示されるアミノ酸配列における変異が、配列番号３で示される塩基配列における５２７番目のＡをＧに置換すること、及び６９３番目〜７００番目の連続したＴのうち何れか１つのＴを欠失することにより生ずるものである請求項２記載の変異株。
バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）のrph遺伝子の不活性化又は欠失により生じる変異が、配列番号６で示されるアミノ酸配列における１４９番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンでフレームシフトし、１５１番目に対応するコドン又はこれに相当する位置のコドンで終止コドンとなる変異である請求項１〜３の何れか１項記載の変異株。
配列番号６で示されるアミノ酸配列における変異が、配列番号５で示される塩基配列において、４３９番目から４４５番目の何れか１ヶ所へＡを挿入することにより生ずるものである請求項４記載の変異株。
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２０７６１として寄託されたバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−１６Ｍ−３７２株。
さらに配列番号８で示されるアミノ酸配列における５２９番目のアラニン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がバリン残基に置換される変異、及び／又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列における１０番目のロイシン残基又はこれに相当する位置のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に置換される変異を含む請求項１〜５の何れか１項記載の変異株。
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２０７６２として寄託されたバチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−３Ｍ−３０株。
請求項１〜８の何れか１項記載の変異株をアルカリ性培地で培養し、その培養物よりアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法。